ISO 23611-2:2024
(Main)Soil quality — Sampling of soil invertebrates — Part 2: Sampling and extraction of micro-arthropods (Collembola and Acarina)
Soil quality — Sampling of soil invertebrates — Part 2: Sampling and extraction of micro-arthropods (Collembola and Acarina)
This document specifies a method for sampling, extracting and preserving collembolans and mites from field soils as a prerequisite for using these animals as bio-indicators (e.g. to assess the quality of a soil as a habitat for organisms). The sampling and extraction methods of this document are applicable to almost all types of soils. Exceptions can be soils from extreme climatic conditions (hard, frozen or flooded soils) and other matrices than soil, e.g. tree trunks, plants or lichens.
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol — Partie 2: Prélèvement et extraction des micro-arthropodes (Collembola et Acarina)
Le présent document spécifie une méthode pour le prélèvement, l’extraction et la conservation des collemboles et des acariens du sol prélevés sur le terrain comme prérequis à l’utilisation de ces animaux en tant que bio-indicateurs (par exemple pour évaluer la qualité d’un sol en tant qu’habitat pour les organismes). Les méthodes de prélèvement et d’extraction du présent document s’appliquent à la quasi-totalité des sols. Les sols présents sous des conditions climatiques extrêmes (sols durs, gelés ou inondés) et les matrices autres que le sol, à l’instar des troncs d’arbres, des plantes ou des lichens, peuvent être considérés comme des exceptions.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 23611-2
Second edition
Soil quality — Sampling of soil
2024-04
invertebrates —
Part 2:
Sampling and extraction of micro-
arthropods (Collembola and
Acarina)
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol —
Partie 2: Prélèvement et extraction des micro-arthropodes
(Collembola et Acarina)
Reference number
© ISO 2024
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Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Test materials . 2
5.1 Biological material .2
5.2 Reagents .2
6 Apparatus . 3
7 Procedure . 4
7.1 Collecting the soil samples . .4
7.2 Extracting Collembola and Acarina from soil samples .4
7.3 Sorting, preserving and identifying Collembola and Acarina .5
7.3.1 Sorting and preserving .5
7.3.2 Identification .5
8 A ssessment of results . 6
9 Study report . 6
Annex A (informative) Species determination in collembolans and mites . 8
Annex B (informative) Alternative method for sampling of micro-arthropods . 9
Bibliography .10
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
characterization, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 444, Environmental characterization of solid matrices, in accordance with the Agreement
on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 23611-2:2006), which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— an additional Note was added in 7.3.2.1 with the description of an alternative method to the classic pre-
heating techniques for specimen preparation for Collembola taxonomic identification;
— the bibliographic references list was revised and updated.
A list of all parts in the ISO 23611 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
This document was prepared in response to a growing need for the standardization of sampling and
extraction methods of soil micro-arthropods. These methods are needed for the following purposes:
— biological classification of soils including soil quality assessment (e.g. References [19], [24], [27], [30],
[36], [40], [41]);
— terrestrial bioindication and long-term monitoring (e.g. References [3], [12], [14], [19], [31], [34], [37]).
Data collected by standardized methods can be more accurately evaluated, allowing more reliable
comparisons between sites (e.g. polluted versus non-polluted sites, changes in land-use practices).
From the several micro-arthropod groups, Collembola and Acarina are the most studied in soil ecology.
Their relevance for the soil system comes from their high abundance and diversity, and also from their
role in key biological processes. Collembola and Oribatid mites act mainly as catalysts in organic matter
[6],[21] [21],[26]
decomposition, whereas predacious mites can act as webmasters in soil food webs. These
characteristics, allied to a widespread taxonomic knowledge, allow their use as study organisms in several
research programmes dealing with the impacts of forest practices (e.g. References [8], [16], [17], [18], [22],
[23], [24], [28], [29], [32], [33], [35], [42]) or crop management practices (e.g [2], [7], [10], [13], [20], [25],
[43], [44].). These features make them suitable organisms to be used as bio-indicators of changes in soil
[38]
quality, especially due to land-use practices and pollution .
[45]
For the sampling design of field studies in general, see ISO 18400-104 for general guidance on the
development of site investigation strategies and detailed guidance on the development of sampling
strategies.
Methods for other soil organism groups, such as earthworms, enchytraeids, nematodes and macro-
[52] [53] [54] [55]
invertebrates are covered in ISO 23611-1 , ISO 23611-3 , ISO 23611-4 and ISO 23611-5 ,
respectively.
v
International Standard ISO 23611-2:2024(en)
Soil quality — Sampling of soil invertebrates —
Part 2:
Sampling and extraction of micro-arthropods (Collembola
and Acarina)
1 Scope
This document specifies a method for sampling, extracting and preserving collembolans and mites from
field soils as a prerequisite for using these animals as bio-indicators (e.g. to assess the quality of a soil as a
habitat for organisms).
The sampling and extraction methods of this document are applicable to almost all types of soils. Exceptions
can be soils from extreme climatic conditions (hard, frozen or flooded soils) and other matrices than soil,
e.g. tree trunks, plants or lichens.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
micro-arthropod
group which is defined by its small size (range size from 100 µm to a few millimetres) making up a significant
part of the below-ground food web in many terrestrial ecosystems
Note 1 to entry: This group is mainly composed by mites (Acarina), springtails (Collembola), Protura, Diplura, garden
centipedes (Symphyla), Pauropoda, small centipedes and millipedes, small arachnids (spiders and pseudoscorpions),
and insects and their larvae from several orders (Hymenoptera, Diptera, Coleoptera, etc.).
4 Principle
Soil samples are collected in the field using a split corer. Soil cores are placed in plastic tubes (or plastic
bags) and transported to the laboratory. Afterwards, Collembola and Acarina are rapidly (within a few days)
extracted by behavioural methods, using a MacFadyen apparatus, and preserved for future identifications.
[12],[34]
In addition, preparation techniques are also described. Finally, abundance values can be recalculated
related to area (usually 1 m ), volume or weight (usually 1 kg).
NOTE Alternative methods for extraction can be used under special circumstances. Flotation methods (e.g. the
heptane flotation method) can be used in clay or loamy soils and a Kempson extractor (6.18) can be used in the case
[34]
litter is sampled .
5 Test materials
5.1 Biological material
Collembola (springtails) are small wingless hexapods (from 150 µm up to 9 mm in length), having a
distinctive head with a pair of antennae, without true compound eyes, with six abdominal segments and
three pre-genital appendages in the abdomen. In the first segment, there is the ventral tube (or collophore)
that is used for adhering to smooth surfaces. The name Collembola comes from this structure (from Greek
colla = glue and embolon = bar). In the third segment, there is the tenaculum, which holds the jumping
apparatus on its normal position. This jumping appendage, the furcula (or spring), is located in the fourth
segment, when present. Springtails live in litter and soil, and have very distinctive life forms. They belong to
[4]
the class Collembola and can be separated into 33 families .
Soil mites are small chelicerate arthropods related to spiders (length from 150 µm up to < 5 mm), living
in soil and litter and presenting very distinctive life forms. They belong to the class Arachnida, subclass
Acarina, and can be separated into four groups: Cryptostigmata (Oribatida), Mesostigmata (Gamasida),
Prostigmata (Trombidiformes) and Astigmata.
NOTE Some hints for the taxonomy of springtails and mites are given in Annex A.
5.2 Reagents
Unless otherwise specified, use only reagents of good quality and distilled water.
5.2.1 Propan-2-ol, 80 % (volume fraction).
5.2.2 Formalin [formaldehyde solution 40 % (volume fraction)].
5.2.3 Acetic acid.
5.2.4 Phenol, C H OH, crystalline (carbolic acid).
6 5
5.2.5 Hydrogen chloride, c(HCl) from 8 mol/l to 10 mol/l.
5.2.6 2,2,2-Trichloro-1,1-ethanediol (chloral hydrate).
5.2.7 1,2,3-Trihydroxypropane (glycerine).
5.2.8 von Törne fixative, used to preserve the extracted animals and composed by Propan-2-ol (80 %),
formalin (40 %) and glacial acetic acid (a volume fraction 10:0,3:0,03).
5.2.9 Nesbitt clearing medium, used to clear mite specimens composed of chloral hydrate (80 g), distilled
water (50 ml) and concentrated hydrogen chloride (5 ml).
5.2.10 Lactophenol solution, used to clear mite specimens composed of lactic acid (10 ml), crystals of
phenol (3,6 g) and distilled water (5 ml).
5.2.11 2-Hydroxypropanoic acid (lactic acid), to clear and observe micro-arthropod specimens, especially
oribatid mites under the microscope.
5.2.12 Ethanol, 70 % to 75 % (volume fraction), used for fixation and preservation (in this case, also in
combination with glycerine, 10:1).
5.2.13 Hoyer’s medium, used to mount Collembola specimens composed of distilled water (50 ml), gum-
arabic (30 g), chloral hydrate (200 g) and glycerine (20 ml).
5.2.14 DNA extraction buffer (SNET buffer solution), used to clear collembolans.
5.2.15 Protease K solution, used to clear collembolans.
5.2.16 Ethanol 35 % (volume fraction), used for preservation of the specimens.
5.2.17 Formol 3 %, used for preservation of the specimens.
5.2.18 Marc André 2 medium, to clear and provide the best optical properties to the specimens for
identification.
6 Apparatus
Use standard laboratory equipment and the following.
6.1 Measuring tape.
6.2 Collecting flasks.
6.3 Wash bottle.
6.4 Forceps, pipette, fine painting brush, fine needles.
6.5 Petri dishes.
6.6 Stereomicroscope.
6.7 Microscope, with phase or interference contrast is preferable.
6.8 Microscopic slides, with excavated area in the centre, and lamellae.
6.9 Electrical heating plate.
6.10 Plastic vials.
6.11 Ceramic heating elements.
6.12 Pencil, notebook, water resistant marker, labels.
6.13 Split corer
Sampling device made of stainless steel or aluminium (40 cm long and e.g. 5,6 cm diameter may be used; the
length and diameter should not differ considerably from these numbers, in order to maintain comparable
conditions), used to collect soil cores (samples). It can be composed of two independent parts that fit together
along the corer main axis or it can consist of one tube. On the top, it has a handle and, on the bottom, a
cutting edge.
6.14 Glass vials.
6.15 Drying oven.
6.16 MacFadyen apparatus
High-gradient (multiple) device used to extract micro-arthropods from soil samples. The principle is to create
an artificial temperature gradient between the canister where the sample is placed (hot) and the collecting
device below (cold), inducing a negative thermotactic (at the same time, a positive hygrotactic, negative
phototactic, and positive skototactic) behaviour on the animals that, by this way, leave the soil sample.
6.17 Plastic tubes, with caps (5 cm diameter, 5 cm long), or plastic bags, for storing the soil samples.
6.18 Kempson extractor, in the case litter is sampled.
6.19 Sample frame, 25 cm × 25 cm × 15 cm, made of stainless steel and with sharpened edges, to sample
animals from the litter layer.
NOTE For details concerning the equipment in 6.13, and 6.16 to 6.19, see References [12] and [34].
7 Procedure
7.1 Collecting the soil samples
At each sampling point (previously defined according to sampling design rules), a soil sample is collected
using a split corer (6.13); for flooded soils the same corer may be employed, but an auger tip should be
present to retain the soil after extraction.
NOTE In addition to the general characterization of the site, it is useful to determine the actual moisture of the
soil to be sampled.
After the sample is taken, the corer is opened (a picture of the soil core profile can complement the site
characterization) and the soil core is separated into litter layer (including the humus horizon) and the
upper 10 cm of the mineral soil. Generally, 5 cm layers are used for the upper part of the mineral horizon, but
if a finer analysis is required, thinner layers can be defined. The depth of the litter layer should be registered.
After this procedure, each layer is conditioned in plastic tubes; these are sealed with caps, labelled, and
stored for transportation to the laboratory. Plastic bags can be used as substitutes of the plastic tubes (6.17),
but special care shall be taken during conditioning to avoid disturbing the core structure and compaction
of the soil material, that can lead to the death of animals. The time lapse between sampling and extraction
should be recorded and should not exceed 5 days (if the samples remain at 20 °C ± 2 °C and the soil is kept
moist), in order to avoid undesirable side effects due to confinement and shifts in micro populations.
If sampling of animals is restricted to the litter layer, a sample frame (6.19) is used instead. The frame is
pressed into the litter by hand. Directly afterwards, the litter inside the frame is collected and the litter
samples are placed in plastic bags (6.17), labelled, and stored.
When sampling in soil, the site should be physico-chemically characterized. In particular, pH, particle
size distribution, C/N ratio, organic carbon content and water-holding capacity should be measured using
[46] [47] [48] [49] [50] [51]
ISO 10390 , ISO 10694 , ISO 11274 , ISO 11277 , ISO 11461 , ISO 11465 .
7.2 Extracting Collembola and Acarina from soil samples
In the laboratory, animals are extracted by behavioural methods, e.g. using a MacFadyen high-gradient
extractor (6.16). Each sample core is placed inverted into the canister having a plastic or metal net (2 mm
mesh size) on the bottom. This is connected to a funnel attached to a collecting flask (6.2) with 25 ml of “von
Törne-fixative” (5.2.8).
Alternatively, a saturated solution of picric acid, a 50 % ethylene glycol solution (plus some drops of a
detergent) or even 75 % ethanol (5.2.12) may be used as fixative.
A temperature gradient is created between the upper part (where the samples are placed) and the lower
part of the system (where the collecting flasks are placed). Heat can be provided by ceramic heating
elements (6.11), giving approximately 10 W per sample. The collecting flasks are immersed in a cooling
water bath. In some commercial apparatus, the temperature gradient is obtained by circulating heated air in
the canister area and cooled air on the collecting area.
The temperature difference between the upper and lower parts should be around 30 °C to 35 °C, with the
upper part being heated at 45 °C to 50 °C and the lower part being cooled usually at 10 °C. Special care shall be
taken to avoid a fast increase in temperature in the upper part, which can cause the rapid desiccation of the
sample and the death of the animals. Therefore, the temperature of the upper part should increase gradually,
starting with approximately 5 °C above field temperature during the first three days, and intensifying the
gradient for the next six to seven days.
The extraction procedure takes nine to 10 days. Afterwards, animal samples are labelled and ready to be
stored until processing (sorting and identification). Extraction should start as soon as possible (i.e. the day
of sampling). In case storage is necessary, the soil samples should be kept at 4 °C.
NOTE 1 The method described is only efficient for active live stages, with an average extraction efficiency of 75 %
[5],[33],[36]
to 80 %. Eggs, other quiescent stages, and animals enclosed in plant debris are not extracted by this method;
[39]
alternatively, the heptane flotation method can be used (see Annex B).
NOTE 2 The size of canisters can vary according to the type of apparatus. Commonly, plastic or metal canisters
of 200 cm (2,5 cm radius and 10 cm high) are used. Some commercial MacFadyen apparatus, however, use larger
canisters of about 800 cm .
NOTE 3 Other types of apparatus using the same principle (e.g. Berlese-Tullgren funnel) can be used to extract the
animals.
NOTE 4 Semi-permanent slide mounts can be obtained by directly mounting ethanol-fixed specimens (5.2.12)
into a mixture of phenol (5.2.4), chloral hydrate (5.2.6) and lactic acid (5.2.11), then preserving the preparation from
desiccation by successive deposits of nail varnish or similar resins.
WARNING — Appropriate precautions shall be taken when dealing with formalin to avoid danger
from inhalation or skin exposure. According to the “Material Safety Data Sheet” for Formaldehyde
37 % solution as published by producing companies, the compound is a skin sensitizer and is
considered to be carcinogen (humans: limited evidence; animals: sufficient evidence). It is legally
notified in industrialised countries for scientific use.
7.3 Sorting, preserving and identifying Collembola and Acarina
7.3.1 Sorting and preserving
After extraction, animals shall be sorted into groups. This procedure is done under a stereomicroscope (6.6)
using Petri dis
...
Norme
internationale
ISO 23611-2
Deuxième édition
Qualité du sol — Prélèvement des
2024-04
invertébrés du sol —
Partie 2:
Prélèvement et extraction des
micro-arthropodes (Collembola et
Acarina)
Soil quality — Sampling of soil invertebrates —
Part 2: Sampling and extraction of micro-arthropods (Collembola
and Acarina)
Numéro de référence
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Tél.: +41 22 749 01 11
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 1
5 Matériaux d’essai . 2
5.1 Matériel biologique .2
5.2 Réactifs .2
6 Appareillage . 3
7 Mode opératoire . 4
7.1 Collecte des échantillons de sol .4
7.2 Extraction des collemboles et des acariens des échantillons de sol .5
7.3 Tri, conservation et identification des collemboles et des acariens .6
7.3.1 Tri et conservation . . .6
7.3.2 Identification .6
8 Évaluation des résultats . 7
9 Rapport d’étude . 7
Annexe A (informative) Détermination des espèces de collemboles et d’acariens . 8
Annexe B (informative) Méthode alternative pour le prélèvement des micro-arthropodes. 9
Bibliographie . 10
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de tout
droit de propriété revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas reçu
notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois, il y a lieu
d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations plus récentes
sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse www.iso.org/patents.
L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de brevet.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 444, Méthodes d'essai pour
la caractérisation environnementale des matrices solides, du Comité européen de normalisation (CEN)
conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 23611-2:2006), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— une Note supplémentaire a été ajoutée au paragraphe 7.3.2.1 avec la description d’une méthode alternative
aux techniques classiques de préchauffage pour la préparation des spécimens destinés à l’identification
taxonomique des collemboles;
— la liste des références bibliographiques a été révisée et mise à jour.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 23611 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
Le présent document a été élaboré pour répondre à un besoin croissant de normalisation des méthodes
de prélèvement et d’extraction des micro-arthropodes du sol. Ces méthodes sont nécessaires pour les
applications suivantes:
— la classification biologique des sols, y compris l’évaluation de la qualité des sols (références [19], [24],
[27], [30], [36], [40], [41], par exemple);
— la bio-indication terrestre et la surveillance à long terme (références [3], [12], [14], [19], [31], [34], [37],
par exemple).
Les données obtenues à l’aide de méthodes normalisées permettent des évaluations plus précises et donc
une comparaison plus fiable entre différents sites (par exemple des sites pollués face à des sites non pollués,
modifications des pratiques d’exploitation du sol).
Parmi les différents groupes de micro-arthropodes, les collemboles et les acariens sont les groupes les plus
étudiés en écologie des sols. Leur pertinence par rapport au sol est due à leur grande abondance et diversité,
mais aussi au rôle qu’ils jouent dans les principaux processus biologiques. Les collemboles et les acariens
[6],[21]
oribates agissent essentiellement en tant que catalyseurs de la décomposition de la matière organique,
[21],[26]
alors que les acariens prédateurs peuvent jouer un rôle en bout de chaîne trophique du sol. Ces
caractéristiques, ajoutées à la bonne connaissance de leur taxinomie, ont favorisé leur utilisation en tant
qu’organismes d’étude au sein de plusieurs programmes de recherche traitant des impacts de l’exploitation
forestière (références [8], [16], [17], [18], [22], [23], [24], [28], [29], [32], [33], [35], [42], par exemple) ou des
pratiques de gestion des cultures (par exemple [2], [7], [10], [13], [20], [25], [43], [44].). Ces caractéristiques
en font des organismes utiles comme bio-indicateurs pour mesurer des changements dans la qualité du sol,
[38]
en particulier en raison des pratiques d’exploitation du sol et de la pollution .
En ce qui concerne les généralités de la conception de l’échantillonnage pour les études de terrain,
[45]
voir l’ISO 18400-104 afin d’obtenir des recommandations générales sur l’élaboration des stratégies
d’investigation des sites ainsi que des recommandations détaillées sur l’élaboration des stratégies
d’échantillonnage.
Les méthodes pour d’autres groupes d’organismes du sol, tels que les vers de terre, les enchytréides,
[52]
les nématopodes et les macro-invertébrés, sont respectivement traitées dans l’ISO 23611-1,
[53] [54] [55]
l’ISO 23611-3, l’ISO 23611-4 et l’ISO 23611-5 .
v
Norme internationale ISO 23611-2:2024(fr)
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol —
Partie 2:
Prélèvement et extraction des micro-arthropodes
(Collembola et Acarina)
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode pour le prélèvement, l’extraction et la conservation des
collemboles et des acariens du sol prélevés sur le terrain comme prérequis à l’utilisation de ces animaux en
tant que bio-indicateurs (par exemple pour évaluer la qualité d’un sol en tant qu’habitat pour les organismes).
Les méthodes de prélèvement et d’extraction du présent document s’appliquent à la quasi-totalité des sols.
Les sols présents sous des conditions climatiques extrêmes (sols durs, gelés ou inondés) et les matrices
autres que le sol, à l’instar des troncs d’arbres, des plantes ou des lichens, peuvent être considérés comme
des exceptions.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
micro-arthropode
groupe défini par sa petite taille (de 100 µm à quelques millimètres) constituant une partie importante du
réseau trophique sous-terrain dans un grand nombre d’écosystèmes terrestres
Note 1 à l'article: Ce groupe est principalement composé des acariens (Acarina), des collemboles (Collembola), des
Protura, des Diplura, des scolopendres des jardins (Symphyla), des Paurapoda, de petits scolopendres et mille-
pattes, de petits arachnides (araignées et pseudoscorpions), et d’insectes et de leurs larves issus de plusieurs ordres
(Hyménoptères, Diptères, Coléoptères, etc.).
4 Principe
Les échantillons de sol sont prélevés sur le terrain à l’aide d’un carottier. Les carottes de sol sont placées
dans des tubes (ou des sacs) en plastique, puis transportées vers le laboratoire. Ensuite, les collemboles et
les acariens sont rapidement extraits (en l’espace de quelques jours) à l’aide de méthodes comportementales,
[12],[34]
au moyen du dispositif de MacFadyen, et conservés à des fins d’identification ultérieure. De plus, les
techniques de préparation sont aussi décrites. Pour finir, les valeurs d’abondance peuvent être recalculées et
rapportées à une surface (généralement 1 m ), un volume ou une masse (généralement 1 kg).
NOTE D’autres méthodes d’extraction peuvent se révéler utiles dans des cas particuliers. Il est possible d’utiliser
les méthodes de flottation (par exemple la méthode de flottation dans l’heptane) dans le cas de sols argileux ou
[34]
limoneux et, lorsque les échantillons sont prélevés sur de la litière, un extracteur de Kempson (6.18) peut être
utilisé.
5 Matériaux d’essai
5.1 Matériel biologique
Les Collembola (collemboles) sont de petits hexapodes sans ailes (dont la longueur est comprise entre
150 µm et 9 mm), possédant une tête caractéristique avec une paire d’antennes, dépourvus de véritables
yeux composés, avec six segments abdominaux et trois appendices prégénitaux au niveau de l’abdomen. Le
premier segment présente un tube ventral (ou collophore) utilisé pour adhérer aux surfaces lisses. Le nom
de Collembola vient de sa structure (du grec colla = colle et embolon = barre). Le troisième segment présente
le tenaculum qui maintient l’appareil de saut dans sa position normale. Lorsqu’il est présent, l’appendice
sauteur, la furcula (ou ressort), se situe sur le quatrième segment. Les collemboles vivent dans la litière et
dans le sol et présentent des formes de vie très variées. Ils appartiennent à la classe Collembola et peuvent
[4]
être répartis en 33 familles .
Les acariens du sol sont de petits arthropodes Chélicérates apparentés aux araignées (longueur comprise
entre 150 µm et < 5 mm), vivant dans le sol et la litière et présentant des formes de vie très variées.
Ils appartiennent à la classe Arachnida, sous-classe Acarina, qui comprend quatre groupes distincts:
Cryptostigmates (Oribates), Mésostigmates (Gamasides), Prostigmates (Trombidiformes) et Astigmates.
NOTE Quelques indications sur la taxinomie des collemboles et des acariens sont données dans l’Annexe A.
5.2 Réactifs
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité reconnue et de l’eau distillée.
5.2.1 Propan-2-ol, à 80 % (fraction volumique).
5.2.2 Formol [solution de formaldéhyde à 40 % (fraction volumique)].
5.2.3 Acide acétique
5.2.4 Phénol, C H OH, cristallin (acide carbolique).
6 5
5.2.5 Acide chlorhydrique, c(HCl) de 8 mol/l à 10 mol/l.
5.2.6 2,2,2-Trichloro-1,1-éthanediol (hydrate de chloral).
5.2.7 1,2,3-Trihydroxypropane (glycérine).
5.2.8 Fixateur de von Törne, utilisé pour conserver les animaux extraits, composé de propan-2-ol (80 %),
de formol (40 %) et d’acide acétique glacial (fraction volumique 10:0,3:0,03).
5.2.9 Milieu d’éclaircissement de Nesbitt, utilisé pour éclaircir les spécimens d’acariens,
composé d’hydrate de chloral (80 g), d’eau distillée (50 ml) et d’acide chlorhydrique concentré (5 ml).
5.2.10 Solution de lactophénol, utilisée pour éclaircir les spécimens d’acariens, composée d’acide lactique
(10 ml), de cristaux de phénol (3,6 g) et d’eau distillée (5 ml).
5.2.11 Acide hydroxy-2-propanoïque (acide lactique), utilisé pour éclaircir et observer au microscope les
spécimens de micro-arthropodes, en particulier les acariens oribates.
5.2.12 Éthanol, de 70 % à 75 % (fraction volumique), utilisé pour la fixation et la conservation (dans ce
dernier cas, il est aussi combiné avec de la glycérine 10:1).
5.2.13 Milieu de Hoyer, utilisé pour monter des spécimens de collemboles, composé d’eau distillée (50 ml),
de gomme arabique (30 g), d’hydrate de chloral (200 g) et de glycérine (20 ml).
5.2.14 Tampon d’extraction d’ADN (solution tampon SNET), utilisé pour éclaircir les collemboles.
5.2.15 Solution de protéinase K, utilisée pour éclaircir les collemboles.
5.2.16 Éthanol à 35 % (fraction volumique), utilisé pour la conservation des spécimens.
5.2.17 Formol à 3 %, utilisé pour la conservation des spécimens.
5.2.18 Milieu Marc André 2, pour éclaircir et conférer les meilleures propriétés optiques aux spécimens à
des fins d’identification.
6 Appareillage
Utiliser du matériel courant de laboratoire ainsi que ce qui suit.
6.1 Mètre ruban
6.2 Flacons de collecte
6.3 Pissette
6.4 Pinces, pipette, pinceau fin, aiguilles fines
6.5 Boîtes de Petri
6.6 Microscope stéréoscopique
6.7 Microscope, à contraste de phase ou interférentiel de préférence.
6.8 Lames, creuses en leur centre, et lamelles pour microscope.
6.9 Plaque chauffante électrique
6.10 Flacons en plastique
6.11 Éléments chauffants en céramique
6.12 Crayon, carnet de notes, marqueur indélébile, étiquettes
6.13 Carottier
Dispositif de prélèvement en acier inoxydable ou en aluminium (il peut être de 40 cm de long et, par exemple,
de 5,6 cm de diamètre; il convient que la longueur et le diamètre ne s’écartent pas beaucoup de ces valeurs
afin de conserver des conditions comparables), utilisé pour recueillir des carottes de sol (échantillons).
Il peut être composé de deux parties indépendantes qui s’adaptent le long de l’axe principal du carottier
ou n’être constitué que d’un seul tube. Il est muni d’une poignée dans sa partie supérieure et d’un bord
tranchant dans sa partie inférieure.
6.14 Flacons en verre
6.15 Étuve de séchage
6.16 Dispositif de MacFadyen
Dispositif d’extraction (multiple) à gradient élevé utilisé pour extraire les micro-arthropodes des échantillons
de sol. Le principe consiste à créer un gradient de température artificiel entre le bidon qui contient
l’échantillon (chaud) et le dispositif de collecte situé en dessous (froid), ce qui induit un comportement de
thermotaxie négative (et aussi d’hygrotaxie positive, de phototaxie négative et de scototaxie positive) chez
les animaux qui, par voie de conséquence, quittent l’échantillon de sol.
6.17 Tubes en plastique, munis de bouchons (diamètre de 5 cm, longueur de 5 cm) ou sacs en
plastique, pour conserver les échantillons de sol.
6.18 Extracteur de Kempson, utilisé lorsque les échantillons concernent la litière.
6.19 Cadre de prélèvement, 25 cm × 25 cm × 15 cm, en acier inoxydable et présentant des bords
tranchants pour prélever les animaux de la couche de litière.
NOTE Pour plus d’informations sur le matériel cité en 6.13 et de 6.16 à 6.19, voir les références [12] et [34].
7 Mode opératoire
7.1 Collecte des échantillons de sol
Un échantillon de sol est prélevé à chaque point d’échantillonnage (défini au préalable selon les règles de
conception de l’échantillonnage), à l’aide d’un carottier (6.13); il est permis d’utiliser le même carottier dans
les sols inondés, mais il convient de se munir d’un embout pour retenir le sol après l’extraction.
NOTE En plus de la caractérisation générale du site, il est utile de déterminer l’humidité réelle du sol à
échantillonner.
Après extraction de l’échantillon, le carottier est ouvert (une photo du profil de la carotte de sol peut
compléter la caractérisation du site) et la carotte de sol est séparée en une couche de litière (y compris
l’horizon humique) et en une couche correspondant aux 10 cm supérieurs du sol minéral. En règle générale,
des couches de 5 cm sont utilisées pour la partie superficielle de l’horizon minéral, mais s’il est nécessaire
d’affiner l’analyse, il est possible de définir des couches plus minces. Il convient de noter la profondeur de
la couche de litière. Ensuite, chaque couche est conditionnée dans des tubes en plastique fermés par des
bouchons, étiquetés et stockés en vue de leur transport vers le laboratoire. Des sacs en plastique (6.17)
peuvent remplacer les tubes en plastique, mais des précautions particulières doivent être prises lors du
conditionnement afin d’éviter de perturber la structure de la carotte et de tasser le matériau de sol, ce qui
peut entraîner la mort des animaux. Il convient de noter le laps de temps écoulé entre le prélèvement et
l’extraction et il est recommandé que ce laps de temps ne dépasse pas 5 jours (si les échantillons restent
à (20 ± 2) °C et si le sol est maintenu humide), afin d’éviter des effets secondaires indésirables dus au
confinement et aux dérives des micro-populations.
Si le prélèvement des animaux se restreint à la couche de la litière, un cadre de prélèvement (6.19) est utilisé.
Le cadre est enfoncé dans la litière à la main. Immédiatement après, la litière se trouvant à l’intérieur du
cadre et les échantillons de litière sont placés dans des sacs en plastique (6.17), qui sont étiquetés puis
stockés.
Lors d’un prélèvement dans le sol, il convient d’établir les caractéristiques physico-chimiques du site.
Il convient en particulier de mesurer le pH, la répartition granulométrique, le rapport C/N, la teneur en
[46] [47] [48]
carbone organique et la capacité de rétention d’eau en utilisant l’ISO 10390, l’ISO 10694, l’ISO 11274,
[49] [50] [51]
l’ISO 11277, l’ISO 11461 et l’ISO 11465 .
7.2 Extraction des collemboles et des acariens des échantillons de sol
Au laboratoire, les animaux sont extraits au moyen de méthodes comportementales, par exemple à l’aide d’un
extracteur de MacFadyen (6.16). Chaque carotte d’échantillon est placée à l’envers dans un bidon dont le fond
comporte un filet en plastique ou en métal (taille de la maille: 2 mm). Celui-ci est raccordé à un entonnoir
fixé sur un flacon de collecte (6.2) contenant 25 ml de fixateur de von Törne (5.2.8).
Il est aussi permis d’utiliser une solution saturée d’acide picrique, une solution de 50 % d’éthylène glycol
(plus quelques gouttes de détergent) ou même de l’éthanol à 75 % (5.2.12) comme fixateur.
Un gradient de température est créé entre la partie supérieure (où sont placés les échantillons) et la partie
inférieure (où se trouvent les flacons de collecte) du système. La chaleur peut être produite par des éléments
chauffants en céramique (6.11) générant environ 10 W par échantillon. Les flacons de collecte sont immergés
dans un bain d’eau de refroidissement. Dans certains dispositifs du commerce, le gradient thermique est
obtenu en faisant circuler de l’air réchauffé dans la zone du bidon et de l’air refroidi dans la zone de collecte.
Il convient que la différence de température entre les parties supérieure et inférieure soit d’environ 30 °C
à 35 °C, la partie supérieure étant chauffée entre 45 °C et 50 °C et la partie inférieure étant refroidie
généralement à 10 °C. Des précautions doivent être prises pour éviter une augmentation brutale de la
température de la partie supérieure, ce qui peut entraîner un dessèchement rapide de l’échantillon et la
mort des animaux. Par conséquent, il convient d’augmenter progressivement la température de la partie
supérieure, en démarrant à 5 °C environ au-dessus de la température du terrain pendant les trois premiers
jours et en intensifiant le gradient pendant les six à sept jours suivants.
Le procédé d’extraction prend de 9 jours à 10 jours. Ensuite, les échantillons d’animaux sont étiquetés et
prêts à être stockés jusqu’au traitement (tri et identification). Il est recommandé de commencer l’extraction
le plus tôt possible (c’est-à-dire le jour du prélèvement). Si le stockage est nécessaire, il convient de conserver
les échantillons de sol à 4 °C.
NOTE 1 La méthode décrite n’est efficace que pour les stades de vie actifs, avec une efficacité d’extraction moyenne
[5],[33],[36]
de 75 % à 80 %. Les œufs, d’autres stades quiescents et les animaux inclus dans des débris végétaux ne
[39]
sont pas extraits par cette méthode. Il est aussi possible d’utiliser la méthode de flottation dans l’heptane (voir
Annexe B).
NOTE 2 La taille des bidons peut varier selon le type de dispositif. En général, des bidons de 200 cm (2,5 cm de
rayon et 10 cm de hauteur), en plastique ou en métal, sont utilisés. Cependant, certains dispositifs de MacFadyen du
commerce utilisent des bidons plus grands, d’environ 800 cm .
NOTE 3 Il est possible d’utiliser d’autres types de dispositifs reposant sur le même principe (par exemple, entonnoir
de Berlese-Tullgren) pour extraire les animaux.
NOTE 4 Il est possible d’obtenir des lames semi-permanentes en montant directement des spécimens fixés à
l’éthanol (5.2.12) dans un mélange de phénol (5.2.4), d’hydrate de chloral (5.2.6) et d’acide lactique (5.2.11), puis en
conservant la préparation à l’abri de la dessiccation au moyen de plusieurs couches de vernis à
...
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