ISO 15952:2018

ISO/TC 190/SC 4
Date: 2018‐06 Deleted: 2016‐12‐15
ISO/TC 190/SC 4/WG 2
Secretariat: AFNOR
Soil quality — Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) — Determination
of the effects on growth by soil contamination
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des escargots juvéniles (Helicidae) —
Détermination des effets sur la croissance par contamination du sol
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Contents Page
1 Scope . . . . . . . 1
2 Normative references . . . . . 1
3 Terms and definitions . . . . . 2
4 Principle . . . . . . . 3
5 Test environment . . . . . . 3
6 Reagents . . . . . . . 3
7 Apparatus . . . . . . . 5
8 Storage and preparation of the samples . . . 5
9 Procedure . . . . . . . 6
10 Reference substance . . . . . 9
11 Calculations and expression of results . 10
12 Validity of test . 12
13 Test report . 13
Annex A (normative) Static method . 14
Annex B (informative) Breeding technique for snails . 15
Annex C (informative) Example of composition of snail feed . 20
Annex D (informative) Example of table of data . 21
Annex E (informative) Example of results with Helix aspersa aspersa . 22
Annex F (informative) Determination of the effects on growth by food contamination . 25
Annex G (informative) Test performance with other snail species . 29
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iii
Deleted: /FDIS
Foreword
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This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological characterization.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 15952:2006), which has been technically
revised.
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Introduction
Because of the limited amount of data available concerning toxicity of contaminants on soil organisms,
the ecotoxicity of soils and waste are cause for serious concern at both national and international levels.
Currently available tests use soil‐fauna organisms restricted to annelid (earthworms and
Enchytraeidae) and arthropod phyla (insects: Collembola and Coleoptera). Among the latter, two
[6]
standards assess acute toxicity [earthworms (ISO 11268‐1) and coleoptera larvae and three other
[3] [2]
standards address sublethal effects of soil contaminants on reproduction (earthworms , Collembola ,
[4]
Enchytraeidae ). In the biological cycles of organisms, it appears that growth is, like reproduction, a
fundamental ecophysiological parameter to be taken into consideration for the sustainability of species
[38]
and ecosystems .
Snails are relevant ecological indicators for assessing the quality of soils(See References [16][18] to
[20][32][33][40] to [42]), as they are characteristic of the soil surface layer (saprophagous and
phytophagous) of which a large part of the biological cycle takes place in the soil (egg‐laying, hatching,
[7][18][29]
initial stages of development, hibernation, etc.) . During the other phases of their cycle, they eat
soil and are in contact with the soil via their moist pedal sole (foot) covered with mucus and participate
in the permanent exchanges with the soil (water, mineral salts, excrement and finally shell and organic
[7][18][31]
matter when they die) . In addition, they constitute an important link between plants, fauna and
soil microorganisms. They correspond fully to the criteria for a good biological indicator: easy to sample
and identify, they are widely distributed; they accumulate contaminants (See References[9],[11] to
[15],[17][18][22][24][29][30],[33] to [48]); their ecological and physiological characteristics are well‐
[7][10][32] [22][26][32]
known ; and they are now easy to breed under controlled conditions . Their susceptibility
to common contaminants of their environment has been demonstrated (See References [11] to
[16],[19] to [28],[30],[33] to [38],[37] to [48]).
This International Standard describes a method for determining the effects on survival and growth of
young snails of substances, preparations (i.e. a mixture or solution composed of two or more
substances), soils or waste materials added to an artificial or a natural soil. The described method is
thus applicable to test contaminated soils or to compare different uncontaminated soils. The
recommended species is Helix aspersa aspersa Müller (also commonly called: common garden snail,
brown garden snail, garden snail, land snail, “Petit‐Gris”; synonyms: Cantareus aspersus, Cornu
[56]
aspersum ). Among land snails (stylommatophoran pulmonate gastropod molluscs of the Helicidae
family), Helix aspersa aspersa Müller is the most ubiquitous. This palearctic species can be acclimated to
regions with different types of climate: Mediterranean, oceanic temperate, midcontinental temperate
and even tropical. Helix aspersa aspersa Müller is of European origin and has been introduced into all
[10]
parts of the world. They are now on all continents except Antarctica .
Indeed, in their natural environment, snails integrate the contaminants by contact (with various
substrates such as soil, soil leachates, plant litter), by ingestion (of plants and soil), as well as through
[7][29]
the respiratory tract . So, for specific testing purposes (evaluation of pesticide toxicity, for example),
another test design, which is focussed on exposure via food uptake, is optionally available (Annex F and
Reference [6]).
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v
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Soil quality — Effects of pollutants on juvenile land snails
(Helicidae) — Determination of the effects on growth by soil
contamination
1 Scope
This document specifies a semi‐static method for determining the effects of contaminants on growth
and survival of young snails, usually Helix aspersa aspersa Müller. The animals are exposed via the
cutaneous and digestive route using a test substrate (artificial or natural soil according to the objective
of the study) to which defined amounts of the following are added:
— substances, mixtures or preparations;
— soils (contaminated or of unknown quality) or waste materials.
This test takes into account the possible changes in the test substance, preparation, soil or waste
material because the test mixtures are prepared and renewed every week during the 28‐day test
period.
A static method may be implemented in addition to the semi‐static method (optional). This method is
described in Annex A.
This method does not apply to substances for which the air/soil partition coefficient is greater than one,
or to substances with vapour pressure exceeding 300 Pa, at 25 °C.
2 Normative references
Deleted: ISO 10390, Soil
quality — Determination of
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content pH¶

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
Deleted:
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH Deleted: ISO 10694, Soil
quality — Determination of organic
and total carbon after dry
ISO 18400‐206, Soil quality — Sampling — Part 206: Guidance on the collection, handling and storage of
combustion (elementary
soil for the assessment of biological functional and structural endpoints in the laboratory
analysis)¶

ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
Deleted:
analysis)
Deleted:
ISO 11268‐1, Soil quality — Effects of pollutants on earthworms — Part 1: Determination of acute toxicity
Deleted:
to Eisenia fetida/Eisenia andrei
Deleted: ISO 11274, Soil
quality — Determination of the
ISO 11269‐2:2012, Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora — Part 2: Effects
water-retention characteristic —
of contaminated soil on the emergence and early growth of higher plants
Laboratory methods¶
ISO 11465, Soil quality —
Determination of dry matter and
ISO 11274, Soil quality — Determination of the water-retention characteristic — Laboratory methods
water content on a mass basis —
Gravimetric method¶
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
EN 14735, Characterization of
method
waste — Preparation of waste
samples for ecotoxicity tests¶
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EN 14735, Characterization of waste — Preparation of waste samples for ecotoxicity tests
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: available at https://www.iso.org/obp
3.1
test substrate
artificial soil or natural soil used as control and dilution substrate
3.2
matrix
soil or waste material under test
3.3
test mixture
mixture of the test substance, preparation or matrix with the test substrate (3.1)
3.4
growth
increase in the biomass, i.e. in the total fresh mass (body with shell) of the organisms
between the start and completion of the test
Note 1 to entry: It is expressed as a biomass growth coefficient k .
GC,m
3.5
growth
increase in the maximum shell diameter, between the start and completion of the test
Note 1 to entry: It is expressed as a shell diameter growth coefficient k .
GC,d
3.6
effect concentration
EC
x
concentration at which a specific effect is detected; x is the percentage (10, 25, 50) of this effect, e.g.
growth inhibition
EXAMPLE EC means the concentration estimated to reduce growth at the end of the test to 50 %
compared to the control (EC and EC for biomass growth and shell growth respectively).
50,m 50,d
3.7
median lethal concentration
LC
concentration of the substance, of the test preparation initially present, or the concentration of the
matrix causing the death of 50 % of the snails submitted to testing
3.8
lowest observed effect concentration
LOEC
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lowest tested concentration at which the test substance is observed to have a statistically significant
effect (p < 0,05) when compared with the control
Note 1 to entry: All test concentrations above the LOEC have a harmful effect equal to or greater than those
observed at the LOEC. When these two conditions cannot be satisfied, a full explanation should be given for how
the LOEC (and hence the NOEC) has been selected.
3.9
no observed effect concentration
NOEC
test concentration immediately below the LOEC, which, when compared with the control, has no
statistically significant effect (p > 0,05) within a given exposure time
Note 1 to entry: The NOEC is the concentration just below the LOEC.
Note 2 to entry: For 3.6, 3.7, 3.8 and 3.9, results are given:
— in dry mass of test substance or preparation per dry mass of the test substrate (3.1);
— in mass percentage of the tested matrix in the test mixture (expressed in dry mass).
4 Principle
Juvenile land snails (usually Helix aspersa aspersa Müller) are exposed during a period of 28 d to test
mixtures containing the test substance, preparation or matrix at different concentrations. The test
mixtures are freshly prepared and renewed every 7 d.
According to the objectives of the study, the test mixtures may be prepared with artificial soil (see 6.3.2)
or with a suitable natural soil (see 6.3.3).
The snails are fed during the test with uncontaminated food.
The effects on growth (biomass and shell diameter) and on survival are measured after 28 d of
exposure (optionally, effects could be measured every 7 days during 28 d).
The results obtained during testing are compared with those of a control to determine the NOEC or
LOEC and to allow the estimation of the concentration which reduces the growth of the snails by 50 %
within 28 d with respect to the fresh mass [EC (28 d)] and to the shell diameter [EC (28 days)]
50,m 50,d
or other values of EC.
x
If the concentrations selected result in lethal effects, the results obtained during testing are compared
with those of a control and used for estimating the concentration which causes the death of 50 % of the
snails [LC (28 d)].
For particular applications, various parameters (EC, NOEC, LOEC, LC ) can be determined (optional)
x 50
after exposure periods lower than 28 d (7 d, 14 d or 21 d).
The test is conducted in two stages:
— a preliminary test intended to indicate both the non‐observed effect concentration, NOEC, and the
complete growth inhibition. The resulting dose‐response relationship is important for the proper
design of the definitive test;
— a definitive test specifying the concentrations which cause between 10 % and 90 % of growth
inhibition. It is not necessary to perform a final test where the preliminary test has not revealed any
inhibitory effects at the maximum concentration tested.
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5 Test environment
The test shall be carried out at a temperature of (20 ± 2) °C under a day‐night photoperiod of 18 h to
6 h. The illumination intensity (artificial light of daylight type), without any natural light in the test
containers shall be 50 to 100 lx.
6 Reagents
6.1 Water, of purity at least deionized.
6.2 Biological material.
Test organisms shall be juvenile snails. The recommended species is Helix aspersa aspersa Müller (also
known as Cantareus aspersus and Cornu aspersum) which shall be 3 to 5 weeks old, having a mean fresh
mass of (1 ± 0,3) g and a shell diameter of (15,5 ± 1) mm.
NOTE The use of some other genus and/or species of Helicidae is possible (see examples and conditions in
Annex G).
The snails shall be selected from synchronous breeding in order to form a population as homogeneous
as possible with respect to size, mass and age. The breeding techniques for snails are described in
Annex B. After a nursery period (3 to 5 weeks, see Annex B), the young snails shall be used after at least
1 week of aestivation and no more than 5 months. The aestivation is carried out in round wooden boxes
(approximately 12 cm in diameter and 4 cm in height), with the snails under dry conditions, at a
temperature of 17 °C to 20 °C.
Two to three days before starting the test, snails shall be woken by spraying water (6.1) into the boxes
used for aestivation. The proportion of snails not woken shall be less than 10 %. As soon as they have
resumed activity (snails not stuck to the walls of the box and which are beginning to move about), the
snails shall be transferred to a test container (7.1) that has been moistened with water (6.1). The
bottom of this box either is covered with absorbent paper that has also been moistened, or can contain
some test substrate (6.3) moistened to 50 % to 60 % of its water‐holding capacity. Between waking and
the start of the test (2 d to 3 d), the snails shall be fed (6.4).
6.3 Test substrate.
6.3.1 General
According to the objectives of the study, either an artificial soil (see 6.3.2) or a suitable natural soil (see
6.3.3) is used as test substrate. The test substrate can be used dry or raw (i.e. without dehydration prior
to use for natural soil).
Artificial soil may be used as a control and dilution substrate to assess the effect of a substance or of a
preparation, or to compare different soils or waste, or to determine the effects of a contaminated soil.
Natural soil (field soil) may be used as a control and dilution substrate in order to assess, for example,
the effect of the incorporation of wastewater treatment plant sludge into the field soil or to test the
effect of a contaminated soil (in this case an uncontaminated soil comparable to the soil sample to be
tested ought to be used).
6.3.2 Artificial soil
The artificial soil shall have the following composition (as defined in ISO 11268‐1).
See Table 1.
Table 1 — Composition of artificial soil
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Composition Percentage expressed in dry mass
Sphagnum peat air‐dried and finely ground (2 ± 1) mm
without any visible plant remains.
Kaolinite clay, preferably containing not less than 30 %
kaolinite.
Air‐dried industrial quartz sand (predominantly fine sand Approximately 69 (depending on the amount of
with more than 50 % by mass of particle size 0,05 mm to CaCO needed).
0,2 mm).
Calcium carbonate (CaCO , pulverised, analytical grade) to Approximately 0,3 to 1,0
bring the pH of the wetted artificial soil to 6,0 ± 0,5.
The artificial soil shall be prepared, at least 2 d prior to starting the test, by mixing the dry constituents
listed above thoroughly in a large‐scale laboratory mixer. The amount of calcium carbonate required
might vary, depending on the properties of the individual batch (mainly the peat) and should be
determined by measuring subsamples immediately before the test.
The mixed artificial soil shall be stored at room temperature for at least 2 d to equilibrate acidity. To
determine pH and the maximum water‐holding capacity, the dry artificial soil is pre moistened one or
2 d before starting the test by adding deionized water to obtain half of the required final water content
of 50 % to 60 % of the maximum water‐holding capacity.
The pH value shall be measured in accordance with ISO 10390. If the measured pH is not within the
required range, a sufficient amount of CaCO shall be added or a new batch of artificial soil shall be
prepared. The maximum water‐holding capacity of the artificial soil shall be determined in accordance
with ISO 11274 or ISO 11269‐2:2012, Annex C.
6.3.3 Natural soil
Determine the following parameters on the selected natural soil which shall be sieved through a 4‐mm
square mesh sieve to remove large fragments:
— pH, according to ISO 10390;
— water‐holding capacity, according to ISO 11274 or ISO 11269‐2:2012, Annex C;
— water content, according to ISO 11465;
— content of organic matter, according to ISO 10694.
It is also recommended to determine the cation exchange capacity, according to ISO 11260.
6.4 Feed.
The feed shall be provided in the form of flour at its natural moisture content (5 % to 10 %).
In order to obtain sufficient growth, it is recommended to carry out the tests with a flour‐based feed
)
comprising cereals, forage, mineral salts and vitamins which properly covers the needs of the snails. An
example of feed composition is given in Annex C.
7 Apparatus
Use ordinary laboratory apparatus and the following.
7.1 Test containers.
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)
Disposable mouse boxes made of transparent polystyrene or any other container having a volume of
approximately 1,6 l [advised approximate dimensions: 24 cm (length) × 10,5 cm (width) × 8 cm
(height)].
7.2 Feed containers.
Petri dishes, approximately 5,5 cm in diameter and approximately 1 cm in height or any other
containers of equivalent dimensions.
7.3 Calliper rule, having a precision of 0,1 mm.
7.4 Balances.
One analytical balance having a precision of at least 1 mg. Two other balances, one having a precision of
0,1 g, another having a precision of 1 g.
8 Storage and preparation of the samples
8.1 Soil to be tested
The soil samples received at the laboratory shall be stored in accordance with ISO 18400‐206.
The soil sample submitted for testing shall be sieved through a 4‐mm square mesh sieve to remove
coarse fragments.
For each soil, the same characteristics than for natural soil (see 6.3.3) that can be used as control or
dilution substrate, shall be determined.
8.2 Waste material
The samples of waste material received at the laboratory shall be stored in accordance with EN 14735
[less than 2 months at (4 ± 3) °C].
For conducting the tests, the grading of the waste shall be less than 4 mm. Where this condition is not
fulfilled, the particle size of the waste material shall be reduced so that all of the particles pass through a
4‐mm square mesh sieve.
9 Procedure
9.1 Preparation of the test
9.1.1 Selection of the concentrations to be tested
9.1.1.1 Preliminary test
This test is performed within a wide range of concentrations.
— Four concentrations of the substance or preparation and one control (e.g. 0 mg/kg; 50 mg/kg;
100 mg/kg; 500 mg/kg and 1 000 mg/kg of test substrate) with five snails per concentration and
per container. The preliminary test may be conducted without replication.
— Four percentages of the matrix under examination and one control (e.g. 0 %; 12,5 %; 25 %; 50 %;
100 %) with five snails per percentage and per container. The preliminary test may be conducted
without replication.
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9.1.1.2 Definitive test
Select a range of at least five concentrations of the test substance, preparation or matrix according to a
geometric progression, so as to cover and extend beyond the range of those concentrations or
percentages which in the preliminary test did not have any effect on the growth or which inhibited it
completely. The ratio of this geometric progression shall preferably not exceed 2.
If the ratio exceeds 2, it is necessary to have available two concentrations for which the observed effect
is between 10 % and 90 %.
For the definitive test, three replicates are carried out per concentration.
9.1.2 Preparation of test mixtures
9.1.2.1 General
The test mixture (see 3.3) is made up of test substrate and of test substance, preparation or matrix.
Prepare enough test mixture in order to cover the bottom of the test container with a layer of the test
mixture of at least 1 cm.
If the test substance is used in the raw state (i.e. without dehydration prior to use), take into account its
moisture rate so as to express the concentrations in milligrams of substance or of preparation per
kilogram of dry test substrate and, for the matrixes, in mass percentage of matrix (expressed in dry
mass) in the test mixture (expressed in dry mass).
9.1.2.2 Water-soluble or emulsifiable substances and preparations
For each examined concentration, dissolve the appropriate quantity of test substance or preparation
required for obtaining the desired concentration in the same water (6.1) used for moistening the test
substrate. Spray the solution over the dry or raw test substrate (6.3), then mix carefully.
The final test mixture shall have a moisture content corresponding to 50 % to 60 % of its total water‐
holding capacity (determined according to ISO 11274 or according to ISO 11269‐2:2012, Annex C).
Measure the pH for each test concentration according to ISO 10390.
Proceed likewise for the control treatment apart from the addition of test substance or preparation.
Continue the test as specified in 9.2.
9.1.2.3 Water-insoluble substances and preparations, but soluble in organic solvents
Dissolve the quantity of test substance or preparation required for obtaining the desired concentration
into a volatile solvent (e.g. methanol or acetone). Spray the obtained solution over the dry or raw test
substrate (6.3). Carefully mix the totality and let the organic solvent to evaporate under a fume
cupboard for 24 h.
Moisten the mixture with water (6.1) up to 50 % to 60 % of its total water‐holding capacity
(determined according to ISO 11274 or according to ISO 11269‐2:2012, Annex C), then mix carefully.
Measure the pH for each test concentration according to ISO 10390.
Proceed likewise for the control treatment apart from the addition of test substance or preparation.
Continue the test as specified in 9.2.
9.1.2.4 Substances and preparations insoluble in both water and organic solvents
For a substance or preparation that is insoluble in a volatile solvent, prepare a mixture of 10 g of
industrial quartz sand (see 6.3.2) (previously sampled from the quantity of sand required for the
preparation of the test substrate) and of the quantity of test substance or preparation required in order
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to obtain the desired concentration. Tranfer the obtained mixture into a container containing the dry or
raw test substrate (6.3) (except the 10 g used for the contamination). Mix carefully.
Moisten the mixture with water (6.1) up to 50 % to 60 % of its total water‐holding capacity
(determined according to ISO 11274 or according to ISO 11269‐2:2012, Annex C), then mix carefully.
Measure the pH for each test concentration according to ISO 10390.
Proceed likewise for the control treatment apart from the addition of test substance or preparation.
Continue the test as specified in 9.2.
9.1.2.5 Matrix
Increasing proportions of test matrix are mixed to the dry or raw test substrate (6.3) (e.g. 0 %; 12,5 %;
25 %; 50 %; 100 %).
The control treatment corresponds to 0 % of test matrix, i.e. 100 % of artificial soil (see 6.3.2) or natural
soil (see 6.3.3).
Moisten the mixture with water (6.1) up to 50 % to 60 % of its total water‐holding capacity
(determined according to ISO 11274 or according toISO 11269‐2:2012, Annex C), then mix carefully.
(The added water corresponds to the volume of water required in order to rehydrate the quantity of
test substrate of the mixture and to the volume of water required in order to rehydrate the quantity of
matrix of the mixture.)
If it is necessary to reduce the humidity of the matrixes, do it by dehydration outdoors or in a drying
oven at a temperature not exceeding 30 °C, in order to limit the loss of volatile substances.
Measure the pH for each test concentration according to ISO 10390.
Continue the test as specified in 9.2.
9.2 Distribution of test mixture
In preparation for the test, add sufficient test mixture (see 9.1.2) into the test containers (7.1) to fill the
bottoms of the test containers to a depth of at least 1 cm.
NOTE If the test substrate (6.3) is artificial soil, the quantity of test mixture is about 140 g (dry mass) for each
test container.
Smooth the surface of the test mixture and compact the soil slightly.
9.3 Introduction of the feed
Place the container (7.2) containing the feed (6.4) on the bottom of the test container (7.1). The feed
shall be provided ad libitum.
9.4 Introduction of the biological reagent
Select five snails (6.2) randomly for each per test container (7.1).
9.5 Handling during the tests
9.5.1 General
Cover the containers with a transparent perforated sheet [e.g. in polyalkylmethacrylate (Plexiglas) of
approximate dimensions 26,5 cm × 13,5 cm] held in place by any appropriate device during the first
two weeks of the test. During the following two weeks, use, to form the lid, a second container (7.1)
turned upside down. This arrangement doubles the volume of the test chamber thus avoiding a negative
group effect on the growth of the snails (see Figure B.2).
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NOTE The plate and the container used to cover the test containers can be perforated by 3 to 4 holes with a
diameter smaller than 2 mm.
Place the test containers with the snails in conditions of the test (see Clause 5). Observe them regularly
and note any anomaly that could interfere with the conducting of the test.
9.5.2 Routine care
Three times a week (for example Monday, Wednesday and Friday) perform the following operations for
each test container.
— Using a spatula, regularly remove the excrement on the test mixture in order to avoid its
accumulation and the development of mould.
— Clean the side walls of the container with absorbent paper moistened with water (6.1) and wash
the lid with tap water, then dry it and remoisten it with water (6.1).
— Moisten the test mixture (see 9.1.2) by spraying it with water (6.1) so that it is at 50 % to 60 % of
its water‐holding capacity. To ensure that the moisture content of the test mixture remains at 50 %
to 60 % throughout the test duration, it is possible to prepare a container without snails which will
be weighed regularly in order to estimate the quantity of water to be sprayed into the test
containers.
— Renew the feed (6.4).
It is advisable to carry out the operations described above at regular times, if possible (morning or
afternoon).
Note the mortality, if any.
9.5.3 Weekly task
If effects need to be determined weekly (optional, see Clause 4), snails are weighed and measured every
week. If not, snails are weighed and measured only at the end of the test (28 d).
Every 7 d:
— prior to changing the feed and cleaning the side walls and the lid, weigh the snails individually
(with a precision of 0,1 g) and measure the shell diameter (with a precision of 0,1 mm); see
Figure 1;
— renew the test mixture (see 9.1.2) by a freshly‐prepared one.
15952_ed2fig1.eps
Figure 1 — Measure of the shell diameter, i.e. the longest size that can be measured (white arrow
on the photo)
The mass of the snails may be uncertain if they have test substrate on their shell or their foot. Before
each weighing, using a spatula, remove the substrate from the shell or the foot. It is possible to leave the
snails to move about on the clean container lid or on slightly moist paper so that they get rid of the
substrate adhering to their foot.
Note the obvious or pathological symptoms (e.g. excessive production of mucus, extended oedematous
body, drooping eyestalk like those described in References [12] or [42]), or any noticeable
modifications in behaviour (e.g. lethargy on the test mixture, lack of feeding), observed on the snails.
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At the end of the test, the pH of a control container and of a container shall be measured for each
concentration in accordance with ISO 10390. It is recommended to measure the pH of any containers in
which the mortality rate or growth rate is unusual.
Optional: at the end of the test (28 days), after final weighing and measurement of the shell diameter, let
the snails of each container fasted during 48 h in moist boxes without test substrate (until they no
longer excrete), then deep‐freeze them in view of possibly analysing the concentration of contaminants
present in their tissues or organs.
10 Reference substance
A control test is regularly conducted with a reference substance to check the occurrence of changes in
the sensitivity of the test organisms.
NOTE Experience has shown that cadmium chloride is a suitable reference substance.
On a regular basis, determine the values of EC (28 d) and EC (28 d) of the cadmium chloride by
50,m 50,d
applying the protocol described in this International Standard.
WARNING — Appropriate precautions should be taken when dealing with cadmium chloride which is a
harmful substance.
The EC (28 d) of the CdCl shall be between 350 mg and 650 mg of Cd per kg of dry test substrate.
50,m 2
The EC (28 d) of the CdCl shall be between 500 mg and 800 mg of Cd per kg of dry test substrate.
50,d 2
Mention the obtained values and their obtaining dates in the test report.
Four laboratories participated in 2000 in an interlaboratory test concerning cadmium chloride. The
results are given in Table 2 (see also Reference [52]).
Table 2 — Results of the interlaboratory test with Helix aspersa aspersa (substrate
contamination; semi-static method)
EC (28 d) EC (28 d)
50,m 50,d
Substance
mg Cd/kg mg Cd/kg
Mean Range Mean Range
CdCl 500 398 to 622 600 507 to 781
11 Calculations and expression of results
11.1 Calculations
For each concentration, determine the percentage of mortality, if any, at the time of the final test.
At the end of the test (28 d) (optional: week by week), calculate the mean masses and the mean shell
diameters, and the associated standard deviations, of the snails for each container and for each
concentration.
An example of a data table is given in Annex D.
For each container, calculate the biomass growth coefficient (designated k ) and the shell diameter
GC,m
growth coefficient (designated k ) according respectively to Formulae (1) and (2):
GC,d
mm
 
tn t0
k100 (1)
GC,m
m
t0
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where
k is the biomass growth coefficient;
GC,m
m is the mean mass of the snails per replicate at time tn, in grams (g);
tn
m Is the mean mass of the snails per replicate at time t0, in grams (g).
t0
dd
 
tn t0
k100 (2)
GC,d
d
t0
where
k is the shell diameter growth coefficient;
GC,d
d is the mean shell diameter of the snails per replicate at time tn, in millimetres (mm);
tn
d is the mean shell diameter of the snails per replicate at time t0, in millimetres (mm).
t0
For each concentration, calculate the mean percentage of biomass growth inhibition (designated p )
I,m
and of shell diameter growth inhibition (designated ) according respectively to Formulae (3) and
p
I,d
(4):
mmm''m

00tn t0 tn t0
p100 (3)
I,m
mm
00tn t0
where
p is the mean percentage of biomass growth inhibition;
I,m
m is the mean mass of the snails at time tn in the control, in grams (g);
0tn
m is the mean mass of the snails at time t0 in the control, in grams (g);
00t
is the mean mass of the snail per concentration at time tn, in grams (g);
m'
tn
is the mean mass of the snail per concentration at time t0, in grams (g).
m '
t0
ddd''d
00tn t0tn t0
p100 (4)
I,d
dd
00tn t0
where
is the mean percentage of shell diameter growth inhibition;
p
I,d
is the mean shell diameter at time tn in the control, in millimetres (mm);
d
0tn
is the mean shell diameter at time t0 in the control, in millimetres (mm);
d
00t
is the mean shell diameter per concentration at time tn, in millimetres (mm);
d '
tn
is the mean shell diameter per concentration at time t0, in millimetres (mm).
d '
t0
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11.2 Expression of results
For each concentration and at various times of measurement, present the percentage of mortality for
each replicate, and for the two measured parameters, biomass growth and shell growth:
— the calculated mean values and the standard deviation per replicate;
— the growth coefficient per replicate (see examples in Tables E.1 and E.2);
— the mean percentage of growth inhibition (see examples in Tables E.3 and E.4);
— a graphic presentation of the results of the test, giving a clear image of the dose‐response
relationship for the effects on growth.
It is possible (optional) to determine the LOEC using an appropriate multiple comparison and to deduce
from it the NOEC, the next lower concentration to the LOEC.
Possibly, for the test substances, preparations or matrixes for which the mortality is dose‐dependent,
calculate, using any appropriate statistical method, the LC (28 d) and its 95 % confidence interval
(the method used for determining growth inhibition is suitable).
In order to estimate the concentration which would cause x % of growth inhibition (EC, for instance
x
EC , EC or EC ), it is possible to fit a model to the test results (k or k ). For this, the values
10 20 50 GC,m GC,d
of EC and the parameters characterizing this model shall, if possible, be estimated with their
x
confidence interval (e.g. 95 %).
The fitting of the model to the data shall be assessed either using a statistical test, or by graphic
representation.
It is possible to use the logistic model which is generally suitable for the statistical analysis of the
produced data.
NOTE 1 This model is used in the framework of the analysis of interlaboratory test results (see Clause 10).
This model is characterized by Formula (5):
a
Y (5)
b

C
1

EC
50
where
Y is the growth coefficient of the live snails per replicate (k or k );
GC,m GC,d
C is the concentration under test (test variable).
The following parameters, characterizing the model, are estimated from the obtained data (e.g. by the
least squares method).
EC is the concentration causing 50 % of growth inhibition;
a is the growth coefficient of the snails expected in the control;
b is a parameter which characterizes the slope of the curve.
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The EC can then be estimated by Formula (6):
x
x
 b
EC EC (6)
x 50
100 x

where x is the sought‐after effect level for calculating the EC (initially fixed parameter).
x
Other models can be used. In this case, a description of the model used shall be given in the test report.
For example, statistical methods are described in Reference [53].
For the substances or preparations, express the values of EC (28 d), EC (28 d) and, if needed ,
50,m 50,d
NOEC and LOEC in mg of test substance or preparation per kilogram of test substrate (expressed in dry
mass).
For soils and waste, express the values of EC (28 d), EC (28 d) and, if needed, NOEC and LOEC
50,m 50,d
in mass percentage of soil or waste in the test mixture (expressed in dry mass).
NOTE 2 It is also possible (optional) to determine other values of EC (for example x = 10 %, 25 %, etc.).
x
Various parameters (EC, NOEC, LOEC, LC ) can also be determinate at other times of measurement (7, 14 or
x 50
21 d).
12 Validity of test
The results are considered to be valid if the following conditions are met:
— the percentage of mortality observed in the control containers is less than or equal to 10 % at the
end of the test;
— the coefficient of variation calculated for the biomass growth and shell growth in the controls is less
than or equal to 40 %;
— the mean biomass of the snails in the controls has been multiplied at least by 4 throughout the test
durati
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 15952
Deuxième édition
2018-06
Qualité du sol — Effets des polluants
vis-à-vis des escargots juvéniles
(Helicidae) — Détermination
des effets sur la croissance par
contamination du sol
Soil quality — Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae)
— Determination of the effects on growth by soil contamination
Numéro de référence
©
ISO 2018
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Environnement de l’essai . 3
6 Réactifs . 4
7 Appareillage . 5
8 Stockage et préparation des échantillons . 6
8.1 Sol à soumettre à essai . 6
8.2 Déchets . 6
9 Mode opératoire. 6
9.1 Préparation de l’essai . 6
9.1.1 Sélection des concentrations à soumettre à essai . 6
9.1.2 Préparation des mélanges d’essai . 7
9.2 Répartition du mélange d’essai . 8
9.3 Introduction de la nourriture . 8
9.4 Introduction du réactif biologique . 9
9.5 Manipulations pendant les essais . 9
9.5.1 Généralités . 9
9.5.2 Soins de routine . 9
9.5.3 Tâche hebdomadaire . 9
10 Substance de référence .10
11 Calculs et expression des résultats .11
11.1 Calculs .11
11.2 Expression des résultats .12
12 Validité de l’essai .14
13 Rapport d’essai .14
Annexe A (informative) Méthode statique .16
Annexe B (informative) Technique d’élevage des escargots .17
Annexe C (informative) Exemple de composition de la nourriture pour escargots .22
Annexe D (informative) Exemple de tableau de données .23
Annexe E (informative) Exemple de résultats avec Helix aspersa aspersa .24
Annexe F (informative) Détermination des effets sur la croissance par contamination
de la nourriture .28
Annexe G (informative) Autres espèces d’escargots adéquates .32
Bibliographie .33
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 15952:2006), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
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Introduction
En raison du nombre limité de données disponibles sur la toxicité des contaminants sur les organismes
vivant dans le sol, l’écotoxicité des sols et des déchets sont très préoccupants tant au niveau national
qu’au niveau international. Les essais actuellement disponibles utilisent les organismes de la faune
du sol limités aux embranchements annélides (vers de terre et Enchytraeidae) et des arthropodes
(insectes: Collemboles et Coléoptères). Parmi ces derniers, deux normes évaluent la toxicité aiguë (vers
[6]
de terre (ISO 11268-1) et larves de coléoptères et trois autres normes traitent des effets sublétaux
[3] [2] [4]
des contaminants du sol sur la reproduction (vers de terre, Collemboles, Enchytraeidae ). Dans
les cycles biologiques des organismes, il semble que la croissance est, tout comme la reproduction, un
paramètre écophysiologique fondamental à prendre en considération pour la viabilité des espèces et
[38]
des écosystèmes .
Les escargots sont des indicateurs écologiques pertinents pour l’évaluation de la qualité des sols (voir
Références [16], [18] à [20], [32], [33], [40] à [42]), étant donné qu’ils sont caractéristiques de la couche
superficielle du sol (saprophages et phytophages) et qu’une grande partie de leur cycle biologique a lieu
[7][18][29]
dans le sol (ponte, éclosion, premiers stades du développement, hibernation, etc.). Pendant les
autres phases de leur cycle, ils ingèrent du sol et sont en contact avec celui-ci par l’intermédiaire de leur
sole pédieuse humide (pied), recouverte de mucus, et participent aux échanges permanents avec le sol
(eau, sels minéraux, excréments, puis finalement la coquille et la matière organique quand ils meurent).
[7][18][31]
De plus, ils représentent un lien important entre les plantes, la faune et les micro-organismes
du sol. Ils répondent pleinement aux critères d’un bon indicateur biologique: faciles à collecter et à
identifier, ils présentent une large répartition, ils accumulent les contaminants (voir Références [9], [11]
à [15], [17], [18], [22], [24], [29], [30], [33] à [48]), leurs caractéristiques écologiques et physiologiques
[7],[10],[32] [22]
sont bien connues et ils sont, à présent, faciles à élever dans des conditions contrôlées.
[26][32]
Leur sensibilité aux contaminants courants dans leur environnement a été démontrée (voir
Références [11] à [16], [19] à [28], [30], [33] à [38], [37] à [48]).
La présente Norme internationale décrit une méthode pour déterminer les effets sur la survie et la
croissance des escargots juvéniles de substances, de préparations (c’est-à-dire un mélange ou une
solution composé d’au moins deux substances), de sols ou de déchets ajoutés à un sol artificiel ou naturel.
La méthode décrite est donc applicable aux essais de sols contaminés ou à la comparaison de différents
sols non contaminés. L’espèce recommandée est Helix aspersa aspersa Müller (aussi communément
appelée: escargot petit-gris, escargot de jardin, Petit-Gris; synonymes: Cantareus aspersus, Cornu
[56]
aspersum ). Parmi les escargots terrestres (mollusques gastéropodes pulmonés stylommatophores
de la famille Helicidae), Helix aspersa aspersa Müller est le plus répandu. Cette espèce paléarctique
peut s’acclimater à des régions présentant des climats de types différents: méditerranéen, océanique
tempéré, continental tempéré, voire tropical. Helix aspersa aspersa Müller est d’origine européenne et
a été introduit dans le monde entier. Ces escargots se trouvent à présent sur tous les continents hormis
[10]
l’Antarctique .
Dans leur environnement naturel, les escargots assimilent les contaminants par contact (avec des
substrats variés tels que le sol, les lixiviats du sol et la litière végétale), par ingestion (de plantes et de
[7][29]
sol), de même que par les voies respiratoires. Ainsi, pour des objectifs particuliers (évaluation de
la toxicité d’un pesticide, par exemple), une autre méthode d’essai basée sur l’exposition par ingestion
d’aliments est disponible en option (Annexe F et Référence [6]).
NORME INTERNATIONALE ISO 15952:2018(F)
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des escargots
juvéniles (Helicidae) — Détermination des effets sur la
croissance par contamination du sol
1 Domaine d’application
Le présent document s’applique à une méthode semi-statique pour la détermination des effets de
contaminants sur la croissance et la survie d’escargots juvéniles, généralement Helix aspersa aspersa
Müller. Les animaux sont exposés par les voies cutanée et digestive à un substrat d’essai (sol artificiel
ou naturel selon l’objectif de l’étude) auquel sont ajoutées des quantités définies:
— de substances, de mélanges ou de préparations;
— de sols (contaminés ou de qualité inconnue) ou de déchets.
Cet essai prend en considération les changements éventuels de la substance d’essai, de la préparation,
du sol ou des déchets, étant donné que les mélanges d’essai sont préparés et renouvelés chaque semaine
pendant la période d’essai de 28 jours.
Il est admis de mettre en œuvre une méthode statique en sus de la méthode semi-statique (facultatif).
Cette méthode est décrite dans l’Annexe A.
Cette méthode ne s’applique pas aux substances dont le coefficient de partage air/sol est supérieur à 1,
ou pour lesquelles la pression de vapeur est supérieure à 300 Pa à 25 °C.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements)
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 18400-206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206: Lignes directrices pour la collecte, la
manipulation et la conservation de sols destinés à l’évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et
structurels en laboratoire
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11268-1, Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre — Partie 1: Détermination de
la toxicité aiguë vis-à-vis de Eisenia fetida/Eisenia andrei
ISO 11269-2:2012, Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du sol — Partie 2:
Effets des sols contaminés sur l'émergence et la croissance des végétaux supérieurs
ISO 11274, Qualité du sol — Détermination de la caractéristique de la rétention en eau — Méthodes de
laboratoire
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
EN 14735, Caractérisation des déchets — Préparation des échantillons de déchets en vue d’essais
écotoxicologiques
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp
3.1
substrat d’essai
sol artificiel ou sol naturel utilisé comme témoin et comme substrat de dilution
3.2
matrice
sol ou déchet soumis à l’essai
3.3
mélange d’essai
mélange de la substance d’essai, de la préparation ou de la matrice avec le substrat d’essai (3.1)
3.4
croissance
augmentation de la biomasse, c’est-à-dire de la masse fraîche totale (corps et coquille) des
organismes entre le début et la fin de l’essai
Note 1 à l'article: Elle s’exprime sous forme d’un coefficient de croissance k .
CC,m
3.5
croissance
augmentation du diamètre maximal de la coquille entre le début et la fin de l’essai
Note 1 à l'article: Elle est exprimée sous forme d’un coefficient de croissance k .
CC,d
3.6
concentration efficace
CEx
concentration à laquelle est décelé un effet spécifique; x est le pourcentage (10, 25, 50) de cet effet, par
exemple inhibition de la croissance
EXEMPLE CE est la concentration estimée pour réduire la croissance, à la fin de l’essai, de 50 % par rapport
au témoin (CE et CE pour la croissance de la biomasse et de la coquille, respectivement).
50,m 50,d
3.7
concentration létale médiane
CL
concentration de la substance d’essai, de la préparation présente à l’origine ou concentration de la
matrice entraînant la mort de 50 % des escargots soumis à l’essai
3.8
concentration minimale avec effet observé
CMEO
concentration la plus basse soumise à l’essai, à laquelle il est observé que la substance d’essai a un effet
statistiquement significatif (p < 0,05) par rapport au témoin
Note 1 à l'article: Toutes les concentrations d’essai supérieures à la CMEO ont un effet nocif supérieur ou égal à
ceux observés à la CMEO. Lorsqu’il n’est pas possible de satisfaire ces deux conditions, il convient d’expliquer
dans le détail comment a été sélectionnée la CMEO (et par conséquent la CSEO).
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3.9
concentration sans effet observable
CSEO
concentration de l’essai immédiatement inférieure à la CMEO, qui, lorsqu’elle est comparée à celle du
témoin, ne produit aucun effet statistiquement significatif (p > 0,05) pendant un temps d’exposition donné
Note 1 à l'article: La CSEO est la concentration immédiatement inférieure à la CMEO.
Note 2 à l'article: Dans le cas de 3.6, 3.7, 3.8 et 3.9, les résultats sont exprimés:
— en masse sèche de la substance d’essai ou de la préparation par masse sèche du substrat d’essai (3.1);
— en pourcentage de la masse de la matrice soumise à l’essai dans le mélange d’essai (exprimé en masse sèche).
4 Principe
Des escargots terrestres juvéniles (généralement Helix aspersa aspersa Müller) sont exposés pendant
une période de 28 jours à des mélanges d’essai contenant la substance d’essai, la préparation ou la
matrice à différentes concentrations. Les mélanges d’essai sont fraîchement préparés et renouvelés
tous les 7 jours.
En fonction des objectifs de l’étude, les mélanges d’essai peuvent être préparés avec du sol
artificiel (6.3.2) ou un sol naturel adapté (6.3.3).
Pendant l’essai, les escargots sont nourris avec un aliment non contaminé.
Les effets sur la croissance (biomasse et diamètre de la coquille) et sur la survie sont mesurés après
28 jours d’exposition (facultativement, les effets peuvent être mesurés tous les 7 jours pendant 28 jours).
Les résultats obtenus au cours de l’essai sont comparés avec ceux d’un témoin afin de déterminer la
CSEO ou la CMEO et ils permettent d’estimer la concentration qui réduit la croissance des escargots
de 50 % en l’espace de 28 jours par rapport à la masse fraîche [CE (28 jours)] et au diamètre de la
50,m
coquille [CE (28 jours)] ou à d’autres valeurs de CE .
50,d x
Si les concentrations sélectionnées provoquent des effets létaux, les résultats obtenus au cours de l’essai
sont comparés à ceux d’un témoin et sont utilisés pour estimer la concentration qui entraîne la mort de
50 % des escargots [CL (28 jours)].
Dans des cas particuliers, il est possible de déterminer (facultatif) certains paramètres (CE , CSEO,
x
CMEO, CL ) après des périodes d’exposition inférieures à 28 jours (7 jours, 14 jours ou 21 jours).
L’essai comprend deux étapes:
— un essai préliminaire dont le but est de déterminer aussi bien la concentration sans effet observable
(CSEO) que l’inhibition totale de la croissance. La relation dose/effet obtenue est importante pour la
conception correcte de l’essai définitif;
— un essai définitif spécifiant les concentrations entraînant une inhibition de 10 % à 90 % de la
croissance. Il n’est pas nécessaire d’effectuer un essai définitif lorsque l’essai préliminaire n’a pas
révélé d’effets inhibiteurs à la concentration maximale soumise à essai.
5 Environnement de l’essai
L’essai doit être réalisé à une température de (20 ± 2) °C avec une photopériode jour-nuit de 18 h à
6 h. L’intensité lumineuse (lumière artificielle de type lumière du jour), sans lumière naturelle dans les
récipients d’essai, doit être de 50 lx à 100 lx.
6 Réactifs
6.1 Eau, de pureté minimum déionisée.
6.2 Matériel biologique
Les organismes d’essai doivent être des escargots juvéniles. L’espèce recommandée est Helix aspersa
aspersa Müller (également connue sous les noms de Cantareus aspersus et de Cornu aspersum), dont les
individus doivent être âgés de 3 à 5 semaines et présenter une masse fraîche moyenne de (1 ± 0,3) g et
un diamètre de coquille de (15,5 ± 1) mm.
NOTE Il est possible d’utiliser un autre genre et/ou une autre espèce d’Helicidae (voir les exemples et les
conditions dans l’Annexe G).
Les escargots doivent être sélectionnés à partir d’un élevage synchrone afin d’obtenir une population
la plus homogène possible au regard de la taille, de la masse et de l’âge. Les techniques d’élevage
des escargots sont décrites dans l’Annexe B. Après une période de nursery (de 3 à 5 semaines, voir
l’Annexe B), les escargots juvéniles doivent être utilisés après une période d’estivation d’au moins
1 semaine et de 5 mois au plus. L’estivation a lieu dans des boîtes rondes en bois (diamètre de 12 cm
et hauteur de 4 cm environ), les escargots étant soumis à des conditions sèches à une température de
17 °C à 20 °C.
De deux à trois jours avant de commencer l’essai, les escargots doivent être réveillés par une
pulvérisation d’eau (6.1) dans les boîtes ayant servi à l’estivation. La proportion d’escargots non
réveillés doit être inférieure à 10 %. Dès que les escargots reprennent leur activité (ils se décollent des
parois de la boîte et commencent à se déplacer), ils doivent être transférés dans un récipient d’essai
(7.1) ayant été préalablement humidifié avec de l’eau (6.1). Le fond de cette boîte est soit recouvert de
papier absorbant ayant aussi été humidifié, soit contenir du substrat d’essai (6.3) humidifié de 50 % à
60 % de sa capacité de rétention d’eau. Il est nécessaire de nourrir les escargots (6.4) entre le moment
du réveil et le début de l’essai (de 2 à 3 jours).
6.3 Substrat d’essai
6.3.1 Généralités
En fonction des objectifs de l’étude, le substrat d’essai peut être préparé avec du sol artificiel (voir 6.3.2)
ou un sol naturel adapté (voir 6.3.3). Le substrat d’essai peut être utilisé sec ou brut (c’est-à-dire sans
déshydratation préalable à l’utilisation pour le sol naturel).
Il est admis d’utiliser un sol artificiel en tant que témoin et substrat de dilution pour évaluer l’effet
d’une substance ou d’une préparation, pour comparer différents sols ou déchets ou pour déterminer les
effets d’un sol contaminé.
Il est admis d’utiliser un sol naturel (sol d’un champ) en tant que témoin et substrat de dilution pour
évaluer, par exemple, l’effet de l’incorporation de boues de stations d’épuration d’eaux usées dans le
sol d’un champ ou pour soumettre à essai l’effet d’un sol contaminé (dans ce cas, il est recommandé
d’utiliser un sol non contaminé, comparable à l’échantillon de sol soumis à essai).
6.3.2 Sol artificiel
Le sol artificiel doit présenter la composition suivante (telle que définie par l’ISO 11268-1).
Voir Tableau 1.
4 © ISO 2018 – Tous droits réservés

Tableau 1 — Composition du sol artificiel
Composition Pourcentage exprimé en masse sèche
Tourbe de sphaigne séchée à l’air et finement moulue (2 ± 1) mm,
dépourvue de résidus végétaux visibles.
Argile à kaolinite, contenant de préférence au moins 30 % de
kaolinite.
Sable quartzeux industriel séché à l’air (prédominance de sable Environ 69 % (en fonction de la quantité
fin avec plus de 50 % de la masse présentant une granulométrie nécessaire de CaCO ).
comprise entre 0,05 mm et 0,2 mm).
Carbonate de calcium (CaCO , pulvérisé, de qualité analytique) Environ 0,3 à 1,0.
pour ramener le pH du sol artificiel humide à 6,0 ± 0,5.
Le sol artificiel doit être préparé au moins 2 jours avant le début de l’essai, en mélangeant parfaitement
les constituants secs, indiqués ci-dessus, dans un mélangeur de laboratoire de grande dimension.
La quantité de carbonate de calcium exigée peut varier en fonction des propriétés de chaque lot
(en particulier de la tourbe) et il convient de la déterminer en mesurant des sous-échantillons
immédiatement avant l’essai.
Il est nécessaire de stocker le sol artificiel mélangé à température ambiante pendant 2 jours au moins,
afin d’en équilibrer l’acidité. Pour déterminer le pH et la capacité de rétention d’eau maximale, le sol
artificiel sec est préhumidifié 1 ou 2 jours avant le début de l’essai, en ajoutant de l’eau déionisée, afin
d’obtenir la moitié de la teneur en eau finale exigée de 50 % à 60 % de la capacité de rétention d’eau
maximale.
La valeur du pH doit être mesurée conformément à l’ISO 10390. Si la valeur du pH mesurée ne se trouve
pas dans la plage exigée, il est nécessaire d’ajouter une quantité suffisante de CaCO ou de préparer
un nouveau lot de sol artificiel. La capacité de rétention d’eau maximale du sol artificiel doit être
déterminée conformément à l’ISO 11274 ou à l’ISO 11269-2:2012, Annexe C.
6.3.3 Sol naturel
Déterminer les paramètres suivants pour le sol naturel sélectionné qui doit être passé au tamis de
4 mm afin d’en extraire les fragments de grosse taille:
— pH, conformément à l’ISO 10390;
— capacité de rétention d’eau conformément à l’ISO 11274 ou à l’ISO 11269-2:2012, Annexe C;
— teneur en eau conformément à l’ISO 11465;
— teneur en matière organique conformément à l’ISO 10694.
Il est aussi recommandé de déterminer la capacité d’échange cationique conformément à l’ISO 11260.
6.4 Nourriture
La nourriture doit être fournie sous forme de farine avec son taux d’humidité naturel (de 5 % à 10 %).
Afin que la croissance soit suffisante, il est recommandé d’effectuer les essais avec une nourriture
à base de farine comprenant des céréales, du fourrage, des sels minéraux et des vitamines couvrant
convenablement les besoins des escargots. Un exemple de composition de la nourriture est fourni dans
l’Annexe C.
7 Appareillage
Le matériel de laboratoire habituel et ce qui suit.
7.1 Récipients d’essai
Boîtes à souris jetables en polystyrène transparent) ou tout autre récipient dont le volume est égal à 1,6 l
[dimensions approximatives recommandées: 24 cm (longueur) × 10,5 cm (largeur) × 8 cm (hauteur)].
7.2 Récipients de nourriture
Boîtes de Petri de 5,5 cm de diamètre environ et de 1 cm de hauteur environ ou tout autre récipient de
dimensions équivalentes.
7.3 Pied à coulisse, d’une précision de 0,1 mm.
7.4 Balances
Une balance analytique d’une précision de 1 mg au moins. Deux autres balances, l’une avec une précision
de 0,1 g, l’autre avec une précision de 1 g.
8 Stockage et préparation des échantillons
8.1 Sol à soumettre à essai
Les échantillons de sol reçus au laboratoire doivent être stockés selon l’ISO 18400-206.
L’échantillon de sol soumis à l’essai doit être passé au tamis de 4 mm afin d’en extraire les fragments
de grande taille.
Il est nécessaire de déterminer, pour chaque sol, les mêmes caractéristiques que pour le sol naturel
(voir 6.3.3) qui peut être utilisé comme témoin ou comme substrat de dilution.
8.2 Déchets
Les échantillons de déchets reçus au laboratoire doivent être stockés conformément à l’EN 14735
[moins de 2 mois à (4 ± 3) °C].
Pour les essais, la granulométrie des déchets doit être inférieure à 4 mm. Si tel n’est pas le cas, il est
nécessaire de réduire la granulométrie des déchets de telle manière que toutes les particules traversent
un tamis de 4 mm .
9 Mode opératoire
9.1 Préparation de l’essai
9.1.1 Sélection des concentrations à soumettre à essai
9.1.1.1 Essai préliminaire
Cet essai est réalisé avec une vaste plage de concentrations.
— Quatre concentrations de la substance ou de la préparation et un témoin (par exemple 0 mg/kg;
50 mg/kg; 100 mg/kg; 500 mg/kg et 1 000 mg/kg de substrat d’essai) avec cinq escargots par
concentration et par récipient. L’essai préliminaire peut être effectué sans répétition.
— Quatre pourcentages de la matrice étudiée et un témoin (par exemple 0 %; 12,5 %; 25 %; 50 % et
100 %) avec cinq escargots par pourcentage et par récipient. L’essai préliminaire peut être effectué
sans répétition.
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9.1.1.2 Essai définitif
Sélectionner une plage de cinq concentrations au moins de la substance d’essai, préparation ou matrice
avec une progression géométrique, de manière à couvrir et à dépasser la plage des concentrations
ou des pourcentages qui n’ont pas eu d’effet, lors de l’essai préliminaire, sur la croissance ou qui l’ont
complètement inhibée. Le facteur de cette progression géométrique ne doit pas être supérieur à 2, de
préférence.
Si le facteur est supérieur à 2, il est nécessaire d’avoir à disposition deux concentrations pour lesquelles
l’effet observé est compris entre 10 % et 90 %.
Trois répétitions par concentration sont effectuées pour l’essai définitif.
9.1.2 Préparation des mélanges d’essai
9.1.2.1 Généralités
Le mélange d’essai (voir 3.3) comprend le substrat d’essai et la substance d’essai, la préparation ou la
matrice. Préparer une quantité suffisante de mélange d’essai pour recouvrir le fond du récipient d’essai
d’une couche de mélange d’essai d’au moins 1 cm.
Si la substance d’essai est utilisée à l’état brut (c’est-à-dire sans déshydratation préalable à l’utilisation),
prendre en considération son taux d’humidité de manière à exprimer les concentrations en
milligrammes de substance ou de préparation par kilogramme de substrat d’essai sec et, dans le cas
des matrices, en pourcentage de masse de la matrice (exprimé en masse sèche) dans le mélange d’essai
(exprimé en masse sèche).
9.1.2.2 Substances et préparations solubles dans l’eau ou émulsifiables
Pour chaque concentration étudiée, dissoudre la quantité adéquate de substance d’essai ou de
préparation exigée pour l’obtention de la concentration souhaitée dans la même eau (6.1) que celle
utilisée pour humidifier le substrat d’essai. Vaporiser la solution sur le substrat d’essai sec ou brut (6.3),
puis mélanger soigneusement.
Le mélange d’essai définitif doit présenter un taux d’humidité correspondant à 50 % à 60 % de sa
capacité de rétention d’eau totale (déterminée conformément à l’ISO 11274 ou conformément à
l’ISO 11269-2:2012, Annexe C).
Mesurer le pH pour chacune des concentrations d’essai conformément à l’ISO 10390.
Procéder de même pour le traitement du témoin, hormis l’ajout de substance d’essai ou de préparation.
Poursuivre l’essai comme spécifié en 9.2.
9.1.2.3 Substances et préparations insolubles dans l’eau, mais solubles dans des solvants
organiques
Dissoudre la quantité adéquate de substance d’essai ou de préparation exigée pour l’obtention de la
concentration souhaitée dans un solvant volatil (du méthanol ou de l’acétone, par exemple). Vaporiser la
solution obtenue sur le substrat d’essai sec ou brut (6.3). Mélanger le tout soigneusement puis laisser le
solvant organique s’évaporer sous hotte aspirante pendant 24 h.
Humidifier le mélange avec de l’eau (6.1) à hauteur de 50 % à 60 % de sa capacité de rétention d’eau
totale (déterminée conformément à l’ISO 11274 ou conformément à l’ISO 11269-2:2012, Annexe C), puis
mélanger soigneusement.
Mesurer le pH pour chacune des concentrations d’essai conformément à l’ISO 10390.
Procéder de même pour le traitement du témoin, hormis l’ajout de substance d’essai ou de préparation.
Poursuivre l’essai comme spécifié en 9.2.
9.1.2.4 Substances et préparations insolubles à la fois dans l’eau et dans les solvants
organiques
Lorsqu’une substance ou une préparation est insoluble dans un solvant volatil, préparer un mélange de
10 g de sable quartzeux industriel (voir 6.3.2) (prélevé au préalable de la quantité de sable exigée pour
la préparation du substrat d’essai) et de la quantité de substance d’essai ou de préparation exigée pour
obtenir la concentration souhaitée. Transférer le mélange obtenu dans un récipient contenant le substrat
d’essai sec ou brut (6.3) (hormis les 10 g utilisés pour la contamination). Mélanger soigneusement.
Humidifier le mélange avec de l’eau (6.1) à hauteur de 50 % à 60 % de sa capacité de rétention d’eau
totale (déterminée conformément à l’ISO 11274 ou conformément à l’ISO 11269-2:2012, Annexe C), puis
mélanger soigneusement.
Mesurer le pH pour chacune des concentrations d’essai conformément à l’ISO 10390.
Procéder de même pour le traitement du témoin, hormis l’ajout de substance d’essai ou de préparation.
Poursuivre l’essai comme spécifié en 9.2.
9.1.2.5 Matrice
Des proportions croissantes de la matrice d’essai sont mélangées au substrat d’essai sec ou brut (6.3)
(par exemple 0 %; 12,5 %; 25 %; 50 %; 100 %).
Le traitement du témoin correspond à 0 % de matrice d’essai, c’est-à-dire 100 % de sol artificiel
(voir 6.3.2) ou de sol naturel (voir 6.3.3).
Humidifier le mélange avec de l’eau (6.1) à hauteur de 50 % à 60 % de sa capacité de rétention d’eau
totale (déterminée conformément à l’ISO 11274 ou conformément à l’ISO 11269-2:2012, Annexe C), puis
mélanger soigneusement. (L’eau ajoutée correspond au volume d’eau exigé pour réhydrater la quantité
de substrat d’essai du mélange et au volume d’eau exigé pour réhydrater la quantité de matrice du
mélange.)
S’il est nécessaire de réduire l’humidité des matrices, réaliser la déshydratation en plein air ou dans
une étuve de séchage sans dépasser une température de 30 °C, afin de limiter la perte de substances
volatiles.
Mesurer le pH pour chacune des concentrations d’essai conformément à l’ISO 10390.
Poursuivre l’essai comme spécifié en 9.2.
9.2 Répartition du mélange d’essai
En préparation de l’essai, ajouter une quantité suffisante de mélange d’essai (voir 9.1.2) dans les
récipients d’essai (7.1) pour remplir les fonds des récipients d’essai sur une hauteur d’au moins 1 cm.
NOTE Si le substrat d’essai (6.3) est un sol artificiel, la quantité de mélange d’essai est d’environ 140 g (masse
sèche) pour chaque récipient d’essai.
Égaliser la surface du mélange d’essai et compacter légèrement le sol.
9.3 Introduction de la nourriture
Placer le récipient (7.2) contenant la nourriture (6.4) sur le fond du récipient d’essai (7.1). La nourriture
doit être administrée ad libitum.
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9.4 Introduction du réactif biologique
Sélectionner cinq escargots (6.2) au hasard pour chaque récipient d’essai (7.1).
9.5 Manipulations pendant les essais
9.5.1 Généralités
Pendant les deux premières semaines de l’essai, recouvrir les récipients d’une plaque transparente
perforée [par exemple en polyalkylméthacrylate (Plexiglas) mesurant environ 26,5 cm × 13,5 cm]
maintenue en place à l’aide d’un dispositif approprié. Pendant les deux semaines suivantes, utiliser
un deuxième récipient (7.1) renversé pour former le couvercle. Cette disposition permet de doubler le
volume de l’enceinte d’essai et d’éviter un effet de groupe négatif sur la croissance des escargots (voir la
Figure B.2).
NOTE Il est possible de perforer la plaque et le récipient utilisés pour couvrir les récipients d’essai de 3 à 4
trous de diamètre inférieur à 2 mm.
Placer les récipients d’essai avec les escargots dans les conditions de l’essai (voir l’Article 5). Les
observer régulièrement et noter toute anomalie pouvant interférer avec le déroulement de l’essai.
9.5.2 Soins de routine
Pour chaque récipient d’essai, effectuer les opérations suivantes trois fois par semaine (par exemple le
lundi, le mercredi et le vendredi):
— à l’aide d’une spatule, extraire régulièrement les excréments déposés sur le mélange d’essai, afin
d’éviter leur accumulation et le développement de moisissures;
— nettoyer les parois latérales du récipient avec du papier absorbant humecté avec de l’eau (6.1)
et nettoyer le couvercle avec de l’eau du robinet, puis le sécher et l’humecter de nouveau avec de
l’eau (6.1);
— humidifier le mélange d’essai (voir 9.1.2) en vaporisant de l’eau (6.1) à hauteur de 50 % à 60 % de sa
capacité de rétention d’eau. Pour s’assurer que le taux d’humidité du mélange d’essai reste de 50 % à
60 % tout au long de la durée de l’essai, il est possible de préparer un récipient dépourvu d’escargots
qui sera régulièrement pesé pour estimer la quantité d’eau à pulvériser dans les récipients d’essai;
— renouveler la nourriture (6.4).
Il est recommandé d’effectuer les opérations décrites ci-dessus, si possible, à heures régulières (le
matin ou l’après-midi).
Noter la mortalité, le cas échéant.
9.5.3 Tâche hebdomadaire
S’il est nécessaire de déterminer les effets tous les sept jours (facultatif, voir l’Article 4), les escargots
sont pesés et mesurés chaque semaine. Sinon, les escargots ne sont pesés et mesurés qu’à la fin de l’essai
(28 jours).
Tous les 7 jours:
— avant de changer la nourriture et de nettoyer les parois latérales et le couvercle, peser les escargots
individuellement (avec une précision de 0,1 g) et mesurer le diamètre de la coquille (avec une
précision de 0,1 mm); voir la Figure 1;
— remplacer le mélange d’essai (voir 9.1.2) par un mélange fraîchement préparé.
Figure 1 — Mesure du diamètre de la coquille, c’est-à-dire la plus longue dimension qui peut
être mesurée (flèche blanche sur la photo)
La masse des escargots peut être faussée si du substrat d’essai adhère à la coquille ou sur le pied des
escargots. Avant chaque pesée, débarrasser la coquille ou le pied de tout substrat à l’aide d’une spatule.
Il est possible de laisser les escargots se déplacer sur le couvercle propre du récipient ou sur du papier
légèrement humecté, de manière à débarrasser leur pied de toute trace de substrat collé.
Relever les symptômes évidents ou pathologiques observés chez les escargots (par exemple production
excessive de mucus, corps œdémateux étendu, tentacules oculaires tombants, comme décrit dans les
Références [12] ou [42]), ou toute modification perceptible du comportement (par exemple léthargie
sur le mélange d’essai, manque d’alimentation).
À la fin de l’essai, le pH doit être mesuré pour un récipient témoin et pour un récipient pour chacune des
concentrations selon l’ISO 10390. Il est recommandé de mesurer le pH de tout récipient dans lequel le
taux de mortalité ou la croissance sort de l’ordinaire.
Facultatif: à la fin de l’essai (28 jours), après la pesée finale et le mesurage final du diamètre de la coquille,
laisser les escargots de chaque récipient jeûner pendant 48 h dans des boîtes humides, dépourvues de
substrat d’essai (jusqu’à ce qu’ils n’excrètent plus), puis les surgeler en vue d’une analyse éventuelle de
la concentration de contaminants présents dans leurs tissus ou organes.
10 Substance de référence
Un essai du témoin est régulièrement effectué avec une substance de référence afin de contrôler la
survenue de changements dans la sensibilité des organismes d’essai.
NOTE Il a été démontré par expérience que le chlorure de cadmium convient en tant que substance de
référence.
Déterminer régulièrement les valeurs de la CE (28 jours) et de la CE (28 jours) pour le chlorure
50,m 50,d
de cadmium, en appliquant le protocole décrit dans la présente Norme internationale.
AVERTISSEMENT — Il convient de prendre les précautions nécessaires pour la manipulation du
chlorure de cadmium qui est une substance nocive.
La CE (28 jours) du CdCl doit être comprise entre 350 mg et 650 mg de Cd par kg de substrat
50,m 2
d’essai sec.
La CE (28 jours) du CdCl doit être comprise entre 500 mg et 800 mg de Cd par kg de substrat
50,d 2
d’essai sec.
Noter les valeurs obtenues ainsi que la date de leur obtention dans le rapport d’essai.
En 2000, quatre laboratoires ont participé à un essai interlaboratoires portant sur le chlorure de
cadmium. Les résultats sont indiqués dans le Tableau 2 (voir aussi Référence [52]).
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Tableau 2 — Résultats de l’essai interlaboratoires avec Helix aspersa aspersa (contamination du
substrat; méthode semi-statique)
CE (28 jours) CE (28 jours)
50,m 50,d
Substance
mg Cd/kg mg Cd/kg
Moyenne Plage Moyenne Plage
CdCl 500 398 à 622 600 507 à 781
11 Calculs et expression des résultats
11.1 Calculs
Pour chaque concentration, déterminer le pourcentage de mortalité, le cas échéant, au moment de
l’essai définitif.
À la fin de l’essai (28 jours) (facultatif: chaque semaine), calculer les masses moyennes et le diamètre
moyen de la coquille, ainsi que les écarts-types associés, pour les escargots de chaque récipient et pour
c
...

ISO/TC 190/SC 4
Deleted: 05‐12
Date: 2018‐06
Deleted: /FDIS
ISO/TC 190/SC 4
Secrétariat: AFNOR
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des escargots juvéniles (Helicidae)
— Détermination des effets sur la croissance par contamination du sol
Soil quality — Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) — Determination of
the effects on growth by soil contamination
Type du document : Norme internationale
Sous‐type du document :
Stade du document : (50) Approbation
Langue du document : F
Deleted: /FDIS
Avant-propos
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nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le
droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
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L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
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Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
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Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/avant‐propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous‐comité SC 4,
Caractérisation biologique.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 15952:2006), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
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ii
Deleted: /FDIS
Introduction
En raison du nombre limité de données disponibles sur la toxicité des contaminants sur les organismes
vivant dans le sol, l’écotoxicité des sols et des déchets sont très préoccupants tant au niveau national
qu’au niveau international. Les essais actuellement disponibles utilisent les organismes de la faune du
sol limités aux embranchements annélides (vers de terre et Enchytraeidae) et des arthropodes
(insectes: Collemboles et Coléoptères). Parmi ces derniers, deux normes évaluent la toxicité aiguë (vers
[6]
de terre (ISO 11268‐1) et larves de coléoptères et trois autres normes traitent des effets sublétaux des
[3] [2] [4]
contaminants du sol sur la reproduction (vers de terre, Collemboles, Enchytraeidae ). Dans les
cycles biologiques des organismes, il semble que la croissance est, tout comme la reproduction, un
paramètre écophysiologique fondamental à prendre en considération pour la viabilité des espèces et
[38]
des écosystèmes .
Les escargots sont des indicateurs écologiques pertinents pour l’évaluation de la qualité des sols (voir
Références [16], [18] à [20], [32], [33], [40] à [42]), étant donné qu’ils sont caractéristiques de la couche
superficielle du sol (saprophages et phytophages) et qu’une grande partie de leur cycle biologique a lieu
[7][18][29]
dans le sol (ponte, éclosion, premiers stades du développement, hibernation, etc.). Pendant les
autres phases de leur cycle, ils ingèrent du sol et sont en contact avec celui‐ci par l’intermédiaire de leur
sole pédieuse humide (pied), recouverte de mucus, et participent aux échanges permanents avec le sol
(eau, sels minéraux, excréments, puis finalement la coquille et la matière organique quand ils
[7][18][31]
meurent). De plus, ils représentent un lien important entre les plantes, la faune et les micro‐
organismes du sol. Ils répondent pleinement aux critères d’un bon indicateur biologique: faciles à
collecter et à identifier, ils présentent une large répartition, ils accumulent les contaminants (voir
Références [9], [11] à [15], [17], [18], [22], [24], [29], [30], [33] à [48]), leurs caractéristiques
[7],[10],[32]
écologiques et physiologiques sont bien connues et ils sont, à présent, faciles à élever dans des
[22][26][32]
conditions contrôlées. Leur sensibilité aux contaminants courants dans leur environnement a
été démontrée (voir Références [11] à [16], [19] à [28], [30], [33] à [38], [37] à [48]).
La présente Norme internationale décrit une méthode pour déterminer les effets sur la survie et la
croissance des escargots juvéniles de substances, de préparations (c’est‐à‐dire un mélange ou une
solution composé d’au moins deux substances), de sols ou de déchets ajoutés à un sol artificiel ou
naturel. La méthode décrite est donc applicable aux essais de sols contaminés ou à la comparaison de
différents sols non contaminés. L’espèce recommandée est Helix aspersa aspersa Müller (aussi
communément appelée: escargot petit‐gris, escargot de jardin, Petit‐Gris; synonymes: Cantareus
[56]
aspersus, Cornu aspersum ). Parmi les escargots terrestres (mollusques gastéropodes pulmonés
stylommatophores de la famille Helicidae), Helix aspersa aspersa Müller est le plus répandu. Cette
espèce paléarctique peut s’acclimater à des régions présentant des climats de types différents:
méditerranéen, océanique tempéré, continental tempéré, voire tropical. Helix aspersa aspersa Müller est
d’origine européenne et a été introduit dans le monde entier. Ces escargots se trouvent à présent sur
[10]
tous les continents hormis l’Antarctique .
Dans leur environnement naturel, les escargots assimilent les contaminants par contact (avec des
substrats variés tels que le sol, les lixiviats du sol et la litière végétale), par ingestion (de plantes et de
[7][29]
sol), de même que par les voies respiratoires. Ainsi, pour des objectifs particuliers (évaluation de la
toxicité d’un pesticide, par exemple), une autre méthode d’essai basée sur l’exposition par ingestion
d’aliments est disponible en option (Annexe F et Référence [6]).
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iii
Deleted: PROJET FINAL DE
NORME INTERNATIONALE ISO 15952:2018(F)
Deleted: /FDIS
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des escargots
juvéniles (Helicidae) — Détermination des effets sur la
croissance par contamination du sol
1 Domaine d’application
Le présent document s’applique à une méthode semi‐statique pour la détermination des effets de
contaminants sur la croissance et la survie d’escargots juvéniles, généralement Helix aspersa aspersa
Müller. Les animaux sont exposés par les voies cutanée et digestive à un substrat d’essai (sol artificiel
ou naturel selon l’objectif de l’étude) auquel sont ajoutées des quantités définies:
— de substances, de mélanges ou de préparations;
— de sols (contaminés ou de qualité inconnue) ou de déchets.
Cet essai prend en considération les changements éventuels de la substance d’essai, de la préparation,
du sol ou des déchets, étant donné que les mélanges d’essai sont préparés et renouvelés chaque
semaine pendant la période d’essai de 28 jours.
Il est admis de mettre en œuvre une méthode statique en sus de la méthode semi‐statique (facultatif).
Cette méthode est décrite dans l’Annexe A.
Cette méthode ne s’applique pas aux substances dont le coefficient de partage air/sol est supérieur à 1,
ou pour lesquelles la pression de vapeur est supérieure à 300 Pa à 25 °C.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements)
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
Deleted: ISO 10390, Qualité
du sol — Détermination du
pH¶
ISO 18400‐206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206: Lignes directrices pour la collecte, la

manipulation et la conservation de sols destinés à l’évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et
structurels en laboratoire
Deleted:
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche Deleted: ISO 10694, Qualité
du sol — Dosage du carbone
(analyse élémentaire)
organique et du carbone total après
combustion sèche (analyse
ISO 11268‐1, Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre — Partie 1: Détermination de
élémentaire)¶
la toxicité aiguë vis-à-vis de Eisenia fetida/Eisenia andrei

Deleted:
ISO 11269‐2:2012, Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du sol — Partie 2:
Deleted:
Effets des sols contaminés sur l'émergence et la croissance des végétaux supérieurs
Deleted:
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ISO 11274, Qualité du sol — Détermination de la caractéristique de la rétention en eau — Méthodes de Deleted: ISO 11274, Qualité du sol —
Détermination de la caractéristique de la
laboratoire
rétention en eau — Méthodes de
laboratoire¶
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
ISO 11465, Qualité du sol —
gravimétrique
Détermination de la teneur pondérale en
matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique¶
EN 14735, Caractérisation des déchets — Préparation des échantillons de déchets en vue d’essais
EN 14735, Caractérisation des
écotoxicologiques
déchets — Préparation des échantillons de
déchets en vue d’essais
3 Termes et définitions
écotoxicologiques¶
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http://www.electropedia.org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https://www.iso.org/obp
3.1
substrat d’essai
sol artificiel ou sol naturel utilisé comme témoin et comme substrat de dilution
3.2
matrice
sol ou déchet soumis à l’essai
3.3
mélange d’essai
mélange de la substance d’essai, de la préparation ou de la matrice avec le substrat d’essai (3.1)
3.4
croissance
augmentation de la biomasse, c’est‐à‐dire de la masse fraîche totale (corps et coquille) des
organismes entre le début et la fin de l’essai
Note 1 à l’article: Elle s’exprime sous forme d’un coefficient de croissance k .
CC,m
3.5
croissance
augmentation du diamètre maximal de la coquille entre le début et la fin de l’essai
Note 1 à l’article: Elle est exprimée sous forme d’un coefficient de croissance k .
CC,d
3.6
concentration efficace
CEx
concentration à laquelle est décelé un effet spécifique; x est le pourcentage (10, 25, 50) de cet effet, par
exemple inhibition de la croissance
EXEMPLE CE est la concentration estimée pour réduire la croissance, à la fin de l’essai, de 50 % par rapport
au témoin (CE et CE pour la croissance de la biomasse et de la coquille, respectivement).
50,m 50,d
3.7
concentration létale médiane
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CL
concentration de la substance d’essai, de la préparation présente à l’origine ou concentration de la
matrice entraînant la mort de 50 % des escargots soumis à l’essai
3.8
concentration minimale avec effet observé
CMEO
concentration la plus basse soumise à l’essai, à laquelle il est observé que la substance d’essai a un effet
statistiquement significatif (p < 0,05) par rapport au témoin
Note 1 à l’article: Toutes les concentrations d’essai supérieures à la CMEO ont un effet nocif supérieur ou égal à
ceux observés à la CMEO. Lorsqu’il n’est pas possible de satisfaire ces deux conditions, il convient d’expliquer dans
le détail comment a été sélectionnée la CMEO (et par conséquent la CSEO).
3.9
concentration sans effet observable
CSEO
concentration de l’essai immédiatement inférieure à la CMEO, qui, lorsqu’elle est comparée à celle du
témoin, ne produit aucun effet statistiquement significatif (p > 0,05) pendant un temps d’exposition
donné
Note 1 à l’article: La CSEO est la concentration immédiatement inférieure à la CMEO.
Note 2 à l’article: Dans le cas de 3.6, 3.7, 3.8 et 3.9, les résultats sont exprimés:
— en masse sèche de la substance d’essai ou de la préparation par masse sèche du substrat d’essai (3.1);
— en pourcentage de la masse de la matrice soumise à l’essai dans le mélange d’essai (exprimé en masse sèche).
4 Principe
Des escargots terrestres juvéniles (généralement Helix aspersa aspersa Müller) sont exposés pendant
une période de 28 jours à des mélanges d’essai contenant la substance d’essai, la préparation ou la
matrice à différentes concentrations. Les mélanges d’essai sont fraîchement préparés et renouvelés tous
les 7 jours.
En fonction des objectifs de l’étude, les mélanges d’essai peuvent être préparés avec du sol
artificiel (6.3.2) ou un sol naturel adapté (6.3.3).
Pendant l’essai, les escargots sont nourris avec un aliment non contaminé.
Les effets sur la croissance (biomasse et diamètre de la coquille) et sur la survie sont mesurés après
28 jours d’exposition (facultativement, les effets peuvent être mesurés tous les 7 jours pendant
28 jours).
Les résultats obtenus au cours de l’essai sont comparés avec ceux d’un témoin afin de déterminer la
CSEO ou la CMEO et ils permettent d’estimer la concentration qui réduit la croissance des escargots de
50 % en l’espace de 28 jours par rapport à la masse fraîche [CE (28 jours)] et au diamètre de la
50,m
coquille [CE (28 jours)] ou à d’autres valeurs de CE.
50,d x
Si les concentrations sélectionnées provoquent des effets létaux, les résultats obtenus au cours de
l’essai sont comparés à ceux d’un témoin et sont utilisés pour estimer la concentration qui entraîne la
mort de 50 % des escargots [CL (28 jours)].
Dans des cas particuliers, il est possible de déterminer (facultatif) certains paramètres (CEx, CSEO,
CMEO, CL ) après des périodes d’exposition inférieures à 28 jours (7 jours, 14 jours ou 21 jours).
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L’essai comprend deux étapes:
— un essai préliminaire dont le but est de déterminer aussi bien la concentration sans effet
observable (CSEO) que l’inhibition totale de la croissance. La relation dose/effet obtenue est
importante pour la conception correcte de l’essai définitif;
— un essai définitif spécifiant les concentrations entraînant une inhibition de 10 % à 90 % de la
croissance. Il n’est pas nécessaire d’effectuer un essai définitif lorsque l’essai préliminaire n’a pas
révélé d’effets inhibiteurs à la concentration maximale soumise à essai.
5 Environnement de l’essai
L’essai doit être réalisé à une température de (20 ± 2) °C avec une photopériode jour‐nuit de 18 h à 6 h.
L’intensité lumineuse (lumière artificielle de type lumière du jour), sans lumière naturelle dans les
récipients d’essai, doit être de 50 lx à 100 lx.
6 Réactifs
6.1 Eau, de pureté minimum déionisée.
6.2 Matériel biologique
Les organismes d’essai doivent être des escargots juvéniles. L’espèce recommandée est Helix aspersa
aspersa Müller (également connue sous les noms de Cantareus aspersus et de Cornu aspersum), dont les
individus doivent être âgés de 3 à 5 semaines et présenter une masse fraîche moyenne de (1 ± 0,3) g et
un diamètre de coquille de (15,5 ± 1) mm.
NOTE Il est possible d’utiliser un autre genre et/ou une autre espèce d’Helicidae (voir les exemples et les
conditions dans l’Annexe G).
Les escargots doivent être sélectionnés à partir d’un élevage synchrone afin d’obtenir une population la
plus homogène possible au regard de la taille, de la masse et de l’âge. Les techniques d’élevage des
escargots sont décrites dans l’Annexe B. Après une période de nursery (de 3 à 5 semaines, voir
l’Annexe B), les escargots juvéniles doivent être utilisés après une période d’estivation d’au moins
1 semaine et de 5 mois au plus. L’estivation a lieu dans des boîtes rondes en bois (diamètre de 12 cm et
hauteur de 4 cm environ), les escargots étant soumis à des conditions sèches à une température de
17 °C à 20 °C.
De deux à trois jours avant de commencer l’essai, les escargots doivent être réveillés par une
pulvérisation d’eau (6.1) dans les boîtes ayant servi à l’estivation. La proportion d’escargots non
réveillés doit être inférieure à 10 %. Dès que les escargots reprennent leur activité (ils se décollent des
parois de la boîte et commencent à se déplacer), ils doivent être transférés dans un récipient d’essai
(7.1) ayant été préalablement humidifié avec de l’eau (6.1). Le fond de cette boîte est soit recouvert de
papier absorbant ayant aussi été humidifié, soit contenir du substrat d’essai (6.3) humidifié de 50 % à
60 % de sa capacité de rétention d’eau. Il est nécessaire de nourrir les escargots (6.4) entre le moment
du réveil et le début de l’essai (de 2 à 3 jours).
6.3 Substrat d’essai
6.3.1 Généralités
En fonction des objectifs de l’étude, le substrat d’essai peut être préparé avec du sol artificiel (voir 6.3.2)
ou un sol naturel adapté (voir 6.3.3). Le substrat d’essai peut être utilisé sec ou brut (c’est‐à‐dire sans
déshydratation préalable à l’utilisation pour le sol naturel).
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Il est admis d’utiliser un sol artificiel en tant que témoin et substrat de dilution pour évaluer l’effet
d’une substance ou d’une préparation, pour comparer différents sols ou déchets ou pour déterminer les
effets d’un sol contaminé.
Il est admis d’utiliser un sol naturel (sol d’un champ) en tant que témoin et substrat de dilution pour
évaluer, par exemple, l’effet de l’incorporation de boues de stations d’épuration d’eaux usées dans le sol
d’un champ ou pour soumettre à essai l’effet d’un sol contaminé (dans ce cas, il est recommandé
d’utiliser un sol non contaminé, comparable à l’échantillon de sol soumis à essai).
6.3.2 Sol artificiel
Le sol artificiel doit présenter la composition suivante (telle que définie par l’ISO 11268‐1).
Voir Tableau 1.
Tableau 1 — Composition du sol artificiel
Composition Pourcentage exprimé en masse sèche
Tourbe de sphaigne séchée à l’air et finement moulue (2 ± 1) mm,
dépourvue de résidus végétaux visibles.
Argile à kaolinite, contenant de préférence au moins 30 % de
kaolinite.
Sable quartzeux industriel séché à l’air (prédominance de sable fin Environ 69 % (en fonction de la quantité
avec plus de 50 % de la masse présentant une granulométrie nécessaire de CaCO).
comprise entre 0,05 mm et 0,2 mm).
Carbonate de calcium (CaCO3, pulvérisé, de qualité analytique) Environ 0,3 à 1,0.
pour ramener le pH du sol artificiel humide à 6,0 ± 0,5.
Le sol artificiel doit être préparé au moins 2 jours avant le début de l’essai, en mélangeant parfaitement
les constituants secs, indiqués ci‐dessus, dans un mélangeur de laboratoire de grande dimension. La
quantité de carbonate de calcium exigée peut varier en fonction des propriétés de chaque lot (en
particulier de la tourbe) et il convient de la déterminer en mesurant des sous‐échantillons
immédiatement avant l’essai.
Il est nécessaire de stocker le sol artificiel mélangé à température ambiante pendant 2 jours au moins,
afin d’en équilibrer l’acidité. Pour déterminer le pH et la capacité de rétention d’eau maximale, le sol
artificiel sec est préhumidifié 1 ou 2 jours avant le début de l’essai, en ajoutant de l’eau déionisée, afin
d’obtenir la moitié de la teneur en eau finale exigée de 50 % à 60 % de la capacité de rétention d’eau
maximale.
La valeur du pH doit être mesurée conformément à l’ISO 10390. Si la valeur du pH mesurée ne se trouve
pas dans la plage exigée, il est nécessaire d’ajouter une quantité suffisante de CaCO ou de préparer un
nouveau lot de sol artificiel. La capacité de rétention d’eau maximale du sol artificiel doit être
déterminée conformément à l’ISO 11274 ou à l’ISO 11269‐2:2012, Annexe C.
6.3.3 Sol naturel
Déterminer les paramètres suivants pour le sol naturel sélectionné qui doit être passé au tamis de
4 mm afin d’en extraire les fragments de grosse taille:
— pH, conformément à l’ISO 10390;
— capacité de rétention d’eau conformément à l’ISO 11274 ou à l’ISO 11269‐2:2012, Annexe C;
— teneur en eau conformément à l’ISO 11465;
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— teneur en matière organique conformément à l’ISO 10694.
Il est aussi recommandé de déterminer la capacité d’échange cationique conformément à l’ISO 11260.
6.4 Nourriture
La nourriture doit être fournie sous forme de farine avec son taux d’humidité naturel (de 5 % à 10 %).
Afin que la croissance soit suffisante, il est recommandé d’effectuer les essais avec une nourriture à
base de farine comprenant des céréales, du fourrage, des sels minéraux et des vitamines couvrant
convenablement les besoins des escargots. Un exemple de composition de la nourriture est fourni dans
l’Annexe C.
7 Appareillage
Le matériel de laboratoire habituel et ce qui suit.
7.1 Récipients d’essai
)
Boîtes à souris jetables en polystyrène transparent ou tout autre récipient dont le volume est égal à
1,6 l [dimensions approximatives recommandées: 24 cm (longueur) × 10,5 cm (largeur) × 8 cm
(hauteur)].
7.2 Récipients de nourriture
Boîtes de Petri de 5,5 cm de diamètre environ et de 1 cm de hauteur environ ou tout autre récipient de
dimensions équivalentes.
7.3 Pied à coulisse, d’une précision de 0,1 mm.
7.4 Balances
Une balance analytique d’une précision de 1 mg au moins. Deux autres balances, l’une avec une
précision de 0,1 g, l’autre avec une précision de 1 g.
8 Stockage et préparation des échantillons
8.1 Sol à soumettre à essai
Les échantillons de sol reçus au laboratoire doivent être stockés selon l’ISO 18400‐206.
L’échantillon de sol soumis à l’essai doit être passé au tamis de 4 mm afin d’en extraire les fragments
de grande taille.
Il est nécessaire de déterminer, pour chaque sol, les mêmes caractéristiques que pour le sol naturel
(voir 6.3.3) qui peut être utilisé comme témoin ou comme substrat de dilution.
8.2 Déchets
Les échantillons de déchets reçus au laboratoire doivent être stockés conformément à l’EN 14735
[moins de 2 mois à (4 ± 3) °C].
Pour les essais, la granulométrie des déchets doit être inférieure à 4 mm. Si tel n’est pas le cas, il est
nécessaire de réduire la granulométrie des déchets de telle manière que toutes les particules traversent
un tamis de 4 mm.
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9 Mode opératoire
9.1 Préparation de l’essai
9.1.1 Sélection des concentrations à soumettre à essai
9.1.1.1 Essai préliminaire
Cet essai est réalisé avec une vaste plage de concentrations.
— Quatre concentrations de la substance ou de la préparation et un témoin (par exemple 0 mg/kg;
50 mg/kg; 100 mg/kg; 500 mg/kg et 1 000 mg/kg de substrat d’essai) avec cinq escargots par
concentration et par récipient. L’essai préliminaire peut être effectué sans répétition.
— Quatre pourcentages de la matrice étudiée et un témoin (par exemple 0 %; 12,5 %; 25 %; 50 % et
100 %) avec cinq escargots par pourcentage et par récipient. L’essai préliminaire peut être effectué
sans répétition.
9.1.1.2 Essai définitif
Sélectionner une plage de cinq concentrations au moins de la substance d’essai, préparation ou matrice
avec une progression géométrique, de manière à couvrir et à dépasser la plage des concentrations ou
des pourcentages qui n’ont pas eu d’effet, lors de l’essai préliminaire, sur la croissance ou qui l’ont
complètement inhibée. Le facteur de cette progression géométrique ne doit pas être supérieur à 2, de
préférence.
Si le facteur est supérieur à 2, il est nécessaire d’avoir à disposition deux concentrations pour lesquelles
l’effet observé est compris entre 10 % et 90 %.
Trois répétitions par concentration sont effectuées pour l’essai définitif.
9.1.2 Préparation des mélanges d’essai
9.1.2.1 Généralités
Le mélange d’essai (voir 3.3) comprend le substrat d’essai et la substance d’essai, la préparation ou la
matrice. Préparer une quantité suffisante de mélange d’essai pour recouvrir le fond du récipient d’essai
d’une couche de mélange d’essai d’au moins 1 cm.
Si la substance d’essai est utilisée à l’état brut (c’est‐à‐dire sans déshydratation préalable à l’utilisation),
prendre en considération son taux d’humidité de manière à exprimer les concentrations en
milligrammes de substance ou de préparation par kilogramme de substrat d’essai sec et, dans le cas des
matrices, en pourcentage de masse de la matrice (exprimé en masse sèche) dans le mélange d’essai
(exprimé en masse sèche).
9.1.2.2 Substances et préparations solubles dans l’eau ou émulsifiables
Pour chaque concentration étudiée, dissoudre la quantité adéquate de substance d’essai ou de
préparation exigée pour l’obtention de la concentration souhaitée dans la même eau (6.1) que celle
utilisée pour humidifier le substrat d’essai. Vaporiser la solution sur le substrat d’essai sec ou brut (6.3),
puis mélanger soigneusement.
Le mélange d’essai définitif doit présenter un taux d’humidité correspondant à 50 % à 60 % de sa
capacité de rétention d’eau totale (déterminée conformément à l’ISO 11274 ou conformément à
l’ISO 11269‐2:2012, Annexe C).
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Mesurer le pH pour chacune des concentrations d’essai conformément à l’ISO 10390.
Procéder de même pour le traitement du témoin, hormis l’ajout de substance d’essai ou de préparation.
Poursuivre l’essai comme spécifié en 9.2.
9.1.2.3 Substances et préparations insolubles dans l’eau, mais solubles dans des solvants
organiques
Dissoudre la quantité adéquate de substance d’essai ou de préparation exigée pour l’obtention de la
concentration souhaitée dans un solvant volatil (du méthanol ou de l’acétone, par exemple). Vaporiser
la solution obtenue sur le substrat d’essai sec ou brut (6.3). Mélanger le tout soigneusement puis laisser
le solvant organique s’évaporer sous hotte aspirante pendant 24 h.
Humidifier le mélange avec de l’eau (6.1) à hauteur de 50 % à 60 % de sa capacité de rétention d’eau
totale (déterminée conformément à l’ISO 11274 ou conformément à l’ISO 11269‐2:2012, Annexe C),
puis mélanger soigneusement.
Mesurer le pH pour chacune des concentrations d’essai conformément à l’ISO 10390.
Procéder de même pour le traitement du témoin, hormis l’ajout de substance d’essai ou de préparation.
Poursuivre l’essai comme spécifié en 9.2.
9.1.2.4 Substances et préparations insolubles à la fois dans l’eau et dans les solvants organiques
Lorsqu’une substance ou une préparation est insoluble dans un solvant volatil, préparer un mélange de
10 g de sable quartzeux industriel (voir 6.3.2) (prélevé au préalable de la quantité de sable exigée pour
la préparation du substrat d’essai) et de la quantité de substance d’essai ou de préparation exigée pour
obtenir la concentration souhaitée. Transférer le mélange obtenu dans un récipient contenant le
substrat d’essai sec ou brut (6.3) (hormis les 10 g utilisés pour la contamination). Mélanger
soigneusement.
Humidifier le mélange avec de l’eau (6.1) à hauteur de 50 % à 60 % de sa capacité de rétention d’eau
totale (déterminée conformément à l’ISO 11274 ou conformément à l’ISO 11269‐2:2012, Annexe C),
puis mélanger soigneusement.
Mesurer le pH pour chacune des concentrations d’essai conformément à l’ISO 10390.
Procéder de même pour le traitement du témoin, hormis l’ajout de substance d’essai ou de préparation.
Poursuivre l’essai comme spécifié en 9.2.
9.1.2.5 Matrice
Des proportions croissantes de la matrice d’essai sont mélangées au substrat d’essai sec ou brut (6.3)
(par exemple 0 %; 12,5 %; 25 %; 50 %; 100 %).
Le traitement du témoin correspond à 0 % de matrice d’essai, c’est‐à‐dire 100 % de sol artificiel
(voir 6.3.2) ou de sol naturel (voir 6.3.3).
Humidifier le mélange avec de l’eau (6.1) à hauteur de 50 % à 60 % de sa capacité de rétention d’eau
totale (déterminée conformément à l’ISO 11274 ou conformément à l’ISO 11269‐2:2012, Annexe C),
puis mélanger soigneusement. (L’eau ajoutée correspond au volume d’eau exigé pour réhydrater la
quantité de substrat d’essai du mélange et au volume d’eau exigé pour réhydrater la quantité de matrice
du mélange.)
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S’il est nécessaire de réduire l’humidité des matrices, réaliser la déshydratation en plein air ou dans une
étuve de séchage sans dépasser une température de 30 °C, afin de limiter la perte de substances
volatiles.
Mesurer le pH pour chacune des concentrations d’essai conformément à l’ISO 10390.
Poursuivre l’essai comme spécifié en 9.2.
9.2 Répartition du mélange d’essai
En préparation de l’essai, ajouter une quantité suffisante de mélange d’essai (voir 9.1.2) dans les
récipients d’essai (7.1) pour remplir les fonds des récipients d’essai sur une hauteur d’au moins 1 cm.
NOTE Si le substrat d’essai (6.3) est un sol artificiel, la quantité de mélange d’essai est d’environ 140 g (masse
sèche) pour chaque récipient d’essai.
Égaliser la surface du mélange d’essai et compacter légèrement le sol.
9.3 Introduction de la nourriture
Placer le récipient (7.2) contenant la nourriture (6.4) sur le fond du récipient d’essai (7.1). La nourriture
doit être administrée ad libitum.
9.4 Introduction du réactif biologique
Sélectionner cinq escargots (6.2) au hasard pour chaque récipient d’essai (7.1).
9.5 Manipulations pendant les essais
9.5.1 Généralités
Pendant les deux premières semaines de l’essai, recouvrir les récipients d’une plaque transparente
perforée [par exemple en polyalkylméthacrylate (Plexiglas) mesurant environ 26,5 cm × 13,5 cm]
maintenue en place à l’aide d’un dispositif approprié. Pendant les deux semaines suivantes, utiliser un
deuxième récipient (7.1) renversé pour former le couvercle. Cette disposition permet de doubler le
volume de l’enceinte d’essai et d’éviter un effet de groupe négatif sur la croissance des escargots (voir la
Figure B.2).
NOTE Il est possible de perforer la plaque et le récipient utilisés pour couvrir les récipients d’essai de 3 à 4
trous de diamètre inférieur à 2 mm.
Placer les récipients d’essai avec les escargots dans les conditions de l’essai (voir l’Article 5). Les
observer régulièrement et noter toute anomalie pouvant interférer avec le déroulement de l’essai.
9.5.2 Soins de routine
Pour chaque récipient d’essai, effectuer les opérations suivantes trois fois par semaine (par exemple le
lundi, le mercredi et le vendredi):
— à l’aide d’une spatule, extraire régulièrement les excréments déposés sur le mélange d’essai, afin
d’éviter leur accumulation et le développement de moisissures;
— nettoyer les parois latérales du récipient avec du papier absorbant humecté avec de l’eau (6.1) et
nettoyer le couvercle avec de l’eau du robinet, puis le sécher et l’humecter de nouveau avec de
l’eau (6.1);
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— humidifier le mélange d’essai (voir 9.1.2) en vaporisant de l’eau (6.1) à hauteur de 50 % à 60 % de
sa capacité de rétention d’eau. Pour s’assurer que le taux d’humidité du mélange d’essai reste de
50 % à 60 % tout au long de la durée de l’essai, il est possible de préparer un récipient dépourvu
d’escargots qui sera régulièrement pesé pour estimer la quantité d’eau à pulvériser dans les
récipients d’essai;
— renouveler la nourriture (6.4).
Il est recommandé d’effectuer les opérations décrites ci‐dessus, si possible, à heures régulières (le matin
ou l’après‐midi).
Noter la mortalité, le cas échéant.
9.5.3 Tâche hebdomadaire
S’il est nécessaire de déterminer les effets tous les sept jours (facultatif, voir l’Article 4), les escargots
sont pesés et mesurés chaque semaine. Sinon, les escargots ne sont pesés et mesurés qu’à la fin de
l’essai (28 jours).
Tous les 7 jours:
— avant de changer la nourriture et de nettoyer les parois latérales et le couvercle, peser les escargots
individuellement (avec une précision de 0,1 g) et mesurer le diamètre de la coquille (avec une
précision de 0,1 mm); voir la Figure 1;
— remplacer le mélange d’essai (voir 9.1.2) par un mélange fraîchement préparé.
Deleted: 15952_ed2fig1.eps¶
Figure 1 — Mesure du diamètre de la coquille, c’est-à-dire la plus longue dimension qui peut être
mesurée (flèche blanche sur la photo)
La masse des escargots peut être faussée si du substrat d’essai adhère à la coquille ou sur le pied des
escargots. Avant chaque pesée, débarrasser la coquille ou le pied de tout substrat à l’aide d’une spatule.
Il est possible de laisser les escargots se déplacer sur le couvercle propre du récipient ou sur du papier
légèrement humecté, de manière à débarrasser leur pied de toute trace de substrat collé.
Relever les symptômes évidents ou pathologiques observés chez les escargots (par exemple production
excessive de mucus, corps œdémateux étendu, tentacules oculaires tombants, comme décrit dans les
Références [12] ou [42]), ou toute modification perceptible du comportement (par exemple léthargie
sur le mélange d’essai, manque d’alimentation).
À la fin de l’essai, le pH doit être mesuré pour un récipient témoin et pour un récipient pour chacune des
concentrations selon l’ISO 10390. Il est recommandé de mesurer le pH de tout récipient dans lequel le
taux de mortalité ou la croissance sort de l’ordinaire.
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Facultatif: à la fin de l’essai (28 jours), après la pesée finale et le mesurage final du diamètre de la
coquille, laisser les escargots de chaque récipient jeûner pendant 48 h dans des boîtes humides,
dépourvues de substrat d’essai (jusqu’à ce qu’ils n’excrètent plus), puis les surgeler en vue d’une
analyse éventuelle de la concentration de contaminants présents dans leurs tissus ou organes.
10 Substance de référence
Un essai du témoin est régulièrement effectué avec une substance de référence afin de contrôler la
survenue de changements dans la sensibilité des organismes d’essai.
NOTE Il a été démontré par expérience que le chlorure de cadmium convient en tant que substance de
référence.
Déterminer régulièrement les valeurs de la CE (28 jours) et de la CE (28 jours) pour le chlorure de
50,m 50,d
cadmium, en appliquant le protocole décrit dans la présente Norme internationale.
AVERTISSEMENT — Il convient de prendre les précautions nécessaires pour la manipulation du
chlorure de cadmium qui est une substance nocive.
La CE (28 jours) du CdCl doit être comprise entre 350 mg et 650 mg de Cd par kg de substrat d’essai
50,m 2
sec.
La CE (28 jours) du CdCl doit être comprise entre 500 mg et 800 mg de Cd par kg de substrat d’essai
50,d 2
sec.
Noter les valeurs obtenues ainsi que la date de leur obtention dans le rapport d’essai.
En 2000, quatre laboratoires ont participé à un essai interlaboratoires portant sur le chlorure de
cadmium. Les résultats sont indiqués dans le Tableau 2 (voir aussi Référence [52]).
Tableau 2 — Résultats de l’essai interlaboratoires avec Helix aspersa aspersa (contamination du
substrat; méthode semi-statique)
CE (28 jours) CE (28 jours)
50,m 50,d
Substance
mg Cd/kg mg Cd/kg
Moyenne Plage Moyenne Plage
CdCl 500 398 à 622 600 507 à 781
11 Calculs et expression des résultats
11.1 Calculs
Pour chaque concentration, déterminer le pourcentage de mortalité, le cas échéant, au moment de
l’essai définitif.
À la fin de l’essai (28 jours) (facultatif: chaque semaine), calculer les masses moyennes et le diamètre
moyen de la coquille, ainsi que les écarts‐types associés, pour les escargots de chaque récipient et pour
chaque concentration.
Un exemple de tableau de données est fourni dans l’Annexe D.
Pour chaque récipient, calculer le coefficient de croissance de la biomasse (désigné k ) et le coefficient
CC,m
de croissance du diamètre de la coquille (désigné k ) selon les Équations (1) et (2), respectivement:
CC,d
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mm
 
tn t0
k100 (1)
CC,m
m
t0
où
K est le coefficient de croissance de la biomasse;
CC,m
est la masse moyenne des escargots par réplicat à l’instant t, en grammes (g);
m n
tn
est la masse moyenne des escargots par réplicat à l’instant t, en grammes (g).
m 0
t0
dd

tn t0
k100 (2)
CC,d
d
t0
où
K est le coefficient de croissance du diamètre de la coquille;
CC,d
d est le diamètre moyen de la coquille des escargots par réplicat à l’instant t, en
tn n
millimètres (mm);
d est le diamètre moyen de la coquille des escargots par réplicat à l’instant t, en
t0 0
millimètres (mm).
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Pour chaque concentration, calculer le pourcentage moyen d’inhibition de la croissance de la biomasse
(désigné p ) et d’inhibition de la croissance du diamètre de la coquille (désigné p ) selon les
I,m I,d
Équations (3) et (4), respectivement:
mmm''m
   
00tn t0 tn t0
p100 (3)
I,m
mm

00tn t0
où
est le pourcentage moyen d’inhibition de la croissance de la biomasse;
p
I,m
est la masse moyenne des escargots pour le témoin à l’instant t, en grammes (g);
m n
0tn
est la masse moyenne des escargots pour le témoin à l’instant t, en grammes (g);
m 0
00t
m' est la masse moyenne de l’escargot par concentration à l’instant tn, en grammes (g);
tn
m' est la masse moyenne de l’escargot par concentration à l’instant t, en grammes (g).
t0
ddd''d
00tn t0tn t0
p100 (4)
I,d
dd
00tn t0
où
est le pourcentage moyen d’inhibition de la croissance du diamètre de la coquille;
p
I,d
est le diamètre moyen de la coquille pour le témoin à l’instant t, en millimètres (mm);
n
d
0tn
est le diamètre moyen de la coquille pour le témoin à l’instant t, en millimètres (mm);
d
00t
est le diamètre moyen de la coquille par concentration à l’instant t, en millimètres (mm);
n
d'
tn
est le diamètre moyen de la coquille par concentration à l’instant t, en millimètres (mm).
d'
t0
11.2 Expression des résultats
Pour chaque concentration et aux différents temps de mesure, présenter le pourcentage de mortalité
pour chaque réplicat et pour les deux paramètres mesurés, la croissance de la biomasse et la croissance
de la coquille:
— les valeurs moyennes calculées et l’écart‐type par réplicat;
— le coefficient de croissance par réplicat (voir les exemples dans les Tableaux E.1 et E.2);
— le pourcentage moyen d’inhibition de la croissance (voir les exemples dans les Tableaux E.3 et E.4);
— une représentation graphique des résultats de l’essai illustrant clairement la relation dose/effet
pour les effets sur la croissance.
Il est possible (facultatif) de déterminer la CMEO en utilisant une comparaison multiple adéquate et de
la déduire à partir de la CSEO, la concentration immédiatement inférieure à la CMEO.
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Éventuellement, pour les substances d’essai, les préparations ou les matrices pour lesquelles la
mortalité est dépendante de la dose, calculer, à l’aide d’une méthode statistiquement appropriée, la
CL (28 jours) et son intervalle de confiance à 95 % (la méthode utilisée pour déterminer l’inhibition
de la croissance peut convenir).
Afin d’estimer la concentration qui entraînerait x % d’inhibition de la croissance (CE, par exemple CE ,
x 10
CE ou CE ), il est possible d’adapter un modèle aux résultats de l’essai (k ou k ). Pour cela, il faut
20 50 CC,m CC,d
estimer les valeurs de la CEx et les paramètres caractérisant ce modèle, si possible, avec leur intervalle
de confiance (par exemple 95 %).
L’adaptation du modèle aux données doit être évaluée soit au moyen d’un test statistique, soit par une
représentation graphique.
Il est possible d’utiliser le modèle logistique qui convient généralement pour l’analyse statistique des
données générées.
NOTE 1 Ce modèle est utilisé dans le cadre de l’analyse des résultats d’essais interlaboratoires (voir
l’Article 10).
Ce modèle est caractérisé par l’Équation (5):
a
Y (5)
b

C
1

EC
50
où
Y est le coefficient de croissance des escargots vivants par réplicat (k ou k );
CC,m CC,d
C est la concentration à l’étude (variable de l’essai).
Les paramètres suivants, qui caractérisent le modèle, sont estimés à partir des données obtenues (par
exemple par la méthode des moindres carrés).
CE est la concentration responsable de 50 % d’inhibition de la croissance;
a est le coefficient de croissance des escargots attendu pour le témoin;
b est un paramètre qui caractérise la pente de la courbe.
Il est possible d’estimer la CE en utilisant l’Équation (6):
x
x b
EC EC (6)
x 50
100 x

où x est le niveau de l’effet recherché pour le calcul de la CEx (paramètre défini initialement).
Il est possible d’utiliser d’autres modèles. Dans ce cas, il est nécessaire de fournir une description du
modèle utilisé dans le rapport d’essai. À titre d’exemples, des méthodes statistiques sont décrites dans
la Référence [53].
Pour les substances ou les préparations, exprimer les valeurs de la CE (28 jours), de la
50,m
CE (28 jours) et, au besoin, de la CSEO et de la CMEO en milligrammes de substance d’essai ou de
50,d
préparation par kilogramme de substrat d’essai (exprimées en masse sèche).
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Pour les sols et les déchets, exprimer les valeurs de la CE (28 jours), de la CE (28 jours) et, au
50,m 50,d
besoin, de la CSEO et de la CMEO en pourcentage de masse de sol ou de déchets dans le mélange d’essai
(exprimé en masse sèche).
NOTE 2 Il est aussi possible (facultatif) de déterminer d’autres valeurs de la CEx (par exemple x = 10 %, 25 %,
etc.). Différents paramètres (CE, CSEO, CMEO, CL ) peuvent également être déterminés à d’autres moments du
x 50
mesurage (7, 14 ou 21 jours).
12 Validité de l’essai
Les résultats sont considérés comme valides si les conditions suivantes sont satisfaites:
— le pourcentage de mortalité observé dans les récipients témoins est inférieur ou égal à 10 % à la fin
de l’essai;
— le coefficient de variation calculé pour la croissance de la biomasse et la croissance d
...