ISO/TS 5594:2022

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 5594
Première édition
2022-11
Qualité de l’eau et du sol —
Recommandations et exigences
relatives à la conception d’un essai
interlaboratoires pour la validation
des essais biologiques
Soil and water quality — Guidance and requirements for designing an
interlaboratory trial for validation of biotests
Numéro de référence
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2022
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 3
5 Exigences, conception et organisation de la ou des campagnes d’essais de validation
de la méthode . 4
5.1 Généralités . 4
5.2 Prévalidation — Exigences minimales relatives aux performances de la méthode
d’essai . 5
5.3 Première étape de validation — Démonstration de l’état de préparation
des laboratoires participants en vue des essais . 5
5.4 Deuxième étape de validation — Démonstration de l’aptitude du laboratoire et de
la transférabilité de l’essai biologique . 5
5.5 Troisième étape de validation — Validation de la méthode . 6
5.5.1 Généralités . 6
5.5.2 Laboratoires participants . 6
5.5.3 Échantillons . 7
5.5.4 Plan d’expérimentation . 7
5.5.5 Informations à fournir aux participants . 8
5.5.6 Analyse de données et évaluation statistique des essais interlaboratoires . 8
6 Évaluation . 9
7 Documentation et rapport .10
Annexe A (informative) Détermination de l’exactitude (justesse et fidélité) lorsque les
résultats des essais d’écotoxicité sont exprimés en descripteurs de toxicité .11
Annexe B (informative) Estimation de l’écart-type de répétabilité .16
Annexe C (informative) Calcul et rapport d’incertitude de s .18
R
Annexe D (informative) Schéma de validation .20
Annexe E (informative) Questionnaire (exemple) .21
Annexe F (informative) Caractéristiques spécifiques des essais biologiques terrestres
recommandés par les laboratoires de référence .23
Annexe G (informative) Caractéristiques spécifiques des essais biologiques aquatiques
recommandés par les laboratoires de référence .27
Annexe H (informative) Résumé des essais interlaboratoires réalisés dans le cadre de la
validation d’essais biologiques terrestres .29
Annexe I (informative) Résumé des essais interlaboratoires réalisés dans le cadre de la
validation d’essais biologiques aquatiques .33
Bibliographie .39
iii
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190 Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-
comité SC 5, Méthodes biologiques.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
La validation d’une norme ISO relative à des essais biologiques a pour but d’estimer l’incertitude des
résultats au moyen d’un essai interlaboratoires. Ce programme de validation comporte généralement
trois étapes majeures.
a) Démonstration de l’état de préparation en vue des essais: cette première étape donne au
laboratoire de référence l’occasion de s’assurer que l’instrumentation recommandée est en place
et que les organismes d’essai et les cultures cellulaires ont été établis en utilisant des mesurages
de performance afin de garantir l’utilisation de cultures ou d’organismes sains lors des essais.
Ces conditions sont généralement spécifiées dans l’article ou le paragraphe intitulé «Organismes
d’essai» ou «Matériaux d’essai» dans une norme ISO.
b) Démonstration de l’aptitude du laboratoire et de la transférabilité de l’essai biologique: au cours
de cette deuxième étape, les laboratoires participants ont pour but d’atteindre les performances
dans les conditions contrôlées pendant cette campagne d’essais interlaboratoires préliminaires, en
ajoutant un composé de référence à une matrice solide ou à un milieu liquide, selon la méthode
d’essai biologique à valider. La capacité de mise en œuvre de la norme d’essai est démontrée lorsque
les critères de validité (par exemple la variabilité des témoins exprimée par le coefficient de
variation du nombre de jeunes dans le cadre d’un essai de reproduction) et qualifie le laboratoire
pour la dernière étape de validation de la méthode.
c) Validation de la méthode: la troisième étape n’implique que les laboratoires qui ont démontré
leur expertise à mettre en œuvre la norme ISO en cours d’élaboration (étape b). En cas de
validation d’une méthode d’essai écotoxicologique ou microbiologique, une ou deux campagnes
d’essais interlaboratoires de validation d’une méthode utilisant un ou plusieurs échantillons
environnementaux sont menées, et les résultats de chaque campagne servent à calculer la variabilité
intralaboratoire et interlaboratoires de la norme d’essai ISO afin de démontrer la fidélité de la
méthode (Annexe A). Si la répétition des campagnes d’essais biologiques est possible, la répétabilité
est déterminée. Pour la validation des méthodes écotoxicologiques, il peut s’avérer utile d’évaluer
l’exactitude de l’effet mesuré – la justesse de mesure. Cela prévaut en particulier pour les méthodes
dont les résultats sont rapportés sous forme de mesurage quantitatif tel qu’une concentration
biologique équivalente. Les résultats obtenus servent à confirmer ou ajuster les critères de validité.
Pour l’étude de validation, il convient de choisir des échantillons représentatifs en fonction du domaine
d’application prévu de la norme (par exemple sols contaminés, sols amendés, sols après remédiation,
déchets, eaux usées, éluats, eaux de surface, eaux souterraines, sédiments et échantillons extraits).
L’Annexe D fournit un schéma global du processus de validation.
v
SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 5594:2022(F)
Qualité de l’eau et du sol — Recommandations et exigences
relatives à la conception d’un essai interlaboratoires pour
la validation des essais biologiques
1 Domaine d’application
Le présent document a pour but de faciliter la conception et l’organisation des essais de validation
d’essais biologiques. Il décrit les activités de validation au cours des différentes étapes du processus
de normalisation et comprend l’évaluation globale des données et la conclusion qui découle de l’étude
de validation.
Le présent document est destiné à la validation d’essais biologiques dont le plan d’expérimentation et
les critères d’effet peuvent différer. Il se peut que certaines exigences du présent document ne soient
pas applicables à toutes les méthodes d’essai.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
témoin
matériau et/ou matrice qui reproduit tous les facteurs susceptibles d’avoir un impact sur les résultats,
à l’exception de la condition spécifique ou du traitement étudié
Note 1 à l'article: Dans les essais de toxicité, il convient que le témoin soit soumis à la totalité des conditions
rencontrées lors de l’exposition au traitement, mais sans le produit toxique.
[SOURCE: Environment Canada 2005]
3.2
critère d’effet
seuil de toxicité déterminé par voie statistique (CE50, par exemple)
[SOURCE: Environment Canada 2005, modifié — La recommandation de ne pas utiliser ce terme pour
des variables observées, telle que la taille, a été supprimée]
3.3
laboratoire de référence
laboratoire en charge de l’organisation de l’étude de validation interlaboratoires
3.4
justesse de mesure
justesse
étroitesse de l’accord entre la moyenne d’un nombre infini de valeurs mesurées répétées et une valeur
de référence
Note 1 à l'article: L’exigence d’un nombre infini de mesures répétées a un fondement théorique. Dans la pratique,
une grande série de résultats d’essai sert à estimer la justesse de mesure.
[SOURCE: Guide ISO/IEC 99:2007, 2.14, modifié — Les Notes à l’article ont été remplacées]
3.5
caractéristiques de performance
mesurages de la performance d’un essai dans des conditions particulières, y compris sa fiabilité et son
exactitude
Note 1 à l'article: Les caractéristiques de performance donnent une indication de l’utilité, des limites et de la
pertinence de l’essai.
[SOURCE: OCDE 2005]
3.6
fidélité
étroitesse de l’accord entre les indications ou les valeurs mesurées obtenues par des mesurages répétés
du même objet ou d’objets similaires dans des conditions spécifiées
Note 1 à l'article: La fidélité est en général exprimée numériquement par des caractéristiques, telles que l’écart-
type, la variance ou le coefficient de variation dans les conditions spécifiées.
Note 2 à l'article: Les conditions spécifiées peuvent être, par exemple, des conditions de répétabilité (3.10),
des conditions de fidélité intermédiaire ou des conditions de reproductibilité (3.12) (voir l’ISO 5725-1).
Note 3 à l'article: La fidélité sert à définir la répétabilité (3.9) de mesure, la fidélité intermédiaire de mesure
et la reproductibilité (3.11) de mesure.
Note 4 à l'article: Le terme «fidélité de mesure» est quelquefois utilisé improprement pour désigner l’exactitude
de mesure.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.7
prévalidation
phase(s) initiale(s) d’une étude de validation
Note 1 à l'article: Cette étude à petite échelle vise à obtenir des informations préliminaires sur la pertinence
et la fiabilité d’une méthode d’essai. Sur la base des résultats de cette étude, il est ensuite permis de modifier
ou d’optimiser le protocole de la méthode d’essai afin de réduire la variabilité intralaboratoire et/ou
interlaboratoires et d’augmenter l’exactitude des études de validation ultérieures. Si elles sont disponibles, les
données de la littérature peuvent être utilisées à cet effet.
[SOURCE: OCDE: 2005, modifié — Les raisons de la réalisation d’une prévalidation ne sont pas précisées]
3.8
composé de référence
produit chimique pour lequel la réponse de l’organisme d’essai est connue
3.9
répétabilité
fidélité (3.6) de mesure selon un ensemble de conditions de répétabilité (3.10)
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.10
condition de répétabilité
condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent la même procédure de
mesure, les mêmes opérateurs, le même système de mesure, les mêmes conditions de fonctionnement
et le même lieu, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des objets similaires pendant une
courte période de temps
Note 1 à l'article: Une condition de mesurage n’est une condition de répétabilité que par rapport à un ensemble
donné de conditions de répétabilité.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.11
reproductibilité
fidélité (3.6) de mesure selon un ensemble de conditions de reproductibilité (3.12)
Note 1 à l'article: Des termes statistiques pertinents sont donnés dans l’ISO 5725-1 et l’ISO 5725-2.
3.12
condition de reproductibilité
condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent des lieux, des opérateurs et
des systèmes de mesure différents, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des objets
similaires
Note 1 à l'article: Les différents systèmes de mesure peuvent utiliser des procédures de mesure différentes.
Note 2 à l'article: Il convient qu’une spécification relative aux conditions contienne, dans la mesure du possible,
les conditions que l’on fait varier et celles qui restent inchangées.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.13
essai de validation interlaboratoires d’une méthode
étude de validation interlaboratoires au cours de laquelle tous les laboratoires réalisent le même essai
biologique en utilisant le même matériau en essai et le même protocole d’essai
Note 1 à l'article: L’essai a pour objectif de déterminer la variabilité interlaboratoires et, dans la mesure du
possible, intralaboratoire.
3.14
transférabilité
capacité des laboratoires compétents et indépendants à mettre en œuvre une procédure d’essai
de manière précise et fiable
[S OU RC E: O CDE: 2005 ]
4 Principe
La validation d’une méthode d’essai proposée est obtenue par la démonstration de coefficients
de variation intralaboratoire et interlaboratoires raisonnables qui ont participé aux campagnes d’essais
de validation formelle de la méthode (c’est-à-dire à la troisième étape de validation, 5.5). Il convient,
de préférence, de déterminer la répétabilité. Cependant, la durée ou la charge de travail de la méthode
d’essai empêche parfois la répétition de l’analyse par des laboratoires individuels. En cas d’absence
de données expérimentales obtenues dans des conditions de répétabilité, il est proposé d’estimer
la répétabilité à partir des limites de confiance du descripteur de toxicité qui intègre la variabilité
des mesurages répétés de la variable biologique dans chaque traitement/dilution (voir référence [67]).
Le cas échéant, la justesse de mesure de la méthode peut être déterminée en accord avec la validation
de la méthode, en particulier pour les méthodes dont les résultats sont rapportés en concentrations
biologiques équivalentes (CBE) (voir l’ISO 23196). La décision finale d’inclure la justesse de mesure
dans l’essai interlaboratoires de validation de la méthode doit être prise par le laboratoire de référence,
après consultation des autres experts impliqués dans l’élaboration de la méthode.
5 Exigences, conception et organisation de la ou des campagnes d’essais
de validation de la méthode
5.1 Généralités
Une condition préalable à la réalisation d’un essai interlaboratoires est que le développement de la
méthode soit achevé. Comme l’objectif de ce type de comparaison interlaboratoires est d’évaluer les
caractéristiques de performance d’un essai biologique, les aspects techniques sont définis dans une
procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode, préparée par le laboratoire de référence
et unique à chaque campagne d’essais interlaboratoires. Les caractéristiques spécifiques dont l’examen
est recommandé aux laboratoires de référence sont respectivement résumées dans les Annexes F et G
pour les essais terrestres et aquatiques, respectivement.
Il convient qu’un laboratoire de référence soit en mesure de démontrer son niveau de compétence
en matière de planification et de réalisation de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode.
Par exemple, le laboratoire qui propose de diriger le processus de validation peut indiquer les années
d’expérience du personnel participant à la réalisation des essais de toxicologie environnementale
ou de microbiologie (par exemple plus de 10 ans d’expérience); apporter la preuve d’une qualité de
service reconnue par le biais d’un programme de certification ou d’accréditation; fournir la preuve qu’il
dispose d’un dossier de suivi de la planification et de la réalisation d’études d’essais multilaboratoires;
démontrer par écrit que son personnel comprend clairement toutes les étapes dont le laboratoire serait
en charge pour mener un programme de validation interlaboratoires; manifester clairement sa volonté
de fournir les matériaux nécessaires pour la culture ou le maintien et l’acclimatation des organismes
requis pour la mise en œuvre de la nouvelle norme d’essai biologique avant et pendant la campagne
d’essais de validation complète; ou indiquer sa volonté d’assurer une formation à distance ou sur site
afin d’aider les laboratoires participants aux étapes préliminaires nécessaires pour démontrer leur état
de préparation pour la mise en œuvre de la nouvelle procédure d’essai. Des suggestions spécifiques et
des détails supplémentaires concernant les étapes et l’aptitude d’un laboratoire de référence et de son
personnel sont décrits dans l’ISO 17043.
Dans le cadre de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode, il convient que le laboratoire
de référence:
— soit responsable de l’organisation et de l’exécution des trois étapes de validation (5.3, 5.4, 5.5) ou
des campagnes d’essais interlaboratoires;
— prépare une procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode pour chaque campagne
d’essais, en définissant tous les aspects techniques de l’exécution de l’essai biologique;
— fournisse aux participants les instructions nécessaires, les échantillons pour essai (par exemple
sols pollués, sols amendés, sols après remédiation, déchets, eaux usées, éluats, eaux de surface, eaux
souterraines, sédiments et échantillons extraits) et les matériaux sélectionnés par le laboratoire de
référence, pour chaque campagne d’essais;
— soit en charge de l’analyse et du compte-rendu des résultats de chaque campagne d’essais;
— soit chargé de demander aux laboratoires participants un retour d’information sur la procédure
d’essai de validation interlaboratoires de la méthode proposée, avant chaque campagne d’essais,
en organisant une télé- ou visio-conférence ou par un échange de courrier électronique.
Un exemple des différents rôles du personnel impliqué dans l’organisation de l’essai de validation
interlaboratoires de la méthode est donné dans l’ISO 5725-2:2019, Article 6.
Sauf spécification contraire du laboratoire de référence, il est fortement recommandé de transférer
tous les résultats ainsi que tous les mesurages des paramètres des conditions d’essai, juste après la fin
des essais pour chaque campagne spécifique.
5.2 Prévalidation — Exigences minimales relatives aux performances de la méthode
d’essai
Il convient que la première étape de validation de la méthode repose sur une évaluation minutieuse de la
littérature scientifique évaluée par les pairs et d’autres rapports et publications pertinents et crédibles
fournissant des informations sur les performances de la méthode d’essai. Il est recommandé d’axer
cette revue documentaire sur l’identification des conditions expérimentales susceptibles d’avoir un
impact sur les résultats d’un essai biologique. Des expériences complémentaires peuvent être réalisées
en laboratoire pour affiner et optimiser la procédure en conséquence. Il est recommandé de porter
une attention particulière à la pertinence écologique des organismes ainsi qu’aux réponses biologiques
utilisées dans les essais biologiques, écologiques et écotoxicologiques par rapport aux propriétés de
la matrice à étudier, par exemple le pH, la matière organique, la conductivité, la teneur en argile ou
la turbidité. Il convient que la conception de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode couvre
la plage de propriétés adaptée à la matrice d’essai (par exemple eau, sédiment, sol) pour laquelle l’essai
biologique est pertinent.
Pour optimiser l’essai biologique pour les essais d’écotoxicité, des témoins doivent être définis pour
différencier les effets des propriétés intrinsèques des échantillons pour essai de ceux causés par les
contaminants. Par exemple, il est recommandé que la validation d’un essai en ce qui concerne son
applicabilité dans l’évaluation des risques des sites pollués comprenne un échantillon de sol pollué
ainsi qu’un échantillon de sol de référence. Il convient que l’échantillon de sol de référence présente
des propriétés intrinsèques similaires à celles de l’échantillon contaminé, mais ne contienne aucun
contaminant ou un niveau de contaminants négligeable.
Des méthodes d’essai sont souvent définies pour au moins deux types d’échantillons différents,
par exemple des sites pollués, des sols amendés, des sols après remédiation, des déchets (par exemple
matériaux de dragage, boues municipales provenant d’une station d’épuration des eaux usées, matières
composées ou lisier, en particulier ceux destinés à un éventuel épandage), des eaux usées, des éluats,
des eaux de surface, des eaux souterraines, des sédiments ou des produits chimiques. Dans une situation
idéale, la méthode d’essai est validée en utilisant le type de contaminant le plus applicable ou le type
de milieu le plus contaminé. Cependant, la validation complète d’une méthode intégrant une grande
diversité d’échantillons n’est généralement pas possible. Il peut être inutile d’effectuer une validation
aussi étendue si un nombre limité d’échantillons est, d’après l’avis des experts du laboratoire de
référence, considéré comme représentatif des domaines d’application les plus importants. Par exemple,
il convient que la validation d’une méthode d’essai destinée à évaluer la qualité des eaux de surface
(par exemple des échantillons d’eau de rivière provenant d’une zone non polluée en amont et d’un point
en aval affecté par une pollution diffuse ou un rejet d’effluents), ou l’efficacité des stations d’épuration
des eaux usées (par exemple en utilisant des échantillons liquides d’effluents ayant été soumis à un
traitement préliminaire et/ou final) tienne compte de la sélection d’échantillons adaptés à l’objectif de
l’application.
5.3 Première étape de validation — Démonstration de l’état de préparation
des laboratoires participants en vue des essais
La première étape consiste à démontrer l’état de préparation des laboratoires participants pour la
culture des organismes d’essai ou des cultures cellulaires et la mise en œuvre de la norme d’essai. Il est
recommandé d’évaluer l’état de préparation des laboratoires participants à l’aide d’une enquête ou d’un
questionnaire complété par chaque participant (Annexe E). Ce questionnaire fournit au coordinateur
des essais de validation du laboratoire de référence, des informations concernant le savoir-faire
technique, l’expérience et les ressources disponibles pour la culture des organismes d’essai et la mise
en œuvre de la procédure d’essai.
5.4 Deuxième étape de validation — Démonstration de l’aptitude du laboratoire
et de la transférabilité de l’essai biologique
La deuxième étape de l’essai interlaboratoires consiste à réaliser une évaluation préliminaire de la
transférabilité et de la fiabilité de l’essai et à identifier les limites éventuelles de l’essai. Parfois, des
campagnes d’essais de validation interlaboratoires d’une méthode impliquant des participants de
laboratoires expérimentés ne génèrent pas de données comparables. Dans ce cas, le laboratoire de
référence peut restreindre davantage les options de la méthode afin d’élever le degré de normalisation
avant la prochaine campagne d’essais interlaboratoires, ou peut conduire ou commanditer des
recherches complémentaires sur la méthode afin d’affiner la normalisation des parties de culture ou
d’essai de la méthodologie. Les résultats de la deuxième étape de validation peuvent être utilisés lors de
la conception de la future campagne d’essais de validation interlaboratoires.
Au moins un laboratoire indépendant du laboratoire ayant mis au point la méthode d’essai réalise
l’essai biologique complet en vue d’une évaluation initiale et d’un examen de sa transférabilité
interlaboratoires et de sa reproductibilité préliminaire. Les laboratoires participants réalisent l’essai
biologique dans les conditions contrôlées et avec un composé de référence dont la toxicité est connue,
à une concentration d’essai spécifique ou dans une plage de concentrations connue communiquée
par le laboratoire de référence. Les résultats sont évalués par le laboratoire de référence, ce qui peut
conduire à l’optimisation de la procédure de culture des organismes et/ou d’essai. Il convient que seuls
les laboratoires qui satisfont aux critères de validité proposés (par exemple variabilité des témoins
exprimée par le coefficient de variation, la sensibilité, le taux de réponse biologique des organismes
soumis à essai dans les témoins) participent à la campagne d’essais de validation de la méthode (voir 5.5).
L’implication des laboratoires non expérimentés est décrite en 5.5.2. L’intégration de ces laboratoires
entraîne parfois des conclusions moins précises, ce qui pose des questions de transférabilité des essais.
Dans les cas où la méthode d’essai ne permet pas d’assurer une reproductibilité suffisante, selon le
degré d’échec, une optimisation ultérieure de cette méthode peut être envisagée ou des recherches
supplémentaires peuvent s’avérer nécessaires pour cette méthode d’essai. Toutes les exigences
spécifiées en 5.5.5 pour l’essai de validation interlaboratoires de la méthode sont applicables pour la
deuxième étape.
5.5 Troisième étape de validation — Validation de la méthode
5.5.1 Généralités
La troisième étape implique une ou plusieurs campagnes d’essais pour obtenir la validation de la
méthode. La procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode est conçue pour évaluer
la variabilité interlaboratoires des résultats obtenus, en réalisant, dans chaque laboratoire participant,
les mêmes mesurages en appliquant la méthode d’essai complète. La répétabilité (variabilité
intralaboratoire) peut être estimée si les essais et les analyses de données sont répétés par chaque
laboratoire. L’Annexe B décrit une autre approche pour estimer la répétabilité à l’aide des limites de
confiance du descripteur de toxicité, qui intègre la variabilité des mesurages répétés de la variable
biologique dans chaque traitement/dilution. Si le résultat n’est pas une valeur numérique (extraction
d’ADN, par exemple), une approche spécifique est nécessaire pour évaluer la reproductibilité (voir 5.5.6).
5.5.2 Laboratoires participants
Le nombre de participants a une influence sur la fiabilité des données de performance calculées
statistiquement. Il est suggéré d’obtenir des ensembles de données valides auprès d’un minimum de
6 laboratoires situés dans 3 pays différents. Par conséquent, il est fortement recommandé d’inviter un
plus grand nombre de laboratoires d’essai et de pays et de les inclure dans des essais de validation
interlaboratoires de la méthode. L’Annexe C fournit des recommandations sur la manière de procéder
si un nombre inférieur d’ensembles de données valides est obtenu, en calculant et en mentionnant
l’incertitude de la variance de reproductibilité.
La participation à ce type d’essais est volontaire et il convient d’attribuer un code (qui peut être
communiqué) à chaque laboratoire participant afin de conserver l’anonymat de la source des ensembles
de données des essais de validation. Si l’appel aux participants engendre un nombre insuffisant de
laboratoires expérimentés avec la méthode, il convient que le laboratoire de référence fournisse
de l’aide pour l’application de cette méthode (en proposant, par exemple, de former le personnel
dans des laboratoires non expérimentés, en organisant un atelier de formation ou en proposant une
téléconférence de planification).
Une invitation doit être adressée aux participants interlaboratoires intéressés bien avant le lancement
de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode. Il est recommandé au laboratoire de référence
qui organise le programme interlaboratoires de transmettre l’invitation aux laboratoires participants
potentiels cinq mois avant le début de la première campagne d’essais interlaboratoires. Il convient de
demander aux laboratoires de manifester leur intérêt à participer dans les quatre semaines suivant
la réception de l’annonce de l’essai interlaboratoires.
Si une validation complète d’une méthode est déjà présente, la méthode peut être adoptée sans autre
essai de validation interlaboratoires de la méthode.
5.5.3 Échantillons
Les matrices d’échantillons doivent refléter le domaine d’application de la méthode d’essai (voir 5.2).
Il convient de ne fournir aux participants aucune information sur les valeurs espérées des paramètres
estimés. Chaque participant doit réaliser l’essai biologique conformément au nombre de réplicats
spécifié par la procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode. Chaque laboratoire doit
recevoir une quantité suffisante d’échantillons ou de sous-échantillons. Les échantillons doivent être
clairement étiquetés (par exemple numéro d’échantillon ou de sous-échantillon, nom du participant,
matrice, date).
Si la détermination de la justesse de mesure est incluse dans l’essai de validation, une valeur vraie
du mesurage est requise. Cette valeur vraie est de nature théorique et ne peut être déterminée qu’en
utilisant un matériau de référence adapté, par référence à une autre méthode de mesure validée ou par
la préparation d’un échantillon de référence connu. Dans ce dernier cas, la matrice environnementale
à évaluer (de l’eau de surface ou un éluat, par exemple) est dopée avec une quantité définie d’un composé
de référence ayant une puissance d’effet toxique connue pour la méthode étudiée. Les échantillons dopés
et les échantillons non dopés respectifs doivent être inclus dans l’essai de validation interlaboratoires de
la méthode, dans lequel il convient que l’échantillon non dopé ne produise aucun effet. Il est également
possible d’utiliser des matrices environnementales synthétiques ou artificielles, telles que des eaux
usées synthétiques (voir référence [61]) pour produire un échantillon sans effet défini. Dans les deux
cas, il convient que le laboratoire de référence vérifie le dopage correct et la stabilité du composé de
référence dans la matrice environnementale, à l’aide d’un essai préliminaire.
Des informations concernant la stabilité et l’homogénéité des sous-échantillons doivent être fournies
ainsi que la date finale de lancement de l’essai. Les conditions de stockage (plage de températures,
protection contre la lumière, par exemple) sont des points importants à décrire dans la procédure
d’essai de validation interlaboratoires de la méthode. Le respect des conditions critiques doit être pris
en compte par le coordinateur du laboratoire de référence lors de l’expédition des échantillons vers
d’autres pays. L’organisateur est tenu de choisir un mode de diffusion ou de distribution des échantillons
approprié.
Si les concentrations d’une substance chimique sont estimées dans le cadre de l’essai biologique,
le laboratoire de référence peut fournir des solutions étalons pour vérifier l’étalonnage, ainsi que des
informations supplémentaires afin d’aider les participants à établir et à réaliser l’essai biologique dans
leurs laboratoires.
Il convient que le laboratoire de référence demande à tous les laboratoires participants d’envoyer
un sous-échantillon du milieu d’essai à un laboratoire d’analyse commun sous contrat avec le laboratoire
de référence, pour la confirmation chimique de la concentration d’essai nominale lorsqu’un composé
de référence est utilisé pour la campagne de validation ordinaire.
5.5.4 Plan d’expérimentation
Les méthodes écotoxicologiques permettent d’établir différents plans d’expérimentation qui peuvent
conduire à différents types de calcul statistique pour l’estimation des critères d’effet de l’essai
[par exemple CMEO (concentration minimale avec effet observé), CEx (concentration efficace), approche
combinée, DMSE (dilution minimale sans effet) ou concentration biologique équivalente (CBE)].
Le laboratoire de référence doit fournir à chaque laboratoire participant des informations détaillées
sur le plan d’expérimentation (par exemple série de dilutions, nombre de dilutions d’essai et de témoins,
nombre de réplicats par traitement). Une estimation de la CEx est préférée à la CSEO (concentration
sans effet observé) ou à la CMEO. À ce stade, il convient de consulter un statisticien et le laboratoire de
référence se chargera probablement de cette consultation.
5.5.5 Informations à fournir aux participants
Il convient que la procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode comprenne les
informations suivantes:
— le strict respect de la procédure d’étude de validation (procédure opératoire normalisée, par
exemple) pour la campagne spécifique d’essais de validation interlaboratoires de la méthode;
— des instructions relatives aux mesures de sécurité car la présence potentielle de contaminants dans
l’échantillon peut présenter un risque pour le personnel de laboratoire;
— les conditions de prétraitement et de stockage des échantillons;
— des instructions supplémentaires pour la réalisation de l’analyse, si nécessaire;
— une description du système d’essai, des conditions d’exposition, des procédures de sélection
des concentrations/dilutions, des variables estimées;
— la personne à contacter (au laboratoire de référence);
— un calendrier (délais pour le début de l’analyse et le retour des résultats);
— la forme des résultats des analyses (unité, nombre de chiffres significatifs, etc.);
— un questionnaire sur les détails expérimentaux, en particulier en cas d’essais d’un protocole à
options multiples;
— la liste des données à soumettre, qu’il convient d’inclure: valeurs de blanc, données d’étalonnage,
données expérimentales d’origine, dossiers médicaux des organismes de culture, registres de
température, procédures utilisées pour calculer et exprimer les résultats, utilisation de témoins
et d’autres contrôles de performance ou mesurages des critères de validité;
— une feuille de calcul pour recalculer les données brutes dans le résultat final, le cas échéant
(par exemple pour le calcul des activités microbiennes à partir des concentrations estimées).
5.5.6 Analyse de données et évaluation statistique des essais interlaboratoires
Tous les résultats doivent satisfaire à chaque critère de validité d’essai proposé. Avant l’évaluation
statistique, les résultats des participants doivent également être vérifiés afin de détecter les données
erronées et les ensembles de données aberrants explicables. Si nécessaire, il peut être demandé à un
participant de laboratoire de vérifier l’absence d’erreurs dans les données transférées.
L’évaluation statistique des essais interlaboratoires comprend deux étapes: l’évaluation des
observations biologiques individuelles ou des critères d’effet calculés de l’essai (par exemple calcul de
l’activité microbienne ou de la CEx) et le calcul de la variabilité intra-/interlaboratoires. Les participants
soumettent les données brutes au laboratoire de référence qui en assure l’évaluation. Si cela est prévu,
il est également possible de soumettre des calculs individuels effectués par les laboratoires participants.
Il convient de noter que même lorsque la même procédure statistique (régression logistique,
par exemple) est utilisée, les résultats peuvent présenter de légères différences en fonction des options
définies pour le calcul et le logiciel utilisé. Des organigrammes de modélisation de la dose-effet pour
l’estimation de la CSEO/CMEO et de la CEx sont disponibles dans l’ISO/TS 20281 et les références [64] et
[68].
Pour les données continues (par exemple longueur, poids), il convient de procéder à l’évaluation
statistique conformément à l’ISO 5725-2, qui décrit l’analyse de la cohérence des données et la
détection des valeurs aberrantes, ainsi que le calcul de la reproductibilité et de la répétabilité. Si un
seul essai est disponible par laboratoire, il est impossible de calculer la répétabilité conformément à
l’ISO 5725-2. Dans ce cas, la répétabilité peut être calculée conformément à l’Annexe B. Lors de l’analyse
interlaboratoires des données, il convient que la décision de retrait des résultats d’essai aberrants
des laboratoires soit fondée sur l’avis d’experts statistiques ou sur une discussion avec le personnel
du laboratoire impliqué dans ces essais. Si les données ne satisfont pas aux critères spécifiés par
l’ISO 5725-2, des statistiques robustes décrites dans l’ISO 5725-5 peuvent être plus appropriées. Des
procédures statistiques pour un petit nombre de participants sont décrites dans l’ISO 13528:2015,
Annexe D. Les résultats rapportés sous forme de valeurs «inférieures à» ne sont pas valables et doivent
être exclus de l’évaluation statistique de la variabilité des essais.
Si les données ne sont pas conformes à une distribution normale [comptages (nombre de jeunes,
par exemple) et données binomiales (si un organisme
...

ISO/TC 190/SC 4
Date :  : 2022-1011
ISO/DTSTS 5594:2022(F)
ISO/TC 190/SC 4
Secrétariat :  : AFNOR
Qualité de l’eau et du sol — Recommandations et exigences relatives à la
conception d’un essai interlaboratoires pour la validation des essais biologiques
Soil and water quality — Guidance and requirements for designing an interlaboratory
trial for validation of biotests

ICS : 13.080.30 ; 13.060.70
Type du document :  Norme internationale
Sous-type du document :
Stade du document :  (60) Publication
Langue du document :  F
SPECIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 5594:2022(F)

DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne
peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique
ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur l’internet ou sur un Intranet, sans
autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci--après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 •• CP 401
CH--1214 Vernier, Geneva, Switzerland
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
copyright@iso.org
www.iso.org
Publié en Suisse
Sommaire Page
Avant-propos . iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 3
5 Exigences, conception et organisation de la ou des campagnes d’essais de validation
de la méthode . 4
5.1 Généralités . 4
5.2 Prévalidation — Exigences minimales relatives aux performances de la méthode
d’essai . 5
5.3 Première étape de validation — Démonstration de l’état de préparation
des laboratoires participants en vue des essais . 5
5.4 Deuxième étape de validation — Démonstration de l’aptitude du laboratoire et de la
transférabilité de l’essai biologique . 6
5.5 Troisième étape de validation — Validation de la méthode . 6
5.5.1 Généralités . 6
5.5.2 Laboratoires participants . 6
5.5.3 Échantillons . 7
5.5.4 Plan d’expérimentation . 8
5.5.5 Informations à fournir aux participants . 8
5.5.6 Analyse de données et évaluation statistique des essais interlaboratoires . 8
6 Évaluation . 9
7 Documentation et rapport . 10
Annexe A (informative) Détermination de l’exactitude (justesse et fidélité) lorsque les
résultats des essais d’écotoxicité sont exprimés en descripteurs de toxicité . 11
Annexe B (informative) Estimation de l’écart-type de répétabilité . 17
Annexe C (informative) Calcul et rapport d’incertitude de s . 19
R
Annexe D (informative) Schéma de validation . 22
Annexe E (informative) Questionnaire (exemple) . 24
Annexe F (informative) Caractéristiques spécifiques des essais biologiques terrestres
recommandés par les laboratoires de référence . 26
Annexe G (informative) Caractéristiques spécifiques des essais biologiques aquatiques
recommandés par les laboratoires de référence . 30
Annexe H (informative) Résumé des essais interlaboratoires réalisés dans le cadre de la
validation d’essais biologiques terrestres . 32
Annexe I (informative) Résumé des essais interlaboratoires réalisés dans le cadre de la
validation d’essais biologiques aquatiques . 36
Bibliographie . 41

Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en
général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit
de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales
et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la
normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l'élaboration
du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-proposle lien suivant : .
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190 Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique CENISO/TC 147, Qualité de l'eau,
sous--comité SC 5, Méthodes biologiques.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
4 © ISO 2022 – Tous droits réservés

Introduction
La validation d’une norme ISO relative à des essais biologiques a pour but d’estimer l’incertitude des
résultats au moyen d’un essai interlaboratoires. Ce programme de validation comporte généralement
trois étapes majeures.
a) Démonstration de l’état de préparation en vue des essais: cette première étape donne au laboratoire
de référence l’occasion de s’assurer que l’instrumentation recommandée est en place et que les
organismes d’essai et les cultures cellulaires ont été établis en utilisant des mesurages de
performance afin de garantir l’utilisation de cultures ou d’organismes sains lors des essais. Ces
conditions sont généralement spécifiées dans l’article ou le paragraphe intitulé «Organismes d’essai»
ou «Matériaux d’essai» dans une norme ISO.
b) Démonstration de l’aptitude du laboratoire et de la transférabilité de l’essai biologique: au cours
de cette deuxième étape, les laboratoires participants ont pour but d’atteindre les performances dans
les conditions contrôlées pendant cette campagne d’essais interlaboratoires préliminaires, en
ajoutant un composé de référence à une matrice solide ou à un milieu liquide, selon la méthode
d’essai biologique à valider. La capacité de mise en œuvre de la norme d’essai est démontrée lorsque
les critères de validité (par exemple la variabilité des témoins exprimée par le coefficient de variation
du nombre de jeunes dans le cadre d’un essai de reproduction) et qualifie le laboratoire pour
la dernière étape de validation de la méthode.
c) Validation de la méthode: la troisième étape n’implique que les laboratoires qui ont démontré leur
expertise à mettre en œuvre la norme ISO en cours d’élaboration (étape b). En cas de validation
d’une méthode d’essai écotoxicologique ou microbiologique, une ou deux campagnes d’essais
interlaboratoires de validation d’une méthode utilisant un ou plusieurs échantillons
environnementaux sont menées, et les résultats de chaque campagne servent à calculer la variabilité
intralaboratoire et interlaboratoires de la norme d’essai ISO afin de démontrer la fidélité de la
méthode (Annexe A). Si la répétition des campagnes d’essais biologiques est possible, la répétabilité
est déterminée. Pour la validation des méthodes écotoxicologiques, il peut s’avérer utile d’évaluer
l’exactitude de l’effet mesuré – la justesse de mesure. CeciCela prévaut en particulier pour les
méthodes dont les résultats sont rapportés sous forme de mesurage quantitatif tel qu’une
concentration biologique équivalente. Les résultats obtenus servent à confirmer ou ajuster les
critères de validité.
Pour l’étude de validation, il convient de choisir des échantillons représentatifs en fonction du domaine
d’application prévu de la norme (par exemple sols contaminés, sols amendés, sols après remédiation,
déchets, eaux usées, éluats, eaux de surface, eaux souterraines, sédiments et échantillons extraits).
L’Annexe D fournit un schéma global du processus de validation.
SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 5594:2022(F)

Qualité de l’eau et du sol — Recommandations et exigences
relatives à la conception d’un essai interlaboratoires pour
la validation des essais biologiques
1 Domaine d’application
Le présent document a pour but de faciliter la conception et l’organisation des essais de validation
d’essais biologiques. Il décrit les activités de validation au cours des différentes étapes du processus
de normalisation et comprend l’évaluation globale des données et la conclusion qui découle de l’étude
de validation.
Le présent document est destiné à la validation d’essais biologiques dont le plan d’expérimentation et
les critères d’effet peuvent différer. Il se peut que certaines exigences du présent document ne soient pas
applicables à toutes les méthodes d’essai.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes ::
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https://www.iso.org/obp ;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https://www.electropedia.org/.
3.1
témoin
matériau et/ou matrice qui reproduit tous les facteurs susceptibles d’avoir un impact sur les résultats,
à l’exception de la condition spécifique ou du traitement étudié
Note 1 à l’article: Dans les essais de toxicité, il convient que le témoin soit soumis à la totalité des conditions
rencontrées lors de l’exposition au traitement, mais sans le produit toxique.
[SOURCE: Environment Canada 2005]
3.2
critère d’effet
seuil de toxicité déterminé par voie statistique (CE50, par exemple)
[SOURCE: Environment Canada 2005, modifié — La recommandation de ne pas utiliser ce terme pour des
variables observées, telle que la taille, a été supprimée]
3.3
laboratoire de référence
laboratoire en charge de l’organisation de l’étude de validation interlaboratoires
ISO/DTS TS 5594:2022(F)
3.4
justesse de mesure
justesse
étroitesse de l’accord entre la moyenne d’un nombre infini de valeurs mesurées répétées et une valeur
de référence
Note 1 à l’article: L’exigence d’un nombre infini de mesures répétées a un fondement théorique. Dans la pratique,
une grande série de résultats d’essai sert à estimer la justesse de mesure.
[SOURCE: Guide ISO/IEC 99:2007, 2.14, modifié — Les Notes à l’article ont été remplacées]
3.5
caractéristiques de performance
mesurages de la performance d’un essai dans des conditions particulières, y compris sa fiabilité et son
exactitude
Note 1 à l’article: Les caractéristiques de performance donnent une indication de l’utilité, des limites et de la
pertinence de l’essai.
[SOURCE: OCDE 2005]
3.6
fidélité
étroitesse de l’accord entre les indications ou les valeurs mesurées obtenues par des mesurages répétés
du même objet ou d’objets similaires dans des conditions spécifiées
Note 1 à l’article: La fidélité est en général exprimée numériquement par des caractéristiques, telles que l’écart--
type, la variance ou le coefficient de variation dans les conditions spécifiées.
Note 2 à l’article: Les conditions spécifiées peuvent être, par exemple, des conditions de répétabilité (3.10),
des conditions de fidélité intermédiaire ou des conditions de reproductibilité (3.12) (voir l’ISO 5725--1).
Note 3 à l’article: La fidélité sert à définir la répétabilité (3.9) de mesure, la fidélité intermédiaire de mesure
et la reproductibilité (3.11) de mesure.
Note 4 à l’article: Le terme «fidélité de mesure» est quelquefois utilisé improprement pour désigner l’exactitude de
mesure.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.7
prévalidation
phase(s) initiale(s) d’une étude de validation
Note 1 à l’article: Cette étude à petite échelle vise à obtenir des informations préliminaires sur la pertinence
et la fiabilité d’une méthode d’essai. Sur la base des résultats de cette étude, il est ensuite permis de modifier ou
d’optimiser le protocole de la méthode d’essai afin de réduire la variabilité intralaboratoire et/ou interlaboratoires
et d’augmenter l’exactitude des études de validation ultérieures. Si elles sont disponibles, les données de la
littérature peuvent être utilisées à cet effet.
[SOURCE: OCDE:2005, modifié — Les raisons de la réalisation d’une prévalidation ne sont pas précisées]
3.8
composé de référence
produit chimique pour lequel la réponse de l’organisme d’essai est connue
3.9
répétabilité
fidélité (3.6) de mesure selon un ensemble de conditions de répétabilité (3.10)
2 © ISO 2022 – Tous droits réservés

[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.10
condition de répétabilité
condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent la même procédure de mesure,
les mêmes opérateurs, le même système de mesure, les mêmes conditions de fonctionnement et le même
lieu, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des objets similaires pendant une courte
période de temps
Note 1 à l’article: Une condition de mesurage n’est une condition de répétabilité que par rapport à un ensemble
donné de conditions de répétabilité.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.11
reproductibilité
fidélité (3.6) de mesure selon un ensemble de conditions de reproductibilité (3.12)
Note 1 à l’article: Des termes statistiques pertinents sont donnés dans l’ISO 5725--1 et l’ISO 5725--2.
3.12
condition de reproductibilité
condition de mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent des lieux, des opérateurs et des
systèmes de mesure différents, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des objets
similaires
Note 1 à l’article: Les différents systèmes de mesure peuvent utiliser des procédures de mesure différentes.
Note 2 à l’article: Il convient qu’une spécification relative aux conditions contienne, dans la mesure du possible,
les conditions que l’on fait varier et celles qui restent inchangées.
[SOURCE: JCGM 200:2012]
3.13
essai de validation interlaboratoires d’une méthode
étude de validation interlaboratoires au cours de laquelle tous les laboratoires réalisent le même essai
biologique en utilisant le même matériau en essai et le même protocole d’essai
Note 1 à l’article: L’essai a pour objectif de déterminer la variabilité interlaboratoires et, dans la mesure du
possible, intralaboratoire.
3.14
transférabilité
capacité des laboratoires compétents et indépendants à mettre en œuvre une procédure d’essai
de manière précise et fiable
[SOURCE: OCDE:2005]
4 Principe
La validation d’une méthode d’essai proposée est obtenue par la démonstration de coefficients
de variation raisonnables dansintralaboratoire et entre les laboratoires interlaboratoires raisonnables
qui ont participé aux campagnes d’essais de validation formelle de la méthode (c’est-à-dire à la troisième
étape de validation, 5.5). Il convient, de préférence, de déterminer la répétabilité. Cependant, la durée ou
la charge de travail de la méthode d’essai empêche parfois la répétition de l’analyse par des laboratoires
individuels. En cas d’absence de données expérimentales obtenues dans des conditions de répétabilité, il
est proposé d’estimer la répétabilité à partir des limites de confiance du descripteur de toxicité qui
intègre la variabilité des mesurages répétés de la variable biologique dans chaque traitement/dilution
(voir référence [67]). Le cas échéant, la justesse de mesure de la méthode peut être déterminée en accord
ISO/DTS TS 5594:2022(F)
avec la validation de la méthode, en particulier pour les méthodes dont les résultats sont rapportés en
concentrations biologiques équivalentes (CBE) (voir l’ISO 23196). La décision finale d’inclure la justesse
de mesure dans l’essai interlaboratoires de validation de la méthode doit être prise par le laboratoire de
référence, après consultation des autres experts impliqués dans l’élaboration de la méthode.
5 Exigences, conception et organisation de la ou des campagnes d’essais
de validation de la méthode
5.1 Généralités
Une condition préalable à la réalisation d’un essai interlaboratoires est que le développement de la
méthode soit achevé. Comme l’objectif de ce type de comparaison interlaboratoires est d’évaluer les
caractéristiques de performance d’un essai biologique, les aspects techniques sont définis dans une
procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode, préparée par le laboratoire de référence
et unique à chaque campagne d’essais interlaboratoires. Les caractéristiques spécifiques dont l’examen
est recommandé aux laboratoires de référence sont respectivement résumées dans les Annexes F et G
pour les essais terrestres et aquatiques, respectivement.
Il convient qu’un laboratoire de référence soit en mesure de démontrer son niveau de compétence
en matière de planification et de réalisation de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode.
Par exemple, le laboratoire qui propose de diriger le processus de validation peut indiquer les années
d’expérience du personnel participant à la réalisation des essais de toxicologie environnementale ou
de microbiologie (par exemple plus de 10 ans d’expérience) ;); apporter la preuve d’une qualité de service
reconnue par le biais d’un programme de certification ou d’accréditation; fournir la preuve qu’il dispose
d’un dossier de suivi de la planification et de la réalisation d’études d’essais multilaboratoires; démontrer
par écrit que son personnel comprend clairement toutes les étapes dont le laboratoire serait en charge
pour mener un programme de validation interlaboratoires; manifester clairement sa volonté de fournir
les matériaux nécessaires pour la culture ou le maintien et l’acclimatation des organismes requis pour la
mise en œuvre de la nouvelle norme d’essai biologique avant et pendant la campagne d’essais
de validation complète; ou indiquer sa volonté d’assurer une formation à distance ou sur site afin d’aider
les laboratoires participants aux étapes préliminaires nécessaires pour démontrer leur état de
préparation pour la mise en œuvre de la nouvelle procédure d’essai. Des suggestions spécifiques et des
détails supplémentaires concernant les étapes et l’aptitude d’un laboratoire de référence et de son
personnel sont décrits dans l’ISO 17043.
Dans le cadre de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode, il convient que le laboratoire
de référence:
— soit responsable de l’organisation et de l’exécution des trois étapes de validation (5.3, 5.4, 5.5) ou des
campagnes d’essais interlaboratoires;
— prépare une procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode pour chaque campagne
d’essais, en définissant tous les aspects techniques de l’exécution de l’essai biologique;
— fournisse aux participants les instructions nécessaires, les échantillons pour essai (par exemple sols
pollués, sols amendés, sols après remédiation, déchets, eaux usées, éluats, eaux de surface, eaux
souterraines, sédiments et échantillons extraits) et les matériaux sélectionnés par le laboratoire de
référence, pour chaque campagne d’essais;
— soit en charge de l’analyse et du compte-rendu des résultats de chaque campagne d’essais;
— soit chargé de demander aux laboratoires participants un retour d’information sur la procédure
d’essai de validation interlaboratoires de la méthode proposée, avant chaque campagne d’essais,
en organisant une télé- ou visio-conférence ou par un échange de courrier électronique.
Un exemple des différents rôles du personnel impliqué dans l’organisation de l’essai de validation
.
interlaboratoires de la méthode est donné dans l’ISO 5725--2:2019, Article 6
4 © ISO 2022 – Tous droits réservés

Sauf spécification contraire du laboratoire de référence, il est fortement recommandé de transférer tous
les résultats ainsi que tous les mesurages des paramètres des conditions d’essai, juste après la fin
des essais pour chaque campagne spécifique.
5.2 Prévalidation — Exigences minimales relatives aux performances de la méthode
d’essai
Il convient que la première étape de validation de la méthode repose sur une évaluation minutieuse de la
littérature scientifique évaluée par les pairs et d’autres rapports et publications pertinents et crédibles
fournissant des informations sur les performances de la méthode d’essai. Il est recommandé d’axer cette
revue documentaire sur l’identification des conditions expérimentales susceptibles d’avoir un impact sur
les résultats d’un essai biologique. Des expériences complémentaires peuvent être réalisées en
laboratoire pour affiner et optimiser la procédure en conséquence. Il est recommandé de porter une
attention particulière à la pertinence écologique des organismes ainsi qu’aux réponses biologiques
utilisées dans les essais biologiques, écologiques et écotoxicologiques par rapport aux propriétés de la
matrice à étudier, par exemple le pH, la matière organique, la conductivité, la teneur en argile ou
la turbidité. Il convient que la conception de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode couvre
la plage de propriétés adaptée à la matrice d’essai (par exemple eau, sédiment, sol) pour laquelle l’essai
biologique est pertinent.
Pour optimiser l’essai biologique pour les essais d’écotoxicité, des témoins doivent être définis pour
différencier les effets des propriétés intrinsèques des échantillons pour essai de ceux causés par les
contaminants. Par exemple, il est recommandé que la validation d’un essai en ce qui concerne son
applicabilité dans l’évaluation des risques des sites pollués comprenne un échantillon de sol pollué ainsi
qu’un échantillon de sol de référence. Il convient que l’échantillon de sol de référence présente des
propriétés intrinsèques similaires à celles de l’échantillon contaminé, mais ne contienne aucun
contaminant ou un niveau de contaminants négligeable.
Des méthodes d’essai sont souvent définies pour au moins deux types d’échantillons différents,
par exemple des sites pollués, des sols amendés, des sols après remédiation, des déchets (par exemple
matériaux de dragage, boues municipales provenant d’une station d’épuration des eaux usées, matières
composées ou lisier, en particulier ceux destinés à un éventuel épandage), des eaux usées, des éluats,
des eaux de surface, des eaux souterraines, des sédiments ou des produits chimiques. Dans une situation
idéale, la méthode d’essai est validée en utilisant le type de contaminant le plus applicable ou le type
de milieu le plus contaminé. Cependant, la validation complète d’une méthode intégrant une grande
diversité d’échantillons n’est généralement pas possible. Il peut être inutile d’effectuer une validation
aussi étendue si un nombre limité d’échantillons est, d’après l’avis des experts du laboratoire de
référence, considéré comme représentatif des domaines d’application les plus importants. Par exemple,
il convient que la validation d’une méthode d’essai destinée à évaluer la qualité des eaux de surface
(par exemple des échantillons d’eau de rivière provenant d’une zone non polluée en amont et d’un point
en aval affecté par une pollution diffuse ou un rejet d’effluents), ou l’efficacité des stations d’épuration
des eaux usées (par exemple en utilisant des échantillons liquides d’effluents ayant été soumis à un
traitement préliminaire et/ou final) tienne compte de la sélection d’échantillons adaptés à l’objectif de
l’application.
5.3 Première étape de validation — Démonstration de l’état de préparation
des laboratoires participants en vue des essais
La première étape consiste à démontrer l’état de préparation des laboratoires participants pour la culture
des organismes d’essai ou des cultures cellulaires et la mise en œuvre de la norme d’essai. Il est
recommandé d’évaluer l’état de préparation des laboratoires participants à l’aide d’une enquête ou d’un
questionnaire complété par chaque participant (Annexe E). Ce questionnaire fournit au coordinateur des
essais de validation du laboratoire de référence, des informations concernant le savoir-faire technique,
l’expérience et les ressources disponibles pour la culture des organismes d’essai et la mise en œuvre
de la procédure d’essai.
ISO/DTS TS 5594:2022(F)
5.4 Deuxième étape de validation — Démonstration de l’aptitude du laboratoire
et de la transférabilité de l’essai biologique
La deuxième étape de l’essai interlaboratoires consiste à réaliser une évaluation préliminaire de la
transférabilité et de la fiabilité de l’essai et à identifier les limites éventuelles de l’essai. Parfois, des
campagnes d’essais de validation interlaboratoires d’une méthode impliquant des participants de
laboratoires expérimentés ne génèrent pas de données comparables. Dans ce cas, le laboratoire de
référence peut restreindre davantage les options de la méthode afin d’élever le degré de normalisation
avant la prochaine campagne d’essais interlaboratoires, ou peut conduire ou commanditer des
recherches complémentaires sur la méthode afin d’affiner la normalisation des parties de culture ou
d’essai de la méthodologie. Les résultats de la deuxième étape de validation peuvent être utilisés lors de
la conception de la future campagne d’essais de validation interlaboratoires.
Au moins un laboratoire indépendant du laboratoire ayant mis au point la méthode d’essai réalise l’essai
biologique complet en vue d’une évaluation initiale et d’un examen de sa transférabilité interlaboratoires
et de sa reproductibilité préliminaire. Les laboratoires participants réalisent l’essai biologique dans
les conditions contrôlées et avec un composé de référence dont la toxicité est connue, à une concentration
d’essai spécifique ou dans une plage de concentrations connue communiquée par le laboratoire
de référence. Les résultats sont évalués par le laboratoire de référence, ce qui peut conduire à
l’optimisation de la procédure de culture des organismes et/ou d’essai. Il convient que seuls les
laboratoires qui satisfont aux critères de validité proposés (par exemple variabilité des témoins exprimée
par le coefficient de variation, la sensibilité, le taux de réponse biologique des organismes soumis à essai
dans les témoins) participent à la campagne d’essais de validation de la méthode (voir 5.5). L’implication
des laboratoires non expérimentés est décrite en 5.5.2. L’intégration de ces laboratoires entraîne parfois
des conclusions moins précises, ce qui pose des questions de transférabilité des essais. Dans les cas où la
méthode d’essai ne permet pas d’assurer une reproductibilité suffisante, selon le degré d’échec, une
optimisation ultérieure de cette méthode peut être envisagée ou des recherches supplémentaires
peuvent s’avérer nécessaires pour cette méthode d’essai. Toutes les exigences spécifiées en 5.5.5 pour
l’essai de validation interlaboratoires de la méthode sont applicables pour la deuxième étape.
5.5 Troisième étape de validation — Validation de la méthode
5.5.1 Généralités
La troisième étape implique une ou plusieurs campagnes d’essais pour obtenir la validation de la
méthode. La procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode est conçue pour évaluer la
variabilité interlaboratoires des résultats obtenus, en réalisant, dans chaque laboratoire participant, les
mêmes mesurages en appliquant la méthode d’essai complète. La répétabilité (variabilité
intralaboratoire) peut être estimée si les essais et les analyses de données sont répétés par chaque
laboratoire. L’Annexe B décrit une autre approche pour estimer la répétabilité à l’aide des limites de
confiance du descripteur de toxicité, qui intègre la variabilité des mesurages répétés de la variable
biologique dans chaque traitement/dilution. Si le résultat n’est pas une valeur numérique (extraction
d’ADN, par exemple), une approche spécifique est nécessaire pour évaluer la reproductibilité (voir 5.5.6).
5.5.2 Laboratoires participants
Le nombre de participants a une influence sur la fiabilité des données de performance calculées
statistiquement. Il est suggéré d’obtenir des ensembles de données valides auprès d’un minimum de
6 laboratoires situés dans 3 pays différents. Par conséquent, il est fortement recommandé d’inviter un
plus grand nombre de laboratoires d’essai et de pays et de les inclure dans des essais de validation
interlaboratoires de la méthode. L’Annexe C fournit des recommandations sur la manière de procéder
si un nombre inférieur d’ensembles de données valides est obtenu, en calculant et en mentionnant
l’incertitude de la variance de reproductibilité.
La participation à ce type d’essais est volontaire et il convient d’attribuer un code (qui peut être
communiqué) à chaque laboratoire participant afin de conserver l’anonymat de la source des ensembles
de données des essais de validation. Si l’appel aux participants engendre un nombre insuffisant de
6 © ISO 2022 – Tous droits réservés

laboratoires expérimentés avec la méthode, il convient que le laboratoire de référence fournisse de l’aide
pour l’application de cette méthode (en proposant, par exemple, de former le personnel dans des
laboratoires non expérimentés, en organisant un atelier de formation ou en proposant une téléconférence
de planification).
Une invitation doit être adressée aux participants interlaboratoires intéressés bien avant le lancement
de l’essai de validation interlaboratoires de la méthode. Il est recommandé au laboratoire de référence
qui organise le programme interlaboratoires de transmettre l’invitation aux laboratoires participants
potentiels cinq mois avant le début de la première campagne d’essais interlaboratoires. Il convient de
demander aux laboratoires de manifester leur intérêt à participer dans les quatre semaines suivant
la réception de l’annonce de l’essai interlaboratoires.
Si une validation complète d’une méthode est déjà présente, la méthode peut être adoptée sans autre
essai de validation interlaboratoires de la méthode.
5.5.3 Échantillons
Les matrices d’échantillons doivent refléter le domaine d’application de la méthode soumise à une
validation interlaboratoiresd’essai (voir 5.2). Il convient de ne fournir aux participants aucune
information sur les valeurs espérées des paramètres estimés. Chaque participant doit réaliser l’essai
biologique conformément au nombre de réplicats spécifié par la procédure d’essai de validation
interlaboratoires de la méthode. Chaque laboratoire doit recevoir une quantité suffisante d’échantillons
ou de sous--échantillons. Les échantillons doivent être clairement étiquetés (par exemple numéro
d’échantillon ou de sous-échantillon, nom du participant, matrice, date).
Si la détermination de la justesse de mesure est incluse dans l’essai de validation, une valeur vraie du
mesurage est requise. Cette valeur vraie est de nature théorique et ne peut être déterminée qu’en utilisant
un matériau de référence adapté, par référence à une autre méthode de mesure validée ou par la
préparation d’un échantillon de référence connu. Dans ce dernier cas, la matrice environnementale
à évaluer (de l’eau de surface ou un éluat, par exemple) est dopée avec une quantité définie d’un composé
de référence ayant une puissance d’effet toxique connue pour la méthode étudiée. Les échantillons dopés
et les échantillons non dopés respectifs doivent être inclus dans l’essai de validation interlaboratoires de
la méthode, dans lequel il convient que l’échantillon non dopé ne produise aucun effet. Il est également
possible d’utiliser des matrices environnementales synthétiques ou artificielles, telles que des eaux usées
synthétiques (voir référence [61]) pour produire un échantillon sans effet défini. Dans les deux cas,
il convient que le laboratoire de référence vérifie le dopage correct et la stabilité du composé de référence
dans la matrice environnementale, à l’aide d’un essai préliminaire.
Des informations concernant la stabilité et l’homogénéité des sous-échantillons doivent être fournies
ainsi que la date finale de lancement de l’essai. Les conditions de stockage (plage de températures,
protection contre la lumière, par exemple) sont des points importants à décrire dans la procédure d’essai
de validation interlaboratoires de la méthode. Le respect des conditions critiques doit être pris en compte
par le coordinateur du laboratoire de référence lors de l’expédition des échantillons vers d’autres pays.
L’organisateur est tenu de choisir un mode de diffusion ou de distribution des échantillons approprié.
Si les concentrations d’une substance chimique sont estimées dans le cadre de l’essai biologique,
le laboratoire de référence peut fournir des solutions étalons pour vérifier l’étalonnage, ainsi que des
informations supplémentaires afin d’aider les participants à établir et à réaliser l’essai biologique dans
leurs laboratoires.
Il convient que le laboratoire de référence demande à tous les laboratoires participants d’envoyer
un sous-échantillon du milieu d’essai à un laboratoire d’analyse commun sous contrat avec le laboratoire
de référence, pour la confirmation chimique de la concentration d’essai nominale lorsqu’un composé
de référence est utilisé pour la campagne de validation ordinaire.
ISO/DTS TS 5594:2022(F)
5.5.4 Plan d’expérimentation
Les méthodes écotoxicologiques permettent d’établir différents plans d’expérimentation qui peuvent
conduire à différents types de calcul statistique pour l’estimation des critères d’effet de l’essai
[par exemple CMEO (concentration minimale avec effet observé), CEx (concentration efficace), approche
combinée, DMSE (dilution minimale sans effet) ou concentration biologique équivalente (CBE)].
Le laboratoire de référence doit fournir à chaque laboratoire participant des informations détaillées sur
le plan d’expérimentation (par exemple série de dilutions, nombre de dilutions d’essai et de témoins,
nombre de réplicats par traitement). Une estimation de la CEx est préférée à la CSEO (concentration sans
effet observé) ou à la CMEO. À ce stade, il convient de consulter un statisticien et le laboratoire de
référence se chargera probablement de cette consultation.
5.5.5 Informations à fournir aux participants
Il convient que la procédure d’essai de validation interlaboratoires de la méthode comprenne les
informations suivantes:
— le strict respect de la procédure d’étude de validation (procédure opératoire normalisée, par
exemple) pour la campagne spécifique d’essais de validation interlaboratoires de la méthode;
— des instructions relatives aux mesures de sécurité car la présence potentielle de contaminants dans
l’échantillon peut présenter un risque pour le personnel de laboratoire;
— les conditions de prétraitement et de stockage des échantillons;
— des instructions supplémentaires pour la réalisation de l’analyse, si nécessaire;
— une description du système d’essai, des conditions d’exposition, des procédures de sélection
des concentrations/dilutions, des variables estimées;
— la personne à contacter (au laboratoire de référence) ;);
— un calendrier (délais pour le début de l’analyse et le retour des résultats) ;);
— la forme des résultats des analyses (unité, nombre de chiffres significatifs, etc.) ;.);
— un questionnaire sur les détails expérimentaux, en particulier en cas d’essais d’un protocole à options
multiples;
— la liste des données à soumettre, qu’il convient d’inclure: valeurs de blanc, données d’étalonnage,
données expérimentales d’origine, dossiers médicaux des organismes de culture, registres de
température, procédures utilisées pour calculer et exprimer les résultats, utilisation de témoins
et d’autres contrôles de performance ou mesurages des critères de validité;
— une feuille de calcul pour recalculer les données brutes dans le résultat final, le cas échéant
(par exemple pour le calcul des activités microbiennes à partir des concentrations estimées).
5.5.6 Analyse de données et évaluation statistique des essais interlaboratoires
Tous les résultats doivent satisfaire à chaque critère de validité d’essai proposé. Avant l’évaluation
statistique, les résultats des participants doivent également être vérifiés afin de détecter les données
erronées et les ensembles de données aberrants explicables. Si nécessaire, il peut être demandé à un
participant de laboratoire de vérifier l’absence d’erreurs dans les données transférées.
L’évaluation statistique des essais interlaboratoires comprend deux étapes: l’évaluation des observations
biologiques individuelles ou des critères d’effet calculés de l’essai (par exemple calcul de l’activité
microbienne ou de la CEx) et le calcul de la variabilité intra-/interlaboratoires. Les participants
soumettent les données brutes au laboratoire de référence qui en assure l’évaluation. Si cela est prévu,
8 © ISO 2022 – Tous droits réservés

il est également possible de soumettre des calculs individuels effectués par les laboratoires participants.
Il convient de noter que même lorsque la même procédure statistique (régression logistique,
par exemple) est utilisée, les résultats peuvent présenter de légères différences en fonction des options
définies pour le calcul et le logiciel utilisé. Des organigrammes de modélisation de la dose-effet pour
l’estimation de la CSEO/CMEO et de la CEx sont disponibles dans l’ISO/TS 20281 et la référenceles
références [64] et [68].
Pour les données continues (par exemple longueur, poids), il convient de procéder à l’évaluation
statistique conformément à l’ISO 5725--2, qui décrit l’analyse de la cohérence des données et la détection
des valeurs aberrantes, ainsi que le calcul de la reproductibilité et de la répétabilité. Si un seul essai est
disponible par laboratoire, il est impossible de calculer la répétabilité conformément à l’ISO 5725--2.
Dans ce cas, la répétabilité peut être calculée conformément à l’Annexe B. Lors de l’analyse
interlaboratoires des données, il convient que la décision de retrait des résultats d’essai aberrants des
laboratoires soit fondée sur l’avis d’experts statistiques ou sur une discussion avec le personnel du
laboratoire impliqué dans ces essais. Si les données ne satisfont pas aux critères spécifiés par
l’ISO 5725--2, des statistiques robustes décrites dans l’ISO 5725--5 peuvent être plus appropriées. Des
procédures statistiques pour un petit nombre de participants sont décrites dans l’ISO 13528:2015,
Annexe D. Les résultats rapportés sous forme de valeurs «inférieures à» ne sont pas valables et doivent
être exclus de l’évaluation statistique de la variabilité des essais.
Si les données ne sont pas conformes à une distribution normale [comptages (nombre de jeunes,
par exemple) et données binomiales (si un organisme est vivant ou mort, par exemple)], il convient
d’appliquer des calculs statistiques appropriés pour l’estimation de l’écart-type et de se conformer
aux hypothèses requises par la technique statistique utilisée. Dans certains cas, une transformation
(par exemple, arcsin pour des données en pourcentage ou des données en espace log) entraîne une
normalisation des données, ce qui permet l’utilisation de procédures statistiques normalisées.
Voir l’Annexe
...