ISO 11267:2023
(Main)Soil quality — Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil contaminants
Soil quality — Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil contaminants
This document specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and determining effects of soil contaminants and substances on the reproduction of Folsomia candida Willem by dermal and alimentary uptake. This document also provides information on how to use this method for testing substances under temperate conditions. The chronic test described is applicable to soils and soil materials of unknown quality, e.g. from contaminated sites, amended soils, soils after remediation, industrial, agricultural or other sites of concern and waste materials. The method is not applicable to volatile substances, i.e. substances for which H (Henry's constant) or the air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 300 Pa at 25 °C.
Qualité du sol — Inhibition de la reproduction de Collembola (Folsomia candida) par des contaminants du sol
Le présent document spécifie l’une des méthodes permettant d’évaluer la fonction d’habitat des sols et de déterminer les effets de contaminants du sol et de substances sur la reproduction de Folsomia candida Willem par absorption cutanée et ingestion. Le présent document fournit des informations sur la manière d’utiliser cette méthode pour évaluer des substances dans des conditions tempérées. L’essai chronique décrit s’applique aux sols et matériaux du sol de qualité inconnue, par exemple provenant de sites pollués, de sols amendés, de sols après remédiation, de sites industriels, agricoles ou d’autres sites d’intérêt et de déchets. La méthode ne s’applique pas aux substances volatiles, c’est-à-dire aux substances pour lesquelles H (constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression de vapeur excède 300 Pa à 25 °C.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11267
Third edition
2023-08
Soil quality — Inhibition of
reproduction of Collembola (Folsomia
candida) by soil contaminants
Qualité du sol — Inhibition de la reproduction de Collembola
(Folsomia candida) par des contaminants du sol
Reference number
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Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
5 Reagents and material . 4
6 Apparatus . 6
7 Procedure .6
7.1 Experimental design . 6
7.1.1 General . 6
7.1.2 Range-finding test . 6
7.1.3 Definitive test . 7
7.2 Preparation of test mixture . 7
7.2.1 Testing contaminated soil . 7
7.2.2 Testing substances added to the test substrate . 8
7.2.3 Preparation of control container . 8
7.3 Addition of the biological material . 9
7.4 Test conditions and measurements . 9
7.5 Determination of surviving Collembola . 9
8 Calculation and expression of results . 9
8.1 Calculation . 9
8.2 Expression of results . . 9
9 Validity of the test .10
10 Statistical analysis .10
10.1 General . 10
10.2 Single-concentration tests . 10
10.3 Multi-concentration tests . 11
10.3.1 Range-finding test . 11
10.3.2 Definitive test . 11
11 Test report .12
Annex A (informative) Techniques for rearing and breeding Folsomia candida.13
Annex B (normative) Determination of water-holding capacity .15
Annex C (informative) Guidance on adjustment of pH of artificial soil .16
Annex D (informative) Extraction and counting of Collembola .17
Annex E (informative) Specific information of alternative Collembolan species other than
Folsomia candida .18
Bibliography .32
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use
of (a) patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed
patent rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received
notice of (a) patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are
cautioned that this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent
database available at www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all
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Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological characterization, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN)
Technical Committee CEN/TC 444, Environmental characterization of solid matrices, in accordance with
the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 11267:2014), which has been technically
revised.
The main change is as follows:
— addition of an annex to provide specific information when using alternative Collembola species for
reproduction test.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
Ecotoxicological test systems are applied to obtain information about the effects of contaminants
in soil and are proposed to complement conventional chemical analysis (see References [2] and [4]).
Reference [2] includes a list and short characterization of recommended and standardized test systems
and Reference [4] gives guidance on the choice and evaluation of the bioassays. Aquatic test systems
with soil eluate are applied to obtain information about the fraction of contaminants potentially
reaching the groundwater by the water path (retention function of soils), whereas terrestrial test
systems are used to assess the habitat function of soils.
Soil-dwelling Collembola are ecologically relevant species for ecotoxicological testing. Springtails are
prey animals for a variety of endogeic and epigeic invertebrates and they contribute to decomposition
processes in soils. In acidic soils they are probably the most important soil invertebrates besides
[19]
enchytraeids with respect to that function, since earthworms are typically absent. Additionally,
Collembola represent arthropod species with a different route and a different rate of exposure
[1] [3]
compared to earthworms and enchytraeids. Various species were used in bioassays of which
four species were used most commonly, Folsomia candida Willem, Folsomia fimetaria L., Onychiurus
[20]
armatus, and Orchesella cincta. Numerous soil toxicity tests supported by Environment Canada
(EC) resulted in the development and standardization of a biological test method for determining the
[10]
lethal and sublethal toxicity of samples of contaminated soil to Collembola. The method prepared
by EC includes four species, Orthonychiurus folsomi, Proisotoma minuta, F. candida, and F. fimetaria. As
standardized test systems using Collembola as indicator organisms for the habitat function of soil,
another two methods exist. One is designed for assessing the effects of substances on the reproductive
[19],[21]
output of the Collembola, F. fimetaria and F. candida in soil , and the other method described here,
focuses on testing contaminated soil. Optionally the method can be used for testing substances added
to standard soils (e.g. artificial soil) for their sublethal hazard potential to Collembola.
This document describes a method that is based on the determination of sublethal effects of contaminated
soils to adult Collembola of the species Folsomia candida Willem. The species is distributed worldwide.
[10],[19]
It plays a similar ecological role to F. fimetari . F. candida reproduces parthenogenetically and is
an easily accessible species as it is commercially available and easy to culture. F. candida is considered
to be a representative of soil arthropods and Collembola in particular. Background information on the
ecology of springtails and their use in ecotoxicological testing is available in Reference [22].
Distinct Collembolan species inhabit various ecological niches at different soil depths and in different
soil types across the globe. Although considered a surrogate species and therefore frequently used in
[28]
ecotoxicological reproduction tests, F. candida is not common in most natural soils. Furthermore,
species specific morphological adaptations can influence exposure and toxic effects of chemicals on
[102]
organisms. Thus, the use of a variety of Collembolan species representing different morphological
adaptations can be advantageous to obtain a broad spectrum of sensitivities for this group. Therefore,
[28]
other species like F. fimetaria (euedaphic, distributed worldwide and found in agricultural soils ),
[31]
Onychirus yodai (an euedaphic Asian species, Proisotoma minuta (hemiedaphic, distributed
[31],[36]
worldwide and inhabiting agricultural soils ), Protaphorura fimata (euedaphic, occuring through
[31],[37]
mild temperate to cold zones ), and Sinella curviseta (epedaphic, distributed from North America
[42]
to Europe, Southeast Asia and Japan ) were added as potential alternative test species (Annex E).
These species have been used as ecotoxicological test species before, but available testing experience is
limited.
Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate.
For contaminated soils, the effects are determined in the soil to be tested and in a control soil. According
to the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) are
either an uncontaminated soil comparable to the soil to be tested (reference soil) or a standard soil
(e.g. artificial soil).
NOTE The stability of the test substance cannot be ensured over the test period. No provision is made in the
test method for monitoring the persistence of the substance under test.
v
INTERNATIONAL STANDARD ISO 11267:2023(E)
Soil quality — Inhibition of reproduction of Collembola
(Folsomia candida) by soil contaminants
1 Scope
This document specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and determining
effects of soil contaminants and substances on the reproduction of Folsomia candida Willem by dermal
and alimentary uptake. This document also provides information on how to use this method for testing
substances under temperate conditions.
The chronic test described is applicable to soils and soil materials of unknown quality, e.g. from
contaminated sites, amended soils, soils after remediation, industrial, agricultural or other sites of
concern and waste materials.
The method is not applicable to volatile substances, i.e. substances for which H (Henry's constant) or
the air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 300 Pa at
25 °C.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10390, Soil, treated biowaste and sludge – Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis)
ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level
using barium chloride solution
ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method
ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic
conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
3.2
ECx
effect concentration for x % effect
concentration (mass fraction) of a test sample or a test substance that causes x % of an effect on a given
end-point within a given exposure period when compared with a control
EXAMPLE An EC50 is a concentration estimated to cause an effect on a test end-point in 50 % of an exposed
population over a defined exposure period.
Note 1 to entry: The ECx is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture (dry mass).
When substances are tested, the ECx is expressed as mass of the test substance per dry mass of soil in milligrams
per kilogram.
3.3
ERx
effect rate for x % effect
rate of a contaminated soil that causes x % of an effect on a given end-point within a given exposure
period when compared with a control
3.4
limit test
single concentration test consisting of at least four replicates each, the soil to be tested without any
dilution or the highest concentration of test substance mixed into the control soil (3.11) and the control
3.5
LOEC
lowest observed effect concentration
lowest test substance concentration that has a statistically significant effect (p < 0,05) when compared
with the control
Note 1 to entry: In this test, the LOEC is expressed as a mass of test substance per dry mass of the soil to be
tested. All test concentrations above the LOEC should usually show an effect that is statistically different from
the control.
3.6
LOER
lowest observed effect rate
lowest rate of a contaminated soil tested in a control soil (3.11) that has a statistically significant effect
(p < 0,05) when compared with the control
3.7
NOEC
no observed effect concentration
highest test substance concentration immediately below the LOEC (3.5) at which no statistically
significant effect is observed when compared to the control
Note 1 to entry: In this test, the concentration corresponding to the NOEC has no statistically significant effect
(p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control.
3.8
NOER
no observed effect rate
highest rate of a contaminated soil to be tested immediately below the LOER (3.6) at which no
statistically significant effect is observed when compared to the control
3.9
reference soil
uncontaminated soil with comparable pedological properties (nutrient concentrations, pH, organic
carbon content and texture) to the soil being studied
3.10
standard soil
field-collected soil or artificial soil whose main properties (pH, texture, organic matter content) are
within a known range
EXAMPLE Euro soils, artificial soil, LUFA standard soil.
Note 1 to entry: The properties of standard soils can differ from the soil to be tested.
3.11
control soil
reference soil (3.9) or standard soil (3.10) used as a control and as a medium for preparing dilution series
with soils to be tested or a reference substance, which fulfils the validity criteria
Note 1 to entry: In the case of natural soil, it is advisable to demonstrate its suitability for a test and for achieving
the test validity criteria before using the soil in a definitive test.
3.12
test mixture
mixture of contaminated soil or the test substance (e.g. chemical, biosolid, waste) with control soil (3.11)
3.13
test mixture ratio
ratio between the soil to be tested and the control soil (3.11) in a test mixture (3.12)
4 Principle
The effects on reproductive output of 10 d to 12 d old Collembola (F. candida) exposed to the soil to be
tested are compared to those observed in a control soil. If appropriate, effects based on exposure to a
test mixture of contaminated soil and control soil or a range of concentrations of a test substance mixed
into control soil are determined. Test mixtures are prepared at the start of the test and are not renewed
within the test period.
The Collembola are incubated until offspring (F ) emerge from eggs laid by mature adults, and the
number of offspring is determined. Usually offspring emerge within 28 d in control experiments. The
results obtained from the tests are compared with a control or, if appropriate, are used to determine
the concentrations which cause no effects on mortality and reproductive output (NOER/NOEC) and the
concentration resulting in x % reduction of juveniles hatched from eggs compared to the control (ERx/
ECx, 28 d) respectively.
If testing a concentration series, all test dilutions/concentrations above the LOER/LOEC have a harmful
effect equal to or greater than that observed at the LOER/LOEC. Where there is no prior knowledge of
the concentration of the soil to be tested or the test substance likely to have an effect, then it is useful to
conduct the test in two steps.
— An acute toxicity test (range-finding test) is carried out, to give an indication of the effect dilution/
concentration, and the dilution/concentration giving no mortality (NOER/NOEC). Dilutions/
concentrations to be used in the definitive test can then be selected.
— A definitive test on the reproductive output determines sublethal effects of (dilutions of) the
contaminated soil or the concentration of a substance which, when evenly mixed into the standard
soil, causes no significant effects on numbers of offspring hatched from eggs compared with the
control (NOER/NOEC), and the lowest concentration causing effects (LOER/LOEC).
A reference soil shall be used to demonstrate the appropriate status of the test population, and to avoid
misinterpretation of results.
5 Reagents and material
5.1 Biological material, in this test, 10 d to 12 d old juvenile springtails of the species Folsomia
candida Willem are used (see A.1 for details on synchronization of breeding).
5.2 Test mixture, which may consist of field-collected soil, waste material or control soil amended
by the test substance.
5.2.1 Field-collected soil or waste
The sample(s) can be field-collected soil from an industrial, agricultural or other site of concern, or
waste materials (e.g. dredged material, municipal sludge from a wastewater treatment plant, composed
material, or manure) under consideration for possible land disposal.
The field-collected soils used in the test shall be passed through a sieve of 4 mm square mesh to remove
coarse fragments and thoroughly mixed. If necessary, soil may be air-dried without heating before
sieving. Storage of soil to be tested should be as short as possible. The soil shall be stored in accordance
with ISO 18400-206 using containers that minimize losses of soil contaminants by volatilization and
sorption to the container walls. If soils or test mixtures have been stored, they should be mixed a second
time immediately before use. Soil pH should not be corrected as it can influence bioavailability of soil
contaminants.
For interpretation of test results, the following characteristics shall be determined for each soil sampled
from a field site:
a) pH in accordance with ISO 10390,
b) texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277,
c) water content in accordance with ISO 11465,
d) water-holding capacity according to Annex B,
e) cationic exchange capacity in accordance with ISO 11260,
f) organic carbon in accordance with ISO 10694,
g) percentage of material (mineral and organic) removed by the 4 mm sieve.
The water holding capacity of all mixtures used in the test should also be measured.
5.2.2 Control soil, either a reference soil or a standard soil that allows the presence of Collembola.
Control soil and soil used for dilution shall not differ in one test (either a reference soil or a standard
soil).
a) If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should
be treated and characterized like the soils to be tested. If a toxic contamination or unusual soil
properties cannot be ruled out, standard control soils should be preferred.
b) For testing the effects of substances mixed into soil, standard soils (e.g. artificial soil, LUFA) shall
be used as test substrate. The properties of the field-collected standard soil shall be reported.
The substrate called artificial soil can be used as a standard soil and has the following composition:
Percentage expressed on dry mass basis
— Sphagnum peat finely ground [a particle size of 10 %
(2 ± 1) mm is acceptable] and with no visible plant
remains
— Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite 20 %
— Industrial quartz sand (dominant fine sand with more 69 %
than 50 % of particle size 0,05 mm to 0,2 mm)
Approximately 0,3 % to 1,0 % calcium carbonate (CaCO , pulverized, analytical grade) are necessary
to get a pH of 6,0 ± 0,5. Further guidance on how to proceed on the adjustment of pH of artificial soil is
available in Annex C.
NOTE 1 Taking the properties of highly non-polar (log Kow > 2) or ionizing substances into account, 5 % of
peat has proven to be sufficient for maintaining the desired structure of the artificial soil.
NOTE 2 It has been demonstrated that F. candida can conform to the validity criteria even on reproductive
output when tested in field soils with lower organic carbon content (e.g. 2,7 %), and there is experience that
this can be achieved in artificial soil with 5 % peat. Therefore, it is not necessary, before using such a soil in a
definitive test, to demonstrate the suitability of the artificial soil for allowing the test to conform to the validity
criteria unless the peat content is lower than that specified above.
Prepare the artificial soil at least three days prior to the start of the test, by mixing the dry constituents
listed above thoroughly in a large-scale laboratory mixer. A portion of the deionized water required
is added during mixing. Allowance should be made for any water that is used for introducing the test
substance into the soil. The amount of calcium carbonate required can vary, depending on properties
of the individual batch of sphagnum peat and should be determined by measuring sub-samples
immediately before the test. Store the mixed artificial soil at room temperature for at least two days
to equilibrate acidity. To determine the pH and the maximum water holding capacity, the dry artificial
soil is pre-moistened one or two days before starting the test by adding deionized water to obtain
approximately half of the required final water content of 40 % to 60 % of the maximum water holding
capacity.
The total water-holding capacity shall be determined according to Annex B; the pH shall be determined
according to ISO 10390.
5.3 Food
A sufficient amount, for example, 2 mg to 10 mg, of granulated dried baker’s yeast, commercially
available for household use, is added to each container as a suitable food source, at the beginning of the
test and after about two weeks.
5.4 Reference substance
To ensure the quality of the test system, tests should be performed regularly (once or twice a year) with
a reference substance.
1)
Boric acid and the plant protection product Betosip (a.i. 157 g/l phenmedipham) have been tested in
an interlaboratory test and are recommended as reference substances.
WARNING — When handling these substances, appropriate precautions should be taken to avoid
ingestion or skin contact.
NOTE 1 Boric acid: Effects on reproductive output (i.e. EC50) are observed at concentrations of 147 mg boric
acid per kilogram of artificial soil (dry mass), 111 mg boric acid per kilogram of artificial soil with 5 % peat, and
[5],[21].
169 mg boric acid per kilogram of clay loam soil for F. candida. Taking into consideration these data and due
to the variability of organism sensitivity, an EC50 value between 50 mg and 175 mg boric acid/kg dry mass of
[103],[104]
artificial soil is acceptable based on current laboratory experience and in previous studies .
NOTE 2 Betosip: Effects on reproductive output (α = 0,05) are observed at concentrations between 100 mg
and 200 mg of the product per kilogram of the substrate (dry mass).
1) Betosip is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience
of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products
may be used if they can be shown to lead to the same results.
6 Apparatus
Use laboratory equipment and the following apparatus:
6.1 Test containers made of glass or other chemically inert material of about 100 ml capacity and
with a diameter of about 5 cm, with lids (e.g. plastic, glass discs or parafilm, able to be closed tightly).
6.2 Apparatus to determine the dry mass of the substrate in accordance with ISO 11465.
6.3 Large scale laboratory mixer for the preparation of the test mixture (5.2).
6.4 Suitable accurate balances.
6.5 Apparatus capable of measuring pH.
6.6 Apparatus to determine water-holding capacity of the substrate (see B.2).
6.7 Exhauster for transfer of springtails (see A.2).
6.8 Test environment.
6.8.1 Enclosure, capable of being controlled to a temperature of (20 ± 2) °C.
6.8.2 Light source, capable of delivering a constant light intensity of 400 Ix to 800 Ix at the substrate
surface at a controlled light: dark cycle of between 12 h:12 h and 16 h:8 h.
7 Procedure
7.1 Experimental design
7.1.1 General
A sample of field-collected soil can be tested at a single concentration (typically 100 %) or evaluated
for toxicity in a multi-concentration test whereby a series of concentrations (dilutions) is prepared
by mixing measured quantities with a control soil (5.2.2). When testing substances, a series of
concentrations is prepared by mixing quantities of the test substance with a standard soil (e.g. artificial
soil). The concentrations being expressed in milligrams of test substance per kilogram of dried control
soil (5.2.2). Depending on the knowledge of relevant response levels a range-finding test may precede
the definitive test. Each definitive test consists of a series of soil mixtures (treatments).
7.1.2 Range-finding test
A test to find the range of contaminated soil mixture ratios (e.g. 0 %, 1 %, 5 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %)
or concentrations of the test substance (e.g. 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg, 1 000 mg/kg)
affecting Collembola is optional. The range-finding test is conducted without replication.
When no effects are observed, even at 100 % contaminated soil or at concentrations of 1 000 mg test
substance per kilogram of standard soil (dry mass), the definitive test can be designed as a limit test.
Each test container (replicate) is filled with 30 g wet mass of the test sample. To ensure easy migration
of springtails, the substrate in the test container should not be compressed.
Use 10 specimens of 10 d to 12 d old Collembola per container. Prepare the test containers as indicated
in 7.2.1. Place the test containers in the test enclosure (6.8.1) with the light source (6.8.2).
At the beginning of the test, add about 2 mg of granulated dry yeast (5.3) to each test container, and
cover the containers tightly (e.g. using plastic, glass discs or parafilm). Open the test containers briefly
twice a week to allow aeration.
After 14 d, count the live Collembola in each container, and determine the percentage mortality for each
test substance concentration. Also, observe surviving Collembola and record any symptoms. Due to the
rapid degradation of dead Collembola, missing Collembola are assumed to have died during the test
period.
NOTE To obtain additional information for the determination of the concentration range for the final test,
the test period can be extended to four weeks to allow qualitative determination of effects at concentrations at
which effects on reproductive output can be expected.
7.1.3 Definitive test
The design of the definitive test depends on the test objectives. Typically, the habitat properties of
samples of a field-collected soil are characterized by comparison of the biological effects found in the
soil to be tested with those found in a reference soil, or if not available or not appropriate due to toxicity
or atypical physicochemical characteristics, in a standard soil. Results for the standard soil assist in
distinguishing contaminant effects from non-contaminant effects caused by soil physicochemical
properties. Regardless of whether a reference soil or standard soil is used for the statistical comparisons,
[20]
the results from standard soil shall be used to judge the validity and acceptability of the test .
If for characterization purposes a test design including dilution series is required, three designs are
possible (the concentrations shall be spaced by a factor not exceeding 2).
— For the NOEC/NOER approach, at least five concentrations in a geometric series should be used.
Four replicates for each concentration plus eight controls are recommended.
— For the ERx/ECx approach, 12 concentrations should be used. Two replicates for each concentration
plus six controls are recommended. The spacing factor can be variable; smaller at low concentrations,
larger at high concentrations.
— For the mixed approach, six concentrations to eight concentrations in a geometric series should
be used. Four replicates for each concentration plus eight controls are recommended. This mixed
approach allows a NOEC as well as an ERx/ECx evaluation.
A limit test can be sufficient if no toxic effect is observed in the range-finding test.
To facilitate checking of the pH and humidity of the test sample, use of additional containers for each
concentration and for the control is recommended.
Each test container (replicate) is filled with 30 g wet mass of the test sample. To ensure easy migration
of Collembola, the substrate in the test container should not be compressed.
7.2 Preparation of test mixture
7.2.1 Testing contaminated soil
According to the selected dilution range, the soil to be tested is mixed with the reference soil or the
standard soil thoroughly (either manually or by using a hand mixer). The homogeneity of the mixture is
checked visually. The total mass of the soil to be tested and the reference soil or the standard soil shall
be 30 g (wet mass) in each test container (6.1). The test mixture shall be wetted with deionized water
to reach 40 % to 60 % of the total water holding capacity determined according to Annex B. In some
cases, for example, when testing waste materials, higher percentages are required. A rough check of the
soil moisture content can be obtained by gently squeezing the soil in the hand; if the moisture content is
correct, small drops of water should appear between the fingers.
Determine the pH for each test mixture (one container per concentration) according to ISO 10390 at the
beginning and end of the test (when acid or basic substances are tested, do not adjust the pH).
Proceed simultaneously with at least four replicates per concentration and the control(s).
WARNING — Contaminated soils can contain unknown mixtures of toxic, mutagenic, or
otherwise harmful substances or infectious microorganisms. Occupational health risks can
arise from dust or evaporated substances as well as via dermal contact during handling and
incubation.
7.2.2 Testing substances added to the test substrate
A standard soil (5.2.2) is used to prepare the test sample. For each test container (6.1), the mass of
the substrate used shall be 30 g (wet mass). Substances are added to the test substrate and are mixed
thoroughly.
For the introduction of test substances use either method a), b) or c), as appropriate:
a) Water-soluble substance
— Immediately before starting the test, dissolve the quantity of the test substance in the water or
a portion of it required to wet the soil samples for the replicates of one concentration in order
to meet the requirements of 5.2.2, and mix it thoroughly with the soil before introducing it into
the test containers.
b) Substances insoluble in water but soluble in organic solvents
— Dissolve the quantity of test substance required to obtain the desired concentration in a volatile
solvent (such as acetone or hexane); mix it with a portion of the quartz sand required. After
evaporating the solvent by placing the container under a fume hood, add the remainder of the
soil and the water and mix it thoroughly before introducing it into the test containers.
Ultrasonic dispersion, organic solvents, emulsifiers or dispersants can be used to disperse substances
with low aqueous solubility. When such auxiliary substances are used, all test concentrations and an
additional control should contain the same minimum amount of auxiliary substance.
WARNING — Take appropriate precautions when dealing with solvent vapour to avoid danger
from inhalation or explosion, and to avoid damage to extraction equipment, pumps, etc.
c) Substances insoluble in water or organic solvents
— For a substance insoluble in a volatile solvent, prepare a mixture of 10 g of finely ground
industrial quartz sand (see 5.2.2) and the quantity of the test substance required to obtain the
desired concentration. Add that mixture to the remainder of the soil and the water and mix
thoroughly before introducing it into a test container.
Base the concentrations selected to provide the LOEC/NOEC on the results of the range-finding test.
Choose the appropriate number of test concentrations above and below the LOEC/NOEC and use a
spacing factor not exceeding 2.
Substances mixed into the substrate do not need to be tested at concentrations higher than 1 000 mg/
kg mass of test sample.
Proceed simultaneously with all replicates per concentration and the control(s) required according to
the selected approach.
Determine the pH for each test mixture (one container per concentration) according to ISO 10390 at the
beginning and end of the test.
7.2.3 Preparation of control container
The control container contains the control soil (5.2.2) moistened with deionized water to reach 40 % to
60 % of the total water holding capacity (determined according to Annex B).
Perform one control container for the range-finding test and six to eight control containers for the
definitive test, depending on its experimental design (see 7.1.3).
Prepare the control containers in the same way as the test containers. If the preparation of the test
requires the use of a solvent (see 7.2.2), use an additional control prepared with solvent but without the
test substance. Cover the containers as indicated in 6.1.
7.3 Addition of the biological material
Ten juvenile Collembola (10 d to 12 d old) are placed in each test container. Collembola are tapped or
sucked from the breeding containers to transfer them to the test containers. This can easily be done
using an exhauster as described in A.2. Before being transferred to the test containers, organisms are
counted and checked for damage both to reduce control mortality and to avoid systematic trial errors.
An example for rearing and breeding the standard species Folsomia candida is provided in Annex A and
for alternative test species in Annex E.
7.4 Test conditions and measurements
At the beginning of the test and after a period of 14 d, add about 2 mg of granulated dry yeast (5.3) to
each test container, and cover the containers tightly (e.g. using plastic, glass discs or parafilm). Open
the test containers briefly twice a week to allow aeration.
Determine the water content and the pH of the soil at the beginning and end of the test for one vessel of
each test conditions. When acidic or basic substances are tested, do not adjust the pH.
After two weeks, check the water content by reweighing the additional test containers, and compensate
for water loss if it exceeds 2 % of the initial water content.
7.5 Determination of surviving Collembola
Determine the number of Collembola present four weeks after introducing the parental Collembola
onto the test and control substrates. Pour the test sample into a 500 ml to 600 ml container and add
water. After gentle stirring of the suspension with a spatula, Collembola drift to the water surface.
Count adults and juveniles, if present, by a suitable procedure (see Annex D) and report the numbers.
NOTE 1 Other extraction methods (e.g. high-gradient extraction) can be used if they have proven to be
effective.
NOTE 2 When Collembola species other than F. candida are used in the test, some modifications in the
procedures of 7.3, 7.4 and 7.5 can be necessary (see Annex E).
8 Calculation and expression of results
8.1 Calculation
For each dilution or concentration, determine the percent mortality and number of offspring produced
after a period of four weeks.
8.2 Expression of results
A graphical presentation of the mean values of the end-points including standard deviation of the
measured values against the soil(s) to be tested, control soil(s) or the selected series of test mixture
ratios should be prepared. This comparison or curve gives an impression of the quality of effects and
their magnitudes. Express the mixture ratio as based on soil dry mass.
ISO
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11267
Troisième édition
2023-08
Qualité du sol — Inhibition de la
reproduction de Collembola (Folsomia
candida) par des contaminants du sol
Soil quality — Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia
candida) by soil contaminants
Numéro de référence
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© ISO 2023
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 3
5 Réactifs et matériel . 4
6 Appareillage . 6
7 Mode opératoire . 7
7.1 Plan d’expérience . 7
7.1.1 Généralités . 7
7.1.2 Essai préliminaire . 7
7.1.3 Essai définitif . 7
7.2 Préparation du mélange d’essai . 8
7.2.1 Essai sur un sol pollué . 8
7.2.2 Essai de substances ajoutées au substrat d’essai . 8
7.2.3 Préparation du récipient témoin . 9
7.3 Ajout du matériel biologique . 10
7.4 Conditions d’essai et mesurages . 10
7.5 Détermination du nombre de collemboles survivants . 10
8 Calcul et expression des résultats .10
8.1 Calcul . 10
8.2 Expression des résultats . 10
9 Validité de l’essai .11
10 Analyse statistique .11
10.1 Généralités . 11
10.2 Essais à une seule concentration . 11
10.3 Essais à plusieurs concentrations.12
10.3.1 Essai préliminaire .12
10.3.2 Essai définitif .12
11 Rapport d’essai .13
Annexe A (informative) Techniques d’élevage de Folsomia candida .14
Annexe B (normative) Détermination de la capacité de rétention d’eau .17
Annexe C (informative) Recommandations relatives à l’ajustement du pH d’un sol artificiel .19
Annexe D (informative) Extraction et comptage des collemboles .20
Annexe E (informative) Informations spécifiques relatives aux espèces alternatives
de collemboles autres que Folsomia candida .21
Bibliographie .37
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner
l’utilisation d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et
à l’applicabilité de tout droit de propriété revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent
document, l’ISO n’avait pas reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa
mise en application. Toutefois, il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent
document que des informations plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de
brevets, disponible à l’adresse www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 444, Méthodes d’essai pour
la caractérisation environnementale des matrices solides, du Comité européen de normalisation (CEN),
conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 11267:2014), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
La principale modification est la suivante:
— ajout d’une annexe afin de fournir des informations spécifiques relatives à l’utilisation d’espèces
alternatives de collemboles pour l’essai de reproduction.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
Des systèmes d’essais d’écotoxicité sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur les effets
des contaminants présents dans le sol et sont proposés en complément d’une analyse chimique
conventionnelle (voir les Références [2] et [4]). La Référence [2] contient une liste et une brève
caractérisation des systèmes d’essai recommandés et normalisés, et la Référence [4] donne des
recommandations pour le choix et l’évaluation des bioessais. Les systèmes d’essais aquatiques avec
un éluat de sol sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur la fraction des contaminants
susceptibles d’être entraînés jusqu’aux eaux souterraines par la circulation de l’eau (fonction de
rétention des sols), alors que les systèmes d’essais terrestres sont utilisés pour évaluer la fonction
d’habitat des sols.
Les collemboles, qui peuplent les sols, présentent une pertinence écologique pour les essais d’écotoxicité.
Les collemboles sont des prédateurs d’un vaste éventail d’invertébrés endogés et épigés, et contribuent
aux processus de décomposition dans les sols. Dans les sols acides, ils sont probablement, avec les
enchytréides, les invertébrés les plus importants eu égard à cette fonction, puisque les vers de terre
[19]
en sont généralement absents . En outre, les collemboles constituent une espèce d’arthropodes
[1]
présentant une autre voie et un autre taux d’exposition que ceux des vers de terre et des
[3]
enchytréides . Les bioessais ont impliqué diverses espèces, parmi lesquelles quatre espèces ont été les
plus couramment utilisées, à savoir Folsomia candida Willem, Folsomia fimetaria L., Onychiurus armatus
[20]
et Orchesella cincta . De nombreux essais de toxicité des sols, réalisés avec le soutien d’Environnement
Canada (EC), ont abouti au développement et à la normalisation d’une méthode d’essai biologique pour
[10]
déterminer la toxicité létale et sublétale d’échantillons d’un sol pollué pour les collemboles . La
méthode élaborée par Environnement Canada (EC) concerne quatre espèces, à savoir Orthonychiurus
folsomi, Proisotoma minuta, F. candida et F. fimetaria. Il existe deux autres méthodes faisant lieu de
systèmes d’essais normalisés utilisant des collemboles comme organismes indicateurs pour la fonction
d’habitat du sol. La première vise à évaluer les effets de substances sur la reproduction des collemboles
[19],[21]
F. fimetaria et F. candida dans le sol , tandis que la seconde, décrite dans le présent document,
s’intéresse particulièrement à l’essai d’un sol pollué. La méthode peut éventuellement être utilisée pour
évaluer le pouvoir toxique aigu sur les collemboles de substances ajoutées à un sol standard (un sol
artificiel, par exemple).
Le présent document décrit une méthode fondée sur la détermination des effets sublétaux des sols
pollués sur les collemboles adultes de l’espèce Folsomia candida Willem. L’espèce est présente dans le
[10],[19]
monde entier. Elle joue un rôle écologique semblable à celui de F. fimetari . F. candida se reproduit
par parthénogenèse et constitue une espèce facilement accessible, car elle est disponible dans le
commerce et facile à élever. F. candida est considérée comme étant représentative des arthropodes
du sol en général et des collemboles en particulier. Des informations contextuelles sur l’écologie des
collemboles et sur leur utilisation dans les essais d’écotoxicité sont disponibles à la Référence [22].
Des espèces distinctes de collemboles habitent dans différentes niches écologiques, dans différents
types de sols et à différentes profondeurs à travers le monde. Bien qu’elle soit considérée comme une
espèce de substitution et qu’elle soit, de ce fait, fréquemment utilisée lors d’essais d’écotoxicité sur la
[28]
reproduction, F. candida n’est pas courante dans la plupart des sols naturels . De plus, des adaptations
morphologiques propres à l’espèce peuvent influencer l’exposition et les effets toxiques des produits
[102]
chimiques sur les organismes . Par conséquent, le recours à plusieurs espèces de collemboles
représentant différentes adaptations morphologiques peut se révéler utile afin d’obtenir un large
spectre de sensibilités pour ce groupe. D’autres espèces, telles que F. fimetaria (espèce euédaphique,
[28]
présente dans le monde entier, qui habite dans des sols agricoles ), Onychirus yodai (une espèce
[31]
asiatique euédaphique , Proisotoma minuta (espèce hémiédaphique, présente dans le monde entier,
[31],[36]
qui habite dans les sols agricoles ), Protaphorura fimata (espèce euédaphique, présente dans les
[31],[37]
zones tempérées à froides ), et Sinella curviseta (espèce épédaphique, présente de l’Amérique du
[42]
Nord à l’Europe, en Asie du Sud-Est et au Japon ) ont été ajoutées comme espèces d’essai alternatives
potentielles (Annexe E). Bien que ces espèces aient déjà servi d’espèces d’essai d’écotoxicité,
les informations d’essai disponibles à leur sujet sont limitées.
Les effets des substances sont évalués à l’aide d’un sol standard, de préférence un substrat de sol
artificiel défini. Pour les sols pollués, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un sol
v
témoin. Selon l’objectif de l’étude, le substrat pour le témoin et les dilutions (série de dilutions d’un sol
pollué) est soit un sol non pollué comparable au sol à évaluer (sol de référence) soit un sol standard (par
exemple un sol artificiel).
NOTE La stabilité de la substance d’essai ne peut pas être garantie pendant toute la durée de l’essai.
La méthode d’essai ne prévoit aucune disposition permettant de surveiller la rémanence de la substance soumise
à essai.
vi
NORME INTERNATIONALE ISO 11267:2023(F)
Qualité du sol — Inhibition de la reproduction de
Collembola (Folsomia candida) par des contaminants du
sol
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie l’une des méthodes permettant d’évaluer la fonction d’habitat des sols
et de déterminer les effets de contaminants du sol et de substances sur la reproduction de Folsomia
candida Willem par absorption cutanée et ingestion. Le présent document fournit des informations sur
la manière d’utiliser cette méthode pour évaluer des substances dans des conditions tempérées.
L’essai chronique décrit s’applique aux sols et matériaux du sol de qualité inconnue, par exemple
provenant de sites pollués, de sols amendés, de sols après remédiation, de sites industriels, agricoles ou
d’autres sites d’intérêt et de déchets.
La méthode ne s’applique pas aux substances volatiles, c’est-à-dire aux substances pour lesquelles
H (constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la
pression de vapeur excède 300 Pa à 25 °C.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 10390, Sols, biodéchets traités et boues — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d'échange cationique et du taux de saturation en
bases échangeables à l'aide d'une solution de chlorure de baryum
ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des
sols — Méthode par tamisage et sédimentation
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
ISO 18400-206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206: Collecte, manipulation et conservation de
sols destinés à l'évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et structurels en laboratoire
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/ .
3.1
contaminant
substance ou agent présent(e) dans le sol du fait de l’activité humaine
3.2
CEx
concentration efficace à x %
concentration (fraction massique) d’un échantillon d’essai ou une substance d’essai qui engendre un
effet de x % sur un résultat final donné durant une période d’exposition déterminée, par rapport au
témoin
EXEMPLE Une CE50 est une concentration estimée produire un effet sur un résultat final de l’essai dans
50 % d’une population exposée durant une période d’exposition déterminée.
Note 1 à l'article: La CEx est exprimée en pourcentage de sol soumis à essai (poids sec) par mélange de sols
(poids sec). Lorsque des substances sont soumises à essai, la CEx est exprimée en masse de substance soumise à
essai par poids sec de sol en milligrammes par kilogramme.
3.3
TEx
taux efficace à x %
taux d’un sol pollué qui engendre un effet de x % sur un résultat final donné durant une période
d’exposition déterminée, par rapport au témoin
3.4
essai limite
essai à une seule concentration comprenant au moins quatre réplicats pour chaque concentration, le sol
soumis à essai sans dilution ou la concentration la plus élevée de substance soumise à essai mélangée
dans le sol témoin (3.11) et le témoin
3.5
CMEO
concentration minimale avec effet observé
concentration la plus faible d’une substance soumise à essai ayant un effet statistiquement significatif
(p < 0,05) en comparaison avec le témoin
Note 1 à l'article: Dans cette méthode d’essai, la CMEO est exprimée en masse de substance soumise à essai par
poids sec du sol soumis à essai. Il convient que toutes les concentrations d’essai supérieures à la CMEO présentent
un effet statistiquement différent du témoin.
3.6
TMEO
taux minimal avec effet observé
taux le plus faible d’un sol pollué soumis à essai dans un sol témoin (3.11) ayant un effet statistiquement
significatif (p < 0,05) en comparaison avec le témoin
3.7
CSEO
concentration maximale sans effet observé
concentration la plus élevée d’une substance soumise à essai, immédiatement inférieure à la CMEO
(3.5), à laquelle aucun effet statistiquement significatif n’est observé en comparaison avec le témoin
Note 1 à l'article: Dans cette méthode d’essai, la concentration correspondant à la CSEO ne présente aucun effet
statistiquement significatif (p < 0,05) durant une période d’exposition déterminée, en comparaison avec le
témoin.
3.8
TSEO
taux maximal sans effet observé
taux le plus élevé d’un sol pollué soumis à essai, immédiatement inférieur au TMEO (3.6), auquel aucun
effet statistiquement significatif n’est observé en comparaison avec le témoin
3.9
sol de référence
sol non pollué présentant des propriétés pédologiques comparables (concentrations d’éléments
nutritifs, pH, teneur en carbone organique et texture) à celles du sol étudié
3.10
sol standard
sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les propriétés principales (pH, texture, teneur en matières
organiques) se situent dans une plage connue
EXEMPLE Euro-Sols, sol artificiel, sol standard LUFA.
Note 1 à l'article: Les propriétés des sols standards peuvent différer de celles du sol soumis à essai.
3.11
sol témoin
sol de référence (3.9) ou sol standard (3.10) utilisé comme témoin et comme milieu pour préparer une
série de dilutions avec les sols soumis à essai ou une substance de référence, qui satisfait aux critères de
validité
Note 1 à l'article: Dans le cas d’un sol naturel, il est recommandé de démontrer sa capacité à être utilisé pour un
essai et à atteindre les critères de validité de l’essai avant d’utiliser un essai définitif.
3.12
mélange d’essai
mélange d’un sol pollué ou de la substance soumise à essai (par exemple, substance chimique,
matière biosolide, déchets) avec un sol témoin (3.11)
3.13
rapport de mélange d’essai
rapport entre le sol soumis à essai et le sol témoin (3.11) dans un mélange d’essai (3.12)
4 Principe
Les effets sur la reproduction de collemboles (F. candida) âgés de 10 à 12 jours et exposés au sol soumis
à essai sont comparés à ceux observés chez des collemboles dans un sol témoin. Si cela est approprié,
les effets observés sont déterminés sur la base de l’exposition à un mélange d’essai de sol pollué et de
sol témoin ou à une gamme de concentrations d’une substance soumise à essai mélangée dans le sol
témoin. Les mélanges d’essai sont préparés au début de l’essai et ne sont pas renouvelés au cours de la
période d’essai.
Les collemboles sont incubés jusqu’à ce que les descendants (F ) sortent des œufs pondus par les adultes
et le nombre de descendants est déterminé. L’éclosion des œufs intervient généralement dans un délai
de 28 jours lors d’expérimentations témoins. Les résultats obtenus lors des essais sont comparés avec
un témoin, ou, le cas échéant, sont utilisés pour déterminer respectivement les concentrations qui ne
provoquent pas d’effets sur la mortalité et la reproduction (TSEO/CSEO) et la concentration entraînant
une réduction de x % du nombre de juvéniles éclos des œufs par rapport au témoin (TEx/CEx, 28 j).
Lorsqu’une gamme de concentration est soumise à essai, toutes les dilutions/concentrations d’essai
supérieures au TMEO/à la CMEO ont un effet nocif supérieur ou égal à celui observé au TMEO/à la
CMEO. Lorsque l’on ne connaît pas la concentration à laquelle le sol ou la substance soumis à essai est
susceptible de produire un effet, il est utile de conduire l’essai en deux étapes:
— un essai de toxicité aiguë (essai préliminaire) est réalisé pour obtenir une indication de la dilution/
concentration produisant un effet, et de la dilution/concentration ne provoquant pas de mortalité
(TSEO/CSEO). Les dilutions/concentrations à utiliser au cours de l’essai définitif peuvent ensuite
être choisies;
— un essai définitif concernant l’efficacité de la reproduction détermine les effets sublétaux du
(des dilutions de) sol pollué ou de la concentration d’une substance qui, lorsqu’elle est uniformément
répartie dans le sol standard, n’a pas d’effet significatif sur le nombre de descendants éclos des œufs
comparé au témoin (TSEO/CSEO), et la plus faible concentration produisant un effet (TMEO/CMEO).
Un sol de référence doit être utilisé pour démontrer l’état approprié de la population soumise à essai et
éviter une mauvaise interprétation des résultats.
5 Réactifs et matériel
5.1 Matériel biologique: au cours de cet essai, des collemboles juvéniles âgés de 10 à 12 jours,
de l’espèce Folsomia candida (Willem), sont utilisés (voir A.1 pour les détails concernant la
synchronisation de l’élevage).
5.2 Mélange d’essai, pouvant être constitué d’un sol prélevé sur le terrain, de déchets ou d’un sol
témoin amendé par la substance soumise à essai.
5.2.1 Sol ou déchets prélevés sur le terrain
L’échantillon ou les échantillons peuvent être un sol prélevé sur le terrain d’un site industriel, agricole
ou d’un autre site d’intérêt, ou des déchets (par exemple, matériau de dragage, boues provenant d’une
station d’épuration des eaux urbaines, matériau composite ou fumier) pour lesquels une éventuelle
mise en dépôt terrestre est envisagée.
Les sols prélevés sur le terrain et utilisés au cours de l’essai doivent être passés dans un tamis à mailles
carrées de 4 mm et être soigneusement mélangés. Si nécessaire, le sol peut être séché à l’air libre sans
chauffage avant le tamisage. Il convient que les sols soumis à essai soient conservés le moins longtemps
possible. Le sol doit être conservé conformément à l’ISO 18400-206 en utilisant des récipients qui
réduisent le plus possible les pertes de contaminants du sol par volatilisation et sorption sur les
parois des récipients. Si des sols ou des mélanges d’essai ont été conservés, il convient de les mélanger
une nouvelle fois avant de les utiliser. Il convient de ne pas corriger le pH du sol, car il peut avoir une
incidence sur la biodisponibilité des contaminants du sol.
Dans le cadre de l’interprétation des résultats d’essai, les caractéristiques suivantes doivent être
déterminées pour chaque échantillon de sol prélevé sur un terrain:
a) pH conformément à l’ISO 10390;
b) texture (sable, limon, vase) conformément à l’ISO 11277;
c) teneur en eau conformément à l’ISO 11465;
d) capacité de rétention d’eau conformément à l’Annexe B;
e) capacité d’échange cationique conformément à l’ISO 11260;
f) carbone organique conformément à l’ISO 10694;
g) pourcentage de matériel (minéral et organique) retenu par le tamis de 4 mm.
Il convient également de mesurer la capacité de rétention d’eau de tous les mélanges utilisés au cours de
l’essai.
5.2.2 Sol témoin, soit un sol de référence soit un sol standard permettant la présence de collemboles.
Le sol témoin et le sol utilisé pour la dilution ne doivent pas différer l’un de l’autre au cours d’un essai
(soit un sol de référence soit un sol standard).
a) Si des sols de référence provenant de zones non polluées voisines d’un site pollué sont disponibles,
il convient de les traiter et de les caractériser de la même manière que les sols soumis à essai.
S’il est impossible d’exclure une contamination toxique ou des propriétés inhabituelles, il convient
de privilégier des sols témoins standards.
b) Afin d’évaluer les effets de substances mélangées au sol, des sols standards (par exemple, sol
artificiel, sol LUFA) doivent être utilisés comme substrat d’essai. Les propriétés du sol standard
prélevé sur le terrain doivent être consignées dans le rapport.
Le substrat appelé «sol artificiel» peut être utilisé comme un sol standard et présente la composition
suivante:
Pourcentage exprimé
en poids sec
— Tourbe de sphaignes, finement moulue [une classe granulométrique de 10 %
(2 ± 1) mm est acceptable], exempte de tout résidu végétal visible
— Argile kaolinique contenant au moins 30 % de kaolinite 20 %
— Sable de quartz industriel (contenant en majorité du sable fin constitué 69 %
à plus de 50 % de grains dans la classe granulométrique de 0,05 mm à
0,2 mm)
Environ 0,3 % à 1,0 % de carbonate de calcium (CaCO , pulvérisé, de qualité analytique) est nécessaire
pour obtenir un pH de 6,0 ± 0,5. L’Annexe C fournit des recommandations supplémentaires relatives à la
manière de procéder à l’ajustement du pH du sol artificiel.
NOTE 1 Compte tenu des propriétés des substances fortement non polaires (log Kow > 2) ou ionisantes, 5 % de
tourbe se sont avérés suffisants pour maintenir la structure souhaitée du sol artificiel.
NOTE 2 Il a été démontré que F. candida peut respecter les critères de validité, même en ce qui concerne
l’efficacité de la reproduction, lorsqu’il est soumis à essai dans des sols ayant une plus faible teneur en carbone
organique (par exemple 2,7 %), et des expériences prouvent que cette teneur peut être obtenue dans un sol
artificiel avec 5 % de tourbe. Par conséquent, avant d’utiliser ce type de sol dans un essai définitif, il n’est pas
nécessaire de démontrer que le sol artificiel permet de réaliser l’essai conformément aux critères de validité,
sauf si la teneur en tourbe est inférieure à la valeur spécifiée ci-dessus.
Préparer le sol artificiel au moins trois jours avant le début de l’essai, en mélangeant soigneusement les
constituants secs indiqués ci-dessus dans un mélangeur de laboratoire de grande dimension. Une partie
de l’eau déionisée nécessaire est ajoutée pendant le mélange. Il convient de tenir compte de l’eau qui est
utilisée pour introduire la substance soumise à essai dans le sol. La quantité de carbonate de calcium
nécessaire peut varier selon les propriétés du lot particulier de tourbe de sphaignes, et il convient
qu’elle soit déterminée par des mesurages effectués sur des sous-échantillons immédiatement avant
l’essai. Conserver le sol artificiel mélangé à température ambiante pendant au moins deux jours pour
équilibrer l’acidité. Afin de déterminer le pH et la capacité maximale de rétention d’eau, le sol artificiel
sec est humidifié un ou deux jours avant le début de l’essai en ajoutant de l’eau déionisée de manière
à atteindre la moitié de la teneur finale en eau requise comprise entre 40 % et 60 % de la capacité
maximale de rétention d’eau.
La capacité totale de rétention d’eau doit être déterminée conformément à l’Annexe B, le pH doit être
déterminé conformément à l’ISO 10390.
5.3 Alimentation
Une source de nourriture appropriée, constituée d’une quantité suffisante, de 2 mg à 10 mg par exemple,
de levure de boulanger sèche en granulés, disponible dans le commerce pour un usage domestique, est
ajoutée à chaque récipient au début de l’essai puis deux semaines environ après le début de l’essai.
5.4 Substance de référence
Afin de garantir la qualité du système d’essai, il convient d’effectuer des essais à intervalles réguliers
(une ou deux fois par an) en utilisant une substance de référence.
1)
De l’acide borique et le produit phytosanitaire Betosip (c’est-à-dire 157 g/l de phenmedipham) ont été
soumis à essai lors d’un essai interlaboratoires, et leur utilisation en tant que substances de référence
est recommandée.
AVERTISSEMENT — Lors de la manipulation de ces substances, il convient de prendre toutes les
précautions nécessaires pour éviter toute ingestion ou tout contact avec la peau.
NOTE 1 Acide borique: Des effets sur la reproduction (c’est-à-dire la CE50) sont observés à des concentrations
de 147 mg d’acide borique par kilogramme de sol artificiel (poids sec), 111 mg d’acide borique par kilogramme
de sol artificiel avec 5 % de tourbe et 169 mg d’acide borique par kilogramme de sol de limon argileux pour
[5],[21]
F. candida . En tenant compte de ces données et en raison de la variabilité de la sensibilité des organismes,
une CE50 comprise entre 50 mg et 175 mg d’acide borique/kg de sol artificiel en poids sec constitue une valeur
[103],[104]
acceptable selon l’expérience actuelle du laboratoire et des études antérieures .
NOTE 2 Betosip: Des effets sur la reproduction (α = 0,05) sont observés à des concentrations comprises entre
100 mg et 200 mg du produit par kilogramme de substrat (poids sec).
6 Appareillage
Utiliser du matériel de laboratoire et l’appareillage suivant:
6.1 Récipients d’essai, en verre ou autre matériau chimiquement inerte, d’une capacité d’environ
100 ml et d’un diamètre d’environ 5 cm, munis de couvercles (par exemple, couvercle en plastique,
disque en verre ou film plastique) pouvant être fermés hermétiquement.
6.2 Appareillage permettant de déterminer le poids sec du substrat conformément à l’ISO 11465.
6.3 Mélangeur de laboratoire de grande dimension pour la préparation du mélange d’essai (5.2).
6.4 Balances de précision adaptées.
6.5 Appareillage permettant de mesurer le pH.
6.6 Appareillage permettant de déterminer la capacité de rétention d’eau du substrat (voir B.2).
6.7 Appareil d’aspiration pour le transfert des collemboles (voir A.2).
6.8 Environnement d’essai.
6.8.1 Enceinte, thermostatée à (20 ± 2) °C.
6.8.2 Source lumineuse, permettant de soumettre les récipients à une intensité lumineuse constante
de 400 Ix à 800 Ix à la surface du substrat, selon un cycle contrôlé lumière/obscurité compris entre
12 h:12 h et 16 h:8 h.
1) Betosip est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention
des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif
du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux
mêmes résultats.
7 Mode opératoire
7.1 Plan d’expérience
7.1.1 Généralités
Un échantillon de sol prélevé sur le terrain peut être soumis à essai à une seule concentration
(généralement 100 %) ou être évalué afin de déterminer sa toxicité au moyen d’un essai à plusieurs
concentrations pour lequel une gamme de concentrations (dilutions) est préparée en mélangeant
des quantités mesurées avec un sol témoin (5.2.2). Lorsque des substances sont soumises à essai,
une gamme de concentrations est préparée en mélangeant différentes quantités de la substance
soumise à essai avec un sol standard (par exemple un sol artificiel). Les concentrations étant exprimées
en milligrammes de substance soumise à essai par kilogramme de sol témoin équivalent sec (5.2.2).
Selon que les niveaux de réponse pertinents sont connus ou non, un essai préliminaire peut précéder
l’essai définitif. Chaque essai définitif comprend une série de mélanges de sols (traitements).
7.1.2 Essai préliminaire
L’essai permettant de déterminer la gamme de rapports de mélange de sols pollués (par exemple, 0 %,
1 %, 5 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %) ou concentrations de substances (par exemple, 0 mg/kg, 1 mg/kg,
10 mg/kg, 100 mg/kg, 1 000 mg/kg) affectant les collemboles est facultatif. L’essai préliminaire est
effectué sans répétition.
Lorsqu’aucun effet n’est observé, même avec un sol pollué à 100 % ou à une concentration de substance
soumise à essai de 1 000 mg par kilogramme de sol standard (poids sec), l’essai définitif peut être conçu
comme un essai limite.
Chaque récipient d’essai (réplicat) est rempli de 30 g d’échantillon d’essai en poids humide. Pour faciliter
la migration des collemboles, il convient de ne pas tasser le substrat dans le récipient d’essai.
Utiliser 10 spécimens de collemboles âgés de 10 à 12 jours par récipient. Préparer les récipients d’essai
en procédant comme indiqué en 7.2.1. Placer les récipients d’essai dans l’enceinte d’essai (6.8.1) avec la
source lumineuse (6.8.2).
Au début de l’essai, ajouter environ 2 mg de levure sèche en granulés (5.3) dans chaque récipient d’essai
et fermer hermétiquement les récipients (par exemple, à l’aide d’un couvercle en plastique, d’un disque
en verre ou d’un film plastique). Ouvrir les récipients d’essai brièvement deux fois par semaine pour les
aérer.
Au bout de 14 jours, compter le nombre de collemboles vivants dans chaque récipient et déterminer le
pourcentage de mortalité pour chaque concentration de substance soumise à essai. Observer également
les collemboles survivants et noter tout symptôme. En raison de la dégradation rapide des collemboles
morts, on présume que les collemboles manquants sont morts durant la période d’essai.
NOTE Afin d’obtenir des informations supplémentaires relatives à la détermination de la gamme de
concentrations pour l’essai final, la période d’essai peut être étendue à quatre semaines afin de permettre une
détermination qualitative des effets à des concentrations auxquelles des effets sur la reproduction peuvent être
attendus.
7.1.3 Essai définitif
Le plan de l’essai définitif dépend des objectifs de l’essai. Les propriétés d’habitat des échantillons de
sol prélevé sur le terrain sont généralement caractérisées en comparant les effets biologiques observés
dans le ou les sols soumis à essai avec ceux observés dans un sol de référence, ou si celui-ci n’est pas
disponible ou n’est pas approprié en raison de sa toxicité ou de caractéristiques physico-chimiques
atypiques, dans un sol standard. Les résultats pour le sol standard contribuent à distinguer les effets
liés aux contaminants et les effets non liés aux contaminants provoqués par des propriétés physico-
chimiques. Indépendamment du fait qu’un sol de référence ou un sol standard soit utilisé pour les
comparaisons statistiques, les résultats obtenus à partir du sol standard doivent être utilisés pour
[20]
évaluer la validité et l’acceptabilité de l’essai .
Si, à des fins de caractérisation, un plan d’expérience incluant une série de dilutions est nécessaire,
trois plans sont possibles (les concentrations doivent être espacées par un facteur inférieur ou égal à 2).
— Pour la méthode CSEO/TSEO, il convient d’utiliser une série géométrique d’au moins
cinq concentrations. Il est recommandé d’utiliser quatre réplicats pour chaque concentration et huit
témoins.
— Pour la méthode TEx/CEx, il convient d’utiliser 12 concentrations. Il est recommandé d’utiliser deux
réplicats pour chaque concentration et six témoins. Le facteur de séparation peut être variable:
plus petit à de faibles concentrations, plus grand à des concentrations élevées.
— Dans le cadre de la méthode mixte, il convient d’utiliser une série géométrique de six à huit
concentrations. Il est recommandé d’utiliser quatre réplicats pour chaque concentration et huit
témoins. Cette méthode mixte permet d’évaluer la CSEO ainsi que le TEx/CEx.
Un essai limite peut suffire en l’absence d’effets toxiques observés au cours de l’essai préliminaire.
Afin de faciliter la vérification du pH et de l’humidité de l’échantillon d’essai, il est recommandé d’utiliser
des récipients supplémentaires pour chaque concentration, ainsi que pour le témoin.
Chaque récipient d’essai (réplicat) est rempli de 30 g d’échantillon d’essai en poids humide. Afin de
faciliter la migration des collemboles, il convient de ne pas tasser le substrat dans le récipient d’essai.
7.2 Préparation du mélange d’essai
7.2.1 Essai sur un sol pollué
Conformément à la gamme de dilutions choisie, le sol soumis à essai est soigneusement mélangé au sol
de référence ou au sol standard (manuellement ou à l’aide d’un mélangeur à main). L’homogénéité du
mélange est contrôlée visuellement. Le poids total du sol soumis à essai et du sol de référence ou du sol
standard doit être de 30 g (poids humide) dans chaque récipient d’essai (6.1). Le mélange d’essai doit
être humidifié avec de l’eau déionisée pour atteindre 40 % à 60 % de sa capacité totale de rétention
d’eau déterminée conformément à l’Annexe B. Dans certains cas, par exemple lorsque l’essai est réalisé
sur des déchets, des pourcentages plus élevés sont nécessaires. Une vérification sommaire de la teneur
en eau du sol peut être effectuée en comprimant légèrement le sol dans la main. Si la teneur en eau est
correcte, de petites gouttes d’eau devraient apparaître entre les doigts.
Déterminer le pH pour chaque mélange d’essai (un récipient par concentration) conformément à
l’ISO 10390 au début et à la fin de l’essai (lorsque des substances acides ou basiques sont soumises à
essai, ne pas ajuster le pH).
Procéder à l’essai simultanément sur au moins quatre réplicats par concentration et sur le ou les
témoins.
AVERTISSEMENT — Les sols pollués peuvent contenir des mélanges inconnus de substances
toxiques, mutagènes ou nocives ou des micro-organismes infectieux. Des risques pour la santé
au travail peuvent survenir en raison de la poussière ou de l’évaporation de substances ainsi que
par contact cutané pendant la manipulation et l’incubation.
7.2.2 Essai de substances ajoutées au substrat d’essai
Un sol standard (5.2.2) est utilisé pour préparer l’échantillon d’essai. Pour chaque récipient d’essai (6.1),
le poids du substrat utilisé doit être de 30 g (poids humide). Des substances sont ajoutées au substrat
d’essai, puis le tout est soigneusement mélangé.
Pour l’introduction des substances soumises à essai, utiliser la méthode a), b) ou c), selon le cas:
a) Substance hydrosoluble
— Immédiatement avant le début de l’essai, dissoudre la quantité de substance soumise à essai
dans l’eau ou une partie nécessaire de cette substance pour humidifier les échantillons de sol
pour les réplicats d’une concentration afin de satisfaire aux exigences de 5.2.2, puis mélanger
soigneusement avec le sol avant d’introduire le tout dans le récipient d’essai.
b) Substances insolubles dans l’eau, mais solubles dans les solvants organiques
— Dissoudre dans un solvant volatil (tel que l’acétone ou l’h
...
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