ISO 11268-2:2023

NORME ISO
INTERNATIONALE 11268-2
Troisième édition
2023-01
Qualité du sol — Effets des polluants
vis-à-vis des vers de terre —
Partie 2:
Détermination des effets sur la
reproduction de Eisenia fetida/Eisenia
andrei et d’autres espèces de vers de
terre
Soil quality — Effects of pollutants on earthworms —
Part 2: Determination of effects on reproduction of Eisenia fetida/
Eisenia andrei and other earthworm species
Numéro de référence
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Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 3
5 Réactifs et matériaux . 4
6 Appareillage . 6
7 Mode opératoire . 7
7.1 Plan d’expérimentation . 7
7.1.1 Généralités . 7
7.1.2 Essai préliminaire . 7
7.1.3 Essai définitif . 7
7.2 Préparation des mélanges d’essai . 8
7.2.1 Essai sur sols pollués . 8
7.2.2 Essais sur substances ajoutées au sol témoin . 8
7.2.3 Préparation des récipients témoins . 9
7.3 Introduction des vers de terre . 9
7.4 Conditions d’essai et mesurages . 10
7.5 Substance de référence . 10
8 Calcul et expression des résultats .10
8.1 Calcul . 10
8.2 Expression des résultats . 10
9 Validité de l’essai .11
10 Analyse statistique .11
10.1 Généralités . 11
10.2 Essais à une seule concentration . 11
10.3 Essais à plusieurs concentrations.12
10.3.1 Essai préliminaire .12
10.3.2 Essai définitif .12
11 Rapport d’essai .13
Annexe A (informative) Détermination de la toxicité chronique des substances chimiques
pour Eisenia fetida/Eisenia andrei dans des conditions tropicales .14
Annexe B (informative) Modes opératoires d’élevage et d’essai pour évaluer les effets de
polluants sur la production de jeunes en utilisant Dendrodilus rubiduscomme vers
de terre .16
Annexe C (informative) Modes opératoires d’élevage et d’essai pour évaluer les effets
de polluants sur la survie des adultes et la production et l’éclosabilité de cocons
en utilisant Aporrectodea caliginosa s.s., comme vers de terre .20
Annexe D (informative) Élevage d’Eisenia fetida et d’Eisenia andrei .24
Annexe E (normative) Détermination de la capacité de rétention d’eau .25
Annexe F (informative) Techniques de comptage des vers juvéniles éclos des cocons .26
Annexe G (informative) Retour d’expérience concernant les critères de performance de
l’essai .27
Bibliographie .34
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire
l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour
responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de brevets. Les détails concernant les références
aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration du
document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 444, Méthodes d’essai pour
la caractérisation environnementale des matrices solides, du Comité européen de normalisation (CEN),
conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 11268-2:2012), qui a fait l’objet
d’une révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— modification de la concentration de la substance de référence (acide borique);
— ajout d’autres espèces de vers de terre (Dendrodrilus rubidus, Aporrectodea caliginosa) dans des
annexes informatives; des informations sur leur taxonomie et leur écologie ainsi que leurs exigences
d’essai spécifiques ont été ajoutées.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 11268 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
Des systèmes d’essais d’écotoxicité sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur les effets des
polluants présents dans le sol et sont proposés en complément d’une analyse chimique conventionnelle
(voir l’ISO 15799 et l’ISO 17616). L’ISO 15799 comprend une liste et une brève caractérisation des
systèmes d’essais recommandés et normalisés et l’ISO 17616 donne des recommandations relatives
au choix et à l’évaluation des essais biologiques. Les systèmes d’essais aquatiques sur éluat de sol sont
mis en œuvre pour obtenir des informations sur la fraction des polluants susceptibles d’atteindre les
eaux souterraines par le mouvement de l’eau (fonction de rétention des sols), alors que les systèmes
d’essais terrestres sont utilisés pour évaluer la fonction d’habitat des sols.
Le présent document décrit une méthode basée sur la détermination des effets sublétaux des sols
pollués pour des vers de terre adultes des espèces Eisenia fetida (Savigny 1826) et Eisenia andrei (André
1963). La méthode peut éventuellement être utilisée pour évaluer le potentiel toxique aigu pour les
vers de terre de produits chimiques ajoutés à un sol standard (par exemple un sol artificiel). En dernier
lieu, des informations sont fournies sur la manière d’utiliser cette méthode pour évaluer des produits
chimiques ou un sol d’essai dans des conditions tropicales (voir l’Annexe A).
Eisenia fetida et Eisenia andrei sont considérés comme étant représentatifs de la faune du sol et des
vers de terre en particulier des régions tempérées. Des informations de base sur leur écologie de vers
de terre et leur usage dans le cadre d’essais d’écotoxicité sont disponibles. Toutefois, ces espèces ne
sont pas systématiquement présentes dans les sols agricoles (sites de culture et pâturages) ou dans les
forêts de ces régions. De plus, elles ne sont pas représentatives des régions boréales ou tropicales. Par
conséquent, d’autres espèces telles que Dendrodilus rubidus (une espèce épigée de litière des régions
boréales) et Aporrectodea caliginosa (une espèce endogée des sols minéraux des régions tempérées)
ont été ajoutées à titre d’autres espèces d’essai possibles (voir les Annexes B et C). Ces autres espèces
de vers de terre sont utilisées depuis longtemps pour les essais d’écotoxicité, toutefois leur usage s’est
limité à certains pays.
Le présent document a été élaboré en tenant compte des modes opératoires d’essai adoptés par
[45][46] [29]
l’Organisation de coopération et de développement économiques et par l’Union européenne .
v
NORME INTERNATIONALE ISO 11268-2:2023(F)
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de
terre —
Partie 2:
Détermination des effets sur la reproduction de Eisenia
fetida/Eisenia andrei et d’autres espèces de vers de terre
AVERTISSEMENT — Les sols pollués peuvent contenir des mélanges inconnus de produits
chimiques toxiques, mutagènes ou nocifs d’une autre manière ou des micro-organismes
infectieux. Des risques pour la santé au travail peuvent survenir en raison de la poussière ou
de l’évaporation de produits chimiques pendant la manipulation et l’incubation. Il convient
de prendre des mesures pour éviter tout contact avec la peau.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie l’une des méthodes permettant d’évaluer la fonction d’habitat des sols et
de déterminer les effets de polluants et de produits chimiques présents dans le sol sur la reproduction
d’Eisenia fetida/Eisenia andrei par absorption cutanée et ingestion. Cet essai chronique s’applique aux
sols et aux matériaux de type sol de qualité inconnue, provenant par exemple de sites pollués, de sols
amendés, de sols après dépollution, de sols agricoles ou autres sites d’intérêt et de déchets.
Cette méthode est principalement destinée à déterminer les effets de polluants et de produits chimiques
présents dans le sol sur la reproduction d’Eisenia fetida/Eisenia andrei. Des informations techniques
sont également fournies sur la manière d’utiliser Eisenia fetida/andrei pour évaluer des produits
chimiques dans des conditions tropicales (voir l’Annexe A). Enfin, cette méthode intègre également des
informations techniques sur la manière de l’utiliser avec d’autres espèces de vers de terre pertinentes
sur le plan environnemental: par exemple, Dendrodrilus rubidus et Aporrectodea caliginosa (voir les
Annexes B et C).
Cette méthode ne s’applique ni aux substances pour lesquelles le coefficient de partage air/sol
est supérieur à un, ni aux substances pour lesquelles la pression de vapeur à 25 °C excède 300 Pa.
Cette méthode ne tient pas compte de la rémanence de la substance pendant l’essai.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 10390, Sols, biodéchets traités et boues — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d'échange cationique et du taux de saturation en
bases échangeables à l'aide d'une solution de chlorure de baryum
ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des
sols — Méthode par tamisage et sédimentation
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
ISO 18400-206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206: Collecte, manipulation et conservation de
sols destinés à l'évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et structurels en laboratoire
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/ .
3.1
polluant
substance ou agent présent(e) dans le sol et résultant de l’activité humaine
[SOURCE: ISO 15176:2019, 3.2.6]
3.2
croissance
augmentation de la biomasse (c’est-à-dire la masse fraîche des organismes)
Note 1 à l'article: Elle est exprimée en pourcentage de la masse fraîche des organismes au début de l’essai.
3.3
reproduction
nombre moyen de jeunes produits par récipient d’essai après huit semaines d’incubation dans des
conditions d’essai spécifiées
3.4
RE
x
CE
x
taux efficace
concentration efficace
taux ou concentration de l’échantillon pour essai ou de la substance d’essai auquel ou à laquelle
la reproduction (3.3) est réduite de x % par rapport au témoin
3.5
essai limite
essai à une seule concentration comprenant au moins quatre réplicats pour chacun, l’échantillon pour
essai sans dilution ou la plus forte concentration de substances d’essai mélangées dans le sol témoin
(3.10) et le témoin
3.6
RMEO
CMEO
plus faible taux ayant un effet observé
plus faible concentration ayant un effet observé
pourcentage le plus faible d’un échantillon pour essai dans un sol témoin (3.10), ou concentration la plus
faible d’une substance, pour lequel (laquelle) un effet statistiquement significatif est observé
Note 1 à l'article: La CMEO est exprimée en pourcentage de masse sèche de sol d’essai par masse sèche de mélange
d’essai. Tous les mélanges d’essai (3.11) supérieurs à la CMEO ont un effet dommageable supérieur ou égal à celui
observé à la CMEO. Si cette condition ne peut pas être satisfaite, il convient d’expliquer comment la CMEO et
la CSEO (3.7) ont été choisies.
3.7
RSEO
CSEO
taux sans effet observé
concentration sans effet observé
pourcentage de sol d’essai immédiatement inférieur au RMEO/à la CMEO ou concentration d’essai la
plus élevée d’une substance soumise à essai qui, comparée au témoin, n’a aucun effet létal ou autre
effet statistiquement significatif, tel qu’une réduction de la reproduction (3.3) ou une modification de la
masse (probabilité d’erreur: p < 0,05)
Note 1 à l'article: La CSEO est exprimée en pourcentage de masse sèche du sol d’essai par masse sèche du mélange
d’essai.
3.8
sol de référence
sol non pollué spécifique du site (par exemple prélevé au voisinage d’un site pollué) ayant des propriétés
similaires (concentrations d’éléments nutritifs, pH, teneur en carbone organique et texture) à celles
du sol soumis à essai
3.9
sol standard
sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les principales propriétés (par exemple pH, texture,
teneur en matières organiques) se situent dans une gamme connue
[29] [46] [40]
EXEMPLE Euro-Soils, artificial soil, LUFA standard soil .
Note 1 à l'article: Les propriétés des sols standard peuvent différer de celles du sol d’essai.
3.10
sol témoin
sol de référence (3.8) ou sol standard (3.9) utilisé comme témoin et comme milieu pour préparer une
gamme de dilutions avec les échantillons pour essai ou une substance de référence qui satisfait aux
critères de validité
Note 1 à l'article: Pour un sol naturel, il est recommandé de démontrer sa capacité à être utilisé pour un essai et
à atteindre les critères de validité de l’essai avant de l’utiliser dans un essai définitif.
3.11
mélange d’essai
mélange d’un sol pollué ou de la substance soumise à essai avec un sol témoin (3.10)
Note 1 à l'article: Les mélanges d’essai sont donnés en pourcentage de sol pollué sur la base de la masse sèche
du sol.
4 Principe
Les effets sur la reproduction de vers de terre adultes (espèce Eisenia fetida ou Eisenia andrei) exposés
au sol soumis à essai sont comparés à ceux observés pour des échantillons exposés à un sol témoin.
Le cas échéant, les effets sont déterminés sur la base de l’exposition à une gamme de dilutions du sol
pollué ou à une gamme de concentrations de la substance soumise à essai. De plus, les observations
relatives à la croissance et à la survie des vers de terre adultes sont consignées. Les mélanges d’essai
sont préparés au début de l’essai et ne sont pas renouvelés au cours de la période d’essai.
Au bout de quatre semaines, les vers adultes sont retirés des récipients d’essai et les effets sur la
mortalité et la biomasse sont mesurés par comptage et pesée. L’effet sur la reproduction, qui constitue
le critère d’effet final, est mesuré en comptant le nombre de jeunes éclos des cocons après une période
supplémentaire de quatre semaines. Les résultats obtenus lors des essais sont comparés à ceux obtenus
avec un sol témoin ou, le cas échéant, sont utilisés pour déterminer respectivement les dilutions ou les
concentrations qui ne provoquent pas d’effet sur la biomasse, la mortalité et la reproduction (RSEO/
CSEO) ainsi que la dilution (concentration) entraînant une réduction de x % du nombre de jeunes éclos
des cocons par rapport au témoin (RE /CE , 56 jours).
x x
Lorsqu’une gamme de dilutions ou de concentrations est soumise à essai, toutes les dilutions/
concentrations d’essai supérieures au RMEO/à la CMEO doivent avoir un effet dommageable supérieur
ou égal à celui observé au RMEO/à la CMEO. Lorsque la dilution/concentration à laquelle le sol soumis
à essai/la substance d’essai est susceptible de produire un effet n’est pas connue, il est recommandé de
conduire l’essai en deux étapes:
— un essai préliminaire est réalisé conformément à l’ISO 11268-1 pour obtenir une indication de
la dilution/concentration produisant un effet et de la dilution/concentration ne provoquant pas
de mortalité (RSEO/CSEO); les dilutions/concentrations à utiliser au cours de l’essai définitif peuvent
ensuite être choisies;
— un essai définitif pour déterminer les effets sublétaux du (des dilutions de) sol pollué ou de la
concentration de la substance chimique qui, lorsqu’il (elle) est uniformément réparti(e) dans
le sol standard, n’a pas d’effet significatif sur le nombre de jeunes éclos des cocons comparé au
témoin (RSEO/CSEO) et la plus faible concentration produisant un effet (RMEO/CMEO).
NOTE Un sol de référence est utilisé pour démontrer l’état approprié de la population soumise à essai et
éviter toute mauvaise interprétation des résultats.
Les effets des substances sont évalués à l’aide d’un sol standard, de préférence un substrat de sol
artificiel défini. Pour les sols pollués, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un sol
témoin. Selon l’objectif de l’étude, il convient que le substrat témoin et de dilution (gamme de dilutions
d’un sol pollué) soit un sol non pollué comparable à l’échantillon de sol à évaluer (sol de référence) ou un
sol standard (par exemple un sol artificiel).
D’autres espèces de vers de terre et leurs exigences respectives sont ajoutées sous la forme d’annexes
spécifiques dans le présent document:
— Dendrodrilus rubidus (voir l’Annexe B);
— Aporrectodea caliginosa (voir l’Annexe C).
5 Réactifs et matériaux
5.1 Matériel biologique, constitué de vers de terre adultes de l’espèce Eisenia fetida ou
[32][36][37]
Eisenia andrei , âgés de trois mois à un an, possédant un clitellum et dont la masse humide est
comprise entre 300 mg et 600 mg (E. fetida) ou entre 250 mg et 600 mg (E. andrei). Il est recommandé
de vérifier l’identité de la variété utilisée pour éviter toute erreur d’identification de l’espèce.
L’identification par codes-barres ADN décrite dans l’ISO 21286est adaptée à cette finalité.
NOTE 1 Lors de l’essai circulaire réalisé pour valider l’ISO 21286, seuls 17 des 28 laboratoires impliqués
(61 %) ont correctement identifié leur élevage de laboratoire de vers de compost. La plupart des laboratoires qui
ne sont pas parvenus à identifier leur élevage ou qui ne l’ont pas identifié correctement avaient un élevage d’E.
[57]
Andrei ou un mélange des deux espèces .
Sélectionner les vers à utiliser pour l’essai de manière à obtenir, dans la mesure du possible,
une population homogène du point de vue de l’âge, de la taille et de la masse. Il convient de préférence
de sélectionner les vers dans un élevage synchrone ayant une structure d’âge relativement homogène.
Laver les vers à l’eau potable avant l’essai.
NOTE 2 Un exemple de technique d’élevage d’Eisenia fetida/Eisenia andrei est donné à l’Annexe D.
Avant l’utilisation, conditionner les vers sélectionnés pendant 1 jour à 7 jours dans un sol standard
ou un sol témoin. La nourriture, qui est également utilisée comme source d’alimentation dans le cadre
de l’essai (voir 5.4), doit être dispensée en quantité suffisante (voir 7.4).
5.2 Échantillon soumis à essai, qui peut être constitué d’un sol prélevé sur le terrain ou d’un sol
témoin amendé par le mélange d’essai.
L’échantillon ou les échantillons peuvent être un sol prélevé sur un site industriel, agricole ou autre site
d’intérêt, ou des déchets (par exemple, matériau de dragage, boues provenant d’une station d’épuration
des eaux urbaines, matériau composté ou fumier) pour lesquels une éventuelle mise en dépôt terrestre
est envisagée.
Les échantillons pour essai doivent être tamisés à 4 mm et soigneusement mélangés. Si nécessaire, le sol
peut être séché à l’air sans chauffage avant le tamisage. Il convient que la conservation des échantillons
pour essai soit aussi courte que possible. Conserver le sol conformément à l’ISO 18400-206 en utilisant
des récipients qui réduisent au minimum les pertes de polluants du sol par volatilisation et sorption
sur les parois des récipients. Il convient de ne pas corriger le pH du sol car il peut avoir une incidence
sur la biodisponibilité des polluants du sol.
Pour l’interprétation des résultats d’essai, les caractéristiques suivantes doivent être déterminées pour
chaque échantillon de sol prélevé sur le terrain:
— pH conformément à l’ISO 10390;
— texture (sable, limon, vase) conformément à l’ISO 11277;
— teneur en eau conformément à l’ISO 11465;
— capacité de rétention d’eau conformément à l’Annexe E;
— capacité d’échange cationique conformément à l’ISO 11260;
— carbone organique conformément à l’ISO 10694.
Il convient également de mesurer la capacité de rétention d’eau de tous les mélanges utilisés dans l’essai.
5.3 Sol témoin, soit a) sol de référence, soit b) sol standard permettant la présence de vers de terre.
a) Si des sols de référence provenant de zones non polluées voisines d’un site pollué sont disponibles,
il convient de les traiter et de les caractériser de la même manière que les échantillons soumis
à essai. S’il n’est pas possible d’exclure une pollution toxique ou des propriétés inhabituelles du sol,
il convient de préférer des sols témoins standard.
b) Pour évaluer les effets de substances mélangées au sol ou pour préparer les dilutions de l’échantillon
soumis à essai, des sols standard doivent être utilisés pour préparer l’échantillon pour essai. Les
propriétés du sol standard prélevé sur le terrain doivent être consignées dans le rapport.
Le substrat appelé «sol artificiel» peut être utilisé comme un sol standard et a la composition suivante:
Pourcentage exprimé
en masse sèche
— Tourbe de sphaignes, finement broyée, exempte de tout résidu végétal visible 10 %
— Argile kaolinique contenant au moins 30 % de kaolinite 20 %
— Sable de quartz industriel (contenant en majorité du sable fin, constitué à plus 69 %
de 50 % de grains de granulométrie comprise entre 0,05 mm et 0,2 mm)
Environ 0,3 % à 1,0 % de carbonate de calcium (CaCO , pulvérisé, de qualité analytique) est nécessaire
pour obtenir un pH de 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Afin de prendre en compte les propriétés des substances fortement non polaires [log K > 2, où K
ow ow
est le coefficient de partage (octanol/eau)] ou ionisantes, 5 % de tourbe se sont révélés suffisants pour maintenir
la structure souhaitée du sol artificiel.
NOTE 2 Il a été démontré qu’Eisenia fetida peut respecter les critères de validité en ce qui concerne la survie
des adultes et la reproduction des jeunes vers, lorsqu’il est soumis à essai dans des sols ayant une plus faible
[20]
teneur en carbone organique (par exemple 2,7 %) , et des expériences prouvent que cette teneur peut être
obtenue dans un sol artificiel avec 5 % de tourbe. Par conséquent, avant d’utiliser un tel sol dans un essai définitif,
il n’est pas nécessaire de démontrer que le sol artificiel permet de respecter les critères de validité, sauf si la
[30]
teneur en tourbe est inférieure à 5 % .
Préparer le sol artificiel au moins trois jours avant le début de l’essai, en mélangeant soigneusement
les constituants secs dans un mélangeur de laboratoire de grandes dimensions. Une partie de l’eau
déionisée requise est ajoutée pendant le mélange. Il convient de tenir compte de l’eau qui est utilisée
pour introduire le mélange d’essai dans le sol. La quantité de carbonate de calcium requise peut varier
selon les propriétés du lot particulier de tourbe de sphaignes et il convient qu’elle soit déterminée
par des mesurages effectués sur des sous-échantillons immédiatement avant l’essai. Conserver le
sol artificiel mélangé à température ambiante pendant au moins deux jours pour équilibrer l’acidité.
Pour déterminer le pH et la capacité maximale de rétention d’eau, le sol artificiel sec est pré-humidifié
un jour ou deux jours avant le début de l’essai en ajoutant de l’eau déionisée de manière à atteindre
approximativement la moitié de la teneur finale en eau requise correspondant de 40 % à 60 % de
la capacité maximale de rétention d’eau.
La capacité totale de rétention d’eau est déterminée conformément à l’Annexe E; le pH est déterminé
conformément à l’ISO 10390.
5.4 Alimentation. Est considéré comme acceptable tout aliment dont la qualité s’est révélée
appropriée pour le maintien, au minimum, de la masse des vers pendant l’essai. L’expérience a montré
[37]
que la farine d’avoine, la poudre de pomme de terre écrasée , la bouse de vache ou le crottin de cheval
constitue un aliment adéquat. Il convient de procéder à des contrôles afin de s’assurer que les vaches
ou les chevaux produisant ce fumier ne sont pas traités par des médicaments ou d’autres substances, tels
que des activateurs de croissance, des nématicides ou des produits vétérinaires comparables pouvant
avoir un effet nocif sur les vers pendant l’essai. Le fumier recueilli en milieu naturel est recommandé,
car l’expérience a montré que la bouse de vache disponible dans le commerce, utilisée comme engrais
dans les jardins, peut avoir des effets nocifs sur les vers. Il convient que le fumier soit séché à l’air,
finement broyé et pasteurisé avant l’emploi.
Avant utilisation, il convient de contrôler la qualité de chaque lot de nourriture fraîche en le donnant
à un élevage de vers non soumis à essai. Il convient que la croissance et la production de cocons
ne diminuent pas par rapport à celles de vers élevés dans un substrat ne contenant pas le nouveau lot de
[45]
nourriture (conditions telles que décrites dans l’OCDE 207 ).
5.5 Acide borique, utilisé comme substance de référence.
6 Appareillage
Le matériel courant de laboratoire et ce qui suit doivent être utilisés.
6.1 Récipients d’essai. Il convient d’utiliser des récipients en verre ou autre matériau chimiquement
inerte, de capacité comprise environ entre 1 l et 2 l. Il convient que les récipients aient une section
transversale d’environ 200 cm de manière à atteindre une hauteur de substrat humide d’environ 5 cm
à 6 cm lorsque 500 g de substrat équivalent sec sont ajoutés. Les récipients d’essai doivent permettre
les échanges gazeux entre le milieu et l’atmosphère ainsi que le passage de la lumière (par exemple
au moyen d’un couvercle transparent perforé). Ils doivent être conçus de manière à empêcher les vers
de terre de s’échapper (par exemple en fixant le couvercle à l’aide de ruban adhésif).
6.2 Apparatus to determine the dry mass of the substrate, in accordance with ISO 11465.
6.3 Mélangeur de laboratoire de grandes dimensions, pour la préparation de l’échantillon soumis
à essai (5.2).
6.4 Balance, ayant une précision d’au moins 1 mg.
6.5 Membrane de polyéthylène, perforée de petits trous pour permettre les échanges entre
l’échantillon et l’atmosphère.
6.6 Environnement d’essai.
6.6.1 Enceinte, thermostatée à (20 ± 2) °C.
6.6.2 Source lumineuse (par exemple, tubes fluorescents blancs), permettant de soumettre les
récipients à une intensité lumineuse constante de 400 lx à 800 lx, selon un cycle contrôlé lumière/
obscurité compris entre 12 h:12 h et 16 h:8 h.
7 Mode opératoire
7.1 Plan d’expérimentation
7.1.1 Généralités
Un échantillon de sol d’essai prélevé sur le terrain peut être soumis à essai à une seule concentration
(généralement 100 %) ou faire l’objet d’une évaluation de sa toxicité lors d’un essai à plusieurs
concentrations pour lequel une gamme de dilutions est préparée en mélangeant des quantités calculées
avec un sol témoin. Lorsque des substances sont soumises à essai, une gamme de concentrations
est préparée en mélangeant des quantités de la substance soumise à essai avec un sol standard
(par exemple le sol artificiel). Les concentrations sont exprimées en milligrammes de substance d’essai
par kilogramme de sol témoin équivalent sec.
Selon la connaissance des niveaux de réponse pertinents, un essai préliminaire peut précéder l’essai
définitif. Chaque essai définitif comprend une gamme de mélanges de sols (traitements).
7.1.2 Essai préliminaire
L’essai préliminaire permettant de déterminer la gamme de ratios de mélange ou de concentrations
de substance d’essai affectant les vers de terre est facultatif, par exemple ratios de mélange de 0 %, 1 %,
5 %, 25 %, 50 %, 75 % et 100 %, ou concentrations de substance d’essai de 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/
kg, 100 mg/kg et 1 000 mg/kg. L’essai préliminaire est effectué sans répétition.
Lorsqu’aucun effet n’est observé, même à 100 % de sol pollué ou à une concentration de substance
d’essai de 1 000 mg par kg de sol standard (équivalent sec), l’essai définitif peut être conçu comme un
essai limite.
7.1.3 Essai définitif
La conception de l’essai définitif dépend des objectifs de l’essai. Les propriétés d’habitat des échantillons
de sol d’essai prélevé sur le terrain sont généralement caractérisées en comparant les effets biologiques
observés dans le ou les sols soumis à essai avec ceux observés dans le sol témoin (essais à une seule
concentration). À défaut de sol de référence à utiliser comme témoin ou en cas de sol de référence
inapproprié en raison de sa toxicité ou de caractéristiques physico-chimiques atypiques, les effets sont
alors comparés à ceux observés dans un sol standard. Si un sol de référence à utiliser comme sol témoin
est disponible, il est recommandé d’inclure également un sol standard présentant une réponse type
[35]
connue et d’utiliser ces résultats pour évaluer la validité et l’acceptabilité de l’essai . Les résultats
obtenus pour le sol standard aident à faire la distinction entre les effets liés aux polluants et ceux non
liés aux polluants provoqués par les propriétés physico-chimiques du sol d’essai et/ou du sol témoin.
Si, à des fins de caractérisation, une conception d’essai incluant une gamme de dilutions est requise,
trois conceptions sont possibles [les concentrations doivent être espacées par un facteur inférieur
ou égal à deux (2)].
— Pour l’approche CSEO/RSEO, il convient d’utiliser une série géométrique d’au moins cinq
concentrations. Quatre réplicats pour chaque concentration et huit témoins sont recommandés.
— Pour l’approche CE , il convient d’utiliser 12 concentrations. Deux réplicats pour chaque concentration
x
et six réplicats de témoin sont recommandés. Le facteur d’écart peut être variable: plus petit pour
les concentrations faibles, plus grand pour les concentrations élevées.
— Pour l’approche mixte, il convient d’utiliser une série géométrique de six à huit concentrations. Quatre
réplicats pour chaque concentration et huit réplicats de témoin sont recommandés. Cette méthode
mixte permet de calculer une CSEO ainsi qu’une estimation de CE.
Un essai limite peut suffire si aucun effet toxique n’a été observé au cours de l’essai préliminaire. Dans le
cadre de l’essai limite, seuls le sol soumis à essai sans dilution et le sol témoin doivent être soumis à
essai, avec au moins quatre réplicats pour chacun d’eux.
7.2 Préparation des mélanges d’essai
7.2.1 Essai sur sols pollués
Mélanger soigneusement le sol soumis à essai avec le sol de référence ou avec le sol standard
(manuellement ou à l’aide d’un mélangeur à main) conformément à la gamme de dilutions choisie.
Contrôler visuellement l’homogénéité du mélange. La masse totale du sol soumis à essai et du sol de
référence ou du sol standard doit être comprise entre 500 g et 600 g (équivalent sec) dans chaque
récipient d’essai (6.1). Humidifier le mélange d’essai avec de l’eau déionisée pour atteindre une teneur
en eau appropriée généralement comprise entre 40 % et 60 % de la capacité totale de rétention d’eau
déterminée conformément à l’Annexe E. Dans certains cas, par exemple lorsque l’essai est réalisé sur
des déchets, des pourcentages plus élevés sont requis. Une vérification sommaire de la teneur en eau
du sol peut être obtenue en comprimant légèrement le sol dans la main; si la teneur en eau est correcte,
de petites gouttes d’eau apparaissent entre les doigts.
Déterminer le pH de chaque mélange d’essai (un récipient par concentration) conformément à
l’ISO 10390 au début et à la fin de l’essai (lorsque des substances acides ou basiques sont soumises à
essai, ne pas ajuster le pH).
Réaliser l’essai simultanément sur au moins quatre réplicats par concentration et sur le ou les témoins.
AVERTISSEMENT — Les sols pollués peuvent contenir des mélanges inconnus de produits
chimiques toxiques, mutagènes ou nocifs d’une autre manière ou des micro-organismes
infectieux. Il convient de prendre des mesures pour éviter tout contact avec la peau. Des
risques pour la santé au travail peuvent survenir en raison de la poussière ou de l’évaporation
de produits chimiques pendant la manipulation et l’incubation.
7.2.2 Essais sur substances ajoutées au sol témoin
Un sol témoin est utilisé pour préparer l’échantillon pour essai. Pour chaque récipient d’essai (6.1),
la masse du substrat utilisé doit être de 500 g (équivalent sec). Ajouter les substances au sol témoin
et mélanger soigneusement.
Pour l’introduction des substances d’essai, utiliser la méthode a), b) ou c), suivant le cas.
a) Substances solubles dans l’eau
— Immédiatement avant le début de l’essai, dissoudre la quantité de substance d’essai dans l’eau, ou
une partie de celle-ci, requise pour humidifier les échantillons de sol correspondant aux réplicats
d’une concentration de façon à satisfaire aux exigences de 5.3. Mélanger soigneusement avec le
substrat avant son introduction dans les récipients d’essai.
b) Substances insolubles dans l’eau mais solubles dans les solvants organiques
— Dissoudre dans un solvant volatil (tel que l’acétone ou l’hexane) la quantité de substance d’essai
requise pour obtenir la concentration désirée, et la mélanger avec une partie de la quantité
requise de sable de quartz. Après avoir évaporé le solvant en plaçant le récipient sous une hotte
aspirante, ajouter le reste du sol standard et l’eau et mélanger soigneusement le tout avant son
introduction dans les récipients d’essai.
Pour disperser les substances peu solubles dans l’eau, il est possible d’avoir recours aux ultrasons,
à des solvants organiques, des émulsifiants ou des dispersants. Dans ce cas, il convient que les
concentrations soumises à essai et un témoin supplémentaire contiennent la même quantité minimale
de substance auxiliaire.
AVERTISSEMENT — Prendre les précautions appropriées concernant les vapeurs de solvant
pour éviter les risques d’inhalation ou d’explosion et pour éviter d’endommager le matériel
d’extraction, les pompes, etc.
c) Substances insolubles dans l’eau ou dans les solvants organiques
— Pour une substance insoluble dans un solvant volatil, préparer un mélange de 10 g de sable
de quartz industriel finement broyé (voir 5.3) et la quantité de substance d’essai requise pour
obtenir la concentration souhaitée. Ajouter ce mélange au reste du sol standard et à l’eau et
mélanger soigneusement avant son introduction dans les récipients d’essai.
— Mélanger la substance d’essai au sol standard avant d’introduire les vers de terre.
Fixer les concentrations permettant d’obtenir la CMEO/CSEO sur la base des résultats de l’essai
préliminaire de manière à ce qu’elles soient espacées par un facteur inférieur ou égal à 2. Il n’est pas
nécessaire de soumettre à essai les
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