ISO 18187:2024
(Main)Soil quality - Contact test for solid samples using the dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis
Soil quality - Contact test for solid samples using the dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis
This document specifies a rapid method for assessing solid samples in an aerobic suspension, by determining the inhibition of dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis using the redox dye resazurin. It is applicable for assessing the effect of water-soluble and solid matter bounded non-volatile contaminants in natural samples, such as soils and waste materials. Although not the main purpose, the contact test can additionally be used for testing the effect of chemicals, as described in the Annex C. The test yields a result within 6 h and can therefore be used for screening potentially contaminated test material.
Qualité du sol — Essai contact pour échantillons solides utilisant l'activité déshydrogénase de Arthrobacter globiformis
Le présent document spécifie une méthode rapide d’évaluation d’échantillons solides en suspension aérobie, en déterminant l’inhibition de l’activité déshydrogénase de Arthrobacter globiformis à l’aide d’un indicateur redox coloré, la résazurine. Cette méthode est applicable à l’évaluation de l’effet de contaminants non volatils, liés aux matières solides ou solubles dans l’eau, présents dans des échantillons naturels tels que des sols et des déchets. Bien qu’il ne s’agisse pas de sa principale finalité, l’essai contact peut également être utilisé pour l’évaluation des effets des produits chimiques, comme décrit dans l’Annexe C. L’essai permet d’obtenir un résultat en 6 h et peut donc être utilisé pour le criblage de matériaux d’essai potentiellement contaminés.
General Information
Relations
Overview
ISO 18187:2024 specifies a rapid contact test for assessing solid samples (soils and waste materials) by measuring the inhibition of dehydrogenase activity of the bacterium Arthrobacter globiformis using the redox dye resazurin. The miniaturized aerobic suspension assay produces a screening result within 6 hours, enabling fast identification of samples containing water‑soluble or solid‑bound non‑volatile contaminants. The second edition extends the scope to include use for testing chemicals (see Annex C) and updates validity and interference guidance for various waste matrices.
Key topics and technical requirements
- Test principle: inhibition of bacterial dehydrogenase activity reduces conversion of resazurin to resorufin; fluorescence measurement of resorufin indicates activity level.
- Test organism and preparations: use of Arthrobacter globiformis (including freeze‑dried preparations and inoculum procedures described in Annex B).
- Controls and blanks: negative and positive controls, Blank A/B, and defined control substrates (e.g., quartz sand or LUFA standard soils) are required to standardize results.
- Procedure elements: preparation of dilutions, aeration, deactivation, inoculum preparation, incubation and fluorescence measurement; calculation of relative fluorescence and percentage inhibition (ECx).
- Quality and validity criteria: built‑in checks for sensitivity (positive controls), statistical analysis, and interlaboratory variability (results summarized in Annex A).
- Interferences and adaptations: guidance on potential interferences (e.g., plastics, low‑density waste) and suggested methodological alternatives; alternative positive controls (e.g., copper sulfate pentahydrate, 3,5‑dichlorophenol, zinc sulfate heptahydrate) for waste testing.
Applications and users
ISO 18187:2024 is aimed at:
- Environmental laboratories conducting soil quality and waste characterization screenings.
- Contaminated land consultants and remediation teams needing rapid triage of samples.
- Regulators and permit authorities requiring consistent, comparable ecotoxicological screening data.
- Research groups and ecotoxicologists studying bioavailability and biological effects of contaminants. Practical uses include rapid screening for contaminated soils and wastes, pre‑screening before detailed chemical analyses, and evaluating effects of test chemicals following Annex C.
Related standards
Normative references and complementary guidance include:
- ISO 5667‑15 (sampling/preservation of sediments/sludge)
- ISO 18400‑206 (soil sampling for microbiological assessment)
- CEN/TR 15310‑1 (waste sampling guidance)
- EN 14735 (preparation of waste samples for ecotoxicity tests)
Keywords: ISO 18187, soil quality, contact test, Arthrobacter globiformis, dehydrogenase activity, resazurin, rapid soil test, waste ecotoxicity, contamination screening, ECx.
Frequently Asked Questions
ISO 18187:2024 is a standard published by the International Organization for Standardization (ISO). Its full title is "Soil quality - Contact test for solid samples using the dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis". This standard covers: This document specifies a rapid method for assessing solid samples in an aerobic suspension, by determining the inhibition of dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis using the redox dye resazurin. It is applicable for assessing the effect of water-soluble and solid matter bounded non-volatile contaminants in natural samples, such as soils and waste materials. Although not the main purpose, the contact test can additionally be used for testing the effect of chemicals, as described in the Annex C. The test yields a result within 6 h and can therefore be used for screening potentially contaminated test material.
This document specifies a rapid method for assessing solid samples in an aerobic suspension, by determining the inhibition of dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis using the redox dye resazurin. It is applicable for assessing the effect of water-soluble and solid matter bounded non-volatile contaminants in natural samples, such as soils and waste materials. Although not the main purpose, the contact test can additionally be used for testing the effect of chemicals, as described in the Annex C. The test yields a result within 6 h and can therefore be used for screening potentially contaminated test material.
ISO 18187:2024 is classified under the following ICS (International Classification for Standards) categories: 13.080.30 - Biological properties of soils. The ICS classification helps identify the subject area and facilitates finding related standards.
ISO 18187:2024 has the following relationships with other standards: It is inter standard links to ISO 23234:2021, ISO 18187:2016. Understanding these relationships helps ensure you are using the most current and applicable version of the standard.
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Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 18187
Second edition
Soil quality — Contact test for solid
2024-05
samples using the dehydrogenase
activity of Arthrobacter globiformis
Qualité du sol — Essai contact pour échantillons solides utilisant
l'activité déshydrogénase de Arthrobacter globiformis
Reference number
© ISO 2024
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on
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Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 4
5 Reagents and material . 4
5.1 Test organisms .4
5.2 Control substrates .4
5.2.1 General .4
5.2.2 Control for soils .4
5.2.3 Control for waste material .5
5.3 Test substrates . . .5
5.4 Reagents .6
6 Apparatus . 8
7 Procedure . 9
7.1 Preparation of dilutions .9
7.2 Reference substances and positive control preparation .9
7.3 Contact test procedure .10
7.3.1 General .10
7.3.2 Aeration .10
7.3.3 Deactivation .11
7.3.4 Preparation of the inoculum .11
7.3.5 Incubation and fluorescence measurement .11
7.4 Interferences .11
8 Calculation and expression of results .12
8.1 Calculation . 12
8.1.1 Relative fluorescence . 12
8.1.2 Determining the percentage of inhibition . 12
8.2 Expression of results . . 12
9 Validity of the test .13
10 Statistical analysis .13
11 Test report . 14
Annex A (informative) Results on the interlaboratory test .15
Annex B (informative) Preparation of test organisms .22
Annex C (informative) Testing chemical substances .24
Bibliography .26
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
characterization, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 444, Environmental characterization of solid matrices, in accordance with the Agreement
on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 18187:2016), which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— the scope was amended to include the possibility of applying the contact assay for testing the effect of
chemicals (as detailed in Annex C);
— further details regarding other potential interfering factors (for the testing of plastic and low-density
waste materials) on the performance of the contact assay were addressed, and adequate methodological
alternatives were suggested to reduce uncertainties in the assay outcome;
— validity criteria were updated to include the range of dehydrogenase activity inhibitions expected under
three other reference substances (i.e. copper sulfate (II) pentahydrate, 3,5-dichlorophenol, zinc sulfate
heptahydrate) that are spiked into quartz sand and used as alternative positive controls in the quality
testing of waste materials;
— in Clause B.4, genome sequencing is proposed to confirm the identity of Arthrobacter globiformis, instead
of microbiological identification strips which are no longer recommended.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
This document describes the miniaturized solid contact assay with Arthrobacter globiformis that allows
the preliminary assessment of solid material (i.e. soil and waste materials) within 6 h. The principle of the
assay relies on dehydrogenase activity inhibition of an added test organism, caused by bioavailable toxic
substances in soil and waste samples. This is an ecologically relevant assay as far as it uses a ubiquitous soil
[1][2]
bacterial species with high affinity to surfaces whose dehydrogenases are involved in different biological
mechanisms withstanding bacteria integrity (e.g. respiratory chains). Moreover, it has been noticed that this
[3][4][5][6][7]
parameter (dehydrogenase activity inhibition) is quite sensitive to different toxic substances.
Overall, this assay is non-labour-intensive, rapid, cost-effective and sensitive, providing results that improve
the physical and chemical assessment of natural samples while allowing a quick indication of their biological
effects.
The miniaturized solid contact assay is based on the solid contact assay established by Reference [8].
This document is also based on Reference [9].
The results of an interlaboratory trial towards the evaluation of test variability to assess different waste
and soil samples, as well as chemicals, are presented in Annex A and in Reference [10].
v
International Standard ISO 18187:2024(en)
Soil quality — Contact test for solid samples using the
dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis
1 Scope
This document specifies a rapid method for assessing solid samples in an aerobic suspension, by determining
the inhibition of dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis using the redox dye resazurin.
It is applicable for assessing the effect of water-soluble and solid matter bounded non-volatile contaminants
in natural samples, such as soils and waste materials. Although not the main purpose, the contact test can
additionally be used for testing the effect of chemicals, as described in the Annex C. The test yields a result
within 6 h and can therefore be used for screening potentially contaminated test material.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5667-15, Water quality — Sampling — Part 15: Guidance on the preservation and handling of sludge and
sediment samples
ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic
conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
CEN/TR 15310-1, Characterization of waste — Sampling of waste materials — Part 1: Guidance on selection
and application of criteria for sampling under various conditions
EN 14735, Characterization of waste — Preparation of waste samples for ecotoxicity tests
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
contact time
exposure period of the bacteria to a suspension of solid matter
3.2
negative control
sample of a control substrate (3.6) with a mixture of known solutions [distilled water, medium (3.13) B or
inoculum (3.12)]
.
Note 1 to entry: It is used to standardize the analysis.
3.3
positive control
sample of a control substrate (3.6) with a mixture of known solutions [distilled water, medium (3.13) B or
inoculum (3.12)] and a reference substance
Note 1 to entry: It is used to check the sensitivity of the test organism.
3.4
blank A
blank, which sets the own fluorescence of the substrate after being deactivated
Note 1 to entry: Blank A is not added with bacteria.
3.5
blank B
blank, which sets the natural fluorescence of the substrate without being deactivated
Note 1 to entry: Blank B is not added with bacteria.
3.6
control substrate
reference or standard substrate used as a control and as a dilution substrate for preparing dilution/
concentration series with test substrates (3.7), a reference substance or a test chemical
EXAMPLE Quartz sand or LUFA standard soil type 2.2.
3.7
test substrate
natural or artificial substrate that is naturally contaminated or spiked with a test chemical
Note 1 to entry: The test substrate is the test material (3.8) after being prepared for testing (e.g. sieved) and/or diluted
with a control substrate (3.6).
3.8
test material
original sample of soil or waste material without any changes (e.g. sieving)
3.9
dehydrogenase activity
activity of hydrogen-abstracting enzymes which are involved in many energy, redox reactions, and
biosynthetic metabolic processes (e.g. the respiratory chain), which require cell integrity to be produced
[2]
Note 1 to entry: These enzymes can reduce resazurin into resorufin in the extracellular environment .
Note 2 to entry: See Reference [11].
3.10
ECx
effect concentration for x % effect
concentration (mass fraction) of a test substance or sample that causes x % of an effect on a given endpoint
within a given exposure period when compared with a control
EXAMPLE An EC50 is a concentration estimated to cause an effect on a test end point in 50 % of an exposed
population over a defined exposure period.
Note 1 to entry: The ECx is expressed as a percentage of soil or waste tested per dry mass of soil mixture. When
chemicals are tested, the ECx is expressed as mass of the test substance per dry mass of substrate, in milligrams per
kilogram.
3.11
freeze-dried bacteria
bacterial culture preserved through the water removing of a frozen cell suspension by sublimation under
reduced vacuum pressure
Note 1 to entry: The preserved cultures can be stored at (−20 ± 2) °C. The bacteria are active after being reconstituted
with sterilized distilled water [20 min to 30 min at (6 ± 2) °C] and ready to be used in the test, see 7.3.4, b).
3.12
inoculum
suspension of bacteria used to inoculate a nutrient solution
3.13
medium
aqueous nutritive solution required for bacterial growth
3.14
optical density of bacterial inoculum
measurement of the attenuation of a light beam passing through a bacterial suspension at 600 nm (used to
determine the cell count indirectly)
Note 1 to entry: In a bacterial test, the absorbance is usually measured as FAU (formazine attenuation units) at 600 nm
(see Reference [12]).
3.15
test start
moment when the substrates, reagents and the bacterial inoculum (3.12) are prepared immediately before
the incubation and reaction period
Note 1 to entry: It is when preparing the test (3.7) and control substrates (3.6) for incubation (i.e. Table 1, day 0).
3.16
reaction time
time it takes for the enzyme to react (from the addition of the resazurin solution until the end of the
kinetics period)
3.17
slope
quotient of the relative fluorescence (3.18) variation along the reaction time (3.16) between 15 min and 45 min
−1
Note 1 to entry: The slope (expressed as min ) results from fitting a linear regression model to the fluorescence
readings over time.
3.18
relative fluorescence
fluorescence measured for each treatment (control and test) after subtracting the fluorescence of the
respective blank A (3.4)
3.19
stock culture
bacterial culture obtained from a pure strain culture acquired from a certified laboratory
Note 1 to entry: This stock culture provides an inoculum (3.12) for the pre-culture in the test procedure.
3.20
lowest ineffective dilution
LID
lowest value of the dilution factor for which the test does not give an ecotoxicological relevant reduction
Note 1 to entry: The LID is expressed as the reciprocal value of dilution.
EXAMPLE An often-used dilution series is 1/2/4/8/16 [ = 100 %/50 %/25 %/12,5 %/6,25 % test substrate (3.7)
to control substrate (3.6)]. An LID of 8 corresponds to a dilution of soil or waste of 1:8.
4 Principle
The bacterium Arthrobacter globiformis is added to the solid material and incubated at (30 ± 1) °C for 2 h.
After this contact time, the non-toxic redox dye resazurin is added. Due to the dehydrogenase activity,
[2]
resazurin is transformed into resorufin, in the extracellular environment. Resorufin can be detected
fluorometrically (excitation at 535 nm, emission at 590 nm) in the presence of solid matter. The increase of
resorufin is determined by measuring the fluorescence every 15 min for a period of 1 h. In order to determine
the inhibition of the dehydrogenase activity, the rate of resorufin increase in the sample is compared with the
rate of resorufin increase in the control. In the presence of toxic substances, an inhibition of dehydrogenase
activity is expected. This is reflected by the reduction of resorufin production and the subsequent lowering
of fluorescence emission.
5 Reagents and material
5.1 Test organisms
1)
The test organism is Arthrobacter globiformis (Conn 1982) Conn and Dimmick 1947 , which is common in
soils. Arthrobacter species belong to the Microccocaceae family. They are mostly obligate aerobic organisms,
[13]
although some species can exhibit anaerobic metabolism under limiting oxygen conditions. Arthrobacter
spp. are chemoheterotrophic and present pleomorphic characteristics, since they show a rod-to-coccus
morphology change as they enter in the stationary phase. Although Arthrobacter is gram-positive, it can
stain gram-negative during the log-phase. Variations in the cell wall thickness along the bacteria growth
[14]
can lead to gram variability by differential staining of the granules. However, this characteristic does not
induce a differential sensitivity between assays, as far as an inoculum in exponential growth phase is used
during the reaction time. Arthrobacter globiformis is classified in the risk group I ‒ non-pathogenic organism.
The bacterium strain can be achieved from commercially available freeze-dried or liquid-frozen aliquots from
culture collections, e.g. Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (strain number
2)
20124), or ARS Culture collection NCAUR. The bacterial suspensions used for toxicity measurements shall
be freshly prepared from stock cultures or directly used from a ready-to-use freeze-dried batch. The stock
culturing and freeze-drying process of the bacteria is described in Annex B.
5.2 Control substrates
5.2.1 General
The control substrates selected from the options presented in 5.2.2 and 5.2.3 should be used to prepare both
the negative (addition of distilled water, see 5.2.2, 5.2.3) and positive (addition of the reference substance,
see 7.2) controls. The moistening of the control substrates (soil or waste material) shall be made one or two
days before the test start (see Table 1). Store the substrate(s) at (4 ± 2) °C until the test start.
5.2.2 Control for soils
There are three possibilities for the choice of the control soil (see also Reference [15]). The reference soil
[item a)] is preferred, but if such a soil is not available, either a standard natural soil or a standard artificial
soil can be used. In any case, the water content of the control soil should be adjusted to 20 %.
a) If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should be
treated and characterized like the soils to be tested. If a toxic contamination or unusual soil properties
cannot be ruled out, standard control soils b) or c) should be preferred.
TM
1) Strain number ATCC 8010 Arthrobacter globiformis (Conn) Conn and Dimmick.
2) Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Mascheroder Weg 10, D-38124
Braunschweig, Germany; or ARS (Agricultural Research Service) Culture collection (also known as NRRL) belonging to
the National Center for Agricultural Utilization Research (NCAUR), 1815 N, University Street, Peoria, Illinois 61604, USA
are examples of firms that sell this bacterium. This information is given for the convenience of users of this document and
does not constitute an endorsement by ISO of these firms.
b) Standard natural soil with the following characteristics: C ≤ (1,7 to 2,6) %; sand (particle
org
size 0,063 mm to 2 mm) content of 50 % to 75 %; < 20 % of particles less than 0,02 mm; pH 5 to 7,5.
3)
EXAMPLE LUFA standard soil type 2.2.
c) Standard artificial soil or quartz sand (with 50 % to 75 % of sand with particle size between 0,063 mm
and 2 mm; pH 5,5 to 6,5).
[16]
The substrate called standard artificial soil has the following composition:
Percentage expressed on
dry mass basis
— Sphagnum peat finely ground and with no visible plant remains
5 %
(particle size ≤ 1 mm)
— Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite 20 %
— Industrial quartz sand (dominant fine sand with 50 % to 75 % of
74 %
particle size 0,063 mm to 2 mm)
— Calcium carbonate 1 %
Standard artificial soil prepared with modified peat and quartz sand particle size should be analysed more
in detail. The presence of low-density particles (e.g. peat) in this artificial substrate that are likely to float
can influence the fluorescence readings, but other control soils (as suggested above) can be selected.
5.2.3 Control for waste material
Quartz sand, see 5.2.2 c). The quartz sand should have a water content of 20 %.
5.3 Test substrates
The samples (soil or waste material) should be tested as soon as possible after sampling. Collect samples as
specified:
— for soil in ISO 18400-206;
— for waste materials in ISO 5667-15, EN 14735 and CEN/TR 15310-1.
Store them in the dark at (4 ± 2) °C for not more than two weeks, to avoid (bio)chemical changes that can
interfere with the ecotoxicity results. For long-term storage, the samples can be frozen at (−20 ± 2) °C.
NOTE For waste samples not microbially-active or not prone to (bio)chemical changes that can lead to a
variation in the ecotoxicity testing results, a storage up to two months at (4 ± 2) °C can be considered upon the
judgment of the operator (as per EN 14735).
Soil and waste samples shall be passed through a sieve of 2 mm square mesh. Waste raw material (e.g.
construction waste material) should be grounded before testing (refer to EN 14735). Metals and organic
contaminants in the samples should be screened as this provides helpful information for data interpretation.
For the interpretation of test results, the following characteristics should be determined for each sample:
[17] [18]
a) pH in accordance with ISO 10390 for soil samples, EN 15933 for biowaste samples and
[17]
ISO 10390 for other solid wastes;
[19]
b) texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277 ;
3) LUFA Standard soil type 2.2 is the trade name of a product supplied by LUFA Speyer. This information is given for the
convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of the product named.
Equivalent products can be used if they can be shown to lead to the same results.
[20] [21]
c) water content in accordance with ISO 11465 for soil samples and EN 15934 for biowaste samples;
[22]
d) water holding capacity according to ISO 11268-2 ;
[23]
e) cation exchange capacity in accordance with ISO 11260 ;
[24] [25]
f) organic carbon in accordance with ISO 10694 for soil samples and EN 15936 for biowaste samples.
Only samples with a pH between 5 and 9 are appropriately assessed by this contact test (see 7.4). The
water content shall be adjusted to 20 % (soil, waste material; see 5.2.2 and 5.2.3). This adjustment shall
be calculated according to the original water content of samples, which should be determined before the
preparation of the test. The moistening of samples shall be done one or two days before the test start (see
Table 1). Store the samples at (4 ± 2) °C until performing the test.
When using soil or waste natural samples, dilutions can also be prepared (see 7.1).
In case of testing a chemical substance in soil, a different procedure should be followed (see Annex C).
Waste materials consisting of sewage sludge with high organic matter (OM) or total organic carbon (TOC)
content should be added with more water (e.g. water content adjusted to 33 %). More tests are being
developed to define the appropriate percentage of water content according to the level of OM or TOC in this
type of samples.
5.4 Reagents
Unless otherwise specified, only analytical-grade reagents shall be used.
5.4.1 Water, sterilized and non-sterilized, deionized, distilled or of equivalent purity
−1
(conductivity < 10 µS · cm ).
5.4.2 Dimethyl sulfoxide solution (DMSO), C H OS, volume fraction of 4 % in distilled water.
2 6
Sterilize the solution by filtration through a polyamide membrane filter having a pore size of 0,2 μm and
using a syringe.
−1
5.4.3 Sodium hydroxide solution, NaOH of, e.g. 1 mol · l .
NOTE For the adjustment of the media pH, it can be necessary to use bases of lower or higher concentration.
−1
5.4.4 Hydrochloric acid, HCl of, e.g. 1 mol · l .
NOTE For the adjustment of the media pH, it can be necessary to use acids of lower or higher concentration.
5.4.5 Medium A, for A. globiformis stock culture (pH 7,2 to 7,4).
Dissolve
— 10 g casein peptone,
— 5 g yeast extract,
— 5 g D(+)-glucose, and
— 5 g NaCl
in water (5.4.1), make up to 1 000 ml with water and autoclave for 20 min at (121 ± 3) °C. If stored sterilized
(never opened) at (4 ± 2) °C in the dark, the solution is stable up to 12 months.
5.4.6 Medium B, for preparing the lyophilizates and the test solution.
Dilute 333,3 ml of medium A (5.4.5) in 666,6 ml of sterilized water. Or, dissolve
— 3,33 g casein peptone,
— 1,67 g yeast extract,
— 1,67 g D(+)-glucose, and
— 1,67 g NaCl
in water (5.4.1) and make the volume up to 1 000 ml with water. Autoclave the medium for 20 min at
(121 ± 3) °C. If stored sterilized (never opened) at (4 ± 2) °C in the dark, the solution is stable up to 12 months.
5.4.7 Agar (casein-peptone soymeal-peptone) slant, for a dense cell suspension of A. globiformis.
Dissolve 40 g of tryptic soy agar in water (5.4.1) and make up to 1 000 ml with water. After being dissolved,
distribute 7 ml of this medium into culture tubes (6.15). The tubes should be filled until allowing the agar to
flow just 50 mm below the neck, when the neck is laid over a horizontal 10 ml glass pipette. Seal them with
caps and then autoclave for 20 min at (121 ± 3) °C. After cooling, the tubes are ready for use.
5.4.8 Protective medium, for freeze-drying bacteria.
Dissolve
— 20 g skim milk, and
— 5 g myo-inositol
in water (5.4.1), make up to 100 ml with water and autoclave for 10 min at (121 ± 3) °C. After autoclaving and
cooling down to (80 ± 2) °C, place the medium immediately in an ice bath to avoid caramelization. If stored
sterilized (never opened) at (4 ± 2) °C in the dark, the solution is stable up to 12 months.
5.4.9 Phosphate buffer.
Dissolve
— 8,2 g KH PO · H O,
2 4 2
— 13,24 g K HPO · H O,
2 4 2
— 2 g sodium acetate, C H NaO , and
2 3 2
— 2 g D(+)-glucose
in water (5.4.1) and make up to 1 000 ml with water. Adjust the pH value of the buffer to 7,0 ± 0,2 with
diluted hydrochloric acid (5.4.4) or sodium hydroxide solution (5.4.3). Autoclave the medium for 20 min at
(121 ± 3) °C. If stored at (4 ± 2) °C in the dark, the solution is stable for up to 12 months.
5.4.10 Resazurin dye solution.
Dissolve (45 ± 1) mg of resazurin in 1 000 ml of phosphate buffer (5.4.9). If stored at (4 ± 2) °C in the dark, the
blue-coloured solution is stable up to one week.
5.4.11 Benzyldimethylhexadecylammonium chloride, reference substance [also called cetalkonium
4)
chloride (C16-BAC)], CH (CH )15N(Cl)(CH )2CH C H [CAS Registry Number® (CAS RN) : 122-18-9].
3 2 3 2 6 5
It is a quaternary ammonium salt often used as an anti-microbial agent. C16-BAC is a homologue of BAC
(benzalkonium chloride, a C12 homologue) which is made of a mixture of alkylbenzyldimethyl-ammonium
chlorides, composed mainly of cetalkonium chloride. C16-BAC is moderately soluble in water (between
−1 −1
2 g · l and 85 g · l ), and whenever needed, the solution can be sonicated to be homogenized. If stored
at (4 ± 2) °C in the dark, the solution is stable for up to one week. Its mode of action targets mainly gram-
[26]
negative bacteria by affecting the permeability of their cytoplasmic membrane and leading to cytolysis.
5.4.12 Copper sulfate (II) pentahydrate, additional reference substance (CAS RN 7758-99-8).
Prepare a stock solution in water (5.4.1) before spiking the quartz sand with its appropriate volume to have
−1
a final concentration of 500 mg Cu · kg soil dry mass.
5.4.13 3,5-dichlorophenol (3,5-DCP), additional reference substance (CAS RN 591-35-5).
Prepare a stock solution in water (5.4.1) before spiking the quartz sand with its appropriate volume to have
−1
a final concentration of 100 mg 3,5-DCP · kg soil dry mass.
5.4.14 Zinc sulfate heptahydrate, additional reference substance (CAS RN 7446-20-0).
Prepare a stock solution in water (5.4.1) before spiking the quartz sand with its appropriate volume to have
−1
a final concentration of 100 mg Zn · kg soil dry mass.
6 Apparatus
Use laboratory equipment and the following.
6.1 Autoclave.
6.2 Ultrasonic bath.
6.3 Sterile bench.
6.4 Freezer, −20 °C and −80 °C for storing lyophilizates and the stock cultures.
6.5 Conical flask, with cellulose stopper as a culture vessel, nominal capacity of 100 ml (e.g. Reference [27]).
6.6 Temperature controlled incubator, capable of being maintained at (30 ± 1) °C.
6.7 Horizontal shaker.
6.8 Photometer, suitable for measuring the optical density of bacterial inoculum at 600 nm.
6.9 Fluorometer for microplates, emission at 590 nm, excitation at 535 nm.
NOTE As an example, the fluorometer can have the following features: sensitivity around 5 pM of fluorescein (top
and bottom reading), dynamic range of five decades, filter-dependent bandpass, tungsten quartz halogen lamp with a
photomultiplier (PMT) detection system.
6.10 pH-meter.
4) Chemical Abstracts Service (CAS) Registry Number® is a trademark of the American Chemical Society (ACS). This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the
product named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
6.11 Multipette or micropipettes, 10 000 µl, 1 000 µl, 200 µl, and 20 µl.
6.12 Tips or combitips, (suitable for 10 ml) autoclavable.
6.13 Microplates, 24 well with lid, transparent and flat bottom.
6.14 Round-bottom glass bottle and adaptable top filter, with 0,22 µm pore, if necessary for the
lyophilizer.
6.15 Glass culture tubes with caps, 16 mm × 160 mm, for agar slant.
6.16 Screw-cap vials, resistant to −80 °C, nominal capacity of 1,5 ml or 2 ml.
6.17 Membrane polyamide filter, pore size 0,2 µm, diameter 25 mm, and syringe.
6.18 Water bath.
6.19 Lyophilizer.
6.20 Sieve, pore size 2 mm.
7 Procedure
7.1 Preparation of dilutions
If very toxic samples are being tested, a geometric dilution series can be prepared by mixing different
proportions of sample (soil or waste material, see 5.3) with the respective control substrate (see 5.2).
Mixture ratios of 100 %, 50 %, 25 %, 12,5 %, 6,25 % and 0 % of sample dry mass are suggested. At the end,
adjust the water content as stated in 5.2 and 5.3.
7.2 Reference substances and positive control preparation
A positive control should be performed every time a contact test is run.
C16-BAC (see 5.4.11) should be used as a reference substance in the testing of soil samples. In an
interlaboratory test (see Reference [6]), LUFA standard soil type 2.2 [see 5.2.2, b)] was spiked with C16-BAC
−1 [5]
at a concentration of 600 mg kg . The mean value of the calculated inhibition was 58,2 % (BAC).
For preparation of the C16-BAC positive control, spike LUFA standard soil type 2.2 [see 5.2.2, b)] with C16-
−1
BAC (see 5.4.11) in a concentration of 600 mg · kg (soil dry mass). Prepare a stock solution by dissolving
(600 ± 2) mg of C16-BAC (see 5.4.11) in 100 ml of distilled water. Afterwards, spike 10 g of LUFA standard
−1
soil type 2.2 with 1 ml of the stock solution (6 mg · ml ). Mix the soil until the substance is homogeneously
distributed. If stored at −20 °C, the prepared positive control substrate is stable for up to six months. If using
a freshly made positive control substrate, it should be prepared one or two days before the test start for
allowing soil-chemical equilibrium (see Table 1). Adjust the water content of the substrate (see 5.2).
For the testing of waste materials (or chemicals, see Annex C), the positive control should also be prepared
in the recommended control substrate [i.e. quartz sand; see 5.2.2, c)]. Other reference substances should
be used, depending on the laboratory resources, or on the type of contaminants in the solid sample (if
known) or testing chemicals. For these situations, and in accordance with the interlaboratory test results
−1
(see Annex A), copper (II) sulfate pentahydrate (see 5.4.12; at 500 mg Cu · kg ), 3,5-DCP (see 5.4.13;
−1 −1
at 100 mg 3,5-DCP · kg ) or zinc sulfate heptahydrate (see 5.4.14; at 100 mg Zn · kg ) should be used as
additional reference substances spiked into quartz sand. Spike this control substrate one or two days before
the test start (see Table 1). As a guidance, the concentrations mentioned cause an average inhibition of A.
globiformis dehydrogenase activity between 40 % and 100 % for copper sulfate, and between 50 % and
80 % for 3,5-DCP and zinc sulfate.
7.3 Contact test procedure
7.3.1 General
One or two days (day −2 or day −1, see Table 1) before the test start, weigh (600 ± 6) mg of the pre-moistened
controls (negative and positive) (see 5.2) and test substrates (see 5.3) into the wells of a 24-well microplate.
Use at least four replicates per treatment. Weigh the same amount of each substrate (controls and test) to
prepare two (preferably three) replicates for each blank A and B (see 3.4, 3.5, Table 1).
— Blank A ‒ This blank sets the remaining dehydrogenase activity measured (as fluorescence) in the different
treatments after deactivation, or the own fluorescence of the substrate material (e.g. constrained by the
organic matter type). The fluorescence of the blank A (controls and test samples) shall be subtracted
from the fluorescence of the respective treatments exposed to the bacteria (see 8.1.1).
— Blank B ‒ This blank indicates the activity level of dehydrogenase in natural samples and the efficiency
of the deactivation step by comparing with blank A. Hence, blank B is a useful measurement for data
interpretation.
The blank B shall be performed in separate microplates. Store the microplates closed with the lid in the dark
at (4 ± 2) °C until further testing.
Table 1 — Overview of the test procedure
Negative Positive
Test day Step Blank B Blank A Test sample
control control
−2 or −1 Preparation of dilutions — — — — If needed
Moistening of the substrates x x x x x
x
Spiking of the substrates — — — x (if chemicals are
tested)
Uncontaminated material
600 ± 6 600 ± 6 600 ± 6 — —
(control) (mg wet mass)
Contaminated or spiked
600 ± 6 600 ± 6 — 600 ± 6 600 ± 6
substrate (mg wet mass)
Store microplates in the dark at 4 °C until the test start (day 0)
−1 Aeration of samples — — — — if anaerobic
0 Water (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
a
— Pasteurization/Deactivation of blank A and test plates
Inoculum (ml) — — 0,4 0,4 0,4
Medium B (ml) 0,4 0,4 — — —
Two hours of incubation at (30 ± 1) °C in the dark
Resazurin solution (ml) 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8
Measurement of the kinetic (every 15 min) during 1 h
a
Test plates are the 24-well microplates containing the negative and positive controls, and the test samples, which are all
added with A. globiformis inoculum. The blank A and B plates are not added with the inoculum, but only with medium B. The
blank B plates are not subjected to the pasteurization/deactivation step.
7.3.2 Aeration
In case of anaerobic soils and waste materials, aerate them one day before the test start (day −1, see Table 1),
by shaking the mixtures (600 mg ± 6 mg of sample wet mass plus 0,6 ml of sterile distilled water) up to 24 h
−1
on a horizontal shaker at a suitable frequency, e.g. 150 min , in order to achieve the first validity criterion
(see Clause 9). The water shall not be removed after aeration, if no more water is added for the incubation
(see 7.3.3).
7.3.3 Deactivation
At the test start (day 0, see Table 1) add 0,6 ml of sterilized distilled water in all replicates and proceed with
the deactivation step.
The natural dehydrogenase activity of the substrates should be suppressed as far as possible by pre-treating
the samples. This is made by heating (except the blank B microplates) the closed microplates with the test
and control (positive and negative) substrates in a water bath at (85 ± 2) °C for 10 min. Afterwards, cool
them down to room temperature for about 15 min in an iced water bath. The heating-cooling process should
be repeated once more.
NOTE This step, together with the incubation at (30 ± 1) °C (see 7.3.5), makes the contact assay inappropriate to
test the effect of volatile compounds in natural contaminated or spiked substrates, since they can easily evaporate
at room temperature (21 °C ± 3 °C). Moreover, heating the sample as proposed can cause the degradation of other
contaminants. An additional blank (e.g. blank C) that does not undergo deactivation and is exposed to the test
organism can be performed to improve data interpretation.
7.3.4 Preparation of the inoculum
The inoculum can be prepared a) from a stock culture or b) from the freeze-dried bacteria batch.
a) The inoculum preparation shall start one day prior to the test start. A 1 ml aliquot of the stock culture of
bacteria prepared according to B.2 shall be grown in 50 ml of medium B (see 5.4.6) for 16 h at (30 ± 1) °C
−1
and 150 min . After that, transfer 1 ml to 50 ml of fresh medium B and incubate 3 h at (30 ± 1) °C and
−1
150 min in a horizontal shaker. Adjust the optical density of bacterial inoculum in log-growth phase to
(0,4 ± 0,1).
b) If using freeze-dried bacteria (see B.3) reconstitute a vial with 0,5 ml of sterilized iced cold water (see
5.4.1) and place the vial for approximately 20 min to 30 min at (6 ± 2) °C. Transfer the suspension into
20 ml of sterilized medium B (see 5.4.6) previously warmed up to (30 ± 1) °C to have the inoculum ready
to use for the contact test. The
...
Norme
internationale
ISO 18187
Deuxième édition
Qualité du sol — Essai contact
2024-05
pour échantillons solides utilisant
l'activité déshydrogénase de
Arthrobacter globiformis
Soil quality — Contact test for solid samples using the
dehydrogenase activity of Arthrobacter globiformis
Numéro de référence
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 4
5 Réactifs et matériaux . 4
5.1 Micro-organismes d’essai .4
5.2 Substrats témoins .5
5.2.1 Généralités .5
5.2.2 Témoin pour les sols .5
5.2.3 Témoin pour les déchets .6
5.3 Substrats d’essai .6
5.4 Réactifs .7
6 Appareillage . 9
7 Mode opératoire . 10
7.1 Préparation des dilutions .10
7.2 Préparation des substances de référence et des témoins positifs .10
7.3 Mode opératoire de l’essai contact.11
7.3.1 Généralités .11
7.3.2 Aération .11
7.3.3 Désactivation . 12
7.3.4 Préparation de l’inoculum . 12
7.3.5 Incubation et mesurage de la fluorescence . 12
7.4 Interférences . 12
8 Calcul et expression des résultats .13
8.1 Calcul . 13
8.1.1 Fluorescence relative . 13
8.1.2 Détermination du pourcentage d’inhibition . 13
8.2 Expression des résultats .14
9 Validité de l’essai . 14
10 Analyse statistique .15
11 Rapport d’essai .15
Annexe A (informative) Résultats de l’essai interlaboratoires . 17
Annexe B (informative) Préparation des organismes d’essai .24
Annexe C (informative) Essais avec les substances chimiques .26
Bibliographie .28
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que l’utilisation du présent document peut impliquer l’utilisation d’un
ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité ou à l’applicabilité de
quelconques droits de propriété à ce propos. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de
propriété et averti de leur existence.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 444, Méthodes d'essai pour
la caractérisation environnementale des matrices solides, du Comité européen de normalisation (CEN)
conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 18187:2016), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— le domaine d’application a été modifié afin d’inclure la possibilité d’appliquer l’essai contact pour
l’évaluation des effets des produits chimiques (comme détaillé dans l’Annexe C);
— des détails supplémentaires concernant d’autres facteurs d’interférence potentiels (pour les essais avec
des plastiques et des déchets de faible densité) sur les performances de l’essai contact ont été fournis
et des alternatives méthodologiques adéquates ont été proposées afin de réduire les incertitudes du
résultat de l’essai;
— les critères de validité ont été actualisés afin d’inclure la gamme d’inhibition de l’activité déshydrogénase
attendue avec trois autres substances de référence (c’est-à-dire sulfate de cuivre (II) pentahydraté,
3,5-dichlorophénol, sulfate de zinc heptahydraté) qui sont ajoutées au sable de quartz et utilisées en tant
que témoins positifs alternatifs pour les essais de qualité des déchets;
— dans l’Article B.4, le séquençage génomique est proposé pour confirmer l’identité de Arthrobacter
globiformis, plutôt que les bandelettes d’identification microbiologique qui ne sont plus recommandées.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
Le présent document décrit l’essai contact miniaturisé sur solide avec Arthrobacter globiformis qui permet
d’effectuer une évaluation préliminaire en 6 h des matériaux solides (c’est-à-dire des sols et des déchets). Le
principe de l’évaluation repose sur l’inhibition de l’activité déshydrogénase d’un micro-organisme d’essai
ajouté, provoquée par des substances toxiques biodisponibles dans des échantillons de sol et de déchets. Il
s’agit d’un essai pertinent d’un point de vue écologique dans la mesure où il utilise une espèce bactérienne
[1][2]
des sols, ubiquitaire, présentant une forte affinité vis-à-vis des surfaces et dont les déshydrogénases
sont impliquées dans divers mécanismes biologiques supportant l’intégrité bactérienne (des chaînes
respiratoires, par exemple). De plus, il a été noté que ce paramètre (inhibition de l’activité déshydrogénase)
[3][4][5][6][7]
est assez sensible aux différentes substances toxiques .
Globalement, cet essai demande peu de main-d’œuvre, il a un bon rapport coût-efficacité et est sensible;
il fournit des résultats qui améliorent l’évaluation physique et chimique des échantillons naturels tout en
permettant une indication rapide de leurs effets biologiques.
L’essai de contact miniaturisé sur solide est basé sur l’essai contact sur solide décrit par la Référence [8].
Le présent document se base également sur la Référence [9].
Les résultats d’un essai interlaboratoires visant à estimer la variabilité de l’essai pour évaluer différents
échantillons de déchets et de sols, ainsi que des produits chimiques, sont présentés dans l’Annexe A et dans
la Référence [10].
v
Norme internationale ISO 18187:2024(fr)
Qualité du sol — Essai contact pour échantillons solides
utilisant l'activité déshydrogénase de Arthrobacter
globiformis
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode rapide d’évaluation d’échantillons solides en suspension aérobie,
en déterminant l’inhibition de l’activité déshydrogénase de Arthrobacter globiformis à l’aide d’un indicateur
redox coloré, la résazurine.
Cette méthode est applicable à l’évaluation de l’effet de contaminants non volatils, liés aux matières solides
ou solubles dans l’eau, présents dans des échantillons naturels tels que des sols et des déchets. Bien qu’il ne
s’agisse pas de sa principale finalité, l’essai contact peut également être utilisé pour l’évaluation des effets
des produits chimiques, comme décrit dans l’Annexe C. L’essai permet d’obtenir un résultat en 6 h et peut
donc être utilisé pour le criblage de matériaux d’essai potentiellement contaminés.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 5667-15, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 15: Lignes directrices pour la conservation et le
traitement des échantillons de boues et de sédiments
ISO 18400-206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206: Collecte, manipulation et conservation de sols
destinés à l'évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et structurels en laboratoire
CEN/TR 15310-1, Caractérisation des déchets — Prélèvement des déchets — Partie 1: Guide relatif au choix et à
l’application des critères d’échantillonnage dans diverses conditions
EN 14735, Caractérisation des déchets — Préparation des échantillons de déchets en vue d’essais
écotoxicologiques
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
temps de contact
durée d’exposition des bactéries à une suspension de matériau solide
3.2
témoin négatif
échantillon d’un substrat témoin (3.6) avec un mélange de solutions connues [eau distillée, milieu (3.13) B ou
inoculum (3.12)]
.
Note 1 à l'article: Il est utilisé dans le but de normaliser l’analyse.
3.3
témoin positif
échantillon d’un substrat témoin (3.6) contenant un mélange de solutions connues [eau distillée, milieu
(3.13) B ou inoculum (3.12)] et une substance de référence
Note 1 à l'article: Il est utilisé pour vérifier la sensibilité de l’organisme d’essai.
3.4
blanc A
blanc qui fixe la fluorescence propre au substrat après sa désactivation
Note 1 à l'article: Aucune bactérie n’est ajoutée au blanc A.
3.5
blanc B
blanc qui fixe la fluorescence naturelle du substrat sans désactivation
Note 1 à l'article: Aucune bactérie n’est ajoutée au blanc B.
3.6
substrat témoin
substrat de référence ou standard, utilisé comme témoin et comme substrat de dilution pour la préparation
des séries de dilutions/concentrations des substrats d’essai (3.7), d’une substance de référence ou d’un
produit chimique
EXEMPLE Sable de quartz ou sol standard de type LUFA 2.2.
3.7
substrat d’essai
substrat naturel ou artificiel qui est naturellement contaminé ou qui est dopé avec un produit chimique
soumis à essai
Note 1 à l'article: Le substrat d’essai est le matériau d’essai (3.8) qui a été préparé pour être soumis à essai (par exemple,
qui a été tamisé) et/ou qui a été dilué avec un substrat témoin (3.6).
3.8
matériau d’essai
échantillon initial de sol ou de déchets n’ayant subi aucune modification (par exemple, tamisage)
3.9
activité déshydrogénase
activité d’enzymes captant l’hydrogène, impliquées dans divers processus métaboliques énergétiques, dans
des réactions d’oxydoréduction et de biosynthèse (la chaîne respiratoire, par exemple) nécessitant l’intégrité
cellulaire pour être produites
[2]
Note 1 à l'article: Ces enzymes peuvent réduire la résazurine en résorufine dans l’environnement extracellulaire .
Note 2 à l'article: Voir Référence [11].
3.10
CEx
concentration d’effet pour un effet de x %
concentration (fraction massique) d’une substance ou d’un échantillon soumis à essai qui produit un effet de
x % pour un paramètre donné, pendant une durée d’exposition définie, par rapport à un témoin
EXEMPLE Une CE50 est une concentration qui produit un effet, pour le paramètre de l’essai, sur 50 % d’une
population exposée sur une durée d’exposition définie.
Note 1 à l'article: La concentration CEx est exprimée sous la forme d’un pourcentage de sol ou de déchet soumis à essai
(matière sèche) dans le mélange de sol (masse de matière sèche). Pour les produits chimiques, la concentration CEx est
exprimée en masse de substance d’essai dans le substrat (équivalent sec), en milligrammes par kilogramme.
3.11
bactéries lyophilisées
culture bactérienne conservée en éliminant l’eau d’une suspension de cellules congelées, par sublimation
sous vide
Note 1 à l'article: Les cultures lyophilisées peuvent être conservées à (−20 ± 2) °C. Les bactéries sont actives après
reconstitution avec de l’eau distillée stérilisée [20 min à 30 min à (6 ± 2) °C] et prêtes à être utilisées pour l’essai, voir
7.3.4 b).
3.12
inoculum
suspension bactérienne utilisée pour ensemencer une solution nutritive
3.13
milieu
solution nutritive aqueuse nécessaire à la croissance des bactéries
3.14
densité optique de l’inoculum bactérien
mesure de l’atténuation d’un faisceau de lumière traversant une suspension bactérienne à 600 nm (utilisée
pour déterminer le nombre de cellules de façon indirecte)
Note 1 à l'article: Dans un essai bactérien, l’absorbance est généralement mesurée en FAU (unités d’atténuation
formazine) à 600 nm (voir Référence [12]).
3.15
début de l’essai
moment où les substrats, les réactifs et l’inoculum (3.12) bactérien sont préparés, précédant immédiatement
la période d’incubation et de réaction
Note 1 à l'article: Il s’agit du jour où le substrat d’essai (3.7) et le substrat témoin (3.6) sont préparés pour
l’incubation (c’est-à-dire Tableau 1, jour 0).
3.16
temps de réaction
temps nécessaire à l’enzyme pour réagir (à partir de l’ajout de la solution de résazurine jusqu’à la fin de la
réaction cinétique)
3.17
pente
rapport de la variation de fluorescence relative (3.18) pendant le temps de réaction (3.16), entre 15 min
et 45 min
−1
Note 1 à l'article: La pente (exprimée en min ) est obtenue par application d’un modèle de régression linéaire aux
valeurs de fluorescence en fonction du temps.
3.18
fluorescence relative
fluorescence mesurée pour chaque traitement (témoin et essai) à laquelle est soustraite la fluorescence du
blanc A (3.4) correspondant
3.19
culture mère
culture bactérienne obtenue à partir d’une culture pure de la souche provenant d’un laboratoire certifié
Note 1 à l'article: Cette culture mère fournit un inoculum (3.12) pour la préculture selon le mode opératoire d’essai.
3.20
dilution minimale sans effet
DMSE
plus faible niveau de dilution pour lequel l’essai n’aboutit pas à une réduction significative d’un point de vue
écotoxicologique
Note 1 à l'article: La DMSE est exprimée en tant que valeur inverse de la dilution.
EXEMPLE La série de dilutions 1/2/4/8/16 [ = 100 %/50 %/25 %/12,5 %/6,25 % de substrat d’essai (3.7) par
rapport au substrat témoin (3.6)] est couramment employée. Une DMSE de 8 correspond à une dilution de sol ou de
déchets de 1:8.
4 Principe
La bactérie Arthrobacter globiformis est ajoutée au matériau solide et incubée à (30 ± 1) °C pendant 2 h. À
l’issue de ce temps de contact, la résazurine, indicateur coloré d’oxydoréduction non toxique, est ajoutée.
L’activité déshydrogénase entraîne une transformation de la résazurine en résorufine dans l’environnement
[2]
extracellulaire. La résorufine peut être détectée par fluorométrie (excitation à 535 nm, émission à
590 nm) en présence de matériau solide. L’augmentation de la résorufine est déterminée en mesurant la
fluorescence toutes les 15 min pendant 1 h. Afin de déterminer l’inhibition de l’activité déshydrogénase,
le taux d’augmentation de résorufine dans l’échantillon est comparé au taux d’augmentation de résorufine
dans le témoin. Une inhibition de l’activité déshydrogénase est attendue en présence de substances toxiques.
Cette inhibition se traduit par la réduction de la production de résorufine et par la diminution de l’émission
de fluorescence qui en découle.
5 Réactifs et matériaux
5.1 Micro-organismes d’essai
1)
L’organisme utilisé pour cet essai est Arthrobacter globiformis (Conn 1982) Conn et Dimmick 1947 ,
qui est courant dans les sols. Les espèces de Arthrobacter appartiennent à la famille des Microccocaceae.
Il s’agit principalement de micro-organismes aérobies stricts, même si certaines espèces peuvent
[13]
présenter un mécanisme anaérobie dans des conditions limitantes en oxygène. Arthrobacter spp. sont
chimiohétérotrophes et présentent des caractéristiques pléomorphes dans la mesure où ils présentent
une modification de leur morphologie, de bâtonnet à coccus, lorsqu’ils entrent en phase stationnaire. Bien
que Arthrobacter soit Gram positif, il peut être Gram négatif pendant la phase de croissance exponentielle.
Des fluctuations de l’épaisseur de paroi cellulaire durant la croissance bactérienne peuvent aboutir à
[14]
une variabilité de la coloration de Gram, se traduisant par une coloration différentielle des granules.
Cependant, cette caractéristique n’induit aucune différence en matière de sensibilité entre les essais, dans
la mesure où un inoculum en phase de croissance exponentielle est utilisé pendant le temps de réaction.
Arthrobacter globiformis appartient au groupe de risque I ‒ micro-organisme non pathogène.
La souche bactérienne peut être obtenue à partir de parties aliquotes lyophilisées ou congelées disponibles
dans le commerce issues de collections de cultures disponibles, par exemple auprès du Deutsche Sammlung
für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (souche 20124), ou auprès de l’ARS Culture Collection
TM
1) Souche ATCC 8010 Arthrobacter globiformis (Conn) Conn et Dimmick.
2)
NCAUR . Les suspensions bactériennes utilisées pour les mesurages de toxicité doivent être fraîchement
préparées à partir des cultures mères ou doivent être directement utilisées lorsqu’elles proviennent d’un lot
lyophilisé prêt à l’emploi. Le procédé de préparation des cultures mères et de lyophilisation des bactéries est
présenté à l’Annexe B.
5.2 Substrats témoins
5.2.1 Généralités
Il convient d’utiliser les substrats témoins sélectionnés en fonction des options présentées en 5.2.2 et 5.2.3
pour préparer à la fois des témoins négatifs (ajout d’eau distillée, voir 5.2.2, 5.2.3) et positifs (ajout de la
substance de référence, voir 7.2). L’humidification des substrats témoins (sols ou déchets) doit être effectuée
un ou deux jours avant le début de l’essai (voir Tableau 1). Conserver le ou les substrats à (4 ± 2) °C jusqu’au
début de l’essai.
5.2.2 Témoin pour les sols
Il existe trois choix possibles de sol témoin (voir également Référence [15]). Le sol de référence [point a)] est
préféré, mais si un tel sol n’est pas disponible, un sol naturel standard ou un sol artificiel standard peut être
utilisé. Dans tous les cas, il convient d’ajuster la teneur en eau du sol témoin à 20 %.
a) Si des sols de référence provenant de zones non contaminées proches d’un site contaminé sont
disponibles, il convient de les traiter et de les caractériser comme les sols devant être soumis à essai. Si
une contamination toxique ou des propriétés inhabituelles du sol ne peuvent être exclues, il convient de
privilégier les sols témoins standard b) ou c).
b) Sol naturel standard présentant les caractéristiques suivantes: C ≤ (1,7 à 2,6) %; teneur en
org
sable (granulométrie de 0,063 mm à 2 mm) de 50 % à 75 %; < 20 % de particules de moins de 0,02 mm;
pH compris entre 5 et 7,5.
3)
EXEMPLE Sol standard LUFA de type 2.2 .
c) Sol artificiel standard ou sable de quartz (50 % à 75 % de sable présentant une granulométrie comprise
entre 0,063 mm et 2 mm; pH 5,5 à 6,5).
[16]
Le substrat appelé sol artificiel standard a la composition suivante:
Pourcentage exprimé sur
la base de la masse sèche
— Tourbe de sphaigne finement broyée et sans résidus de plante
5 %
visible (granulométrie ≤ 1 mm)
— Argile kaolinique contenant moins de 30 % de kaolinite 20 %
— Sable de quartz industriel (majoritairement constitué de sable fin,
50 % à 75 % des grains présentant une granulométrie comprise 74 %
entre 0,063 mm et 2 mm)
2) Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH, Mascheroder Weg 10, D-38124 Brunswick,
Allemagne ou ARS (Agricultural Research Service) Culture collection (également connu sous le nom de NRRL) appartenant
au National Center for Agricultural Utilization Research (NCAUR), 1815 N, University Street, Peoria, Illinois 61604, USA
(États-Unis d’Amérique), sont des exemples de sociétés commercialisant cette bactérie. Cette information n’est donnée
aux utilisateurs du présent document que par souci de commodité et ne constitue en rien une recommandation de ces
sociétés par l’ISO.
3) Le sol standard LUFA de type 2.2 est l’appellation commerciale d’un produit fourni par LUFA Speyer. Cette information
n’est donnée aux utilisateurs de la présente Norme internationale que par souci de commodité et ne constitue en rien une
recommandation de ce produit par l’ISO. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent
aux mêmes résultats.
— Carbonate de calcium 1 %
Il convient d’étudier plus en détail un sol artificiel standard préparé à partir de tourbe et de sable de
quartz de granulométrie modifiée. La présence dans ce substrat artificiel de particules de faible masse
volumique (tourbe, par exemple) susceptibles de flotter peut influencer les mesures de fluorescence,
cependant d’autres sols témoins (comme suggéré ci-dessus) peuvent être sélectionnés.
5.2.3 Témoin pour les déchets
Sable de quartz, voir 5.2.2, c). Il convient que le sable de quartz présente une teneur en eau de 20 %.
5.3 Substrats d’essai
Il convient de soumettre à essai les échantillons (sols ou déchets) le plus rapidement possible après
prélèvement. Prélever les échantillons comme spécifié:
— pour les sols, dans l’ISO 18400-206;
— pour les déchets, dans l’ISO 5667-15, l’EN 14735 et le CEN/TR 15310-1.
Les conserver à l’abri de la lumière à (4 ± 2) °C pendant au maximum deux semaines, afin d’éviter les
modifications (bio)chimiques susceptibles d’interférer avec les résultats d’écotoxicité. Pour une conservation
de longue durée, les échantillons peuvent être congelés à (−20 ± 2) °C.
NOTE Pour les échantillons de déchets ne présentant pas d’activité microbienne ou non sujets à des modifications
(bio)chimiques pouvant entraîner une variation des résultats des essais d’écotoxicité, une conservation jusqu’à deux
mois à (4 ± 2) °C peut être envisagée sur décision de l’opérateur (conformément à l’EN 14735).
Les échantillons de sol et de déchets doivent être tamisés à 2 mm (tamis à mailles carrées). Il convient de
broyer les déchets bruts (déchets de construction, par exemple) avant de les soumettre à essai (se référer à
l’EN 14735). Il convient de procéder à une recherche des métaux et des contaminants organiques dans les
échantillons afin d’obtenir des informations utiles à l’interprétation des données.
Pour l’interprétation des résultats d’essai, il convient de déterminer les caractéristiques suivantes pour
chaque échantillon:
[17] [18]
a) le pH conformément à l’ISO 10390 pour les échantillons de sol, à l’EN 15933 pour les échantillons
[17]
de biodéchets et à l’ISO 10390 pour les autres déchets solides;
[19]
b) la texture (sable, limon, silt) conformément à l’ISO 11277 ;
[20] [21]
c) la teneur en eau conformément à l’ISO 11465 pour les échantillons de sol et à l’EN 15934 pour les
échantillons de biodéchets;
[22]
d) la capacité de rétention d’eau conformément à l’ISO 11268-2 ;
[23]
e) la capacité d’échange cationique conformément à l’ISO 11260 ;
[24] [25]
f) le carbone organique conformément à l’ISO 10694 pour les échantillons de sol et à l’EN 15936
pour les échantillons de biodéchets.
Seuls les échantillons dont le pH est compris entre 5 et 9 sont évalués de manière adéquate par cet essai
contact (voir 7.4). La teneur en eau doit être ajustée à 20 % (pour les sols et les déchets; voir 5.2.2 et 5.2.3).
Cet ajustement doit être calculé en fonction de la teneur en eau d’origine des échantillons, qu’il convient de
déterminer avant la préparation de l’essai. L’humidification des échantillons doit être effectuée un ou deux
jours avant le début de l’essai (voir Tableau 1). Conserver les échantillons à (4 ± 2) °C jusqu’à la réalisation de
l’essai.
Des dilutions peuvent également être préparées (voir 7.1) pour des échantillons naturels de sols et de
déchets.
Pour les essais relatifs aux substances chimiques ajoutées à un sol, il convient de suivre un mode opératoire
différent (voir Annexe C).
Il convient d’ajouter plus d’eau aux déchets à base de boues d’épuration à teneur élevée en matière
organique (MO) ou à teneur élevée en carbone organique total (COT) (teneur en eau ajustée à 33 %
par exemple). Des essais supplémentaires visant à définir le pourcentage approprié de teneur en eau en
fonction du niveau de MO ou de COT dans ce type d’échantillons sont en cours de développement.
5.4 Réactifs
Sauf spécification contraire, seuls des réactifs de qualité analytique doivent être utilisés.
5.4.1 Eau, stérilisée et non stérilisée, déionisée, distillée ou de pureté équivalente
−1
(conductivité < 10 µS · cm ).
5.4.2 Solution de diméthylsulfoxyde (DMSO), C H OS, à 4 % en volume dans de l’eau distillée.
2 6
Stériliser la solution par filtration au travers d’une membrane polyamide filtrante de 0,2 µm de porosité, en
utilisant une seringue.
−1
5.4.3 Solution d’hydroxyde de sodium, NaOH, par exemple 1 mol · l .
NOTE Pour ajuster le pH des milieux, il peut être nécessaire d’utiliser des bases de plus faible ou plus forte
concentration.
−1
5.4.4 Acide chlorhydrique, HCl, par exemple 1 mol · l .
NOTE Pour ajuster le pH des milieux, il peut être nécessaire d’utiliser des acides de plus faible ou plus forte
concentration.
5.4.5 Milieu A, destiné à la culture mère de A. globiformis (pH 7,2 à 7,4).
Dissoudre
— 10 g de peptone de caséine;
— 5 g d’extrait de levure;
— 5 g de D(+)-glucose;
— 5 g de NaCl;
dans de l’eau (5.4.1), compléter à 1 000 ml avec de l’eau et autoclaver pendant 20 min à (121 ± 3) °C. Lorsque
la solution stérilisée est conservée (sans jamais être ouverte) à (4 ± 2) °C à l’abri de la lumière, elle reste
stable jusqu’à 12 mois.
5.4.6 Milieu B, destiné à la préparation des lyophilisats et de la solution d’essai.
Diluer 333,3 ml du milieu A (5.4.5) dans 666,6 ml d’eau stérilisée. Ou dissoudre
— 3,33 g de peptone de caséine;
— 1,67 g d’extrait de levure;
— 1,67 g de D(+)-glucose;
— 1,67 g de NaCl;
dans de l’eau (5.4.1) et compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Autoclaver le milieu pendant 20 min à (121 ± 3) °C.
Lorsque la solution stérilisée est conservée (sans jamais être ouverte) à (4 ± 2) °C à l’abri de la lumière, elle
reste stable jusqu’à 12 mois.
5.4.7 Gélose inclinée (peptone de caséine, peptone de soja), pour une suspension cellulaire dense
de A. globiformis.
Dissoudre 40 g de gélose trypticase soja dans de l’eau (5.4.1) et compléter à 1 000 ml avec de l’eau.
Après dissolution complète, répartir 7 ml de ce milieu dans des tubes de culture (6.15). Il convient de remplir
les tubes de manière à ne pas dépasser une hauteur de 50 mm en dessous du col, lorsque le col est posé sur
une pipette horizontale en verre de 10 ml placée à l’horizontale. Fermer les tubes avec les bouchons puis
autoclaver pendant 20 min à (121 ± 3) °C. Après refroidissement, les tubes sont prêts à l’emploi.
5.4.8 Milieu de protection, destiné aux bactéries lyophilisées.
Dissoudre
— 20 g de lait écrémé;
— 5 g de myo-inositol;
dans de l’eau (5.4.1), compléter à 100 ml avec de l’eau et autoclaver pendant 10 min à (121 ± 3) °C. À l’issue de
l’autoclavage et du refroidissement à (80 ± 2) °C, placer immédiatement le milieu dans un bain de glace afin
d’éviter la caramélisation. Lorsque la solution stérilisée est conservée (sans jamais être ouverte) à (4 ± 2) °C
à l’abri de la lumière, elle reste stable jusqu’à 12 mois.
5.4.9 Tampon phosphate.
Dissoudre
— 8,2 g de KH PO , H O;
2 4 2
— 13,24 g de K HPO , H O;
2 4 2
— 2 g d’acétate de sodium, C H NaO ;
2 3 2
— 2 g de D(+)-glucose;
dans de l’eau (5.4.1) et compléter à 1 000 ml avec de l’eau. Ajuster le pH du tampon à 7,0 ± 0,2 avec de
l’acide chlorhydrique dilué (5.4.4) ou une solution d’hydroxyde de sodium (5.4.3). Autoclaver le milieu
pendant 20 min à (121 ± 3) °C. Lorsque la solution est conservée à (4 ± 2) °C à l’abri de la lumière, elle reste
stable jusqu’à 12 mois.
5.4.10 Solution de colorant résazurine.
Dissoudre (45 ± 1) mg de résazurine dans 1 000 ml de tampon phosphate (5.4.9). Lorsque la solution de
couleur bleue est conservée à (4 ± 2) °C à l’abri de la lumière, elle reste stable jusqu’à une semaine.
5.4.11 Chlorure de benzyldiméthylhexadécylammonium, substance de référence [également appelé
4)
chlorure de cétalkonium (BAC-C16)], CH (CH )15N(Cl)(CH )2CH C H [CAS Registry Number® (CAS RN) :
3 2 3 2 6 5
122-18-9].
Il s’agit d’un sel d’ammonium quaternaire couramment utilisé comme agent antimicrobien. Le BAC-C16 est
un homologue du BAC (chlorure de benzalkonium, un homologue en C12) qui est constitué d’un mélange
de chlorures d’alkylbenzyldiméthylammonium, principalement composé de chlorure de cétalkonium. Le
−1 −1
BAC-C16 est modérément soluble dans l’eau (entre 2 g · l et 85 g · l ), et si nécessaire, la solution peut
être homogénéisée par sonication. Lorsque la solution est conservée à (4 ± 2) °C à l’abri de la lumière, elle
reste stable pendant une semaine. Son mode d’action cible principalement les bactéries Gram négatives par
[26]
modification de la perméabilité de leurs membranes cytoplasmiques, entraînant une cytolyse .
4) Chemical Abstracts Service (CAS) Registry Number® est une marque commerciale de l’American Chemical
Society (ACS). Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement
que l’ISO approuve l’emploi du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré
qu’ils aboutissent aux mêmes résultats.
5.4.12 Sulfate de cuivre (II) pentahydraté, substance de référence complémentaire (CAS RN 7758-99-8).
Préparer une solution mère dans l’eau (5.4.1) avant de doper le sable de quartz avec son volume approprié
−1
pour obtenir une concentration finale de 500 mg de Cu · kg de sol (masse sèche).
5.4.13 3,5-dichlorophénol (3,5-DCP), substance de référence complémentaire (CAS RN 591-35-5).
Préparer une solution mère dans l’eau (5.4.1) avant de doper le sable de quartz avec son volume approprié
−1
pour obtenir une concentration finale de 100 mg de 3,5-DCP · kg de sol (masse sèche).
5.4.14 Sulfate de zinc heptahydraté, substance de référence complémentaire (CAS RN 7446-20-0).
Préparer une solution mère dans l’eau (5.4.1) avant de doper le sable de quartz avec son volume approprié
−1
pour obtenir une concentration finale de 100 mg de Zn · kg de sol (masse sèche).
6 Appareillage
Utiliser du matériel de laboratoire et l’appareillage suivant.
6.1 Autoclave
6.2 Bain à ultrasons
6.3 Enceinte stérile
6.4 Congélateur, −20 °C et −80 °C, destiné à la conservation des lyophilisats et des cultures mères.
6.5 Fiole conique, avec un bouchon en cellulose servant de flacon de culture, d’une capacité nominale
de 100 ml (Référence [27] par exemple).
6.6 Incubateur thermostaté, pouvant maintenir une température de (30 ± 1) °C.
6.7 Agitateur horizontal
6.8 Photomètre, adapté à un mesurage de la densité optique de l’inoculum bactérien à 600 nm.
6.9 Fluorimètre pour microplaques, émission à 590 nm, excitation à 535 nm.
NOTE À titre d’exemple, le fluorimètre peut présenter les caractéristiques suivantes: sensibilité d’environ
5 pM de fluorescéine (lecture par le dessus ou par le dessous), plage dynamique de cinq ordres de grandeur, bande
passante selon le filtre, lampe halogène en quartz à filament de tungstène avec un système de détection comprenant
un photomultiplicateur (PMT).
6.10 pH-mètre
6.11 Pipette multi-distributrice ou micropipettes, 10 000 µl, 1 000 µl, 200 µl, et 20 µl.
6.12 Embouts ou Combitips (adaptés à un volume de 10 ml) autoclavables.
6.13 Microplaques, 24 puits avec couvercles, transparentes et à fond plat.
6.14 Ballon en verre à fond rond avec un filtre adaptable de porosité de 0,22 µm, pour le lyophilisateur.
6.15 Tubes de culture en verre avec bouchons, 16 mm × 160 mm, destinés à la gélose inclinée.
6.16 Flacons avec bouchons à vis, résistant à une température de −80 °C, d’une capacité nominale de
1,5 ml ou de 2 ml.
6.17 Filtre membrane en polyamide, porosité 0,2 µm, 25 mm de diamètre, et seringue.
6.18 Bain-marie
6.19 Lyophilisateur
6.20 Tamis, porosité 2 mm.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation des dilutions
Lorsque les échantillons soumis à essai sont très toxiques, une série de dilutions selon une progression
géométrique peut être préparée en mélangeant différentes proportions d’échantillon (sols ou déchets,
voir 5.3) avec le substrat témoin correspondant (voir 5.2). Des mélanges avec les proportions suivantes:
100 %, 50 %, 25 %, 12,5 %, 6,25 % et 0 % de masse sèche d’échantillon sont suggérés. Ajuster ensuite la
teneur en eau comme mentionné en 5.2 et 5.3.
7.2 Préparation des substances de référence et des témoins positifs
Il convient de préparer un témoin positif chaque fois qu’un essai contact est effectué.
Il convient d’utiliser le BAC-C16 (voir 5.4.11) comme substance de référence dans le cas d’essais sur
échantillons de sols. Dans un essai interlaboratoires (voir Référence [6]), un sol standard LUFA de type 2.2
−1
[voir 5.2.2, b)] a été dopé avec du BAC-C16 à une concentration de 600 mg kg . La valeur moyenne de
[5]
l’inhibition calculée était de 58,2 % (BAC) .
Pour la préparation du témoin positif BAC-C16, doper le sol standard LUFA de type 2.2 [voir 5.2.2, b)] avec
−1
du BAC-C16 (voir 5.4.11) à une concentration de 600 mg · kg (en masse sèche de sol). Préparer une solution
mère en dissolvant (600 ± 2) mg de BAC-C16 (voir 5.4.11) dans 100 ml d’eau distillée. Doper ensuite 10 g
−1
de sol standard LUFA de type 2.2 avec 1 ml de la solution mère (6 mg · ml ). Mélanger le sol jusqu’à ce que
la substance soit répartie de manière homogène. Lorsque le substrat témoin positif préparé est conservé
à −20 °C, il reste stable jusqu’à six mois. Si un substrat témoin positif fraîchement préparé est utilisé,
il convient de le préparer un ou deux jours avant le début de l’essai afin de permettre au sol d’atteindre
l’équilibre chimique (voir Tableau 1). Ajuster la teneur en eau du substrat (voir 5.2).
Pour les déchets (ou les produits chimiques, voir Annexe C), il convient que le témoin positif soit également
préparé dans le substrat témoin recommandé [c’est-à-dire du sable de quartz; voir 5.2.2, c)]. Il convient
d’utiliser d’autres substances de référence, selon les moyens du laboratoire, le type de contaminants présents
dans l’échantillon solide (s’ils sont connus) ou les produits chimiques soumis à essai. Dans ces situations, et
selon les résultats de l’essai interlaboratoires (voir Annexe A), il convient d’utiliser du sulfate de cuivre (II)
−1 −1
pentahydraté (voir 5.4.12; à 500 mg Cu · kg ), du 3,5-DCP (voir 5.4.13; à 100 mg 3,5-DCP · kg ) ou du sulfate
−1
de zinc heptahydraté (voir 5.4.14; à 100 mg Zn · kg ) comme substances de référence complémentaires
pour le dopage du sable de quartz. Doper ce substrat témoin un ou deux jours avant le début de l’essai
(voir Tableau 1). À titre indicatif, les concentrations mentionnées entraînent une inhibition moyenne
de l’activité déshydrogénase de A. globiformis comprise entre 40 % et 100 % pour le sulfate de cuivre, et
entre 50 % et 80 % pour le 3,5-DCP et le sulfate de zinc.
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