ISO 17601:2025
(Main)Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene sequences by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) from DNA directly extracted from soil
Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene sequences by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) from DNA directly extracted from soil
This document specifies the crucial steps of a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method to measure the abundance of selected microbial gene sequences from soil DNA extract. The number of microbial gene sequences quantified by qPCR provides an estimation of the abundance of selected microbial groups in soil.
Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences de gènes microbiens par amplification par réaction de polymérisation en chaîne quantitative (qPCR) à partir d’ADN directement extrait du sol
Le présent document spécifie les étapes principales d’une méthode de réaction de polymérisation en chaîne quantitative (qPCR) permettant de mesurer l’abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à partir d’un extrait d’ADN du sol. Le nombre de séquences de gènes microbiens quantifiées par qPCR fournit une estimation de l’abondance de groupes microbiens spécifiques dans le sol.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 17601
Second edition
Soil quality — Estimation of
2025-10
abundance of selected microbial
gene sequences by quantitative
polymerase chain reaction (qPCR)
from DNA directly extracted from soil
Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences
de gènes microbiens par amplification par réaction de
polymérisation en chaîne quantitative (qPCR) à partir d’ADN
directement extrait du sol
Reference number
© ISO 2025
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Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Test materials . 4
5.1 DNA .4
5.2 Bacteria .4
5.3 Plasmid .4
5.4 Enzymes .4
5.5 Chemicals .4
5.6 Products for bacterial culture medium .5
5.7 Buffers and reagents .5
6 Apparatus . 6
7 Procedure . 6
7.1 qPCR standard preparation and calibration of qPCR assay (task 1) .6
7.1.1 General .6
7.1.2 Amplicon design (task 1, step 1) .6
7.1.3 qPCR standard preparation (task 1, step 2) .7
7.1.4 Bacterial isolate DNA, environmental DNA, artificial DNA .7
7.1.5 Calibration of the qPCR (task 1, step 3) .9
7.2 Preparation of soil DNA template and inhibition test (task 2) .10
7.2.1 General .10
7.2.2 Soil DNA preparation (task 2, step 4) . .10
7.2.3 Inhibition test (task 2, step 5) .10
7.3 qPCR assay (task 3) . . . 12
7.3.1 General . 12
7.3.2 qPCR (task 3, step 6) . 12
7.4 Validation and analysis of qPCR assay (task 4) . 12
7.4.1 General . 12
7.4.2 Validation of the qPCR assay (task 4, step 7) . 12
7.4.3 Calculation of the copy number of the gene of interest in the soil DNA extract
(task 4, step 8) . 13
8 Examination of the critical steps of the qPCR assay .13
9 Expression of the results of the qPCR assay . 14
10 International ring test . 14
11 Test report . 14 ®
Annex A (informative) Description of principal steps of TaqMan qPCR assay .15
Annex B (informative) International ring test for evaluating qPCR to quantify the abundance of
selected microbial gene sequences from DNA directly extracted from soil . 17
Annex C (informative) Examples of well-established primer systems for a qPCR-based
quantification of marker genes in soil samples .30
Bibliography .33
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
characterization, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 444, Environmental characterization of solid matrices, in accordance with the Agreement
on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 17601:2016), which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— Annex C has been expanded by adding examples of well-established qPCR systems to quantify certain
microbial groups or their function.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
DNA (DNAs) is a major component of any living organism, coding for enzymes responsible for their biological
activities. The study of DNA sequences from DNA sources extracted from different environmental matrices,
by means of numerous molecular approaches, provides molecular markers that can be used to sharply
distinguish and identify different organisms (bacteria, archaea, and eukaryotes).
Up to now, most of the studies aiming to develop microbial quality indicators applicable to complex
environment such as soil were biased by the poor culturability of many microorganisms under laboratory
conditions and the lack of sensitivity of traditional microbiological methods. The recent development of a
large set of molecular biology methods based on amplification of soil-extracted nucleic acids have provided
a pertinent alternative to classical culture-based microbiological methods providing unique insight into the
[2][3][4][5][6]
composition, richness, and structure of microbial communities. DNA-based approaches are now
well established in soil ecology and serve as genotypic markers for determining microbial diversity. The
results of molecular analyses of soil microbial communities and populations rely on two main parameters:
a) the extraction of DNA representative of the indigenous bacterial community composition, and b) PCR bias
such as the choice of primers, the concentration of amplified DNA, errors in the PCR, or even the method
[7][4][8][9]
chosen for the analysis.
Numerous studies have investigated new methods to improve extraction, purification, amplification,
[10]
and quantification of DNA from soils. Recently, ISO 11063 reported “a method to extract nucleic acids
directly from soil samples” derived from Reference [10], opening a new window for developing standardized
[11]
molecular approaches to estimate soil quality.
The aim of this document is to describe the procedure used to set up and perform quantitative PCR to quantify
the abundance of soil microbial phyla, as well as functional groups, from DNA directly extracted from soil
samples. The quantification of soil microbial phyla and functional groups by qPCR assays can contribute to
the development of routine tools to monitor soil quality. The repeatability and the reproducibility of the qPCR
procedure were assessed in an international ring test study (see Annex B). The repeatability of this procedure
was successfully evaluated for 16S rRNA genes and for genes coding a functional marker of denitrifiers (the
nitrite reductase gene nirK). The reproducibility of this procedure revealed a laboratory effect which can
be overcome by interpreting the results of the quantification of the abundance of the microbial groups by
comparison, either by using an external reference (DNA extracted from a control strain) in the assay or
by calculating a percentage of variations between treatments to normalize the data. It is noteworthy that
the number of genes is not necessarily directly linked to the number of organisms that are measured. For
example, the number of ribosomal operon is ranging from one copy to 20 copies in different bacterial phyla.
Therefore, the number of 16S rRNA sequences quantified from soil DNA extracts does not give an exact
estimate of the number of soil bacteria. Furthermore, the number of sequences is not necessarily linked to
living microorganisms and can comprise sequences amplified from dead microorganisms.
A list of currently well-established qPCR assays to assess selected functional traits of the soil microbiome is
listed in Annex C.
v
International Standard ISO 17601:2025(en)
Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial
gene sequences by quantitative polymerase chain reaction
(qPCR) from DNA directly extracted from soil
1 Scope
This document specifies the crucial steps of a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method to
measure the abundance of selected microbial gene sequences from soil DNA extract. The number of microbial
gene sequences quantified by qPCR provides an estimation of the abundance of selected microbial groups in soil.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic
conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
ISO 11063, Soil quality — Direct extraction of soil DNA
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
soil DNA
DNA extracted from living and dead biota in the soil
Note 1 to entry: The soil biota includes microorganisms, plants and animals.
3.2
polymerase chain reaction
PCR
method allowing the amplification of a specific DNA sequence using a specific pair of oligonucleotide primers
3.3
quantitative polymerase chain reaction
qPCR
method allowing the quantification in a DNA template (3.4) of the number of DNA sequences targeted by a
specific pair of oligonucleotide primers
3.4
template
DNA sample used to perform polymerase chain reaction (PCR) (3.2) to amplify a specific DNA sequence
3.5
amplicon
PCR product obtained by polymerase chain reaction (PCR) (3.2) from a template (3.4)
3.6
cloning vector
circular DNA molecule in which the amplicon (3.5) is inserted by ligation and which is used to transform
competent Escherichia coli
3.7
qPCR standard
cloned DNA target used as template (3.4) for quantitative polymerase reaction (qPCR) (3.3) to establish the
standard curve relating the abundance of target sequence as a function of cycle threshold (Ct) (3.9) values
3.8
non-template control
NTC
control, usually molecular grade water, that is used as negative control in quantitative polymerase reaction
(qPCR) (3.3) assay to check for the absence of contaminant in the qPCR mix
3.9
cycle threshold
Ct
number of quantitative polymerase chain reaction (qPCR) (3.3) cycles required for the fluorescent signal to
cross the threshold (i.e. to exceed background level)
Note 1 to entry: The Ct value is inversely proportional to the abundance of the target sequence.
4 Principle
This document describes a qPCR assay using fluorescent DNA binding dye as reporter. This qPCR assay has
1)
been validated by an international ring test conducted with the SYBR Green , a commonly used fluorescent
DNA binding dye which binds all double-stranded DNA and can be detected by measuring the increase in
fluorescence throughout the cycle.
The method comprises four tasks and eight steps as summarized in Figure 1. According to Reference [1], the
three critical steps to be validated for each qPCR assay are as shown in Figure 1.
1) SYBR® Green is a trademark of Thermo Fisher Scientific Inc. This information is given for the convenience of users
of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named.
Figure 1 — Main tasks and critical steps to estimate the abundance of selected microbial gene
sequences by qPCR assay
This document describes a qPCR assay based on the use of fluorescent DNA binding dye which has been
®2)
validated by an international ring test using SYBR Green qPCR. In Annex A, information about the TaqMan
qPCR assay (which was not tested in the international ring test) is given. The first task comprises three steps
describing the design of optimal amplicon for qPCR (step 1), the preparation of qPCR standards (step 2),
and the procedure to calibrate the qPCR assay (step 3). The second task includes two steps describing the
procedures to prepare soil DNA samples (step 4) and to test for the presence of qPCR inhibitors in soil DNA
samples (step 5). The third task is constituted of a single step describing the protocol to perform the qPCR
assay (step 6).
Finally, the fourth task is made of two steps: one describes the procedure to validate the qPCR assays
(step 7) to check its quality and the other describes the different options to calculate the copy number of
gene sequences from the cycle threshold values (Ct) obtained from the analysis of qPCR amplification plots
(step 8).
5 Test materials
5.1 DNA
5.1.1 DNA, extracted from pure bacterial and fungal isolates using classical extraction procedures or by
using commercial kit to extract genomic DNA.
5.1.2 Soil DNA, extracted from aliquots of soil according to ISO 11063.
5.2 Bacteria
5.2.1 Escherichia coli strain, usually used for cloning of PCR product.
5.3 Plasmid
5.3.1 Cloning vector, usually used for cloning of PCR product in competent Escherichia coli.
5.4 Enzymes
5.4.1 Taq polymerase.
5.4.2 T4 DNA ligase.
5.4.3 T4 gene 32 protein (T4gp32).
3)
5.4.4 Bovine serum albumin (CAS RN 9048-46-8).
5.5 Chemicals
5.5.1 Ampicilline sodium, C H N NaO S (CAS No. 69-52-3).
16 18 3 4
5.5.2 Boric acid, BH O (CAS No. 10043-35-3).
3 3
2) TaqMan is a trademark of Roche Molecular Systems, Inc. This information is given for the convenience of users of this
document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products may be used if they
can be shown to lead to the same results. ®
3) Chemical Abstract Service (CAS) Registry Number is a trademark of the American Chemical Society (ACS). This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the
product named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
5.5.3 Deoxynucleotide solution, dNTPs.
®5)
5.5.4 SYBR Safe double-strand DNA gel stain.
5.5.5 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) dihydrate, C H N O Na ·2 H O
10 14 2 8 2 2
(CAS No. 6381-92 6).
5.5.6 Glucose, C H O (CAS No. 50-99-7).
6 12 6
5.5.7 Hydrochloric acid, HCl (CAS No. 7647-01-0).
5.5.8 IPTG, Isopropyl-Beta-D-Thiogalactopyranoside, (CAS No. 367-93-1).
5.5.9 Magnesium chloride, MgCl (CAS No. 7786-30-3).
5.5.10 Magnesium sulfate, MgSO (CAS No. 7487-88-9).
5.5.11 Molecular-biology-grade water, H O.
5.5.12 Potassium chloride, KCl (CAS No. 7447-40-7).
5.5.13 Sodium chloride, NaCl (CAS No. 7647-14-5).
5.5.14 Tris[hydroxymethyl]aminomethane, C H NO (CAS No. 77-86-1).
4 11 3
5.5.15 X-Gal, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside, (CAS No. 7240-90-6).
5.6 Products for bacterial culture medium
6)
5.6.1 Bacto™tryptone , enzymatic digest of casein.
5.6.2 Yeast extract powder (CAS No. 8013-01-2).
5.7 Buffers and reagents
5.7.1 Ampicillin solution, 2 g of ampicilline sodium in 4 ml of 0,22 µm filter sterilized H O. Adjust to
20 ml with sterilized H O, prepare 1 ml aliquots, and store at −20 °C.
−1 −1
5.7.2 EDTA, 0,5 mol·l , 186,10 g of EDTA in 1 000 ml of H O adjusting with NaOH (10 mol·l ) to pH 8,0.
5.7.3 SYBR Safe® DNA gel stain, dilute 10 000 × SYBR Safe® gel stain in TBE buffer × 1.
5.7.4 IPTG stock solution, 1 g of IPTG in 8 ml of H O. After careful mixing, the solution is adjusted to
10 ml and sterilized under security microbiology post. Prepare 1 ml aliquot of IPTG and store at −20 °C. ®
5.7.5 Solid LB medium, 10 g of Bacto tryptone , 5 g of yeast extract, 5 g of sodium chloride, and 15 g of
−1
agar in 1 000 ml of H O. After autoclaving for 20 min at 120 °C, 1 ml of ampicillin stock solution at 100 mg·ml
is added to LB medium and plated in Petri dishes (20 ml) under a security microbiology post. 100 µl of IPTG
solution are plated on solid LB-ampicillin medium. When IPTG solution is entered in LB-ampicillin medium,
20 µl of X-Gal solution is plated on solid LB-ampicillin medium. Solid LB medium is stored at 4 °C until its use.
®
5.7.6 SOC medium, 20 g of Bacto tryptone , 5 g of yeast extract, 0,58 g of NaCl, 0,95 g of MgCl , 2,46 g of
MgSO , and 3,60 g of glucose in 1 l H O. Sterilize by 20 min autoclaving at 120 °C. Prepare 950 ml aliquots
4 2
and store at −20 °C.
−1 −1
5.7.7 Tris-HCl, 1 mol·l , 121,14 g of Tris in 1 000 ml of H O adjusting with 4 mol·l HCl to pH 8,0.
−1
5.7.8 TBE buffer × 10, pH 8,0, 108 g of Tris base, 55 g of boric acid, and 40 ml of 0,5 mol·l EDTA (pH 8,0)
in 1 000 ml of H O.
5.7.9 TBE buffer × 1, 100 ml of TBE buffer × 10 in 900 ml of H O.
−1 −1
5.7.10 TE buffer × 10, pH 8,0, 100 ml of 1 mol·l Tris-HCl pH 8,0, 20 ml of 50 mmol·l EDTA pH 8,0 in
880 ml of molecular grade water.
5.7.11 TE buffer × 1, 100 ml of TE buffer × 10 in 900 ml of H O.
5.7.12 X-gal solution, 250 mg of X-Gal in 5 ml of dimethylformamide. After careful mixing, prepare 0,5 ml
aliquot and store at −20 °C.
6 Apparatus
Use standard laboratory equipment including pipettes, a centrifuge, fume hood cabinet, horizontal
electrophoresis system and the following.
6.1 Thermocycler suitable for qPCR analysis, allowing the real-time quantification of amplicons
from various DNA templates with a theoretical detection limit of one copy of a sequence target per sample
analysed.
6.2 Spectro-photometer, allowing the quantification of double-strand DNA at 260 nm.
6.3 Spectro-fluorimeter, allowing the quantification of double-strand DNA.
NOTE Only one of these two apparatus is required to estimate DNA concentration.
7 Procedure
7.1 qPCR standard preparation and calibration of qPCR assay (task 1)
7.1.1 General
The qPCR assay is based on the quantification of the amplicons at the end of each PCR cycle by using a
DNA dye which fluoresces when intercalated in the double strand amplicons. The purpose of this task is to
describe the definition of the appropriate amplicon to settle down a qPCR assay (step 1), the preparation of
the qPCR standard (step 2), and the calibration of the qPCR assay (step 3).
7.1.2 Amplicon design (task 1, step 1)
7.1.2.1 General
The first step aims at designing the oligonucleotide primer pair; it can be designed in silico using different
programs using the sequence of the microbial gene of interest to be quantified by qPCR from soil DNA extracts.
The specificity of the primers shall be checked in silico by comparing their sequences to known sequences
4)
available in the Genbank database . Only primers specific for the gene target shall be considered. 7.1.2.2
provides indications to guide the design of the oligonucleotide primer pair for establishing the qPCR assay.
7.1.2.2 qPCR
— Optimal amplicon length ranges between 100 bp (base pairs) to 250 bp.
— Optimal primer length ranges between 18 bp and 25 bp with a GC content of 50 % and melting temperature
between 58 °C and 65 °C.
— The five nucleotides at the 3’ end of each primer should have no more than two G or C bases.
— Avoid succession of identical nucleotide, especially true for guanine.
— 3’ self-complementarity of the primer, taken as a measure of its tendency to form a primer-dimer with
itself, should be checked and avoided.
— Avoid design of primers with more than four mismatches because too high degeneracy of the primer
contributes to fluctuation of qPCR results.
7.1.3 qPCR standard preparation (task 1, step 2)
Step 2 of task 1 describes the procedure used to generate qPCR standards targeting a sequence of the
microbial gene of interest from different DNA templates (pure bacterial or fungal isolate, environmental
DNA, or artificial DNA). It also reports the procedure used to insert the qPCR standard in a cloning vector,
transform Escherichia coli, and purify recombinant plasmids harbouring the qPCR standard for further use
for qPCR assays.
7.1.4 Bacterial isolate DNA, environmental DNA, artificial DNA
7.1.4.1 General
The first step of the qPCR standard preparation relies on the extraction of DNA templates known to harbour
the microbial gene of interest. This can be done starting from different materials such as:
a) pure cultures of microorganisms (DNA is extracted from cells harvested from a fresh culture of
microorganisms by using conventional genomic DNA extraction protocols);
b) artificial DNA.
If no biological samples are available or known to harbour the gene of interest, artificial DNA made of the
sequence of the gene of interest can be synthesized.
In all cases, the quality of DNA template used for amplifying the qPCR standard by PCR shall be verified ®
by electrophoresis on 1 % agarose gel in TBE buffer stained with appropriate staining (e.g. SYBR Safe
staining). The concentration of DNA is measured by spectrophotometry at 260 nm. DNA template is diluted
−1
to 10 ng·µl in a final volume of 20 µl and stored at −20 °C.
The qPCR standard sequence is amplified by PCR using a specific primer pair designed according to the
recommendations described in 7.1.2.2 (task 1, step 1). The amplification reaction is carried out in a final
−1 −1
25 µl volume containing 2,5 µl of 10 × Taq polymerase buffer, 200 µmol·l of each dNTP, 1,5 mmol·l of
−1
MgCl , 0,5 µmol·l of each primer and 0,625 U of Taq polymerase. A volume of 2,5 µl of DNA (e.g. 25 ng
of DNA) is used as template for the PCR reactions. PCR is performed in a thermocycler according to the
recommendations of the qPCR kit furnisher. As an example, the following program can be used: one cycle of
4 min at 94 °C; 39 cycles of 1 min at 94 °C, 1 min at annealing temperature specific for the qPCR standard
amplicon, and 1,5 min at 72 °C; and a final extension step at 72 °C for 5 min. The expected size of the qPCR
standard amplicon is verified by electrophoresis on 2 % agarose gel in TBE buffer stained with appropriate ®
staining (e.g. SYBR Safe staining). Amplicons are purified either from the gel using appropriate methods or
4) http:// www .ncbi .nlm .nih .gov/ genbank/
by using exclusion chromatography columns to remove primers. Purified amplicons are then quantified by
spectrophotometry at 260 nm or by spectrofluorimetry.
7.1.4.2 Cloning, dilution preparation of qPCR standard
7.1.4.2.1 Ligation of amplicon of qPCR standard
For an optimal ligation of an amplicon into a cloning vector, a 3:1 molar ratio should be used. The mass of
PCR product to be used for ligation can be calculated using Formula (1):
mn
plasmidDNA× insert
Q=×3 (1)
n
plasmid
where
Q is the mass of PCR product, in nanograms (ng);
m is the mass of plasmid DNA, in nanograms (ng);
plasmid DNA
n is the size of the insert, in bp;
insert
n is the size of the plasmid, in bp.
plasmid
Taking into account a plasmid size of 3 000 bp, a 16S rRNA insert of 200 bp, and 50 ng of plasmid DNA per
ligation reaction, the amount of PCR amplicon to be used per ligation calculated using Formula (1) is:
50×200
Q= ×=310
The ligation reaction is made of the required amount of qPCR standard purified amplicon (Q), 50 ng of
plasmid DNA, 5 µl of 2 × ligation buffer, 3 U of T4 DNA ligase, and molecular grade water to reach a final
volume of 10 µl. The ligation reaction is incubated overnight at 4 °C or for adequate T4 DNA ligase, one hour
at ambient temperature.
The efficiency of the ligation is verified by electrophoresis by loading 1 µl ligated plasmid and open plasmid
(i.e. 5 ng of plasmid) on 1 % agarose gel in TBE buffer stained with appropriate staining. Ligated plasmid is
characterized by a shorter migration in the agarose gel.
7.1.4.2.2 Transformation of competent Escherichia coli
8 −1
Competent E. coli are transformed by heat shock as described below. Competent cells (10 cfu·µg of DNA)
freshly thawed out are incubated for 5 min on ice. Then 1 µl of the ligation reaction is added to cells, smoothly
mixed, and incubated for 20 min on ice. Bacterial cells are heat shock treated by 50 s incubation at 42 °C and
immediately placed on ice and incubated for 2 min. Then 950 µl of SOC medium are added and the bacterial
−1
cells are incubated at 37 °C under agitation at 150 min for 1 h. 100 µl bacterial cells aliquots are plated
onto LB/Amp/IPTG/X-Gal solid medium (5.7.5). Petri dishes are then incubated at 37 °C overnight.
7.1.4.2.3 Screening for recombinant clone
Plates are placed at 4 °C for several hours to accentuate coloration of bacterial colonies. White colonies are
picked, plated onto LB/Amp/IPTG/X-Gal solid medium, and incubated overnight at 37 °C. Several white
colonies are picked and put in 100 µl molecular grade water. PCR is carried out to confirm the presence of
the insert in the recombinant clone. The insert is amplified by PCR using SP6 (5’−ATT TAG GTG ACA CTA
TAG−3’) and T7 (5’−TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG−3’) primers. The amplification reaction is carried out in a
−1 −1
final 25 µl volume containing 2,5 µl of 10 × Taq polymerase buffer, 200 µmol·l of each dNTP, 1,5 mmol·l of
−1
MgCl , 0,5 µmol·l of each primer and 0,625 U of Taq polymerase. A volume of 2,5 µl of bacterial suspension
is used as template for the PCR reactions. PCR is performed in a thermocycler according to the following
program: one cycle of 4 min at 94 °C; 35 cycles of 45 s at 94 °C, 45 s at 55 °C, and 1,5 min at 72 °C; and a final
extension step at 72 °C for 5 min. The size of the expected qPCR amplicon is verified by electrophoresis on
2 % agarose gel in TBE buffer stained with appropriate staining.
7.1.4.2.4 Purification and linearization of recombinant plasmid
Recombinant clones, white in colour and confirmed by PCR, are inoculated to 10 ml LB/Amp liquid medium
−1
incubated at 37 °C under agitation (150 min ) overnight. The plasmid is purified from 2 ml cell suspension
using conventional mini-preparation. Plasmid DNA is then quantified by spectrophotometry at 260 nm and
aliquots are prepared and stored at −20 °C until use.
The plasmid is linearized with a restriction enzyme presenting a single restriction site in the sequence of
the plasmid. User shall make sure that the chosen restriction enzyme is not also cutting the insert. Digestion
of the plasmid is performed overnight at 37 °C in a final volume of 10 µl containing 250 ng of recombinant
plasmid, 0,5 U of restriction enzyme, 1 µl of 10 × restriction enzyme buffer, and molecular grade water.
The efficiency of the restriction of the plasmid is verified by electrophoresis on 1 % agarose gel. Linearized
plasmid is stored at −20 °C and is used as stock solution to prepare serial dilution of qPCR standard used to
calibrate qPCR assay.
The concentration in DNA of linearized plasmid is measured by spectrophotometry at 260 nm or by
spectrofluorimetry in order to determine the plasmid copies number. This operation can be facilitated
5)
by using an online calculator such as oligo calc . From this stock solution, an initial solution containing
0,5 × 10 copies of the qPCR standard per µl is prepared in 100 µl of molecular grade water. Tenfold serial
dilutions are then prepared to reach 0,5 × 10 copies of the plasmid per µl. Additional intermediary dilutions
can also be prepared depending on the range where copy numbers are expected.
7.1.5 Calibration of the qPCR (task 1, step 3)
7.1.5.1 General
The procedure used to generate the calibration curve and evaluate the efficiency of the qPCR assay is
described in 7.1.5.2 and 7.1.5.3.
7.1.5.2 qPCR assay
8 1
The qPCR calibration assay is performed on serial dilution of the cloned standard (ranging from 10 to 10
copies per µl) using a primer pair specifically targeting the gene of interest. The amplification reaction is
−1
carried out in a final 15 µl volume containing 2 µl of plasmid standard, 1 µmol·l of each primer, 7,5 µl of
2 × Taq master mix or 1,5 µl of 10 × Taq master mix containing a fluorescent DNA binding dye, dNTPs, MgCl ,
and Taq polymerase and molecular grade water. The qPCR reaction is performed in a real-time thermocycler
according to the recommendations of the qPCR kit furnisher. As an example, the following program can be
used: one cycle of 15 min at 95 °C; 35 cycles of 30 s at 95 °C, 30 s at annealing temperature, 30 s at 72 °C, and
30 s at 80 °C where the fluorescence is collected; and a final dissociation stage by increasing the temperature
from 80 °C to 95 °C. The temperature to which the fluorescence is measured shall be lower than the melting
temperature of the amplicon. qPCR calibration is performed in triplicate and three NTC are also included.
7.1.5.3 Establishment of the calibration curve and calculation of qPCR efficiency
At the end of qPCR assay, results are analysed using the program furnished with the thermocycler. In order
to validate the qPCR, the following shall be observed:
a) no amplification for NTC;
b) a single dissociation peak for each dilution of qPCR standard;
c) a linear calibration curve with r equal or superior to 98 %.
The qPCR calibration curve gives the number of Ct as a function of the amount of the log of the number of
copy of standard sequences.
5) https:// bio .tools/ oligocalc
Values determined from the calibration curve using Formula (2) are used to calculate the efficiency of the
qPCR assay using the Formula (3).
Ct =⋅aq+c (2)
where
Ct is measured cycle threshold;
q is the copy number of qPCR standard;
a is the slope of the calibration curve;
c is the ordinate at the origin (Ct for 1 copy of qPCR standard).
()−1/a
E =−10 1 (3)
where
E is the efficiency of the calibration assay;
a is the slope of the calibration curve.
Users shall be aware that a calibration curve having a slope equal to −3,32 is 100 % efficient. A twofold-
dilution or a 10-fold-dilution of a given DNA template gives a Ct difference of 1 or of 3,3 respectively (i.e. 10
Ct = 10 and 10 Ct = 13,3) for a qPCR assay efficient at 100 %.
7.2 Preparation of soil DNA template and inhibition test (task 2)
7.2.1 General
This task describes the procedure used to prepare DNA template and to check for the presence of Taq
polymerase inhibitors in DNA extracts used as template for qPCR assay. This test shall be performed to
validate the quality of DNA extracts and allow their use as template for conducting qPCR assays.
7.2.2 Soil DNA preparation (task 2, step 4)
Step 4 of task 2 describes the procedure used to extract DNA from soil samples. Soil samples shall be
collected, handled, and stored according to ISO 18400-206. Soil DNA extraction shall be done according to
−1 −1
ISO 11063. Soil DNA samples are diluted to 1 ng·µl and 0,1 ng·µl and stored at −20 °C until their use.
7.2.3 Inhibition test (task 2, step 5)
7.2.3.1 General
The procedure used to test for the presence of Taq polymerase inhibitors in soil DNA extracts is described in
7.2.3.2. This step is prerequisite that shall be done prior to performing the qPCR assay on soil DNA extracts.
Indeed, Taq polymerase inhibitors such as humic acid substances are often co-extracted with soil DNA,
and only soil DNA extract free of inhibitors can be subjected to qPCR analysis to estimate the abundance of
selected microbial gene sequences in soil. Two inhibition tests are described in 7.2.3.2 and 7.2.3.3.
7.2.3.2 Spiking of exogenic DNA in soil DNA extract
The search for inhibitors can be done by quantifying the abundance of a known amount of exogenic DNA
spiked into soil DNA. The protocol proposed here describes the analysis done after spiking plasmid DNA into
soil DNA extract. This procedure can be adapted to any exogenic DNA sources by performing the qPCR with
an appropriate primer pair specific for the sequence of spiked DNA.
The qPCR is performed using SP6 and T7 primers specific from the plasmid. The amplification reaction is
carried out in a final 15 µl volume containing 2 µl of plasmid DNA, 2 µl of soil DNA (using the two dilutions
−1 −1 −1
1 ng·µl and 0,1 ng·µl ), 1,0 µmol·l of each primer, 7,5 µl of 2 × Taq master mix or 1,5 µl of 10 × Taq master
mix containing fluorescent DNA binding dye, dNTPs, MgCl , and Taq polymerase and molecular grade water.
The qPCR reaction is performed in a real-time thermocycler according to the following program: one cycle
of 15 min at 95 °C; 30 cycles of 15 s at 95 °C, 30 s at 55 °C, and 30 s at 72 °C. SP6-T7 qPCR inhibition test is
performed for each dilution of soil DNA extract to be tested, three positive controls containing only plasmid
DNA and three NTC.
The inhibition test is validated by observing the following:
a) no amplicon in NTC control;
b) similar Ct values in qPCR performed from soil DNA extract and plasmid DNA (Figure 2).
The soil DNA dilution showing no inhibition is chosen as template to perform the qPCR assay.
Key
X qPCR cycle
Y fluorescence
1 pGEM-T
2 partial inhibition
3 inhibition
Figure 2 — Results of inhibition test carried out by qPCR assay targeting SP6-T7 region of pGEM-T
plasmid spiked in known amount into soil DNA extracts
If a full or partial inhibition is observed (i.e. no amplicon or drift in Ct value, respectively), soil DNA extract
shall be diluted to remove the inhibition and submitted again to a new inhibition test. If this does not yield in
the improvement of the qPCR inhibition test, then the DNA extracts shall be further purified as indicated in
ISO 11063 and submitted again to the inhibition test. When acceptable results are obtained for the inhibition
test, soil DNA samples can be used to run qPCR assay.
Users shall be aware that qPCR assay performed from soil DNA extract can be improved by using carriers that
−1
favour the activity of Taq polymerase. Among the most popular, serum albumin bovine used at 400 ng·µl
−1
of qPCR reaction is proved to eradicate inhibition. Alternatively, T4 gene 32 protein at 30 ng·µl of qPCR
reaction gives similar results.
7.2.3.3 Dilution of DNA template
As an alternative inhibition test, the presence of Taq polymerase inhibitors in soil DNA extract can be
searched by performing qPCR assay targeting the gene of interest using as template 10 times dilution of
−1 −1 −1
soil DNA extracts (10 ng·µl , 1 ng·µl , 0,1 ng·µl ). The qPCR assay is performed following the procedure
described in 7.2.3.2. The qPCR inhibition test is performed for each dilution of soil DNA extract to be tested
including three positive controls containing only standard DNA and three NTC. The inhibition test is
validated by observing the following:
a) no amplicon in NTC control;
b) amplification in positive control;
c) for each sample test, Ct values difference of 3,32 between 10 times dilution.
Soil DNA extracts showing inhibition shall be treated as indicated in 7.2.1.
7.3 qPCR assay (task 3)
7.3.1 General
Step 6 of task 3 des
...
Norme
internationale
ISO 17601
Deuxième édition
Qualité du sol — Estimation de
2025-10
l’abondance de séquences de gènes
microbiens par amplification par
réaction de polymérisation en
chaîne quantitative (qPCR) à partir
d’ADN directement extrait du sol
Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial
gene sequences by quantitative polymerase chain reaction (qPCR)
from DNA directly extracted from soil
Numéro de référence
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 2
5 Matériel d’essai . 4
5.1 ADN .4
5.2 Bactéries . .4
5.3 Plasmide .4
5.4 Enzymes .4
5.5 Produits chimiques .4
5.6 Produits pour le milieu de culture bactérienne .5
5.7 Tampons et réactifs .5
6 Appareillage . 6
7 Mode opératoire . 6
7.1 Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l’essai de qPCR (tâche 1) .6
7.1.1 Généralités .6
7.1.2 Création de l’amplicon (tâche 1, étape 1) .7
7.1.3 Préparation des étalons de qPCR (tâche 1, étape 2) .7
7.1.4 ADN d’isolat bactérien, ADN environnemental, ADN artificiel .7
7.1.5 Étalonnage de la qPCR (tâche 1, étape 3).9
7.2 Préparation d’une matrice d’ADN du sol et essai d’inhibition (tâche 2) .10
7.2.1 Généralités .10
7.2.2 Préparation de l’ADN du sol (tâche 2, étape 4) .10
7.2.3 Essai d’inhibition (tâche 2, étape 5) .11
7.3 Essai de qPCR (tâche 3) . 13
7.3.1 Généralités . 13
7.3.2 qPCR (tâche 3, étape 6) . 13
7.4 Validation et examen de l’essai de qPCR (tâche 4) . 13
7.4.1 Généralités . 13
7.4.2 Validation de l’essai de qPCR (tâche 4, étape 7) . 13
7.4.3 Calcul du nombre de copies du gène d’intérêt dans l’extrait d’ADN du sol
(tâche 4, étape 8) .14
8 Examen des étapes critiques de l’essai de qPCR. 14
9 Expression des résultats de l’essai de qPCR .15
10 Essai interlaboratoires international .15
11 Rapport d’essai .15 ®
Annexe A (informative) Description des principales étapes d’un essai de qPCR TaqMan .16
Annexe B (informative) Essai interlaboratoires international relatif à l’évaluation de la qPCR
pour quantifier l’abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à partir
d’ADN extrait directement du sol .18
Annexe C (informative) Exemples de systèmes d’amorces bien établis pour une quantification
par qPCR de gènes marqueurs dans des échantillons de sol .31
Bibliographie .34
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité
de tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait
pas reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application.
Toutefois, il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des
informations plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à
l’adresse www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié de tels
droits de propriété et averti de leur existence.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 444, Méthodes d'essai pour
la caractérisation environnementale des matrices solides, du Comité européen de normalisation (CEN),
conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 17601:2016), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— l’Annexe C a été enrichie par des exemples de systèmes de qPCR bien établis permettant de quantifier
certains groupes microbiologiques ou leur fonction.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
L’ADN (acide désoxyribonucléique) est un constituant majeur de tous les organismes vivants codant pour
les enzymes responsables de leurs activités biologiques. L’étude des séquences d’ADN extrait de différentes
matrices environnementales, à l’aide d’approches moléculaires, permet de fournir des marqueurs
moléculaires qui peuvent être utilisés pour différencier et identifier clairement différents organismes
(bactéries, archées et eucaryotes).
Jusqu’à présent, la plupart des études visant à développer des indicateurs de la qualité microbienne
applicables aux milieux complexes, tels que le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de nombreux
micro-organismes dans des conditions de laboratoire et par le manque de sensibilité des méthodes
microbiologiques classiques. Le développement récent de nombreuses méthodes de biologie moléculaire
reposant sur l’amplification des acides nucléiques extraits du sol a permis de proposer une alternative
pertinente à la microbiologie pasteurienne permettant de décrire en détail la composition, la richesse et
[2][3][4][5][6]
la structure des communautés microbiennes. Les approches reposant sur l’extraction de l’ADN
à partir d’échantillons environnementaux sont désormais bien établies dans le domaine de l’écologie des
sols et servent de marqueurs génotypiques pour la détermination de la diversité microbienne. Les résultats
d’analyses moléculaires des communautés et populations microbiennes du sol reposent sur deux paramètres
principaux: a) l’extraction d’ADN représentatif de la composition de la communauté microbienne indigène et
b) les biais introduits par la PCR, notamment le choix des amorces oligonucléotidiques, la concentration de
[7][4][8][9]
l’ADN utilisé comme matrice, les erreurs de PCR ou encore la méthode d’analyse post-PCR choisie .
De nombreuses études ont été menées avec ces nouvelles méthodes permettant d’améliorer l’extraction,
[10]
la purification, l’amplification et la quantification de l’ADN des sols. Récemment, l’ISO 11063 a décrit une
«méthode pour extraire directement les acides nucléiques d’échantillons de sol», dérivée de la Référence [10],
ouvrant de nouvelles perspectives de développement d’approches moléculaires normalisées pour estimer la
[11]
qualité du sol .
Le présent document a pour objectif de décrire le mode opératoire utilisé pour mettre en place et réaliser
une PCR quantitative afin de quantifier l’abondance des phyla microbiens du sol ainsi que celle de groupes
fonctionnels, à partir d’extrait d’ADN de sol. La quantification des phyla microbiens du sol et des groupes
fonctionnels par des essais de qPCR peut contribuer au développement d’outils de routine permettant de
surveiller la qualité du sol. La répétabilité et la reproductibilité du mode opératoire de la qPCR ont été
évaluées lors d’un essai interlaboratoires international (voir Annexe B). La répétabilité de cette méthode
a été évaluée avec succès pour les essais de qPCR ciblant les gènes ARNr 16S ainsi que des gènes codant
un marqueur fonctionnel de bactéries dénitrifiantes (le gène nitrite réductase nirK). La reproductibilité de
cette méthode a révélé un effet de laboratoire qui peut être surmonté en interprétant les résultats de la
quantification de l’abondance de groupes microbiens par comparaison, soit en utilisant une référence externe
(ADN extrait d’une souche témoin) lors de l’essai de qPCR, soit en calculant un pourcentage de variations
entre traitements pour normaliser les données. Il convient de noter que le nombre de gènes n’est pas
nécessairement lié directement au nombre de micro-organismes mesurés. Par exemple, le nombre d’opérons
ribosomiques est compris entre une et 20 copies dans différents phyla bactériens. Par conséquent, le nombre
de séquences d’ARNr 16S quantifiées dans des extraits d’ADN du sol ne donne pas une estimation exacte du
nombre de bactéries contenues dans le sol. Par ailleurs, le nombre de séquences n’est pas nécessairement lié
à des micro-organismes vivants et peut comprendre des séquences amplifiées à partir de l’ADN extrait de
micro-organismes morts.
Une liste d’essais de qPCR actuellement bien établis permettant d’évaluer une sélection de traits fonctionnels
du microbiome du sol est donnée à l’Annexe C.
v
Norme internationale ISO 17601:2025(fr)
Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences
de gènes microbiens par amplification par réaction de
polymérisation en chaîne quantitative (qPCR) à partir d’ADN
directement extrait du sol
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie les étapes principales d’une méthode de réaction de polymérisation en chaîne
quantitative (qPCR) permettant de mesurer l’abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à
partir d’un extrait d’ADN du sol. Le nombre de séquences de gènes microbiens quantifiées par qPCR fournit
une estimation de l’abondance de groupes microbiens spécifiques dans le sol.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 18400-206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206: Collecte, manipulation et conservation de sols
destinés à l’évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et structurels en laboratoire
ISO 11063, Qualité du sol — Extraction directe de l'ADN du sol
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
ADN du sol
ADN extrait du biote vivant et mort dans le sol
Note 1 à l'article: Le biote du sol comprend des micro-organismes, des plantes et des animaux.
3.2
réaction de polymérisation en chaîne
PCR
méthode permettant l’amplification d’une séquence spécifique d’ADN en utilisant un jeu spécifique d’amorces
oligonucléotidiques
3.3
réaction de polymérisation en chaîne quantitative
qPCR
méthode permettant la quantification dans une matrice (3.4) d’ADN du nombre de séquences d’ADN ciblés
par un jeu spécifique d’amorces oligonucléotidiques
3.4
matrice
échantillon d’ADN utilisé pour réaliser une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) (3.2) afin d’amplifier
une séquence spécifique d’ADN
3.5
amplicon
produit de PCR obtenu par réaction de polymérisation en chaîne(PCR) (3.2) à partir d’une matrice (3.4)
3.6
vecteur de clonage
molécule d’ADN circulaire dans laquelle l’amplicon (3.5) est inséré par réaction de ligation et qui est utilisée
pour la transformation d’Escherichia coli compétente
3.7
étalon de qPCR
ADN cible cloné utilisé comme matrice (3.4) pour la réaction de polymérisation en chaîne quantitative (qPCR)
(3.3) afin d’établir la courbe d’étalonnage de l’abondance d’une séquence cible en fonction des valeurs du
cycle seuil (Ct) (3.9)
3.8
témoin négatif
NTC
témoin, généralement de l’eau de qualité biologie moléculaire, qui est utilisé comme témoin négatif dans
l’essai de réaction de polymérisation en chaîne quantitative (qPCR) (3.3) pour vérifier l’absence de contaminant
dans le mélange de qPCR
3.9
cycle seuil
Ct
nombre de cycles de réaction de polymérisation en chaîne quantitative (qPCR) (3.3) requis pour que le signal
fluorescent franchisse la valeur seuil (c’est-à-dire dépasse le bruit de fond)
Note 1 à l'article: La valeur de Ct est inversement proportionnelle à l’abondance de la séquence cible.
4 Principe
Le présent document décrit l’essai de qPCR utilisant un colorant fluorescent se fixant à l’ADN comme
rapporteur. Cet essai de qPCR a été validé lors d’un essai interlaboratoires international mené avec le
1)
SYBR Green , un colorant fluorescent se fixant à l’ADN double brin et pouvant être détecté en mesurant
l’augmentation de fluorescence au cours du cycle.
La méthode comprend quatre tâches et huit étapes, comme résumé à la Figure 1. Selon la Référence [1],
les trois étapes critiques devant être validées pour chaque essai de qPCR sont telles qu’indiquées à la
Figure 1.
1) SYBR® Green est une marque déposée de Thermo Fisher Scientific Inc. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit
ainsi désigné.
Figure 1 — Principales tâches et étapes critiques permettant d’estimer l’abondance de séquences
spécifiques de gènes microbiens par un essai de qPCR
Le présent document décrit l’essai de qPCR basé sur l’utilisation d’un colorant fluorescent se fixant à
l’ADN double brin qui a été validé par un essai interlaboratoires international utilisant la qPCR SYBR
®2)
Green. L’Annexe A fournit des informations sur l’essai de qPCR TaqMan (qui n’a pas fait partie de l’essai
interlaboratoires international). La première tâche comporte trois étapes décrivant la création d’un
amplicon optimal pour la qPCR (étape 1), la préparation d’étalons de qPCR (étape 2) et le mode opératoire
d’étalonnage de l’essai de qPCR (étape 3). La deuxième tâche comporte deux étapes décrivant les modes
opératoires de préparation des échantillons d’ADN du sol (étape 4) et d’essai pour détecter la présence
d’inhibiteurs de qPCR dans les échantillons d’ADN du sol (étape 5). La troisième tâche comporte une seule
étape décrivant le protocole pour réaliser l’essai qPCR (étape 6).
Enfin, la quatrième tâche comporte deux étapes. L’une décrit la procédure de validation des essais de qPCR
(étape 7) afin de vérifier la qualité et l’autre décrit les différentes options permettant de calculer le nombre
de copies de séquences du gène à partir des valeurs du cycle seuil (Ct) obtenues par l’analyse des courbes
d’amplification par qPCR (étape 8).
5 Matériel d’essai
5.1 ADN
5.1.1 ADN, extrait d’isolats bactériens et fongiques purs en utilisant des modes opératoires d’extraction
classiques ou en utilisant un kit commercial pour extraire l’ADN génomique.
5.1.2 ADN du sol, extrait d’aliquotes de sol conformément à l’ISO 11063.
5.2 Bactéries
5.2.1 Souche d’Escherichia coli, habituellement utilisée pour le clonage d’un produit de PCR.
5.3 Plasmide
5.3.1 Vecteur de clonage, habituellement utilisé pour le clonage d’un produit de PCR dans une souche
d’Escherichia coli compétente.
5.4 Enzymes
5.4.1 Taq polymérase.
5.4.2 T4 ADN ligase.
5.4.3 Protéine 32 codée par le gène du phage T4.
3)
5.4.4 Albumine de sérum de bovin (CAS RN 9048-46-8).
5.5 Produits chimiques
o
5.5.1 Ampicilline sodique, C H N NaO S (n CAS 69-52-3).
16 18 3 4
2) TaqMan est une marque déposée de Roche Molecular Systems, Inc. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit
ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il peut être démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats. ®
3) Chemical Abstract Service (CAS) Registry Number est une marque déposée de l’American Chemical Society (ACS).
Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO
approuve l’emploi du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il peut être démontré qu’ils
conduisent aux mêmes résultats.
o
5.5.2 Acide borique, BH O (n CAS 10043-35-3).
3 3
5.5.3 Solution de désoxynucléotides, dNTPs.
®5)
5.5.4 Agent intercalent SYBR Safe permettant de visualiser l’ADN sur gel.
5.5.5 Sel disodique de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), C H N O Na·2 H O
10 14 2 8 2 2
o
(n CAS 6381-92 6).
o
5.5.6 Glucose, C H O (n CAS 50-99-7).
6 12 6
o
5.5.7 Acide chlorhydrique, HCl (n CAS 7647-01-0).
o
5.5.8 IPTG, Isopropyl-bêta-D-Thiogalactopyranoside (n CAS 367-93-1).
o
5.5.9 Chlorure de magnésium, MgCl (n CAS 7786-30-3).
o
5.5.10 Sulfate de magnésium, MgSO (n CAS 7487-88-9).
5.5.11 Eau de qualité biologie moléculaire, H O.
o
5.5.12 Chlorure de potassium, KCl (n CAS 7447-40-7).
o
5.5.13 Chlorure de sodium, NaCl (n CAS 7647-14-5).
o
5.5.14 Tris[hydroxyméthyl]aminométhane, C H NO (n CAS 77-86-1).
4 11 3
o
5.5.15 X-Gal, bromo-5-chloro-4-indolyl-3-bêta-D-galactopyranoside (n CAS 7240-90-6).
5.6 Produits pour le milieu de culture bactérienne
6)
5.6.1 Bacto™tryptone , digestat enzymatique de caséine.
o
5.6.2 Extrait de levure en poudre (n CAS 8013-01-2).
5.7 Tampons et réactifs
5.7.1 Solution d’ampicilline, 2 g d’ampicilline sodique dans 4 ml de H O stérilisée à l’aide d’un filtre de
0,22 µm. Compléter à 20 ml avec de l’H O stérilisée, préparer des aliquotes de 1 ml et conserver à −20 °C.
−1
5.7.2 EDTA, 0,5 mol·l , 186,10 g d’EDTA dans 1 000 ml de H O, en ajustant le pH à 8,0 à l’aide de
−1
NaOH (10 mol·l ).
5.7.3 Agent intercalant SYBR Safe® permettant de visualiser l’ADN sur gel, diluer 10 000 X de
SYBR Safe® dans un tampon TBE × 1.
5.7.4 Solution mère d’IPTG, 1 g d’IPTG dans 8 ml de H O. Après l’avoir mélangée soigneusement,
la solution est complétée à 10 ml et stérilisée dans un poste de sécurité microbiologique. Préparer une
aliquote de 1 ml d’IPTG et la conserver à −20 °C. ®
5.7.5 Milieu LB solide, 10 g de Bacto tryptone , 5 g d’extrait de levure, 5 g de chlorure de sodium et
15 g de gélose, dans 1 000 ml de H O. Après autoclavage pendant 20 min à 120 °C, 1 ml d’une solution mère
−1
d’ampicilline à 100 mg·ml est ajouté au milieu LB et étalé dans des boîtes de Petri (20 ml) dans un poste de
sécurité microbiologique. 100 µl de solution d’IPTG sont étalés sur le milieu LB solide-ampicilline. Lorsque la
solution d’IPTG a pénétré le milieu LB-ampicilline, 20 µl de solution X-Gal sont étalés sur le milieu LB solide-
ampicilline. Le milieu LB solide est conservé à 4 °C jusqu’à son utilisation. ®
5.7.6 Milieu SOC, 20 g de Bacto tryptone , 5 g d’extrait de levure, 0,58 g de NaCl, 0,95 g de MgCl , 2,46 g
de MgSO et 3,60 g de glucose dans 1 l de H O. Stériliser à l’autoclave pendant 20 min à 120 °C. Préparer des
4 2
aliquotes de 950 ml et les conserver à −20 °C.
−1 −1
5.7.7 Tris-HCl, 1 mol·l , 121,14 g de Tris dans 1 000 ml de H O, en ajustant le pH à 8,0 avec du HCl 4 mol·l .
−1
5.7.8 Tampon TBE × 10, pH 8,0, 108 g de base Tris, 55 g d’acide borique et 40 ml d’EDTA 0,5 mol·l
(pH 8,0) dans 1 000 ml de H O.
5.7.9 Tampon TBE × 1, 100 ml de tampon TBE × 10 dans 900 ml de H O.
−1 −1
5.7.10 Tampon TE × 10, pH 8,0, 100 ml de Tris-HCl 1 mol·l à pH 8,0, 20 ml d’EDTA 50 mmol·l à pH 8,0
dans 880 ml d’eau de qualité biologie moléculaire.
5.7.11 Tampon TE × 1, 100 ml de tampon TE × 10 dans 900 ml de H O.
5.7.12 Solution X-gal, 250 mg de X-Gal dans 5 ml de diméthylformamide. Après homogénéisation,
préparer des aliquotes de 0,5 ml et les conserver à −20 °C.
6 Appareillage
Utiliser un matériel de laboratoire courant, notamment pipettes, centrifugeuse, poste de sécurité
microbiologique, hotte chimique, système d’électrophorèse horizontale, et les éléments suivants.
6.1 Thermocycleur approprié pour l’analyse qPCR, permettant de quantifier en temps réel des
amplicons générés à partir de diverses matrices d’ADN, avec une limite de détection théorique d’une copie
d’une séquence d’ADN cible dans la prise d’échantillon analysée.
6.2 Spectrophotomètre, permettant de quantifier l’ADN double brin à 260 nm.
6.3 Spectrofluorimètre, permettant de quantifier l’ADN double brin.
NOTE Un seul de ces deux appareils est requis pour estimer la concentration d’ADN.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l’essai de qPCR (tâche 1)
7.1.1 Généralités
L’essai de qPCR est basé sur la quantification des amplicons à la fin de chaque cycle de PCR en utilisant un
colorant d’ADN qui émet une fluorescence lorsqu’il est intercalé dans le double brin des amplicons. Le but
de cette tâche est de décrire la définition de l’amplicon approprié en vue d’un essai de qPCR (étape 1), de la
préparation de l’étalon de qPCR (étape 2) et de l’étalonnage de l’essai de qPCR (étape 3).
7.1.2 Création de l’amplicon (tâche 1, étape 1)
7.1.2.1 Généralités
La première étape vise à créer le jeu d’amorces oligonucléotidiques; il peut être conçu in silico à l’aide de
différents programmes en utilisant la séquence du gène microbien d’intérêt devant être quantifiée par qPCR
à partir d’extraits d’ADN de sol. La spécificité des amorces doit être vérifiée in silico en comparant leurs
4)
séquences à des séquences connues disponibles dans la base de données Genbank . Seules les amorces
spécifiques pour le gène cible doivent être prises en compte. 7.1.2.2 fournit des indications pour accompagner
la conception d’un jeu d’amorces oligonucléotidiques en vue d’un essai de qPCR.
7.1.2.2 qPCR
— La longueur optimale de l’amplicon est comprise entre 100 pb (jeux de base) et 250 pb.
— La longueur optimale des amorces est comprise entre 18 pb et 25 pb, avec une teneur en GC de 50 % et
une température de fusion comprise entre 58 °C et 65 °C.
— Il convient que les cinq nucléotides au niveau de l’extrémité 3‘ de chaque amorce ne contiennent pas plus
de deux bases G ou C.
— Éviter la succession de nucléotides identiques, en particulier pour la guanine.
— Il convient de vérifier et d’éviter l’auto-complémentarité 3‘ de l’amorce, indiquant sa tendance à former
des dimères avec elle-même.
— Éviter la conception d’amorces comportant plus de quatre mésappariements, car une dégénérescence
trop importante de l’amorce contribue à la fluctuation des résultats de qPCR.
7.1.3 Préparation des étalons de qPCR (tâche 1, étape 2)
L’étape 2 de la tâche 1 décrit le mode opératoire utilisé pour générer des étalons de qPCR ciblant une séquence
du gène microbien d’intérêt à partir de différentes matrices d’ADN (isolat bactérien ou fongique pur, ADN
environnemental ou ADN artificiel). Elle indique également le mode opératoire utilisé pour insérer l’étalon
de qPCR dans un vecteur de clonage, transformer Escherichia coli et purifier les plasmides recombinants
contenant l’étalon de qPCR en vue de leur utilisation ultérieure pour des essais de qPCR.
7.1.4 ADN d’isolat bactérien, ADN environnemental, ADN artificiel
7.1.4.1 Généralités
La première étape de la préparation d’étalons de qPCR repose sur l’extraction de matrices d’ADN connues
pour contenir le gène microbien d’intérêt. Elle peut être réalisée à partir de différentes matrices telles que:
a) des cultures pures de micro-organismes (l’ADN est extrait de cellules prélevées dans une culture fraîche
de micro-organismes en utilisant des protocoles d’extraction d’ADN génomique classiques);
b) de l’ADN artificiel.
Si aucun échantillon biologique n’est disponible ou connu pour contenir le gène d’intérêt, il est possible de
synthétiser de l’ADN artificiel constitué de la séquence du gène d’intérêt.
Dans tous les cas, la qualité de la matrice d’ADN utilisée pour amplifier l’étalon de qPCR par PCR doit être
vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 1 % dans un tampon TBE, coloré avec un agent intercalant ®
approprié (par exemple SYBR Safe ). La concentration d’ADN est mesurée par spectrophotométrie à 260 nm.
−1
La matrice d’ADN est diluée à 10 ng·µl dans un volume final de 20 µl et conservée à −20 °C.
La séquence étalon de qPCR est amplifiée par PCR en utilisant un jeu d’amorces spécifique conçu conformément
aux recommandations données en 7.1.2.2 (tâche 1, étape 1). La réaction d’amplification est réalisée dans
4) https:// www .ncbi .nlm .nih .gov/ genbank/
−1
un volume final de 25 µl contenant 2,5 µl de tampon Taq polymérase 10 × , 200 µmol·l de chaque dNTP,
−1 −1
1,5 mmol·l de MgCl , 0,5 µmol·l de chaque amorce et 0,625 U de Taq polymérase. Un volume de 2,5 µl
d’ADN (soit 25 ng d’ADN) est utilisé comme matrice pour les PCR. La PCR est réalisée dans un thermocycleur
conformément aux recommandations du fournisseur du kit qPCR. À titre d’exemple, le programme suivant
peut être utilisé: un cycle de 4 min à 94 °C, 39 cycles de 1 min à 94 °C, 1 min à la température d’hybridation
propre à l’amplicon étalon de qPCR et 1,5 min à 72 °C, puis une étape finale d’élongation à 72 °C pendant 5 min.
La taille attendue de l’amplicon étalon de qPCR est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 2 % dans ®
un tampon TBE coloré avec un agent intercalant approprié (par exemple SYBR Safe ). Les amplicons sont
purifiés sur gel par des méthodes appropriées ou en utilisant des colonnes de chromatographie d’exclusion
pour éliminer les amorces. Les amplicons purifiés sont ensuite quantifiés par spectrophotométrie à 260 nm
ou par spectrofluorimétrie.
7.1.4.2 Clonage, préparation des dilutions d’étalon de qPCR
7.1.4.2.1 Ligature d’un amplicon d’étalon de qPCR
Pour une réaction de ligation optimale de l’amplicon dans le vecteur de clonage, il convient d’utiliser un
rapport molaire de 3:1. La masse de produit de PCR à utiliser pour la ligature peut être calculée à l’aide de la
Formule (1):
mn
ADNp lasmidique× insert
Q =×3 (1)
n
plasmide
où
Q est la masse de produit de PCR, en nanogrammes (ng);
m est la masse d’ADN plasmidique, en nanogrammes (ng);
ADN plasmidique
n est la taille de l’insert, en pb;
insert
n est la taille du plasmide, en pb.
plasmide
Compte tenu d’une taille de plasmide de 3 000 pb, d’un insert ARNr 16S de 200 pb et de 50 ng d’ADN
plasmidique par réaction de ligation, la quantité d’amplicon de PCR à utiliser par réaction de ligation en
utilisant la Formule 1) est:
50×200
Q= ×=310
La réaction de ligation est réalisée avec la quantité requise d’amplicon purifié d’étalon de qPCR (Q), 50 ng
d’ADN plasmidique, 5 µl de tampon de réaction de ligation 2 × , 3 U de T4 ADN ligase et suffisamment d’eau
de qualité biologie moléculaire pour atteindre un volume final de 10 µl. La réaction de ligation est conduite à
4 °C pendant toute une nuit ou, pour une T4 ADN ligase appropriée, une heure à température ambiante.
L’efficacité de la ligation est vérifiée par électrophorèse en chargeant 1 µl de plasmide ligué et de plasmide
ouvert (c’est-à-dire 5 ng de plasmide) sur un gel d’agarose à 1 % dans un tampon TBE et coloré par un agent
intercalant approprié. Le plasmide ligué est caractérisé par une plus courte migration dans le gel d’agarose.
7.1.4.2.2 Transformation d’Escherichia coli compétente
Des cellules E. coli compétentes sont transformées par un choc thermique comme décrit ci-dessous.
8 −1
Des cellules compétentes (10 ufc·µg d’ADN) fraîchement décongelées sont incubées pendant 5 min sur
de la glace. Ensuite, 1 µl du réactif de ligation est ajouté aux cellules, mélangé doucement et incubé pendant
20 min sur de la glace. Les cellules bactériennes sont alors soumises à un choc thermique par une incubation
de 50 s à 42 °C, immédiatement suivie d’une incubation de 2 min sur de la glace. Ensuite, 950 µl de milieu SOC
−1
sont ajoutés et les cellules bactériennes sont incubées à 37 °C sous agitation à 150 min pendant 1 h. Des
aliquotes de cellules bactériennes de 100 µl sont étalées sur un milieu LB/Amp/IPTG/X-Gal solide (5.7.5).
Les boîtes de Petri sont ensuite incubées à 37 °C pendant toute une nuit.
7.1.4.2.3 Criblage de clone recombinant
Les boîtes de Petri sont placées à 4 °C pendant plusieurs heures pour accentuer la coloration des colonies
bactériennes. Des colonies blanches sont prélevées, étalées sur un milieu LB/Amp/IPTG/X-Gal solide et
incubées pendant toute une nuit à 37 °C. Plusieurs colonies blanches sont prélevées et suspendues dans
100 µl d’eau de qualité biologie moléculaire. Une PCR est réalisée pour confirmer la présence de l’insert
dans le clone recombinant. L’insert est amplifié par PCR en utilisant des amorces SP6 (5’−ATT TAG GTG ACA
CTA TAG−3’) et T7 (5’−TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG−3’). La réaction d’amplification est réalisée dans
−1
un volume final de 25 µl contenant 2,5 µl de tampon Taq polymérase 10 × , 200 µmol·l de chaque dNTP,
−1 −1
1,5 mmol·l de MgCl , 0,5 µmol·l de chaque amorce et 0,625 U de Taq polymérase. Un volume de 2,5 µl
de chaque suspension bactérienne est utilisé comme matrice pour les PCR. La PCR est réalisée dans un
thermocycleur conformément au programme suivant: un cycle de 4 min à 94 °C, 35 cycles de 45 s à 94 °C,
45 s à 55 °C, et 1,5 min à 72 °C; et une étape finale d’élongation à 72 °C pendant 5 min. La taille de l’amplicon
de qPCR attendu est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 2 % dans un tampon TBE coloré avec un
agent intercalant approprié.
7.1.4.2.4 Purification et linéarisation du plasmide recombinant
Les clones recombinants, de couleur blanche et confirmés par PCR, sont inoculés dans 10 ml d’un
−1
milieu LB/Amp liquide incubés à 37 °C sous agitation (150 min ) pendant toute une nuit. Le plasmide
recombinant est purifié à partir de 2 ml de suspension cellulaire en utilisant une mini-préparation classique.
L’ADN plasmidique est ensuite quantifié par spectrophotométrie à 260 nm et des aliquotes sont préparées et
conservées à −20 °C jusqu’à leur utilisation.
Le plasmide est linéarisé par une enzyme de restriction présentant un seul site de restriction dans la
séquence du plasmide. L’utilisateur doit s’assurer que l’enzyme de restriction choisie ne coupe pas aussi
l’insert. La digestion du plasmide est réalisée pendant toute une nuit à 37 °C dans un volume final de 10 µl
contenant 250 ng de plasmide recombinant, 0,5 U d’enzyme de restriction, 1 µl de tampon pour enzyme
de restriction 10 × et de l’eau de qualité biologie moléculaire. L’efficacité de la restriction du plasmide est
vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %. Le plasmide linéarisé est conservé à −20 °C et utilisé
comme solution mère pour préparer une série de dilutions de l’étalon de qPCR utilisée pour étalonner l’essai
de qPCR.
La concentration en ADN du plasmide linéarisé est mesurée par spectrophotométrie à 260 nm ou par
spectrofluorimétrie afin de déterminer le nombre de copies du plasmide. Cette opération peut être facilitée
5)
par l’utilisation d’un calculateur en ligne tel qu’Oligocalc . À partir de cette solution mère, une solution
initiale contenant 0,5 × 10 copies de l’étalon de qPCR par µl est préparée dans 100 µl d’eau de qualité
biologie moléculaire. Une série de dilutions au dixième est ensuite préparée pour atteindre 0,5 × 10 copies
du plasmide par µl. Des dilutions intermédiaires supplémentaires peuvent également être préparées en
fonction de la gamme dans laquelle les nombres de copies du gène cible sont attendus.
7.1.5 Étalonnage de la qPCR (tâche 1, étape 3)
7.1.5.1 Généralités
La procédure utilisée pour générer la courbe d’étalonnage et évaluer l’efficacité de l’essai de qPCR est décrite
en 7.1.5.2 et 7.1.5.3.
7.1.5.2 Essai de qPCR
8 1
L’étalonnage de l’essai de qPCR est réalisé sur une série de dilutions de l’étalon cloné (allant de 10 à 10 copies
par µl) en utilisant un jeu d’amorces ciblant le gène d’intérêt. La réaction d’amplification est réalisée dans
−1
un volume final de 15 µl contenant 2 µl d’étalon de plasmide, 1 µmol·l de chaque amorce, 7,5 µl du mélange
maître Taq 2 × ou 1,5 µl du mélange maître Taq 10 × contenant un colorant fluorescent se fixant à l’ADN, les
dNTPs, du MgCl et la Taq polymérase, et de l’eau de qualité moléculaire. La réaction qPCR est réalisée dans
un thermocycleur en temps réel conformément aux recommandations du fournisseur du kit qPCR. À titre
d’exemple, le programme suivant peut être utilisé: un cycle de 15 min à 95 °C, 35 cycles de 30 s à 95 °C, 30 s
5) https:// bio .tools/ oligocalc
à la température d’hybridation appropriée, 30 s à 72 °C et 30 s à 80 °C au cours desquels la fluorescence est
collectée à la fin de chaque cycle PCR et une étape finale de dissociation en augmentant la température de
80 °C à 95 °C. La température à laquelle la fluorescence est mesurée doit être inférieure à la température de
fusion de l’amplicon. L’étalonnage de la qPCR est réalisé en trois exemplaires et trois témoins négatifs (NTC)
sont également inclus.
7.1.5.3 Détermination de la courbe d’étalonnage et calcul de l’efficacité de la qPCR
À la fin de l’essai de qPCR, les résultats sont analysés en utilisant le programme fourni avec le thermocycleur.
Afin de valider la qPCR, les points suivants doivent être observés:
a) aucune amplification pour les témoins négatifs (NTC);
b) un seul pic de dissociation pour chaque dilution de l’étalon qPCR;
c) une courbe d’étalonnage linéaire avec r supérieur ou égal à 98 %.
La courbe d’étalonnage de la qPCR donne le nombre de Ct en fonction du nombre (log) de copies de la
séquence étalon.
Les valeurs déterminées à partir de la courbe d’étalonnage à l’aide de la Formule (2) sont utilisées pour
calculer l’efficacité de l’essai de qPCR à l’aide de la Formule (3).
Ct =⋅aq+c (2)
où
Ct est le cycle seuil mesuré;
q est le nombre de copies de la séquence étalon de la qPCR;
a est la pente de la courbe d’étalonnage;
c est l’ordonnée à l’origine (Ct pour 1 copie de l’étalon de qPCR).
−1/a
()
E =−10 1 (3)
où
E est l’efficacité de la courbe d’étalonnage;
a est la pente de la courbe d’étalonnage.
Les utilisateurs doivent être conscients qu’une courbe d’étalonnage ayant une pente égale à −3,32 correspond
à une efficacité de 100 %. Une dilution au demi ou au dixième d’une matrice d’ADN donnée donne une
8 7
différence de Ct de 1 ou de 3,3 respectivement (c’est-à-dire 10 Ct = 10 et 10 Ct = 13,3) pour un essai de
qPCR efficace à 100 %.
7.2 Préparation d’une matrice d’ADN du sol et essai d’inhibition (tâche 2)
7.2.1 Généralités
Cette tâche décrit le mode opératoire utilisé pour préparer une matrice d’ADN et pour vérifier la présence
d’inhibiteurs de la Taq polymérase dans les extraits d’ADN utilisés comme matrice pour l’essai de qPCR.
Cet essai d’inhibition doit être réalisé pour valider la qualité des extraits d’ADN et permettre leur utilisation
comme matrice pour mener des essais de qPCR.
7.2.2 Préparation de l’ADN du sol (tâche 2, étape 4)
L’étape 4 de la tâche 2 décrit le mode opératoire utilisé pour extraire l’ADN d’échantillons de sol.
Les échantillons de sols doivent être échantillonnés, manipulés et conservés conformément
...
Questions, Comments and Discussion
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