ISO 11268-2:2012

NORME ISO
INTERNATIONALE 11268-2
Deuxième édition
2012-11-01
Qualité du sol — Effets des polluants vis-
à-vis des vers de terre —
Partie 2:
Détermination des effets sur la
reproduction de Eisenia fetida/Eisenia
andrei
Soil quality — Effects of pollutants on earthworms —
Part 2: Determination of effects on reproduction of Eisenia fetida/
Eisenia andrei
Numéro de référence
©
ISO 2012
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Réactifs et matériaux . 4
6 Appareillage . 6
7 Mode opératoire . 6
7.1 Plan d’expérimentation . 6
7.2 Préparation des mélanges d’essai . 7
7.3 Introduction des vers de terre . 9
7.4 Conditions d’essai et mesurages . 9
7.5 Substance de référence . 9
8 Calcul et expression des résultats . 9
8.1 Calcul . 9
8.2 Expression des résultats . 9
9 Validité de l’essai .10
10 Analyse statistique .10
10.1 Généralités .10
10.2 Essais à une seule concentration .10
10.3 Essais à plusieurs concentrations . 11
11 Rapport d’essai .12
Annexe A (informative) Détermination de la toxicité chronique des substances chimiques pour les vers
de terre dans des conditions tropicales .13
Annexe B (informative) Élevage d’Eisenia fetida et d’Eisenia andrei .15
Annexe C (informative) Détermination de la capacité de rétention d’eau d’un sol artificiel .16
Annexe D (informative) Techniques de comptage des vers juvéniles éclos des cocons .17
Annexe E (informative) Performance de la méthode .18
Bibliographie .20
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 11268-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 11268-2:1998), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
L’ISO 11268 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité du sol — Effets des
polluants vis-à-vis des vers de terre:
— Partie 1: Détermination de la toxicité aiguë vis-à-vis de Eisenia fetida/Eisenia andrei
— Partie 2: Détermination des effets sur la reproduction de Eisenia fetida/Eisenia andrei
— Partie 3: Lignes directrices relatives à la détermination des effets sur site
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Introduction
Des systèmes d’essais écotoxicologiques sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur les effets des
contaminants présents dans le sol et sont proposés en complément d’une analyse chimique conventionnelle
[34] [35]
(voir l’ISO 15799 et l’ISO 17616 ). L’ISO 15799 comprend une liste et une brève caractérisation des
systèmes d’essai recommandés et normalisés et l’ISO 17616 donne des lignes directrices pour le choix et
l’évaluation des essais biologiques. Les systèmes d’essais aquatiques sur éluat de sol sont mis en œuvre pour
obtenir des informations sur la fraction des contaminants susceptibles d’atteindre les eaux souterraines par le
mouvement de l’eau (fonction de rétention des sols), alors que les systèmes d’essais terrestres sont utilisés
pour évaluer la fonction d’habitat des sols. En tant que systèmes d’essais normalisés utilisant des vers de terre
comme organismes indicateurs pour la fonction d’habitat du sol, un essai de toxicité aiguë pour la survie et un
essai de toxicité chronique pour la reproduction sont disponibles.
La présente partie de l’ISO 11268 décrit une méthode basée sur la détermination des effets sublétaux des sols
contaminés pour des vers de terre adultes des espèces Eisenia fetida (Savigny 1826) et Eisenia andrei (André
1963). La méthode peut éventuellement être utilisée pour évaluer le potentiel toxique aigu pour les vers de terre
de produits chimiques ajoutés à un sol standard (par exemple un sol artificiel). En dernier lieu, des informations
sont fournies sur la manière d’utiliser cette méthode pour évaluer des produits chimiques dans des conditions
tropicales (voir l’Annexe A).
Eisenia fetida et Eisenia andrei sont considérés comme étant représentatifs de la faune du sol et des vers de
terre en particulier. Des informations de base sur l’écologie des vers de terre et leur utilisation en écotoxicologie
sont disponibles. D’autres espèces, par exemple Aporrectodea caliginosa, Lumbricus rubellus et Lumbricus
terrestris, ont également été utilisés comme organismes d’essai. En général, ces espèces ou d’autres ne se
sont pas avérées être plus sensibles, et les bases de données et l’expérience dans l’évaluation des sols sont
[16][17]
également réduites .
La présente partie de l’ISO 11268 a été élaborée en tenant compte des modes opératoires d’essai adoptés par
[27][28] [11]
l’Organisation de coopération et de développement économiques et par l’Union européenne .
NORME INTERNATIONALE ISO 11268-2:2012(F)
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre —
Partie 2:
Détermination des effets sur la reproduction de Eisenia fetida/
Eisenia andrei
AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de produits
chimiques toxiques, mutagènes ou nocifs d’une autre manière ou des micro-organismes infectieux.
Des risques pour la santé au travail peuvent survenir en raison de la poussière ou de l’évaporation de
produits chimiques pendant la manipulation et l’incubation. Il convient de prendre des mesures pour
éviter tout contact avec la peau.
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 11268 spécifie l’une des méthodes permettant d’évaluer la fonction d’habitat des
sols et de déterminer les effets de contaminants du sol et de produits chimiques sur la reproduction d’Eisenia
fetida/Eisenia andrei par absorption cutanée et ingestion. Cet essai chronique s’applique aux sols et aux
matériaux de type sol de qualité inconnue, provenant par exemple de sites contaminés, de sols amendés, de
sols après remédiation, de sols agricoles ou autres sites d’intérêt et de déchets.
Les effets des substances sont évalués à l’aide d’un sol standard, de préférence un substrat de sol artificiel
défini. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un sol témoin.
Selon l’objectif de l’étude, le substrat témoin et de dilution (gamme de dilutions d’un sol contaminé) peut être
soit un sol non contaminé comparable à l’échantillon de sol à évaluer (sol de référence), soit un sol standard
(par exemple un sol artificiel).
Des informations sont fournies sur la manière d’utiliser cette méthode pour évaluer des produits chimiques
dans des conditions tempérées ainsi que dans des conditions tropicales.
La méthode ne s’applique pas aux substances volatiles, c’est-à-dire aux substances pour lesquelles H
(constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression de
vapeur à 25 °C excède 0,013 3 Pa.
Cette méthode ne tient pas compte de la stabilité de la substance pendant l’essai.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire des processus,
de la biomasse et de la diversité microbiens
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d’échange cationique effective et du taux de
saturation en bases échangeables à l’aide d’une solution de chlorure de baryum
ISO 11268-1, Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre — Partie 1: Détermination de la
toxicité aiguë vis-à-vis de Eisenia fetida/Eisenia andrei
ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des sols —
Méthode par tamisage et sédimentation
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
contaminant
substance ou agent présent(e) dans le sol et résultant de l’activité humaine
[ISO 15176:2002]
3.2
croissance
augmentation de la biomasse (c’est-à-dire la masse fraîche des organismes)
NOTE Elle est exprimée en pourcentage de la masse fraîche des organismes au début de l’essai.
3.3
reproduction
nombre moyen de jeunes produits par récipient d’essai après huit semaines d’incubation dans des conditions
d’essai spécifiées
3.4
RE (taux efficace) ou CE (concentration efficace)
x x
taux ou concentration de l’échantillon pour essai ou de la substance d’essai auquel ou à laquelle la reproduction
est réduite de x % par rapport au témoin
3.5
essai limite
essai à une seule concentration comprenant au moins quatre réplicats pour chacun, l’échantillon pour essai
sans dilution ou la plus forte concentration de substances d’essai mélangées dans le sol témoin et le témoin
3.6
plus faible taux (RMEO) ou concentration ayant un effet observé (CMEO)
pourcentage le plus faible d’un échantillon pour essai dans un sol témoin, ou concentration la plus faible d’une
substance, pour lequel (laquelle) un effet statistiquement significatif est observé
NOTE La CMEO est exprimée en pourcentage de masse sèche de sol d’essai par masse sèche de mélange d’essai.
Tous les mélanges d’essai supérieurs à la CMEO ont un effet dommageable supérieur ou égal à celui observé à la CMEO.
Si cette condition ne peut pas être satisfaite, il convient d’expliquer comment la CMEO et la CSEO (3.7) ont été choisies.
3.7
RSEO (taux sans effet observé) ou CSEO (concentration sans effet observé)
pourcentage de sol d’essai immédiatement inférieur à la RMEO/CMEO ou concentration d’essai la plus élevée
d’une substance soumise à essai qui, comparée au témoin, n’a aucun effet létal ou autre effet statistiquement
significatif, tel qu’une réduction de la reproduction ou une modification de la masse (probabilité d’erreur p < 0,05)
NOTE La CSEO est exprimée en pourcentage de masse sèche du sol d’essai par masse sèche du mélange d’essai.
3.8
sol de référence
sol non contaminé spécifique au site (par exemple prélevé au voisinage d’un site contaminé) ayant des
propriétés similaires (concentrations d’éléments nutritifs, pH, teneur en carbone organique et texture) à celles
du sol soumis à essai
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3.9
sol standard
sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les principales propriétés (par exemple pH, texture, teneur en
matières organiques) se situent dans une gamme connue
[11] [27] [23]
EXEMPLE Euro-Soils , sol artificiel , sol standard LUFA .
NOTE Les propriétés des sols standards peuvent différer de celles du sol d’essai.
3.10
sol témoin
sol de référence ou sol standard utilisé comme témoin et comme milieu pour préparer une gamme de dilutions
avec les échantillons pour essai ou une substance de référence qui satisfait les critères de validité
NOTE Pour un sol naturel, il est recommandé de démontrer sa capacité à être utilisé pour un essai et à atteindre les
critères de validité de l’essai avant de l’utiliser dans un essai définitif.
3.11
mélange d’essai
mélange d’un sol contaminé ou de la substance soumise à essai avec un sol témoin (3.10)
NOTE Les mélanges d’essai sont donnés en pourcentage de sol contaminé sur la base de la masse sèche du sol.
3.12
ratio de mélange d’essai
rapport entre le sol soumis à essai et le sol témoin dans un mélange d’essai
NOTE Différents ratios peuvent être appliqués dans une gamme de dilutions afin de déterminer une relation dose-réponse.
4 Principe
Les effets sur la reproduction de vers de terre adultes (espèce Eisenia fetida ou Eisenia andrei) exposés au
sol soumis à essai sont comparés à ceux observés pour des échantillons exposés à un sol témoin. Le cas
échéant, les effets sont déterminés sur la base de l’exposition à une gamme de dilutions du sol contaminé
ou à une gamme de concentrations de la substance soumise à essai. De plus, les observations relatives à la
croissance et à la survie des vers de terre adultes sont consignées. Les mélanges d’essai sont préparés au
début de l’essai et ne sont pas renouvelés au cours de la période d’essai.
Au bout de quatre semaines, les vers adultes sont retirés des récipients d’essai et les effets sur la mortalité et
la biomasse sont mesurés par comptage et pesée. L’effet sur la reproduction, qui constitue le critère d’effet final,
est mesuré en comptant le nombre de jeunes éclos des cocons après une période supplémentaire de quatre
semaines. Les résultats obtenus lors des essais sont comparés à ceux obtenus avec un sol témoin ou, le cas
échéant, sont utilisés pour déterminer respectivement les dilutions ou les concentrations qui ne provoquent pas
d’effet sur la biomasse, la mortalité et la reproduction (RMEO/CMEO) ainsi que la dilution (concentration) entraînant
une réduction de x % du nombre de juvéniles éclos des cocons par rapport au témoin (RE /CE , 56 jours).
x x
Lorsqu’une gamme de dilutions ou de concentrations est soumise à essai, toutes les dilutions/concentrations
d’essai supérieures à la RMEO/CMEO) doivent avoir un effet dommageable supérieur ou égal à celui observé
à la RMEO/CMEO. Lorsqu’on ne connaît pas la dilution/concentration à laquelle le sol soumis à essai/la
substance d’essai est susceptible de produire un effet, il est utile de conduire l’essai en deux étapes.
— Un essai préliminaire est réalisé conformément à l’ISO 11268-1 pour obtenir une indication de la
dilution/concentration produisant un effet et de la dilution/concentration ne provoquant pas de mortalité
(RSEO/CSEO). Les dilutions/concentrations à utiliser au cours de l’essai définitif peuvent ensuite être choisies.
— Un essai définitif pour déterminer les effets sublétaux du (des dilutions de) sol contaminé ou la concentration
de la substance chimique qui, lorsqu’il (elle) est uniformément réparti(e) dans le sol standard, n’a pas
d’effet significatif sur le nombre de jeunes éclos des cocons comparé au témoin (RSEO/CSEO) et la plus
faible concentration produisant un effet (RMEO/CMEO).
NOTE L’utilisation d’un sol de référence est une exigence essentielle pour démontrer l’état actuel de la population
soumise à essai et éviter toute mauvaise interprétation des résultats.
5 Réactifs et matériaux
[15][19]
5.1 Réactif biologique, constitué de vers de terre adultes de l’espèce Eisenia fetida ou Eisenia andrei
[20]
, âgés de deux mois à un an, possédant un clitellum et dont la masse humide est comprise entre 300 mg et
600 mg (E. fetida) ou entre 250 mg et 600 mg (E. andrei).
Sélectionner les vers à utiliser pour l’essai de manière à obtenir, dans la mesure du possible, une population
homogène du point de vue de l’âge, de la taille et de la masse. Il convient de préférence de sélectionner les
vers dans un élevage synchrone ayant une structure d’âge relativement homogène. Laver les vers à l’eau
potable avant l’essai.
NOTE Un exemple de technique d’élevage d’Eisenia fetida/Eisenia andrei est donné dans l’Annexe B.
Avant l’utilisation, conditionner les vers sélectionnés pendant 1 jour à 7 jours dans un sol standard ou un
sol témoin. La nourriture, qui est également utilisée comme source d’alimentation dans le cadre de l’essai
(voir 5.3), doit être dispensée en quantité suffisante (voir 7.4).
5.2 Échantillon soumis à essai, qui peut être constitué d’un sol prélevé sur le terrain ou d’un sol témoin
amendé par le mélange d’essai.
5.2.1 Sols prélevés sur le terrain, sol ou déchets
Le ou les échantillons peuvent être un sol prélevé sur un site industriel, agricole ou autre site d’intérêt, ou des
déchets (par exemple matériau de dragage, boues provenant d’une station d’épuration des eaux urbaines,
matériau composite ou fumier) pour lesquels une éventuelle mise en dépôt terrestre est envisagée.
Les échantillons pour essai doivent être tamisés à 4 mm et soigneusement mélangés. Si nécessaire, le sol
peut être séché à l’air sans chauffage avant le tamisage. Il convient que la conservation des échantillons pour
essai soit aussi courte que possible. Conserver le sol conformément à l’ISO 10381-6 en utilisant des récipients
qui réduisent au minimum les pertes de contaminants du sol par volatilisation et sorption sur les parois des
récipients. Il convient de ne pas corriger le pH du sol car il peut avoir une incidence sur la biodisponibilité des
contaminants du sol.
Pour l’interprétation des résultats d’essai, les caractéristiques suivantes doivent être déterminées pour chaque
échantillon de sol prélevé sur le terrain:
— pH conformément à l’ISO 10390;
— texture (sable, limon, vase) conformément à l’ISO 11277;
— teneur en eau conformément à l’ISO 11465;
— capacité de rétention d’eau conformément à l’Annexe C;
— capacité d’échange cationique conformément à l’ISO 11260;
— carbone organique conformément à l’ISO 10694.
NOTE Il est important de mesurer la capacité de rétention d’eau de tous les mélanges utilisés dans l’essai.
5.2.2 Sol témoin, soit a) sol de référence (3.8) soit b) sol standard (3.9) permettant la présence de vers de terre.
a) Si des sols de référence provenant de zones non contaminées voisines d’un site contaminé sont disponibles,
il convient de les traiter et de les caractériser de la même manière que les échantillons soumis à essai. S’il
est impossible d’exclure une contamination toxique ou des propriétés inhabituelles du sol, il convient de
préférer des sols témoins standards.
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b) Pour évaluer les effets de substances mélangées au sol ou pour préparer les dilutions de l’échantillon
soumis à essai, des sols standards doivent être utilisés pour préparer l’échantillon pour essai. Les
propriétés du sol standard prélevé sur le terrain doivent être consignées dans le rapport.
Le substrat appelé «sol artificiel» peut être utilisé comme un sol standard et a la composition suivante:
Pourcentage exprimé
en masse sèche
— Tourbe de sphaignes, finement moulue, exempte de tout résidu 10 %
végétal visible
— Argile kaolinique contenant au moins 30 % de kaolinite 20 %
— Sable de quartz industriel (contenant en majorité du sable fin, 69 %
constitué à plus de 50 % de grains de granulométrie comprise entre
0,05 mm et 0,2 mm)
Environ 0,3 % à 1,0 % de carbonate de calcium (CaCO , pulvérisé, de qualité analytique) sont nécessaires
pour obtenir un pH de 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Afin de prendre en compte les propriétés des substances fortement non polaires [log K > 2, où K est le
ow ow
coefficient de partage (octanol/eau)] ou ionisantes, 5 % de tourbe se sont avérés suffisants pour maintenir la structure
souhaitée du sol artificiel.
NOTE 2 Il a été démontré qu’Eisenia fetida peut respecter les critères de validité, même en ce qui concerne la reproduction,
[18]
lorsqu’il est soumis à essai dans des sols ayant une plus faible teneur en carbone organique (par exemple 2,7 %) , et des
expériences prouvent que cette teneur peut être obtenue dans un sol artificiel avec 5 % de tourbe. Par conséquent, avant
d’utiliser un tel sol dans un essai définitif, il n’est pas nécessaire de démontrer que le sol artificiel permet de respecter les
[28]
critères de validité, sauf si la teneur en tourbe est inférieure à la valeur spécifiée ci-dessus .
Préparer le sol artificiel au moins trois jours avant le début de l’essai, en mélangeant soigneusement les
constituants secs indiqués ci-dessus dans un mélangeur de laboratoire de grandes dimensions. Une partie
de l’eau déionisée nécessaire est ajoutée pendant le mélange. Il convient de tenir compte de l’eau qui est
utilisée pour introduire le mélange d’essai dans le sol. La quantité de carbonate de calcium nécessaire peut
varier selon les propriétés du lot particulier de tourbe de sphaignes et il convient qu’elle soit déterminée par
des mesurages effectués sur des sous-échantillons immédiatement avant l’essai. Conserver le sol artificiel
mélangé à température ambiante pendant au moins deux jours pour équilibrer l’acidité. Pour déterminer le pH
et la capacité maximale de rétention d’eau, le sol artificiel sec est pré-humidifié un jour ou deux jours avant le
début de l’essai en ajoutant de l’eau déionisée de manière à atteindre approximativement la moitié de la teneur
finale en eau requise correspondant de 40 % à 60 % de la capacité maximale de rétention d’eau.
La capacité totale de rétention d’eau est déterminée conformément à l’Annexe C; le pH est déterminé
conformément à l’ISO 10390.
5.3 Alimentation. Est considéré comme acceptable tout aliment dont la qualité s’est avérée appropriée pour
le maintien, au minimum, de la masse des vers pendant l’essai. L’expérience a montré que la farine d’avoine, la
[20]
poudre de pomme de terre écrasée , la bouse de vache ou le crottin de cheval constitue un aliment adéquat.
Il convient de procéder à des contrôles afin de s’assurer que les vaches ou les chevaux produisant ce fumier
ne sont pas traités par des médicaments ou d’autres substances, tels que des activateurs de croissance,
des nématicides ou des produits vétérinaires comparables pouvant avoir un effet nocif sur les vers pendant
l’essai. Le fumier recueilli en milieu naturel est recommandé, car l’expérience a montré que la bouse de vache
disponible dans le commerce, utilisée comme engrais dans les jardins, peut avoir des effets nocifs sur les vers.
Il convient que le fumier soit séché à l’air, finement broyé et pasteurisé avant l’emploi.
Avant utilisation, il convient de contrôler la qualité de chaque lot de nourriture fraîche en le donnant à un
élevage de vers non soumis à essai. Il convient que la croissance et la production de cocons ne diminuent pas
par rapport à celles de vers élevés dans un substrat ne contenant pas le nouveau lot de nourriture (conditions
[27]
telles que décrites dans l’OCDE 207 ).
5.4 Acide borique, utilisé comme substance de référence.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire, et ce qui suit.
6.1 Récipients d’essai, en verre ou autre matériau chimiquement inerte, de capacité comprise environ entre
1 l et 2 l. Il convient que les récipients aient une section transversale d’environ 200 cm de manière à atteindre
une hauteur de substrat humide d’environ 5 cm à 6 cm lorsque 500 g de substrat équivalent sec sont ajoutés. Les
récipients d’essai doivent permettre les échanges gazeux entre le milieu et l’atmosphère ainsi que le passage
de la lumière (par exemple au moyen d’un couvercle transparent perforé). Ils doivent être conçus de manière à
empêcher les vers de terre de s’échapper (par exemple en fixant le couvercle à l’aide de ruban adhésif).
6.2 Appareillage permettant de déterminer la masse sèche du substrat, conformément à l’ISO 11465.
6.3 Mélangeur de laboratoire de grandes dimensions, pour la préparation de l’échantillon soumis à essai (5.2).
6.4 Balance, ayant une précision d’au moins 1 mg.
6.5 Membrane de polyéthylène, perforée de petits trous pour permettre les échanges entre l’échantillon et
l’atmosphère.
6.6 Environnement d’essai.
6.6.1 Enceinte, thermostatée à (20 ± 2) °C.
6.6.2 Source lumineuse (par exemple tubes fluorescents blancs), permettant de soumettre les récipients à
une intensité lumineuse constante de 400 Ix à 800 Ix, selon un cycle contrôlé lumière/obscurité compris entre
12 h:12 h et 16 h:8 h.
7 Mode opératoire
7.1 Plan d’expérimentation
7.1.1 Généralités
Un échantillon de sol d’essai prélevé sur le terrain peut être testé à une seule concentration (généralement
100 %) ou faire l’objet d’une évaluation de sa toxicité lors d’essai à plusieurs concentrations pour lequel une
gamme de dilutions est préparée en mélangeant des quantités calculées avec un sol témoin (5.2.2). Lorsque des
substances sont soumises à essai, une gamme de concentrations est préparée en mélangeant des quantités
de la substance soumise à essai avec un sol standard (par exemple le sol artificiel). Les concentrations sont
exprimées en milligrammes de substance d’essai par kilogramme de sol témoin équivalent sec.
Selon la connaissance des niveaux de réponse pertinents, un essai préliminaire peut précéder l’essai définitif.
Chaque essai définitif comprend une gamme de mélanges de sols (traitements). Chaque traitement est répété
au moins quatre fois.
7.1.2 Essai préliminaire
L’essai préliminaire permettant de déterminer la gamme de mélanges ou de concentrations de substance
d’essai affectant les vers de terre est facultatif, par exemple ratios de mélange de 0 %, 1 %, 5 %, 25 %,
50 %, 75 % et 100 %, ou concentrations de substance d’essai de 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg et
1 000 mg/kg. L’essai préliminaire est effectué sans répétition.
Lorsqu’aucun effet n’est observé, même à 100 % de sol contaminé ou à une concentration de substance d’essai
de 1 000 mg par kg de sol standard (équivalent sec), l’essai définitif peut être conçu comme un essai limite.
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7.1.3 Essai définitif
La conception de l’essai définitif dépend des objectifs de l’essai. Les propriétés d’habitat des échantillons
de sol d’essai prélevé sur le terrain sont généralement caractérisées en comparant les effets biologiques
observés dans le(s) sol(s) soumis à essai avec ceux observés dans le sol témoin (3.10) (essais à une seule
concentration). Si un sol de référence (3.8) devant être utilisé comme témoin n’est pas disponible ou n’est
pas approprié en raison de sa toxicité ou de caractéristiques physico-chimiques atypiques, les effets sont
alors comparés à ceux observés dans un sol standard. Si l’on dispose d’un sol de référence à utiliser comme
sol témoin, il est recommandé d’inclure également un sol standard présentant une réponse type connue et
[18]
d’utiliser ces résultats pour évaluer la validité et l’acceptabilité de l’essai . Les résultats obtenus pour le sol
standard aident à faire la distinction entre les effets liés aux contaminants et ceux non liés aux contaminants
provoqués par les propriétés physico-chimiques du sol d’essai et/ou du sol témoin.
Si, à des fins de caractérisation, une conception d’essai incluant une gamme de dilutions est nécessaire, trois
conceptions sont possibles (les concentrations doivent être espacées par un facteur inférieur ou égal à 2).
— Pour l’approche CSEO/RSEO, il convient d’utiliser une série géométrique d’au moins cinq concentrations.
Quatre réplicats pour chaque concentration et huit témoins sont recommandés.
— Pour l’approche CE , il convient d’utiliser 12 concentrations. Deux réplicats pour chaque concentration et six
x
témoins sont recommandés. Le facteur de séparation peut être variable; plus petit pour les concentrations
faibles, plus grand pour les concentrations élevées.
— Pour l’approche mixte, il convient d’utiliser une série géométrique de six à huit concentrations. Quatre
réplicats pour chaque concentration et huit témoins sont recommandés. Cette méthode mixte permet
d’évaluer une CSEO ainsi qu’une CE .
x
Un essai limite peut suffire si aucun effet toxique n’a été observé au cours de l’essai préliminaire. Dans l’essai
limite, seul le sol soumis à essai sans dilution et le sol témoin doivent être testés, avec au moins quatre
répétitions pour chacun d’eux.
7.2 Préparation des mélanges d’essai
7.2.1 Essai sur sols contaminés
Mélanger soigneusement le sol soumis à essai avec le sol de référence ou avec le sol standard (manuellement
ou à l’aide d’un mélangeur à main) conformément à la gamme de dilutions choisie. Contrôler visuellement
l’homogénéité du mélange. La masse totale du sol soumis à essai et du sol de référence ou du sol standard doit
être comprise entre 500 g et 600 g (équivalent sec) dans chaque récipient d’essai (6.1). Humidifier le mélange
d’essai avec de l’eau déionisée pour atteindre une teneur en eau appropriée généralement comprise entre
40 % et 60 % de la capacité totale de rétention d’eau déterminée conformément à l’Annexe C. Dans certains
cas, par exemple lorsque l’essai est réalisé sur des déchets, des pourcentages plus élevés sont nécessaires.
Une vérification sommaire de la teneur en eau du sol peut être obtenue en comprimant légèrement le sol dans
la main; si la teneur en eau est correcte, de petites gouttes d’eau apparaissent entre les doigts.
Déterminer le pH de chaque mélange d’essai (un récipient par concentration) conformément à l’ISO 10390 au
début et à la fin de l’essai (lorsque des substances acides ou basiques sont soumises à essai, ne pas ajuster le pH).
Réaliser l’essai simultanément sur au moins quatre réplicats par concentration et sur le(s) témoin(s).
AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de produits
chimiques toxiques, mutagènes ou nocifs d’une autre manière ou des micro-organismes infectieux. Il
convient de prendre des mesures pour éviter tout contact avec la peau. Des risques pour la santé au
travail peuvent survenir en raison de la poussière ou de l’évaporation de produits chimiques pendant
la manipulation et l’incubation.
7.2.2 Essais sur substances ajoutées au sol témoin
Un sol témoin (5.2.2) est utilisé pour préparer l’échantillon pour essai. Pour chaque récipient d’essai (6.1), la
masse du substrat utilisé doit être de 500 g (équivalent sec). Ajouter les substances au sol témoin et mélanger
soigneusement.
Pour l’introduction des substances d’essai, utiliser la méthode a), b) ou c), selon le cas:
a) Substances solubles dans l’eau
— Immédiatement avant le début de l’essai, dissoudre la quantité de substance d’essai dans l’eau, ou
une partie de celle-ci, requise pour humidifier les échantillons de sol correspondant aux réplicats
d’une concentration de façon à satisfaire aux exigences de 5.2.2. Mélanger soigneusement avec le
substrat avant son introduction dans les récipients d’essai.
b) Substances insolubles dans l’eau mais solubles dans les solvants organiques
— Dissoudre dans un solvant volatil (tel que l’acétone ou l’hexane) la quantité de substance d’essai
nécessaire pour obtenir la concentration désirée, et la mélanger avec une partie de la quantité
nécessaire de sable de quartz. Après avoir évaporé le solvant en plaçant le récipient sous une hotte
aspirante, ajouter le reste du sol standard et l’eau et mélanger soigneusement le tout avant son
introduction dans les récipients d’essai.
Pour disperser les substances peu solubles dans l’eau, il est possible d’avoir recours aux ultrasons, à des
solvants organiques, des émulsifiants ou des dispersants. Dans ce cas, il convient que les concentrations
soumises à essai et un témoin supplémentaire contiennent la même quantité minimale de substance auxiliaire.
AVERTISSEMENT — Prendre les précautions appropriées concernant les vapeurs de solvant pour
éviter les risques d’inhalation ou d’explosion et pour éviter d’endommager le matériel d’extraction,
les pompes, etc.
c) Substances insolubles dans l’eau ou dans les solvants organiques
— Pour une substance insoluble dans un solvant volatil, préparer un mélange de 10 g de sable de
quartz industriel finement broyé (voir 5.2.2) et la quantité de substance d’essai nécessaire pour
obtenir la concentration souhaitée. Ajouter ce mélange au reste du sol standard et à l’eau et mélanger
soigneusement avant son introduction dans les récipients d’essai.
Mélanger la substance d’essai au sol standard avant d’introduire les vers de terre.
Les concentrations permettant d’obtenir la CMEO/CSEO doivent être choisies sur la base des résultats de
l’essai préliminaire. Les concentrations doivent être espacées par un facteur inférieur ou égal à 2. Il n’est pas
nécessaire de soumettre à essai les substances mélangées au substrat à des concentrations supérieures à
1 000 mg/kg de l’échantillon d’essai. Réaliser l’essai simultanément avec tous les réplicats par concentration
et pour le(s) témoin(s) nécessaires conformément à l’approche choisie.
Déterminer le pH de chaque échantillon soumis à essai (un récipient par concentration) conformément à
l’ISO 10390 au début et à la fin de l’essai.
7.2.3 Préparation des récipients témoins
Le récipient témoin contient le sol témoin (5.2.2) humidifié avec de l’eau déionisée pour atteindre 40 % à 60 %
de la capacité totale de rétention d’eau (déterminée conformément à l’Annexe C).
Préparer un récipient témoin pour l’essai préliminaire et au moins quatre récipients témoins pour l’essai définitif.
Préparer les récipients témoins de la même manière que les récipients d’essai. Si la préparation de l’essai
nécessite l’utilisation d’un solvant (voir 7.2.2), utiliser un témoin supplémentaire préparé avec le solvant, mais
sans la substance d’essai. Couvrir les récipients comme indiqué en 6.1.
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7.3 Introduction des vers de terre
Pour chaque récipient d’essai ainsi que pour le(s) récipient(s) témoin(s), préparer, laver et essuyer doucement
(à l’aide de papier absorbant) 10 vers (5.1). Pour éviter les erreurs systématiques dans la répartition des vers
dans les récipients d’essai, déterminer l’homogénéité de la population d’essai en pesant un échantillon de
20 vers individuellement. L’homogénéité ayant été vérifiée, choisir des lots de 10 vers, les peser et les placer
dans chaque récipient d’essai. Placer les lots de vers dans les récipients de façon aléatoire. Il convient que la
plage de biomasse moyenne entre les récipients ne dépasse pas 100 mg.
Couvrir les récipients comme indiqué en 6.1 et les placer dans l’enceinte d’essai (6.6.1).
7.4 Conditions d’essai et mesurages
Un jour après avoir ajouté les vers, répandre 5 g par récipient d’essai de nourriture finement moulue séchée à
l’air (5.3) sur la surface du sol et l’humidifier avec de l’eau potable (environ 5 ml à 6 ml par récipient). Nourrir les
vers une fois par semaine pendant la période d’essai. Si la consommation de nourriture est faible, réduire au
minimum l’apport en nourriture pour éviter la prolifération fongique ou les moisissures. Pour chaque récipient
d’essai, enregistrer le comportement alimentaire et la quantité de nourriture apportée pendant la durée de l’essai.
Maintenir constante la teneur en eau du substrat dans les récipients d’essai pendant toute la durée de l’essai,
en pesant les récipients d’essai à intervalles réguliers, et en rajoutant de l’eau si nécessaire. À la fin de l’essai,
la teneur en eau ne doit pas s’écarter de plus de 10 % de celle mesurée au début de l’essai.
Garder les vers adultes pendant quatre semaines dans l’échantillon pour essai. À la fin de cette période, retirer
les adultes et, pour chaque récipient, noter le nombre total et la masse des vers de terre adultes vivants. Garder
les récipients d’essai pendant quatre autres semaines dans l’environnement d’essai (6.6) pour permettre aux
jeunes de se développer. Au début de cette période, les juvéniles reçoivent une fois 5 g de nourriture par
récipient d’essai soigneusement mélangés à la main avec le substrat. Au terme de cette période, compter, au
moyen d’une méthode appropriée, le nombre de jeunes éclos des cocons, par récipient d’essai.
NOTE L’Annexe D donne des exemples de deux méthodes appropriées, l’une d’elles permettant le comptage des cocons.
7.5 Substance de référence
La CSEO et/ou la CE d’une substance de référence doivent être déterminées afin de s’assurer que les
x
conditions d’essai en laboratoire sont adéquates et de vérifier que la réponse de l’organisme d’essai ne varie
pas statistiquement dans le temps. Il est conseillé de soumettre à essai une substance de référence au moins
deux fois par an ou, lorsque l’essai est effectué à une fréquence plus basse, parallèlement à la détermination
de la toxicité d’une substance d’essai.
L’acide borique est recommandé comme substance de référence. Si le composé est mélangé dans le substrat,
observer les effets sur la reproduction (α = 0,05, où α est le seuil de signification) à des concentrations
comprises entre 400 mg et 600 mg d’acide borique par kilogramme de masse sèche de substrat. Le rapport
d’essai relatif aux résultats sur la substance de référence doit être renseigné périodiquement ainsi qu’en cas
de modifications des conditions d’essai.
8 Calcul et expression des résultats
8.1 Calcul
Déterminer, pour chaque dilution ou concentration, le pourcentage de mortalité, le pourcentage d’augmentation
ou de perte de biomasse des adultes au bout de quatre semaines ainsi que le nombre de jeunes produits au
cours d’une autre période de quatre semaines.
8.2 Expression des résultats
Il convient d’établir une représentation graphique des valeurs moyennes des critères d’effets, incluant l’écart-
type des valeurs mesurées pour le(s) sol(s) soumis à essai, le(s) sol(s) témoin(s) ou les ratios de mélange
d’essai. Cette comparaison ou courbe donne un aperçu de la qualité des effets et de leur amplitude. Le ratio
de mélange est exprimé sur la base de la masse sèche du sol.
Si une gamme de dilutions ou de concentrations a été préparée, indiquer:
— pour l’approche CE , le pourcentage de mélange de sols en équivalent sec ou en milligrammes par
x
kilogramme de substrat de sol sec, la dilution médiane en pourcentage du sol contaminé ou la concentration
médiane de la substance d’essai, qui réduit de 50 % le nombre de jeunes (CE ) par rapport au témoin au
cours de la période d’essai; ou
— pour l’approche CSEO, le ratio de mélange de sols immédiatement inférieur à la CMEO ou la plus forte
concentration soumise à essai d’une substance d’essai qui, comparée au témoin, n’a aucun effet létal
ou autre effet statistiquement significatif, tel qu’une modification de la masse et une diminution de la
reproduction (p < 0,05).
9 Validité de l’essai
Les résultats sont considérés comme valides si:
— le taux de production de jeunes est d’au moins 30 par récipient témo
...