ISO 17601:2016

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 17601
First edition
2016-01-15
Soil quality — Estimation of
abundance of selected microbial gene
sequences by quantitative PCR from
DNA directly extracted from soil
Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences de gènes
microbiens par amplification par réaction de polymérisation en
chaîne (PCR) quantitative à partir d’ADN directement extrait du sol
Reference number
©
ISO 2016
© ISO 2016, Published in Switzerland
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland
Tel. +41 22 749 01 11
Fax +41 22 749 09 47
copyright@iso.org
www.iso.org
ii © ISO 2016 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Test materials . 4
5.1 DNA . 4
5.2 Bacteria . 4
5.3 Plasmid . 4
5.4 Enzyme . 4
5.5 Chemicals . 4
5.6 Product for bacterial culture medium . 5
5.7 Buffer and reagents . 5
6 Apparatus . 6
7 Procedure. 6
7.1 qPCR standard preparation and calibration of qPCR assay (task 1) . 6
7.1.1 General. 6
7.1.2 Amplicon design (task 1, step 1) . 6
7.1.3 qPCR standard preparation (task 1, step 2) . 7
7.1.4 Isolate DNA, environmental DNA, artificial DNA . 7
7.1.5 Calibration of the qPCR (task 1, step 3) . 9
7.2 Preparation of soil DNA template and inhibition test (task 2) .10
7.2.1 General.10
7.2.2 Soil DNA preparation (task 2, step 4) .10
7.2.3 Inhibition test (task 2, step 5) .10
7.2.4 Dilution of DNA template .12
7.3 qPCR assay (task 3) .12
7.3.1 General.12
7.3.2 qPCR .12
7.4 Validation and analysis of qPCR assay (task 4) .12
7.4.1 General.12
7.4.2 Validation of the qPCR assay .12
7.4.3 Calculation of the copy number of the gene of interest in the soil DNA extract.13
8 Examination of the critical steps of the qPCR assay .14
9 Expression of the results of the qPCR assay .14
10 International ring test .14
11 Test report .14 ®
Annex A (informative) Description of principal steps of TaqMan qPCR assay .15
Annex B (informative) International ring-test for evaluating qPCR to quantify the
abundance of selected microbial gene sequences from DNA directly extracted from soil .17
Bibliography .30
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological methods.
iv © ISO 2016 – All rights reserved

Introduction
DNA (DNAs) is a major component of any living organisms coding for enzymes responsible for
their biological activities. The study of DNA sequences from DNA sources extracted from different
environmental matrices, by means of numerous molecular approaches, provides molecular markers that
can be used to sharply distinguish and identify different organisms (bacteria, archaea, and eucaryotes).
Up to now, most of the studies aiming to develop microbial quality indicators applicable to complex
environment such as soil were biased by the poor culturability of many microorganisms under
laboratory conditions and the lack of sensitivity of traditional microbiological methods. The recent
development of a large set of molecular biology methods based on amplification of soil-extracted
nucleic acids have provided a pertinent alternative to classical culture-based microbiological methods
[2]
providing unique insight into the composition, richness, and structure of microbial communities.
[3] [4] [5] [6]
DNA-based approaches are now well established in soil ecology and serve as genotypic
markers for determining microbial diversity. The results of molecular analyzes of soil microbial
communities and/or populations rely on two main parameters: a) the extraction of DNA representative
of the indigenous bacterial community composition and b) PCR bias such as the choice of primers, the
[7] [4] [8] [9]
concentration of amplified DNA, errors in the PCR, or even the method chosen for analysis.
Numerous studies have investigated new methods to improve extraction, purification, amplification,
[10]
and quantification of DNA from soils. Recently, ISO 11063 reporting “a method to extract nucleic
acids directly from soil samples“ derived from Reference [10] is opening a new window for developing
[11]
standardized molecular approaches to estimate soil quality.
The aim of this International Standard is to describe the procedure used to set up and perform
quantitative PCR to quantify the abundance of soil microbial phyla, as well as functional groups from
DNA directly extracted from soil samples. The quantification of soil microbial phyla, as well as functional
groups by qPCR assays can contribute to the development of routine tools to monitor soil quality.
The repeatability and the reproducibility of the procedure of the quantitative PCR were assessed in
an international ring test study (see Annex B). The repeatability of this procedure was successfully
evaluated for both 16S rRNA genes, as well as genes coding a functional marker of denitrifiers (the
nitrite reductase gene nirK). The reproducibility of this procedure revealed a laboratory effect which
can be overcome by interpreting the results of the quantification of the abundance of the microbial
groups by comparison, either by using an external reference (DNA extracted from a control strain) in
the assay or by calculating a percentage of variations between treatments to normalize the data.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 17601:2016(E)
Soil quality — Estimation of abundance of selected
microbial gene sequences by quantitative PCR from DNA
directly extracted from soil
1 Scope
This International Standard specifies the crucial steps of a quantitative real-time polymerase chain
reaction (qPCR) method to measure the abundance of selected microbial gene sequences from soil DNA
extract which provides an estimation of selected microbial groups.
It is noteworthy that the number of genes is not necessarily directly linked to the number of organisms
that are measured. For example, the number of ribosomal operon is ranging from one copy to 20 copies
in different bacterial phyla. Therefore, the number of 16S rRNA sequences quantified from soil DNA
extracts does not give an exact estimate of the number of soil bacteria. Furthermore, the number of
sequences is not necessarily linked to living microorganisms and can comprise sequences amplified
from dead microorganisms.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under
aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
ISO 11063, Soil quality — Method to directly extract DNA from soil samples
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
soil DNA
DNA extracted from soil of living and dead biota
EXAMPLE Microorganisms, plants, animals.
3.2
polymerase chain reaction
PCR
method allowing the amplification of a specific DNA sequence using a specific pair of oligonucleotide
primers
3.3
quantitative polymerase chain reaction
qPCR
method allowing the quantification in a DNA template (3.4) of the number of a specific DNA sequence
using a specific pair of oligonucleotide primers
3.4
template
DNA sample used to perform PCR (3.2) to amplify a specific DNA sequence
3.5
amplicon
PCR product obtained by PCR (3.2) from a template (3.4)
3.6
cloning vector
circular DNA molecule in which the amplicon (3.5) is inserted by ligation used to transform competent
Escherichia coli for cloning the amplicon
3.7
qPCR standard
cloned DNA target used as template (3.4) for qPCR reaction to establish the standard curve relating the
abundance of target sequence as a function of cycle threshold values (Ct)
3.8
non-template control
NTC
control, usually molecular grade water, that is used as negative control in qPCR assay to check for the
absence of contaminant in the qPCR mix
3.9
cycle threshold
Ct
number of qPCR cycles required for the fluorescent signal to cross the threshold (i.e. exceeds
background level)
Note 1 to entry: The Ct value is inversely proportional to the abundance of the target sequence.
4 Principle
This International Standard describes qPCR assay using fluorescent DNA binding dye as reporter.
This qPCR assay has been validated by an international ring test conducted with the SYBR Green, a
commonly used fluorescent DNA binding dye which binds all double–stranded DNA and can be detected
by measuring the increase in fluorescence throughout the cycle.
The method aims to measure the abundance of selected microbial gene sequences from soil DNA
extract. The method comprises four tasks and eight steps as summarized in Figure 1. According to
Reference [1], the three critical steps to be validated for each qPCR assay are as shown in Figure 1.
2 © ISO 2016 – All rights reserved

Validation
Validation
Figure 1 — Main tasks and critical steps to estimate the abundance of selected microbial gene
sequences by qPCR assay
This International Standard describes qPCR assay based on the use of fluorescent DNA binding dye
®1)
which has been validated by an international ring test using SYBR Green qPCR. In Annex A,

1) SYBR Green is a registered trademark of Molecular Probes. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products
may be used if they can be shown to lead to the same results.
2) ®
information about TaqMan qPCR assay not tested in the international ring test are given. The
first task is made of three steps describing the design of optimal amplicon for qPCR (step one), the
preparation of qPCR standards (step two), and the procedure to calibrate the qPCR assay (step three).
The second task includes two additional steps describing the procedures to prepare soil DNA samples
(step four) and to test for the presence of qPCR inhibitors in soil DNA samples (step five). The third
task is constituted of a single step describing the protocol to perform qPCR assay (step six). Finally, the
fourth task is made of two steps, one describing the procedure to validate qPCR assays (step 7) to check
the quality of qPCR assay and another one describing the different options to calculate the number of
sequences of the gene of interest copy from cycle threshold (Ct) obtained from the analysis of qPCR
amplification plots (step 8).
5 Test materials
5.1 DNA
5.1.1 DNA, extracted from pure bacterial and fungal isolates using classical extraction procedures or
by using commercial kit to extract genomic DNA.
5.1.2 Soil DNA, extracted from aliquots of soil according to ISO 11063.
5.2 Bacteria
5.2.1 Escherichia coli strain, usually used for cloning of PCR product.
5.3 Plasmid
5.3.1 Cloning vector, usually used for cloning of PCR product in competent Escherichia coli.
5.4 Enzyme
5.4.1 Taq polymerase.
5.4.2 T4 DNA ligase.
5.4.3 T4 gene T32.
5.4.4 Bovine serum albumin (CAS No. 9048-46-8).
5.5 Chemicals
5.5.1 Ampicilline sodium, C H N NaO S (CAS No. 69-52-3).
16 18 3 4
5.5.2 Boric acid, BH O (CAS No. 10043-35-3).
3 3
5.5.3 Deoxynucleotide solution, dNTPs. ®
5.5.4 SYBR Safe DNA gel stain.

2) TaqMan is a trademark of Roche Molecular Systems, Inc. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products
may be used if they can be shown to lead to the same results.
4 © ISO 2016 – All rights reserved

5.5.5 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA), C H N O Na·2 H O
10 14 2 8 2 2
(CAS No. 6381-92 6).
5.5.6 Glucose, C H O (CAS No. 50-99-7).
6 12 6
5.5.7 Chlorhydric acid, HCl (CAS No. 7647-01-0).
5.5.8 IPTG, Isopropyl-Beta-D-Thiogalactopyranoside, (CAS No. 367-93-1).
5.5.9 Magnesium chloride, MgCl (CAS No. 7786-30-3).
5.5.10 Magnesium sulfate, MgSO (CAS No. 7487-88-9).
5.5.11 Molecular-biology-grade water, H O.
5.5.12 Potassium chloride, KCl (CAS No. 7447-40-7).
5.5.13 Sodium chloride, NaCl (CAS No. 7647-14-5).
5.5.14 Tris[hydroxymethyl]aminomethane, C H NO (CAS No. 77-86-1).
4 11 3
5.5.15 X-Gal, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside, (CAS No. 7240-90-6).
5.6 Product for bacterial culture medium
®3)
5.6.1 Bacto tryptone , enzymatic digest of casein.
5.6.2 Yeast extract powder (CAS No. 8013-01-2).
5.7 Buffer and reagents
5.7.1 Ampicilline solution, 2 g of ampicilline sodium in 4 ml of 0,22 µm filter sterilized H O. Adjust to
20 ml with sterilized H O, prepare 1 ml aliquots, and store at -20 °C.
-1 -1
5.7.2 EDTA, 0,5 mol·l , 186,10 g of EDTA in 1 000 ml of H O adjusting with NaOH (10 mol·l ) to pH 8,0.
5.7.3 SYBR Safe™ DNA gel stain, dilute 10,000X SYBR Safe™ gel stain in TBE buffer × 1.
5.7.4 IPTG stock solution, 1 g of IPTG in 8 ml of H O. After careful mixing, the solution is adjusted to
10 ml and sterilized under security microbiology post. Prepare 1 ml aliquot of IPTG and store at -20 °C. ®
5.7.5 Solid LB medium, 10 g of Bacto tryptone , 5 g of yeast extract, 5 g of sodium chloride, and 15 g
of agar in 1 000 ml of H O. After autoclaving for 20 min at 120 °C, 1 ml of ampicilline stock solution at
-1
100 mg·ml is added to LB medium and plated in Petri dishes (20 ml) under a security microbiology
post. 100 µl of IPTG solution are plated on solid LB-ampicilline medium. When IPTG solution is entered
in LB-ampicilline medium, 20 µl of X-Gal solution is plated on solid LB-ampicilline medium. Solid LB
medium is stored at 4 °C until its use.

3) Bacto tryptone is the trademark of a product supplied by Difco Laboratories. This information is given for
the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named.
Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results. ®
5.7.6 SOC medium, 20 g of Bacto tryptone , 5 g of yeast extract, 0,58 g of NaCl, 0,95 g of MgCl , 2,46 g
of MgSO , and 3,60 g of glucose in 1 l H O. Sterilize by 20 min autoclaving at 120 °C. Prepare 950 ml
4 2
aliquots and store at -20 °C.
-1 -1
5.7.7 Tris-HCl, 1 mol·l , 121,14 g of Tris in 1 000 ml of H O adjusting with 4 mol·l HCl to pH 8,0.
-1
TBE buffer × 10, pH 8,0, 108 g of Tris base, 55 g of boric acid, and 40 ml of 0,5 mol·l EDTA (pH 8,0) in
1 000 ml of H O.
5.7.8 TBE buffer × 1, 100 ml of TBE buffer × 10 in 900 ml of H O.
-1 -1
5.7.9 TE buffer × 10, pH 8,0, 100 ml of 1 mol·l Tris-HCl pH 8,0, 20 ml of 50 mmol·l EDTA pH 8,0 in
880 ml of molecular grade water.
5.7.10 TE buffer × 1, 100 ml of TE buffer × 10 in 900 ml of H O.
5.7.11 X-gal solution, 250 mg of X-Gal in 5 ml of dimethylformamide 5 ml. After careful mixing, prepare
0,5 ml aliquot and store at -20 °C.
6 Apparatus
Use standard laboratory equipment including pipettes, a centrifuge, fume hood cabinet, horizontal
electrophoresis system and the following.
6.1 Quantitative PCR, allowing the real-time quantification of amplicons from various DNA templates
with a theoretical detection limit of one copy of a sequence target per sample analyzed.
6.2 Spectro-photometer, allowing the quantification of double-strand DNA at 260 nm.
6.3 Spectro-fluorimeter, allowing the quantification of double-strand DNA.
NOTE Only one of these two apparatus is required to estimate DNA concentration.
7 Procedure
7.1 qPCR standard preparation and calibration of qPCR assay (task 1)
7.1.1 General
qPCR assay is based on the quantification of the amplicons at the end of each PCR cycle by using a DNA
dye which fluoresces when intercalated in the double strand amplicons. The purpose of this task is to
describe the definition of appropriate amplicon to settle down a qPCR assay (step one), the preparation
of qPCR standard (step two), and the calibration of the qPCR assay (step three).
7.1.2 Amplicon design (task 1, step 1)
7.1.2.1 General
The first step aims at designing oligonucleotide primer pair; it can be designed in silico using different
programs using the sequence of the microbial gene of interest to be quantified by qPCR from soil
DNA extracts. The specificity of the primers shall be checked in silico by comparing their sequences
to known sequences available in the Genbank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
Only primers specific for the gene target shall be considered. The main parameters to be considered to
design oligonucleotide primer pair for establishing qPCR assay are listed thereafter.
6 © ISO 2016 – All rights reserved

7.1.2.2 qPCR
— Optimal amplicon length ranges between 100 bp to 250 bp.
— Optimal primer length ranges between 18 bp and 25 bp with a GC content of 50 % and melting
temperature between 58 °C and 65 °C.
— The five nucleotides at the 3” end of each primer should have no more than two G and/or C bases.
— Avoid succession of identical nucleotide, especially true for guanine.
— 3” self-complementarity of the primer taken as a measure of its tendency to form a primer-dimer
with itself should be checked and avoided.
— Avoid design of primers with more than four mismatches because too high degeneracy of the primer
contributes to fluctuation of qPCR results.
7.1.3 qPCR standard preparation (task 1, step 2)
Step 2 of task 1 describes the procedure used to generate qPCR standards targeting a sequence of the
microbial gene of interest from different DNA templates (pure bacterial or fungal isolate, environmental
DNA, or artificial DNA). It also reports the procedure used to insert the qPCR standard in a cloning
vector, transform Escherichia coli, and purify recombinant plasmids harboring qPCR standard for
further use for qPCR assays.
7.1.4 Isolate DNA, environmental DNA, artificial DNA
7.1.4.1 General
The first step of qPCR standard preparation relies on the extraction of DNA templates known to harbour
the microbial gene of interest. This can be done starting from different materials such as the following:
a) pure cultures of microorganisms;
DNA is extracted from cells harvested from a fresh culture of microorganisms by using conventional
genomic DNA extraction protocols.
b) artificial DNA.
If no biological samples are available or known to harbour the gene of interest, artificial DNA made of
the sequence of the gene of interest can be synthesized.
In all cases, the quality of DNA template used for amplifying the qPCR standard by PCR shall be verified
by electrophoresis on 1 % agarose gel in TBE buffer stained with appropriate staining (e.g. SYBR Safe™
staining). The concentration of DNA is measured by spectro-photometry at 260 nm. DNA template is
-1
diluted to 10 ng·µl in a final volume of 20 µl and stored at -20 °C.
The qPCR standard sequence is amplified by PCR using a specific primer pair designed according to
recommendations described in task 1 of block 1. The amplification reaction is carried out in a final
-1 -1
25 µl volume containing 2,5 µl of 10 × Taq polymerase buffer, 200 µmol·l of each dNTP, 1,5 mmol·l
-1
of MgCl , 0,5 µmol·l of each primer and 0,625 U of Taq polymerase. A volume of 2,5 µl of DNA (e.g.
25 ng of DNA) is used as template for the PCR reactions. PCR is performed in a thermocycler according
to the following program: one cycle of 4 min at 94 °C; 39 cycles of 1 min at 94 °C, 1 min at annealing
temperature specific for the qPCR standard amplicon, 1,5 min at 72 °C, and a final extension step at
72 °C for 5 min. The expected size of the qPCR standard amplicon is verified by electrophoresis on 2 %
agarose gel in TBE buffer stained with appropriate staining (e.g. SYBR Safe™ staining). Amplicons are
purified either from the gel using appropriate methods or by using exclusion chromatography columns
to remove primers. Purified amplicons are then quantified by spectro-photometry at 260 nm or by
spectrofluorimetry.
7.1.4.2 Cloning, dilution preparation of qPCR standard
7.1.4.2.1 Ligation of amplicon of qPCR standard
For an optimal ligation of an amplicon into a cloning vector should a 3:1 molar ratio the mass of PCR
product (Q in ng of DNA) to be used for ligation can be calculated (see Formula 1):
mn
plasmid DNAi× nsert
Q=×3 (1)
n
plasmid
Q = [(amount of plasmid DNA × size of the insert (bp)/size of the plasmid (bp)] × (3/1)
where
Q is the mass of PCR product, in nanograms (ng);
m is the mass of plasmid DNA, in nanograms (ng);
plasmid
DNA
n is the size of the insert, in bp;
insert
n is the size of the plasmid, in bp;
plasmid
Taking into account that a plasmid size of 3 000 bp, a 16S rRNA insert of 200 bp, and 50 ng of plasmid
DNA per ligation reaction the amount of PCR amplicon to be used per ligation (see Formula 2) is:
50×200
Q= ×=310 (2)
The ligation reaction is made of the required amount of qPCR standard purified amplicon (Q), 50 ng of
plasmid DNA, 5 µl of 2 × ligation buffer, 3 U of T4 DNA ligase, and molecular grade water to reach a final
volume of 10 µl. The ligation reaction is incubated overnight at 4 °C or for adequate T4 DNA ligase, one
hour at ambient temperature.
The efficiency of the ligation is verified by electrophoresis by loading 1 µl ligated plasmid and open
plasmid (i.e. 5 ng of plasmid) on 1 % agarose gel in TBE buffer stained with appropriate staining.
Ligated plasmid is characterized by a shorter migration in the agarose gel.
7.1.4.2.2 Transformation of competent Escherichia coli
8 -1
Competent E. coli are transformed by heat shock as described below. Competent cells (10 cfu·µg of
DNA) freshly thawed out are incubated for 5 min on ice. Then 1 µl of the ligation reaction is added
to cells, smoothly mixed, and incubated for 20 min on ice. Bacterial cells are heat shock treated for
50 s incubation at 42 °C and immediately placed on ice and incubated for 2 min. Then 950 µl of SOC
-1
medium are added and the bacterial cells are incubated at 37 °C under agitation at 150 min for 1 h.
100 µl bacterial cells aliquots are plated onto LB/Amp/IPTG/X-Gal solid medium. Petri dishes are then
incubated at 37 °C overnight.
7.1.4.2.3 Screening for recombinant clone
Plates are placed at 4 °C for several hours to accentuate coloration of bacterial colonies. White colonies
are picked, plated onto LB/Amp/IPTG/X-Gal solid medium, and incubated overnight at 37 °C. Several
white colonies were picked and put in 100 µl molecular grade water. PCR is carried out to confirm the
presence of the insert in the recombinant clone. The insert is amplified by PCR using SP6 (5’-ATT TAG
GTG ACA CTA TAG −3’) and T7 (5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG −3’) primers. The amplification reaction
-1
is carried out in a final 25 µl volume containing 2,5 µl of 10 × Taq polymerase buffer, 200 µmol·l of each
-1 -1
dNTP, 1,5 mmol·l of MgCl , 0,5 µmol·l of each primer and 0,625 U of Taq polymerase. A volume of 2,5 µl
of bacterial suspension is used as template for the PCR reactions. PCR is performed in a thermocycler
according to the following program: one cycle of 4 min at 94 °C, 35 cycles of 45 s at 94 °C, 45 s at 55 °C,
8 © ISO 2016 – All rights reserved

1,5 min at 72 °C, and a final extension step at 72 °C for 5 min. The size of the expected qPCR amplicon is
verified by electrophoresis on 2 % agarose gel in TBE buffer stained with appropriate staining.
7.1.4.2.4 Purification and linearization of recombinant plasmid
Recombinant clones, white in colour confirmed by PCR are inoculated to 10 ml LB/Amp liquid medium
-1
incubated at 37 °C under agitation (150 min ) overnight. Plasmid is purified from 2 ml cell suspension
using conventional mini-preparation. Plasmid DNA is then quantified by spectro-photometry at 260 nm
and aliquots are prepared and stored at −20 °C until use.
Plasmid is linearized with a restriction enzyme presenting a single restriction site in the sequence of
the plasmid. User shall make sure that the chosen restriction enzyme is not also cutting the insert.
Digestion of the plasmid is performed overnight at 37 °C in a final volume of 10 µl containing 250 ng of
recombinant plasmid, 0,5 U of restriction enzyme, 1 µl of 10 × restriction enzyme buffer, and molecular
grade water. The efficiency of the restriction of the plasmid is verified by electrophoresis on 1 % agarose
gel. Linearized plasmid is stored at -20 °C and is used as stock solution to prepare serial dilution of
qPCR standard used to calibrate qPCR assay.
The concentration in DNA of linearized plasmid is measured by spectrophotometry at 260 nm or by
spectrofluorimetry in order to determine the plasmid copies number. This operation can be facilitated
by using an online calculator such as oligo calc (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.
html). From this stock solution, an initial solution containing 0,5 × 10 copies of the qPCR standard
per µl is prepared in 100 µl of molecular grade water. Tenfold serial dilutions are then prepared to
reach 0,5 × 10 copies of the plasmid per µl. Additional intermediary dilutions can also be prepared
depending on the range where copy numbers are expected.
7.1.5 Calibration of the qPCR (task 1, step 3)
7.1.5.1 General
The procedure used to generate the calibration curve and evaluate the efficiency of the qPCR assay is
described thereafter.
7.1.5.2 qPCR assay
8 1
qPCR calibration assay is performed on serial dilution of the cloned standard (ranging from 10 to 10
copies per µl) using a primer pair specifically targeting the gene of interest. The amplification reaction
-1
is carried out in a final 15 µl volume containing 2 µl of plasmid standard, 1 µmol·l of each primer,
7,5 µl of 2 × Taq master mix or 1,5 µl of 10 × Taq master mix containing a fluorescent DNA binding dye,
dNTPs, MgCl , and Taq polymerase and molecular grade water. qPCR reaction is performed in a real-
time thermocycler according to the following program: one cycle of 15 min at 95 °C, 35 cycles of 30 s
at 95 °C, 30 s at annealing temperature, 30 s at 72 °C, 30 s at 80 °C where the fluorescence is collected,
and a final dissociation stage by increasing the temperature from 80 °C to 95 °C. qPCR calibration is
performed in triplicate and three NTC are also included.
7.1.5.3 Establishment of the calibration curve and calculation of qPCR efficiency
At the end of qPCR assay, results are analyzed using the automatic option. Validation of the qPCR required
the observation of: a) no amplification for NTC, b) a single dissociation peak for each dilution of qPCR
standard, and c) a linear calibration curve with r equal or superior to 98 %. qPCR calibration curve is
giving the number of Ct as a function of the amount of the log of the number of copy of standard sequences.
The efficiency of the qPCR assay is estimated as given in Formula 3 from values determined from the
calibration curve formula.
Ct =⋅aq+c (3)
where
Ct is measured cycle threshold;
q is the copy number of qPCR standard;
a slope of the calibration curve;
c ordinate at the origin (Ct for 1 copy of qPCR standard).
()−1 a
E =−10 1 (4)
where
E is the efficiency of the calibration assay;
a slope of the calibration curve.
It shall be noticed that calibration curve having a slope equal to −3,32 is 100 % efficient. A twofold- or a
10-fold-dilution of a given DNA template gives a Ct difference of 1 or of 3,3 respectively (i.e. 10 Ct = 10
and 10 Ct = 13,3) for qPCR assay efficient at 100 %.
7.2 Preparation of soil DNA template and inhibition test (task 2)
7.2.1 General
This task describes the procedure used to prepare DNA template and to check for the presence
of Taq polymerase inhibitors in DNA extracts used as template for qPCR assay. This test is an
obligatory prerequisite to validate the quality of DNA extracts and allow their use as template for
conducting qPCR assays.
7.2.2 Soil DNA preparation (task 2, step 4)
Step 4 of task 2 describes the procedure used to extract DNA from soil samples. Soil samples shall be
collected, handled, and stored according to ISO 10381-6. Soil DNA extraction shall be done according to
-1 -1
ISO 11063. Soil DNA samples are diluted to 1 ng·µl and 0,1 ng·µl and stored at −20 °C until their use.
7.2.3 Inhibition test (task 2, step 5)
The procedure used to test for the presence of Taq polymerase inhibitors in soil DNA extracts is
described thereafter. This step is prerequisite that shall be done prior to perform qPCR assay from soil
DNA extracts. Indeed, Taq polymerase inhibitors such as humic acid substances often co-extracted with
soil DNA and only soil DNA extract free of inhibitors can be subjected to qPCR analysis to estimate the
abundance of selected microbial gene sequences in soil. Two inhibition tests are described thereafter.
7.2.3.1 Spiking of exogenic DNA in soil DNA extract
Search for inhibitors can be done by quantifying the abundance of exogenic DNA spiked in known
amount to soil DNA. The protocol proposed below describes the analysis done after spiking plasmid
DNA to soil DNA extract. This procedure can be adapted to any exogenic DNA sources by performing
the qPCR with appropriate primer pair specific for the sequence of spiked DNA.
10 © ISO 2016 – All rights reserved

qPCR is performed using SP6 and T7 primers specific from the plasmid. The amplification reaction is
carried out in a final 15 µl volume containing 2 µl of plasmid DNA, 2 µl of soil DNA (using the two dilutions
-1 -1
1 and 0,1 ng·µl ), 1,0 µmol·l of each primer, 7,5 µl of 2 × Taq master mix or 1,5 µl of 10 × Taq master mix
containing fluorescent DNA binding dye dNTPs, MgCl , and Taq polymerase and molecular grade water.
qPCR reaction is performed in a real-time thermocycler according to the following program: one cycle
of 15 min at 95 °C; 30 cycles of 15 s at 95 °C, 30 s at 55 °C, and 30 s at 72 °C. SP6-T7 qPCR inhibition test
is performed for each dilution of soil DNA extract to be tested, three positive controls containing only
plasmid DNA and three NTC.
The inhibition test is validated by observing the following:
a) no amplicon in NTC control;
b) similar Ct values in qPCR performed from soil DNA extract and plasmid DNA (Figure 2).
Soil DNA dilution showing no inhibition is chosen as template to perform qPCR assay.
Key
X ΔRn
Y cycle
1 pGEM-T
2 partial inhibition
3 inhibition
Figure 2 — Results of inhibition test carried out by qPCR assay targeting SP6-T7 region of
pGEM-T plasmid spiked in known amount to soil DNA extracts
If a full or partial inhibition is observed (i.e. no amplicon or drift in Ct value, respectively), soil DNA
extract shall be diluted to remove the inhibition and submitted again to a new inhibition test. If this
does not yield in the improvement of the qPCR inhibition test, then the DNA extracts shall be further
purified as recommended in ISO 11063 and submitted again to the inhibition test. When acceptable
results are obtained for the inhibition test, soil DNA samples can be used to run qPCR assay.
It shall be noticed that qPCR assay performed from soil DNA extract can be improved by using
carriers that favour the activity of Taq polymerase. Among most popular serum albumin bovine used
-1
at 400 ng·µl of qPCR, reaction is proved to eradicate inhibition. Alternatively, T4 gene 32 protein at
-1
30 ng·µl of qPCR reaction is giving similar results.
7.2.4 Dilution of DNA template
Alternatively, the presence of Taq polymerase inhibitors in soil DNA extract can be searched by
performing qPCR assay targeting the gene of interest using as template 10 times dilution of soil DNA
-1 -1 -1
extracts (10 ng·µl , 1 ng·µl , 0,1 ng·µl ). The qPCR assay is performed following the procedure
described above. qPCR inhibition test is performed for each dilution of soil DNA extract to be tested
including three positive controls containing only standard DNA and three NTC. The inhibition test is
validated by observing the following:
a) no amplicon in NTC control;
b) amplification in positive control;
c) for each sample test, Ct values difference of 3,32 between 10 times dilution.
Soil DNA extracts showing inhibition shall be treated as suggested in 7.2.1.
7.3 qPCR assay (task 3)
7.3.1 General
Step 6 of task 3 describes the procedure to quantify the abundance of a microbial gene (called thereafter
gene of interest) from soil DNA extract. qPCR reactions are performed using as template a) the dilution
of soil DNA extract chosen in step 5, task 2 (inhibition step), b) duplicate each dilution of the calibration
8 8
curve (from 0,5 × 10 to 0,5 × 10 copies of standard DNA per µl), and c) three non-template controls
made of molecular grade water only.
7.3.2 qPCR
qPCR assay targeting the gene of interest is performed on duplicate of each soil DNA templates at
the dilution showing no inhibition of Taq polymerase on duplicate of each plasmid standard dilution
8 1
(ranging from 10 to 10 copies per µl) and on triplicate of NTC. Primer pair specific for gene of
interest are used. The amplification reaction is carried out in a final 15 µl volume containing 2 µl of
-1
DNA template, 1 µmol·l of each primer, 7,5 µl of 2 × Taq master mix or 1,5 µl of 10 × Taq master mix
containing fluorescent DNA binding dye dNTPs, MgCl , and Taq polymerase and molecular grade water.
qPCR reaction is performed in a real-time thermocycler according to the following program: one cycle
of 15 min at 95 °C, 35 cycles of 30 s at 95 °C, 30 s at appropriate annealing temperature, 30 s at 72 °C,
and 30 s at 80 °C where the fluorescence is collected and a final dissociation stage by increasing the
temperature from 80 °C to 95 °C.
7.4 Validation and analysis of qPCR assay (task 4)
7.4.1 General
Step 7 of task 4 describes the procedure used for checking the validity of the qPCR assays and processing
qPCR crude results. Step 8 of task 4 proposes two modes of calculation to estimate the abundance of the
gene of interest expressed either as sequence copy number per ng of soil DNA or per g of soil.
7.4.2 Validation of the qPCR assay
7.4.2.1 General
At the end of the qPCR reaction, results are analyzed using the automatic option. The parameters to be
considered to validate the qPCR assay are detailed thereafter.
12 © ISO 2016 – All rights reserved

7.4.2.2 qPCR assay
Validation of the qPCR requires the observation of the following:
a) no amplification for NTC;
b) a linear calibration curve with r equal or superior to 98 %;
c) a dissociation curve showing a single peak at the expected melting temperature specific for each
gene target attesting for the specificity of the amplification.
It is noteworthy that if degenerated primer pair is used, divergent sequences are amplified from soil
DNA extract and as a result, dissociation curve cannot form a single sharp peak as observed for
...

PROJET DE NORME INTERNATIONALE
ISO/DIS 17601
ISO/TC 190/SC 4 Secrétariat: AFNOR
Début de vote: Vote clos le:
2013-09-26 2013-12-26
Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences
de gènes microbiens par amplification par réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) quantitative en temps réel
à partir d’ADN directement extrait du sol
Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene sequences by quantitative realtime PCR
from DNA directly extracted from soil
ICS: 13.080.30
CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR
OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC
SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE PEUT
ÊTRE CITÉ COMME NORME INTERNATIONALE
AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES
FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET
COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR
POSSIBILITÉ DE DEVENIR DES NORMES
POUVANT SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA
RÉGLEMENTATION NATIONALE.
Numéro de référence
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET
ISO/DIS 17601:2013(F)
SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS
OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS
DE PROPRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT
ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À
©
FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE. ISO 2013

ISO/DIS 17601:2013(F)
Notice de droit d’auteur
Ce document de l’ISO est un projet de Norme internationale qui est protégé par les droits d’auteur
de l’ISO. Sauf autorisé par les lois en matière de droits d’auteur du pays utilisateur, aucune partie de
ce projet ISO ne peut être reproduite, enregistrée dans un système d’extraction ou transmise sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie,
les enregistrements ou autres, sans autorisation écrite préalable.
Les demandes d’autorisation de reproduction doivent être envoyées à l’ISO à l’adresse ci-après ou au
comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Toute reproduction est soumise au paiement de droits ou à un contrat de licence.
Les contrevenants pourront être poursuivis.
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés

ISO/DIS 17601
Sommaire Page
Avant-propos . 4
Introduction . 5
1  Domaine d'application . 1
2  Références normatives . 1
3  Termes et définitions . 1
4  Principe . 2
5  Matériel d’essai . 3
5.1  ADN . 3
5.2  Bactéries . 3
5.3  Plasmide
5.4  Enzymes et protéines . 3
5.5  Produits chimiques . 3
5.6  Produit pour le milieu de culture bactérienne . 4
5.7  Tampon et réactifs . 4
6  Appareillage . 5
7  Mode opératoire . 6
7.1  Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l'analyse par qPCR (tâche 1) . 6
7.2  Préparation d'une matrice d'ADN du sol et essai d'inhibition (tâche 2) . 12
7.3  Analyse par qPCR (tâche 3) . 14
7.4  Validation et examen de l'analyse par qPCR (tâche 4) . 15
8  Validation de l'analyse par qPCR . 16
9  Expression des résultats de l'analyse par qPCR . 16
10  Rapport d'essai . 17
Annexe A (informative) Étude interlaboratoires internationale relative à l'évaluation de la
quantification de l'abondance de groupes microbiens par qPCR . 18
Annexe B (informative) Analyse basée sur un essai qPCR SYBR Green . 19
B.1  Préparation de l'étalon de qPCR SYBR Green et étalonnage de l'analyse par qPCR SYBR
Green16) . 19
B.2  Préparation d'une matrice d'ADN du sol et essai d'inhibition . 19
B.3  Analyse par qPCR SYBR Green . 19
B.4  Validation et examen de l'analyse par qPCR SYBR Green . 19
Annexe C (informative) Analyse basée sur un essai qPCR TaqMan . 20
C.1  Préparation de l'étalon de qPCR TaqMan et étalonnage de l'analyse par qPCR TaqMan . 20
C.2  Préparation d'une matrice d'ADN du sol et essai d'inhibition . 20
C.3  Analyse par qPCR TaqMan . 20
C.4  Validation et examen de l'analyse par qPCR TaqMan . 20
Bibliographie . 21

iii © ISO 2013 – Tous droits réservés

ISO/DIS 17601
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 17601 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4, Méthodes
biologiques.
ISO/DIS 17601
Introduction
L'ADN (acide désoxyribonucléique) est un constituant majeur de tout organisme vivant codant pour les
enzymes responsables de ses activités biologiques. L’étude des séquences d’ADN extrait de différentes
matrices environnementales, à l’aide d’approches moléculaires, permet de fournir des marqueurs
moléculaires qui peuvent être utilisés pour différencier et identifier clairement différents micro-organismes
(bactéries, archées et eucaryotes).
Jusqu’à présent, la plupart des études visant à développer des indicateurs microbiens de la qualité du sol et
applicables aux milieux complexes, tels que le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de nombreux
micro-organismes et par le manque de sensibilité des méthodes microbiologiques classiques [1]. Le
développement récent de nombreuses méthodes de biologie moléculaire reposant principalement sur
l'amplification des acides nucléiques extraits du sol a permis de proposer une alternative pertinente à la
microbiologie pasteurienne permettant de connaître en détail la composition, la richesse et la structure des
communautés microbiennes [2], [3], [4], [5], [6]. Les approches reposant sur l’extraction de l’ADN à partir
d’échantillons environnementaux sont désormais bien établies dans le domaine de l’écologie des sols et
servent de marqueurs génétiques permettant d’évaluer la diversité microbienne. Les résultats d’analyses
moléculaires des communautés et/ou populations microbiennes du sol reposent sur deux paramètres
principaux : (i) l’extraction d’ADN représentatif de la composition de la communauté microbienne indigène et
(ii) les biais introduits par la PCR, notamment le choix des amorces oligo-nucléotidiques, la concentration de
l’ADN utilisé comme matrice pour la PCR, les erreurs de PCR ou encore la méthode d’analyse post-PCR
choisie [7], [4], [8], [9].
De nombreuses études ont été conduites avec ces nouvelles méthodes permettant d’améliorer l’extraction, la
purification, l’amplification et la quantification de l’ADN des sols [10]. Récemment, l'ISO 11063 décrivant « une
méthode pour extraire directement les acides nucléiques d'échantillons de sol », dérivée de [10], a ouvert de
nouvelles perspectives de développement d'approches moléculaires normalisées pour estimer la qualité du
sol [11].
La présente Norme internationale a pour objectif de décrire le mode opératoire utilisé pour mettre en place et
réaliser une PCR quantitative afin de quantifier l'abondance de groupes microbiens du sol ainsi que les
groupes fonctionnels à partir d’extrait d’ADN de sol. La quantification des phyla microbiens du sol ainsi que
des groupes fonctionnels par des analyses qPCR peut contribuer au développement d'outils de routine
permettant de surveiller la qualité du sol. A la demande de l'ISO, la reproductibilité de la quantification de
l'abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens par amplification par réaction de polymérisation
en en chaîne par polymérase (PCR) quantitative en temps réel à partir d’ADN directement extrait du sol, a été
évaluée lors d'une étude interlaboratoires internationale (Annexe A).
v © ISO 2013 – Tous droits réservés

PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 17601

Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences de
gènes microbiens par amplification par réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) quantitative en temps réel à
partir d’ADN directement extrait du sol
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie les étapes cruciales d'une méthode d'amplification par réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) quantitative en temps réel (qPCR) permettant de mesurer l'abondance de
séquences spécifiques de gènes microbiens à partir d'un extrait d'ADN du sol qui fournit une estimation de
l’abondance de groupes microbiens spécifiques.
Il convient de noter que le nombre de gènes n'est pas nécessairement lié directement au nombre de micro-
organismes mesurés. Par exemple, le nombre d'opérons ribosomiques va d'une copie à 20 copies dans
différents phyla bactériens. Par conséquent, le nombre de séquences d'ARNr 16S quantifiées dans des
extraits d'ADN du sol ne donne pas une estimation exacte du nombre de bactéries du sol. Par ailleurs, le
nombre de séquences n'est pas nécessairement lié à des micro-organismes vivants et peut comprendre des
séquences amplifiées à partir de l’ADN extrait de micro-organismes morts.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6 : Lignes directrices pour la collecte, la
manipulation et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l'évaluation en laboratoire
des processus, de la biomasse et de la diversité microbiens.
ISO 11063, Qualité du sol — Méthode pour extraire directement l'ADN d'échantillons de sol.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
ADN du sol
ADN extrait du biote vivant et mort du sol
EXEMPLE Micro-organismes, plantes, animaux.
3.2
amplification par réaction de polymérisation en chaîne
PCR
méthode permettant l'amplification d'une séquence spécifique d'ADN en utilisant une paire spécifique
d'amorces oligonucléotidiques
ISO/DIS 17601
3.3
amplification par réaction de polymérisation quantitative en temps réel
qPCR
méthode permettant la quantification dans une matrice d’ADN du nombre d'une séquence spécifique d'ADN
en utilisant une paire spécifique d'amorces oligonucléotidiques
3.4
matrice
échantillon d'ADN utilisé pour réaliser une réaction de PCR afin d'amplifier une séquence spécifique d'ADN
3.5
amplicon
produit de PCR obtenu par PCR à partir d'une matrice
3.6
vecteur de clonage
molécule d'ADN circulaire dans laquelle l'amplicon est inséré par réaction de ligation, utilisée pour la
transformation d'Escherichia coli compétente en vue du clonage de l'amplicon
4 Principe
La méthode vise à mesurer l'abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à partir d'un extrait
d'ADN du sol. La méthode comprend quatre tâches et huit étapes, comme illustré à la Figure 1.

2 © ISO 2013 – Tous droits réservés

ISO/DIS 17601
Figure 1 — Principales tâches permettant d'estimer l'abondance de séquences spécifiques de gènes
microbiens par qPCR
La première tâche comporte trois étapes décrivant la conception d'un amplicon optimal pour la qPCR (étape
une), la préparation d'étalons de qPCR (étape deux) et le mode opératoire d'étalonnage de l'analyse par
qPCR (étape trois). La deuxième tâche comporte deux étapes supplémentaires décrivant les modes
opératoires de préparation des échantillons d'ADN du sol (étape quatre) et d'essai pour détecter la présence
d'inhibiteurs de qPCR dans les échantillons d'ADN du sol (étape cinq). La troisième tâche comporte une seule
1) 2)
étape décrivant le protocole pour réaliser les analyses par qPCR de SYBR® Green et TaqMan® (étape
six). Enfin, la quatrième tâche comporte deux étapes, l'une décrivant la procédure de validation des analyses
par qPCR (étape sept) afin de vérifier la qualité de l'analyse par qPCR, et l'autre décrivant les différentes
options permettant de calculer le nombre de séquences de la copie du gène d'intérêt à partir du cycle seuil
(Ct) obtenu par l'analyse de tracés d'amplification par qPCR (étape huit).
5 Matériel d’essai
5.1 ADN
5.1.1 L'ADN est extrait d'isolats bactériens et fongiques purs en utilisant des modes opératoires d'extraction
classiques ou en utilisant un kit du commerce pour extraire l'ADN génomique.
5.1.2 L'ADN du sol est extrait d'aliquotes de sol conformément à l'ISO 11063.
5.2 Bactéries
5.2.1 Souche d'Escherichia coli, habituellement utilisée pour le clonage de produit de PCR.
5.3 Plasmide
5.3.1 Vecteur de clonage, habituellement utilisé pour le clonage d'un produit de PCR dans une souche
d’Escherichia coli compétente, comportant les amorces oligonucléotidiques universelles SP6 et T7 situées de
part et d’autre du site d’insertion.
5.4 Enzymes et protéines
5.4.1 Taq polymérase.
5.4.1 T4 ADN ligase.
5.4.3 Protéine T32 codée par le gène correspondant du phage T4.
5.4.4 Albumine de sérum de bovin (n° CAS 9048-46-8).
5.5 Produits chimiques
5.5.1 Ampicilline sodique, C H N NaO S (n° CAS 69-52-3).
16 18 3 4
5.5.2 Acide borique, BH O (n° CAS 10043-35-3).

3 3
1)
SYBR Green est une marque déposée de Molecular Probes. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs du présent
document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents
peuvent être utilisés s’il est possible de démontrer qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
2)
TaqMan est une marque déposée de Roche Molecular Systems, Inc. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs du
présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits
équivalents peuvent être utilisés s’il est possible de démontrer qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
ISO/DIS 17601
5.5.3 Solution de désoxynucléotides, dNTPs.
5.5.4 Bromure d'éthidium (n° CAS 1239-45-8).
5.5.5 Sel disodique de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), C H N O Na ·2 H O
10 14 2 8 2 2
(n° CAS 6381-92 6).
5.5.6 Glucose, C H O (n° CAS 50-99-7).
6 12 6
5.5.7 Acide chlorhydrique, HCl (n° CAS 7647-01-0).
5.5.8 IPTG, Isopropyl-bêta-D-Thiogalactopyranoside (n° CAS 367-93-1).
5.5.9 Chlorure de magnésium, MgCl (n° CAS 7786-30-3).
5.5.10 Sulfate de magnésium, MgSO (n° CAS 7487-88-9).
5.5.11 Eau de qualité biologie moléculaire, H O.
5.5.12 Chlorure de potassium, KCl (n° CAS 7447-40-7).
5.5.13 Chlorure de sodium, NaCl (n° CAS 7647-14-5).
5.5.14 Tris[hydroxyméthyl]aminométhane, C H NO (n° CAS 77-86-1).
4 11 3
5.5.15 X-Gal, bromo-5-chloro-4-indolyl-3-bêta-D-galactopyranoside (n° CAS 7240-90-6).
5.6 Produit pour le milieu de culture bactérienne
3)
5.6.1 Bacto® tryptone, digestat enzymatique de caséine.
5.6.2 Extrait de levure en poudre (n° CAS 8013-01-2).
5.6.3 Gélose
5.7 Tampon et réactifs
5.7.1 Solution d'ampicilline, 2 g d'ampicilline sodique dans 4 ml de H O stérilisée à l'aide d'un filtre de
0,22 µm. Compléter à 20 ml avec H O stérilisée, préparer des aliquotes de 1 ml et conserver à - 20 °C.
5.7.2 EDTA, 0,5 mol/l, 186,10 g d'EDTA dans 1 000 ml de H O, en ajustant le pH à 8,0 à l'aide de NaOH
(10 mol/l).
5.7.3 Bromure d'éthidium, 5 mg de bromure d'éthidium dans 1 000 ml de H O.
5.7.4 Solution mère d'IPTG, 1 g d'IPTG dans 8 ml de H O. Après l'avoir mélangée soigneusement, la
solution est complétée à 10 ml et stérilisée dans un poste de sécurité microbiologique. Préparer une aliquote
de 1 ml d'IPTG et la conserver à - 20 °C.

3)
Bacto tryptone est la marque déposée d'un produit fourni par Difco Laboratories. Cette information est donnée à l'intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est possible de démontrer qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
4 © ISO 2013 – Tous droits réservés

ISO/DIS 17601
TM 3)
5.7.5 Milieu LB solide, 10 g de Bacto -tryptone, 5 g d'extrait de levure, 5 g de chlorure de sodium,
15 g de gélose, dans 1 000 ml de H O. Après passage à l'autoclave pendant 20 min à 120 °C, le milieu LB est
versé dans des boîtes de Petri stériles (20 ml) dans un poste de sécurité microbiologique. Après solidification,
les boîtes de Pétri contenant le milieu LB sont conservées à 4 °C jusqu'à leur utilisation.
5.7.6 Milieu LB/Amp solide, préparé selon la recette du milieu LB solide, excepté qu'après le passage à
-1
l'autoclave pendant 20 min à 120 °C, 1 ml d'une solution mère d'ampicilline à 100 mg·ml est ajouté au milieu
LB.
5.7.5 Milieu LB/Amp/X-Gal/IPTG solide, préparé selon la recette du milieu LB/Amp solide. Dans un poste
de sécurité microbiologique, 100 µl de solution d'IPTG sont appliqués sur le milieu LB/Amp solide. Après
évaporation, 20 µl de solution X-Gal sont plaqués sur le milieu solide. Ce milieu solide est conservé comme
décrit ci-dessus.
TM 3)
5.7.8 Milieu LB liquide, 10 g de Bacto -tryptone, 5 g d'extrait de levure, 5 g de chlorure de sodium,
dans 1 000 ml de H O, passés à l'autoclave pendant 20 min à 120 °C.
5.7.9 Milieu LB/Amp liquide, préparé selon la recette du milieu LB liquide, excepté qu'après le passage à
-1
l'autoclave pendant 20 min à 120 °C, 0,2 ml d'une solution mère d'ampicilline à 100 mg·ml est ajouté au
milieu LB.
TM 3)
5.7.10 Milieu SOC, 20 g de Bacto -tryptone, 5 g d'extrait de levure, 0,58 g de NaCl, 0,95 g de MgCl ,
2,46 g de MgSO , 3,60 g de glucose dans 1 l de H O. Stériliser à l'autoclave pendant 20 min à 120 °C.
4 2
Préparer des aliquotes de 950 ml et les conserver à - 20 °C.
5.7.11 Tris-HCl, 1 mol/l, 121,14 g de Tris dans 1 000 ml de H O, en ajustant le pH à 8,0 avec du HCl 4 mol/l.
5.7.12 Tampon TBE × 10, pH 8,0, 108 g de base Tris, 55 g d'acide borique, 40 ml d'EDTA 0,5 mol/l (pH 8,0)
dans 1 000 ml de H O.
5.7.13 Tampon TBE × 1, 100 ml de tampon TBE × 10 dans 900 ml de H O.
5.7.14 Tampon TE × 10, pH 8,0, 100 ml de Tris-HCl 1 mol/l à pH 8,0, 20 ml d'EDTA 50 mmol/l à pH 8,0
dans 880 ml de H O.
5.7.15 Tampon TE × 1, 100 ml de tampon TE × 10 dans 900 ml de H O.
5.7.16 Solution X-gal, 250 mg de X-Gal dans 5 ml de diméthylformamide 5 ml. Après homogénéisation,
préparer une aliquote de 0,5 ml et la conserver à - 20 °C.
6 Appareillage
Utiliser un matériel de laboratoire courant, notamment pipettes, centrifugeuse, poste de sécurité
microbiologique, hotte chimique, système d’électrophorèse horizontale et les éléments suivants.
6.1 PCR quantitative, permettant de quantifier en temps réel des amplicons à partir de diverses matrices
d'ADN, avec une limite de détection d'une copie d'une séquence d’ADN cible dans la prise d’échantillon
analysée.
6.2 Spectrophotomètre, permettant de quantifier l'ADN double brin à 260 nm.
NOTE Un seul de ces deux appareils est requis pour estimer la concentration d'ADN.
4)
6.3 Spectrofluorimètre , permettant de quantifier l'ADN double brin.
ISO/DIS 17601
7 Mode opératoire
7.1 Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l'analyse par qPCR (tâche 1)
7.1.1 Généralités
Le but de cette tâche est de décrire la définition d'un amplicon approprié en vue d'une analyse par qPCR
(étape une), de la préparation d'un étalon de qPCR (étape deux) et de l'étalonnage de l'analyse par qPCR
(étape trois). Pour la première étape de la tâche 1, la conception d'un amplicon en vue d'une analyse par
qPCR SYBR Green ou TaqMan est considérée séparément pour des raisons techniques. En effet, ces deux
analyses par qPCR diffèrent notamment par la méthode utilisée pour la quantification en temps réel des
amplicons : (i) pour la première méthode, les amplicons sont quantifiés à la fin de chaque cycle de PCR en
utilisant le SYBR Green qui émet une fluorescence lorsqu'il est intercalé dans la double hélice de l'amplicon,
(ii) pour la deuxième méthode, la libération d'un colorant fluorescent à la suite de l'hydrolyse d'une sonde
interne résultant de l'activité exonucléase 5´–3´ de la Taq polymérase est estimée à la fin de chaque cycle de
PCR. Pour ces raisons, les spécifications techniques relatives à la mise en œuvre de ces deux méthodes
différentes sont légèrement divergentes.
7.1.2 Conception de l'amplicon (tâche 1, étape 1)
7.1.2.1 Généralités
La première étape vise à concevoir une paire d'amorces oligonucléotidiques pour amplifier un amplicon
approprié optimisant l'analyse par qPCR. La conception de la paire d'amorces peut être effectuée in silico à
l'aide de différents programmes en utilisant la séquence du gène microbien d'intérêt devant être quantifiée par
qPCR à partir d'extraits d'ADN de sol. La spécificité des amorces doit être vérifiée in silico en comparant leurs
séquences à des séquences connues disponibles dans la base de données Genbank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Seuls les amorces spécifiques pour le gène cible doivent être prises
en compte. Les principaux paramètres à considérer pour la conception d'un jeu d'amorces oligonucléotidiques
en vue d'une analyse par qPCR SYBR Green ou TaqMan sont indiqués ci-après.
7.1.2.2 qPCR SYBR Green
 La longueur optimale de l'amplicon est comprise entre 100 pb et 250 pb ;
 la longueur optimale des amorces est comprise entre 18 pb et 25 pb, avec une teneur en GC de 50 % et
une température de fusion comprise entre 58 °C et 65 °C ;
 il convient que les cinq nucléotides au niveau de l'extrémité 3´ de chaque amorce ne contiennent pas
plus de deux bases G et/ou C ;
 éviter la succession de nucléotides identiques, en particulier pour la guanine ;
 il convient de vérifier et d'éviter l'auto-complémentarité 3' de l'amorce, prise comme mesure de sa
tendance à former des dimères avec elle-même.
6 © ISO 2013 – Tous droits réservés

ISO/DIS 17601
7.1.2.3 qPCR TaqMan
En premier lieu, la sonde TaqMan doit être conçue, puis les amorces choisies de part et d’autre de façon à
entourer aussi près que possible la sonde sans chevauchement. Les principaux paramètres à considérer pour
concevoir la sonde interne sont indiqués ci-après :
 la teneur en GC doit être maintenue dans la plage de 20 % à 80 % ;
 il convient que la température de fusion (T ) soit comprise entre 58 °C et 65 °C (similaire à celle du jeu
m
d'amorces utilisée dans l'analyse TaqMan) ;
 éviter la succession de nucléotides identiques, en particulier pour la guanine (G) ;
 ne pas placer de base G sur l'extrémité 5´ de la sonde TaqMan ;
 sélectionner le brin contenant plus de bases C que de bases G.
Les recommandations données pour la qPCR pour choisir la paire d'amorces doivent également être
respectées pour concevoir les amorces pour la qPCR TaqMan. Toutefois, les utilisateurs doivent garder à
l'esprit que plus la taille de l'amplicon est petite (mais sans chevauchement avec la sonde TaqMan), meilleure
l’amplification est la meilleure.
7.1.3 Préparation des étalons de qPCR (tâche 1, étape 2)
L'étape 2 de la tâche 1 décrit le mode opératoire utilisé pour générer des étalons de qPCR ciblant une
séquence du gène microbien d'intérêt à partir de différentes matrices d'ADN (isolat bactérien ou fongique pur,
ADN environnemental ou ADN artificiel). Elle indique également le mode opératoire utilisé pour insérer l'étalon
de qPCR dans un vecteur de clonage, transformer Escherichia coli et purifier les plasmides recombinants
abritant l'étalon de qPCR en vue de leur utilisation ultérieure pour des analyses par qPCR.
7.1.4 ADN d'isolat, ADN environnemental, ADN artificiel
7.1.4.1 Généralités
La première étape de la préparation d'étalons de qPCR repose sur l'extraction de matrices d'ADN connues
pour contenir le gène microbien d'intérêt. Elle peut être réalisée à partir de différentes matrices biologiques :
1) cultures bactériennes ou fongiques pures ;
2) échantillons environnementaux ou 3) ADN artificiel :
i) l'ADN est extrait de cellules bactériennes ou fongiques prélevées dans une culture fraîche en
utilisant des protocoles d'extraction d'ADN génomique classiques ;
ii) l'ADN est extrait des matrices environnementales selon différents protocoles. Lorsque des
échantillons de sol sont étudiés, l'ADN est extrait conformément à l'ISO 11063 qui décrit une
méthode permettant d'extraire directement les acides nucléiques du sol ;
3) en variante, si aucun échantillon biologique n'est disponible ou connu pour contenir le gène d'intérêt,
il est possible de synthétiser de l'ADN artificiel constitué de la séquence du gène d'intérêt.
Dans tous les cas, la qualité de la matrice d'ADN utilisée pour amplifier l'étalon de qPCR par PCR doit être
vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % dans un tampon TBE, coloré avec un agent intercalant
approprié (par exemple bromure d'éthidium, 5 mg/l). La concentration d'ADN est mesurée par
spectrophotométrie à 260 nm ou par spectrofluorimétrie. La matrice d'ADN est diluée à 10 ng/µl dans un
volume final de 20 µl et conservée à - 20 °C.
ISO/DIS 17601
La séquence étalon de qPCR est amplifiée par PCR en utilisant une paire d'amorces spécifique conçue
conformément aux recommandations données dans la tâche 1 de l'étape 1. La réaction d'amplification est
réalisée dans un volume final de 25 µl contenant 2,5 µl de tampon Taq polymérase 10 ×, 200 µmol/l de
chaque dNTP, 1,5 mmol/l de MgCl , 0,5 µmol/l de chaque amorce et 0,625 U de Taq polymérase. Un volume
de 2,5 µl d'ADN (par exemple 25 ng d'ADN) est utilisé comme matrice pour les réactions PCR. La PCR est
réalisée dans un thermocycleur conformément au programme suivant : un cycle de 4 min à 94 °C ; 39 cycles
de 1 min à 94 °C, 1 min à la température d’hybridation propre à l'amplicon étalon de qPCR, 1,5 min à 72 °C et
une étape finale d'élongation à 72 °C pendant 5 min. La taille attendue de l'amplicon étalon de qPCR est
vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose à 2 % dans un tampon TBE coloré avec un agent intercalant
approprié (par exemple bromure d'éthidium, 5 mg/l). Les amplicons sont purifiés pour éliminer les amorces, le
sel et les enzymes restantes. Parmi les méthodes appropriées pour purifier les amplicons, on pourrait
recommander l'utilisation de (i) la chromatographie d'exclusion ou d'affinité appliquée directement aux
produits de PCR ou (ii) la purification des amplicons après leur séparation par électrophorèse sur gel
d'agarose comme décrit dans [12]. Les amplicons purifiés sont
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 17601
Première édition
2016-01-15
Qualité du sol — Estimation de
l’abondance de séquences de gènes
microbiens par amplification par
réaction de polymérisation en chaîne
(PCR) quantitative à partir d’ADN
directement extrait du sol
Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene
sequences by quantitative PCR from DNA directly extracted from soil
Numéro de référence
©
ISO 2016
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2016, Publié en Suisse
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland
Tel. +41 22 749 01 11
Fax +41 22 749 09 47
copyright@iso.org
www.iso.org
ii © ISO 2016 – Tous droits réservés

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Matériel d’essai . 4
5.1 ADN . 4
5.2 Bactéries . 4
5.3 Plasmide . 4
5.4 Enzymes . 4
5.5 Produits chimiques . 4
5.6 Produit pour le milieu de culture bactérienne . 5
5.7 Tampon et réactifs . 5
6 Appareillage . 6
7 Mode opératoire. 6
7.1 Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l’essai de qPCR (tâche 1) . 6
7.1.1 Généralités . 6
7.1.2 Création de l’amplicon (tâche 1, étape 1) . 7
7.1.3 Préparation des étalons de qPCR (tâche 1, étape 2) . 7
7.1.4 ADN d’isolat, ADN environnemental, ADN artificiel . 7
7.1.5 Étalonnage de la qPCR (tâche 1, étape 3) .10
7.2 Préparation d’une matrice d’ADN du sol et test d’inhibition (tâche 2) .11
7.2.1 Généralités .11
7.2.2 Préparation de l’ADN du sol (tâche 2, étape 4) .11
7.2.3 Test d’inhibition (tâche 2, étape 5) .11
7.2.4 Dilution de la matrice d’ADN .12
7.3 Essai de qPCR (tâche 3) .13
7.3.1 Généralités .13
7.3.2 qPCR .13
7.4 Validation et examen de l’essai de qPCR (tâche 4) .13
7.4.1 Généralités .13
7.4.2 Validation de l’essai de qPCR .13
7.4.3 Calcul du nombre de copies du gène d’intérêt dans l’extrait d’ADN du sol .14
8 Examen des étapes critiques de l’essai de qPCR .14
9 Expression des résultats de l’essai de qPCR .15
10 Étude interlaboratoires internationale .15
11 Rapport d’essai .15 ®
Annexe A (informative) Description des principales étapes d’un essai de qPCR TaqMan .16
Annexe B (informative) Étude interlaboratoires internationale relative à l’évaluation de la
qPCR pour quantifier l’abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à
partir d’ADN extrait directement du sol .18
Bibliographie .31
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO, participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 190, Qualité du sol, sous–comité
SC 4, Méthodes biologiques.
iv © ISO 2016 – Tous droits réservés

Introduction
L’ADN (acide désoxyribonucléique) est un constituant majeur de tous les organismes vivants codant
pour les enzymes responsables de leurs activités biologiques. L’étude des séquences d’ADN extrait
de différentes matrices environnementales, à l’aide d’approches moléculaires, permet de fournir des
marqueurs moléculaires qui peuvent être utilisés pour différencier et identifier clairement différents
organismes (bactéries, archées et eucaryotes).
Jusqu’à présent, la plupart des études visant à développer des indicateurs microbiens de la qualité du
sol et applicables aux milieux complexes, tels que le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de
nombreux micro-organismes dans des conditions de laboratoire et par le manque de sensibilité des
méthodes de microbiologie classiques. Le développement récent de nombreuses méthodes de biologie
moléculaire reposant sur l’amplification des acides nucléiques extraits du sol a permis de proposer une
alternative pertinente à la microbiologie pasteurienne permettant de décrire en détail la composition,
[2] [3] [4] [5] [6]
la richesse et la structure des communautés microbiennes.   Les approches reposant sur
l’extraction de l’ADN à partir d’échantillons environnementaux sont désormais bien établies dans le
domaine de l’écologie des sols et servent de marqueurs génétiques permettant d’évaluer la diversité
microbienne. Les résultats d’analyses moléculaires des communautés et/ou populations microbiennes
du sol reposent sur deux paramètres principaux: a) l’extraction d’ADN représentatif de la composition
de la communauté microbienne indigène et b) les biais introduits par la PCR, notamment le choix des
amorces oligonucléotidiques, la concentration de l’ADN utilisé comme matrice, les erreurs de PCR ou
[7] [4] [8] [9]
encore la méthode d’analyse post-PCR choisie.
De nombreuses études ont été menées avec ces nouvelles méthodes permettant d’améliorer l’extraction,
[10]
la purification, l’amplification et la quantification de l’ADN des sols. Récemment, l’ISO 11063
décrivant «une méthode pour extraire directement les acides nucléiques d’échantillons de sol», dérivée
de la Référence [10], a ouvert de nouvelles perspectives de développement d’approches moléculaires
[11]
normalisées pour estimer la qualité du sol.
La présente Norme internationale a pour objectif de décrire le mode opératoire utilisé pour mettre en
place et réaliser une PCR quantitative afin de quantifier l’abondance de groupes microbiens du sol ainsi
que celle de groupes fonctionnels à partir d’extrait d’ADN de sol. La quantification des phyla microbiens
du sol ainsi que des groupes fonctionnels par des essais de qPCR peut contribuer au développement
d’outils de routine permettant de surveiller la qualité du sol. La répétabilité et la reproductibilité de la
méthode d’amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) quantitative ont été évaluées
lors d’une étude interlaboratoires internationale (voir Annexe B). La répétabilité de cette méthode a été
évaluée avec succès pour les essais de qPCR ciblant les gènes ARNr 16S ainsi que des gènes codant un
marqueur fonctionnel de bactéries dénitrifiantes (le gène nitrite réductase nirK). La reproductibilité de
cette méthode a révélé un effet de laboratoire qui peut être surmonté en interprétant les résultats de la
quantification de l’abondance de groupes microbiens par comparaison, soit en utilisant une référence
externe (ADN extrait d’une souche témoin) lors de l’essai de qPCR, soit en calculant un pourcentage de
variations entre traitements pour normaliser les données.
NORME INTERNATIONALE ISO 17601:2016(F)
Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences
de gènes microbiens par amplification par réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) quantitative à partir d’ADN
directement extrait du sol
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie les étapes principales d’une méthode d’amplification par
réaction de polymérisation en chaîne (PCR) quantitative (qPCR) permettant de mesurer l’abondance de
séquences spécifiques de gènes microbiens à partir d’un extrait d’ADN du sol qui fournit une estimation
de l’abondance de groupes microbiens spécifiques.
Il convient de noter que le nombre de gènes n’est pas nécessairement lié directement au nombre de
micro-organismes mesurés. Par exemple, le nombre d’opérons ribosomiques est compris entre une
et 20 copies dans différents phyla bactériens. Par conséquent, le nombre de séquences d’ARNr 16S
quantifiées dans des extraits d’ADN du sol ne donne pas une estimation exacte du nombre de bactéries
contenues dans le sol. Par ailleurs, le nombre de séquences n’est pas nécessairement lié à des micro-
organismes vivants et peut comprendre des séquences amplifiées à partir de l’ADN extrait de micro-
organismes morts.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la
manipulation et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire
des processus, de la biomasse et de la diversité microbiens
ISO 11063, Qualité du sol — Méthode pour extraire directement l’ADN d’échantillons de sol
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
ADN du sol
ADN extrait du biote vivant et mort du sol
EXEMPLE Micro-organismes, plantes, animaux.
3.2
amplification par réaction de polymérisation en chaîne
PCR
méthode permettant l’amplification d’une séquence spécifique d’ADN en utilisant un jeu spécifique
d’amorces oligonucléotidiques
3.3
amplification par réaction de polymérisation en chaîne quantitative
qPCR
méthode permettant la quantification dans une matrice (3.4) d’ADN du nombre d’une séquence
spécifique d’ADN en utilisant un jeu spécifique d’amorces oligonucléotidiques
3.4
matrice
échantillon d’ADN utilisé pour réaliser une réaction de PCR (3.2) afin d’amplifier une séquence
spécifique d’ADN
3.5
amplicon
produit de PCR obtenu par PCR (3.2) à partir d’une matrice (3.4)
3.6
vecteur de clonage
molécule d’ADN circulaire dans laquelle l’amplicon (3.5) est inséré par réaction de ligation, utilisée pour
la transformation d’Escherichia coli compétente en vue du clonage de l’amplicon
3.7
étalon de qPCR
ADN cible cloné utilisé comme matrice (3.4) pour la réaction qPCR afin d’établir la courbe d’étalonnage
de l’abondance d’une séquence cible en fonction des valeurs du cycle seuil (Ct)
3.8
témoin négatif
NTC
témoin, généralement de l’eau de qualité biologie moléculaire, qui est utilisé comme témoin négatif dans
l’essai de qPCR pour vérifier l’absence de contaminant dans le mélange de qPCR
3.9
cycle seuil
Ct
nombre de cycles de qPCR requis pour que le signal fluorescent franchisse la valeur seuil (c’est-à-dire
dépasse le bruit de fond)
Note 1 à l’article: La valeur de Ct est inversement proportionnelle à l’abondance de la séquence cible.
4 Principe
La présente Norme internationale décrit l’essai de qPCR utilisant un colorant fluorescent se fixant à
l’ADN comme rapporteur. Cet essai de qPCR a été validé lors d’une étude interlaboratoires internationale
menée avec le SYBR Green, un colorant fluorescent se fixant à l’ADN double brin et pouvant être détecté
en mesurant l’augmentation de fluorescence au cours du cycle.
La méthode vise à mesurer l’abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à partir d’un
extrait d’ADN du sol. La méthode comprend quatre tâches et huit étapes, comme résumé à la Figure 1.
Selon la Référence [1], les trois étapes critiques devant être validées pour chaque essai de qPCR sont
telles qu’indiquées à la Figure 1.
2 © ISO 2016 – Tous droits réservés

Figure 1 — Principales tâches et étapes critiques permettant d’estimer l’abondance de
séquences spécifiques de gènes microbiens par un essai de qPCR
La présente Norme internationale décrit l’essai de qPCR basé sur l’utilisation d’un colorant fluorescent
se fixant à l’ADN double brin qui a été validé par une étude interlaboratoires internationale utilisant le
1) 2)
® ®
qPCR SYBR Green . L’Annexe A fournit des informations sur l’essai de qPCR TaqMan qui n’a pas fait
l’objet d’une étude interlaboratoires internationale. La première tâche comporte trois étapes décrivant
la création d’un amplicon optimal pour la qPCR (étape une), la préparation d’étalons de qPCR (étape
deux) et le mode opératoire d’étalonnage de l’essai de qPCR (étape trois). La deuxième tâche comporte
deux étapes supplémentaires décrivant les modes opératoires de préparation des échantillons d’ADN
du sol (étape quatre) et d’essai pour détecter la présence d’inhibiteurs de qPCR dans les échantillons
d’ADN du sol (étape cinq). La troisième tâche comporte une seule étape décrivant le protocole pour
réaliser l’essai qPCR (étape six). Enfin, la quatrième tâche comporte deux étapes, l’une décrivant la
procédure de validation des essais de qPCR (étape sept) afin de vérifier la qualité de l’essai de qPCR,
et l’autre décrivant les différentes options permettant de calculer le nombre de copies de la séquence
du gène d’intérêt à partir du cycle seuil (Ct) obtenu par l’analyse des courbes d’amplification par qPCR
(étape huit).
5 Matériel d’essai
5.1 ADN
5.1.1 ADN, extrait d’isolats bactériens et fongiques purs en utilisant des modes opératoires d’extraction
classiques ou en utilisant un kit commercial pour extraire l’ADN génomique.
5.1.2 ADN du sol, extrait d’aliquotes de sol conformément à l’ISO 11063.
5.2 Bactéries
5.2.1 Souche d’Escherichia coli, habituellement utilisée pour le clonage d’un produit de PCR.
5.3 Plasmide
5.3.1 Vecteur de clonage, habituellement utilisé pour le clonage d’un produit de PCR dans une souche
d’Escherichia coli compétente.
5.4 Enzymes
5.4.1 Taq polymérase.
5.4.2 T4 ADN ligase.
5.4.3 Protéine T32 codée par le gène correspondant du phage T4.
5.4.4 Albumine de sérum de bovin (n° CAS 9048-46-8).
5.5 Produits chimiques
5.5.1 Ampicilline sodique, C H N NaO S (n° CAS 69-52-3).
16 18 3 4
1) SYBR Green est une marque déposée de Molecular Probes. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du
produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est possible de démontrer qu’ils conduisent
aux mêmes résultats.
2) TaqMan est une marque déposée de Roche Molecular Systems, Inc. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du
produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est possible de démontrer qu’ils conduisent
aux mêmes résultats.
4 © ISO 2016 – Tous droits réservés

5.5.2 Acide borique, BH O (n° CAS 10043-35-3).
3 3
5.5.3 Solution de désoxynucléotides, dNTPs. ®
5.5.4 Agent intercalent SYBR Safe permettant de visualiser l’ADN sur gel.
5.5.5 Sel disodique de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), C H N O Na ·2 H O
10 14 2 8 2 2
(n° CAS 6381-92 6).
5.5.6 Glucose, C H O (n° CAS 50-99-7).
6 12 6
5.5.7 Acide chlorhydrique, HCl (n° CAS 7647-01-0).
5.5.8 IPTG, Isopropyl-bêta-D-Thiogalactopyranoside (n° CAS 367-93-1).
5.5.9 Chlorure de magnésium, MgCl (n° CAS 7786-30-3).
5.5.10 Sulfate de magnésium, MgSO (n° CAS 7487-88-9).
5.5.11 Eau de qualité biologie moléculaire, H O.
5.5.12 Chlorure de potassium, KCl (n° CAS 7447-40-7).
5.5.13 Chlorure de sodium, NaCl (n° CAS 7647-14-5).
5.5.14 Tris[hydroxyméthyl]aminométhane, C H NO (n° CAS 77-86-1).
4 11 3
5.5.15 X-Gal, bromo-5-chloro-4-indolyl-3-bêta-D-galactopyranoside (n° CAS 7240-90-6).
5.6 Produit pour le milieu de culture bactérienne
3) ®
5.6.1 Bacto tryptone , digestat enzymatique de caséine.
5.6.2 Extrait de levure en poudre (n° CAS 8013-01-2).
5.7 Tampon et réactifs
5.7.1 Solution d’ampicilline, 2 g d’ampicilline sodique dans 4 ml de H O stérilisée à l’aide d’un filtre
de 0,22 µm. Compléter à 20 ml avec H O stérilisée, préparer des aliquotes de 1 ml et conserver à - 20 °C.
-1
5.7.2 EDTA, 0,5 mol·l , 186,10 g d’EDTA dans 1 000 ml de H O, en ajustant le pH à 8,0 à l’aide de NaOH
-1
(10 mol·l ).
5.7.3 Agent intercalant SYBR Safe™ permettant de visualiser l’ADN sur gel, diluer 10 000X de SYBR
Safe™ dans un tampon TBE × 1.
3) Bacto tryptone est la marque déposée d’un produit fourni par Difco Laboratories. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi
exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est possible de démontrer qu’ils
conduisent aux mêmes résultats.
5.7.4 Solution mère d’IPTG, 1 g d’IPTG dans 8 ml de H O. Après l’avoir mélangée soigneusement,
la solution est complétée à 10 ml et stérilisée dans un poste de sécurité microbiologique. Préparer une
aliquote de 1 ml d’IPTG et la conserver à - 20 °C. ®
5.7.5 Milieu LB solide, 10 g de Bacto tryptone , 5 g d’extrait de levure, 5 g de chlorure de sodium et
15 g de gélose, dans 1 000 ml de H O. Après autoclavage pendant 20 min à 120 °C, 1 ml d’une solution
-1
mère d’ampicilline à 100 mg·ml est ajouté au milieu LB et étalé dans des boîtes de Petri (20 ml) dans
un poste de sécurité microbiologique. 100 µl de solution d’IPTG sont étalés sur le milieu LB solide-
ampicilline. Lorsque la solution d’IPTG a pénétré le milieu LB-ampicilline, 20 µl de solution X-Gal sont
étalés sur le milieu LB solide-ampicilline. Le milieu LB solide est conservé à 4 °C jusqu’à son utilisation. ®
5.7.6 Milieu SOC, 20 g de Bacto tryptone , 5 g d’extrait de levure, 0,58 g de NaCl, 0,95 g de MgCl ,
2,46 g de MgSO et 3,60 g de glucose dans 1 l de H O. Stériliser à l’autoclave pendant 20 min à 120 °C.
4 2
Préparer des aliquotes de 950 ml et les conserver à - 20 °C.
-1
5.7.7 Tris-HCl, 1 mol·l , 121,14 g de Tris dans 1 000 ml de H O, en ajustant le pH à 8,0 avec du HCl
4 mol/l.
-1
Tampon TBE × 10, pH 8,0, 108 g de base Tris, 55 g d’acide borique et 40 ml d’EDTA 0,5 mol·l (pH 8,0)
dans 1 000 ml de H O.
5.7.8 Tampon TBE × 1, 100 ml de tampon TBE × 10 dans 900 ml de H O.
-1 -1
5.7.9 Tampon TE × 10, pH 8,0, 100 ml de Tris-HCl 1 mol·l à pH 8,0, 20 ml d’EDTA 50 mmol·l à pH 8,0
dans 880 ml d’eau de qualité biologie moléculaire.
5.7.10 Tampon TE × 1, 100 ml de tampon TE × 10 dans 900 ml de H O.
5.7.11 Solution X-gal, 250 mg de X-Gal dans 5 ml de diméthylformamide. Après homogénéisation,
préparer des aliquotes de 0,5 ml et les conserver à - 20 °C.
6 Appareillage
Utiliser un matériel de laboratoire courant, notamment pipettes, centrifugeuse, poste de sécurité
microbiologique, hotte chimique, système d’électrophorèse horizontale et les éléments suivants.
6.1 PCR quantitative, permettant de quantifier en temps réel des amplicons générés à partir de
diverses matrices d’ADN, avec une limite de détection théorique d’une copie d’une séquence d’ADN cible
dans la prise d’échantillon analysée.
6.2 Spectrophotomètre, permettant de quantifier l’ADN double brin à 260 nm.
6.3 Spectrofluorimètre, permettant de quantifier l’ADN double brin.
NOTE Un seul de ces deux appareils est requis pour estimer la concentration d’ADN.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l’essai de qPCR (tâche 1)
7.1.1 Généralités
L’essai de qPCR est basé sur la quantification des amplicons à la fin de chaque cycle de PCR en utilisant
un colorant d’ADN qui émet une fluorescence lorsqu’il est intercalé dans le double brin des amplicons.
6 © ISO 2016 – Tous droits réservés

Le but de cette tâche est de décrire la définition d’un amplicon approprié en vue d’un essai de qPCR
(étape une), de la préparation d’un étalon de qPCR (étape deux) et de l’étalonnage de l’essai de qPCR
(étape trois).
7.1.2 Création de l’amplicon (tâche 1, étape 1)
7.1.2.1 Généralités
La première étape vise à créer un jeu d’amorces oligonucléotidiques. Il peut être conçu in silico à l’aide
de différents programmes en utilisant la séquence du gène microbien d’intérêt devant être quantifiée
par qPCR à partir d’extraits d’ADN de sol. La spécificité des amorces doit être vérifiée in silico en
comparant leurs séquences à des séquences connues disponibles dans la base de données Genbank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Seules les amorces spécifiques pour le gène cible doivent
être prises en compte. Les principaux paramètres à considérer pour la conception d’un jeu d’amorces
oligonucléotidiques en vue d’un essai de qPCR sont indiqués ci-après.
7.1.2.2 qPCR
— La longueur optimale de l’amplicon est comprise entre 100 pb et 250 pb.
— La longueur optimale des amorces est comprise entre 18 pb et 25 pb, avec une teneur en GC de 50 %
et une température de fusion comprise entre 58 °C et 65 °C.
— Il convient que les cinq nucléotides au niveau de l’extrémité 3” de chaque amorce ne contiennent pas
plus de deux bases G et/ou C.
— Éviter la succession de nucléotides identiques, en particulier pour la guanine.
— Il convient de vérifier et d’éviter l’auto-complémentarité 3” de l’amorce, indiquant sa tendance à
former des dimères avec elle-même.
— Éviter la conception d’amorces comportant plus de quatre mésappariements car une dégénérescence
trop importante de l’amorce contribue à la fluctuation des résultats de qPCR.
7.1.3 Préparation des étalons de qPCR (tâche 1, étape 2)
L’étape 2 de la tâche 1 décrit le mode opératoire utilisé pour générer des étalons de qPCR ciblant
une séquence du gène microbien d’intérêt à partir de différentes matrices d’ADN (isolat bactérien ou
fongique pur, ADN environnemental ou ADN artificiel). Elle indique également le mode opératoire
utilisé pour insérer l’étalon de qPCR dans un vecteur de clonage, transformer Escherichia coli et purifier
les plasmides recombinants contenant l’étalon de qPCR en vue de leur utilisation ultérieure pour des
essais de qPCR.
7.1.4 ADN d’isolat, ADN environnemental, ADN artificiel
7.1.4.1 Généralités
La première étape de la préparation d’étalons de qPCR repose sur l’extraction de matrices d’ADN
connues pour contenir le gène microbien d’intérêt. Elle peut être réalisée à partir de différentes
matrices telles que les suivantes:
a) cultures pures de microorganismes;
L’ADN est extrait de cellules prélevées dans une culture fraîche de microorganismes en utilisant des
protocoles d’extraction d’ADN génomique classiques.
b) ADN artificiel.
Si aucun échantillon biologique n’est disponible ou connu pour contenir le gène d’intérêt, il est possible
de synthétiser de l’ADN artificiel constitué de la séquence du gène d’intérêt.
Dans tous les cas, la qualité de la matrice d’ADN utilisée pour amplifier l’étalon de qPCR par PCR doit être
vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 1 % dans un tampon TBE, coloré avec un agent intercalant
approprié (par exemple SYBR Safe™). La concentration d’ADN est mesurée par spectrophotométrie à
-1
260 nm ou par spectrofluorimétrie. La matrice d’ADN est diluée à 10 ng·µl dans un volume final de
20 µl et conservée à - 20 °C.
La séquence étalon de qPCR est amplifiée en utilisant un jeu d’amorces spécifique conçu conformément
aux recommandations données dans la tâche 1 de l’étape 1. La réaction d’amplification est réalisée
-1
dans un volume final de 25 µl contenant 2,5 µl de tampon Taq polymérase 10 ×, 200 µmol·l de chaque
-1 -1
dNTP, 1,5 mmol·l de MgCl , 0,5 µmol·l de chaque amorce et 0,625 U de Taq polymérase. Un volume
de 2,5 µl d’ADN (par exemple 25 ng d’ADN) est utilisé comme matrice pour les réactions PCR. La PCR
est réalisée dans un thermocycleur conformément au programme suivant: un cycle de 4 min à 94 °C;
39 cycles de 1 min à 94 °C, 1 min à la température d’hybridation propre à l’amplicon étalon de qPCR,
1,5 min à 72 °C et une étape finale d’élongation à 72 °C pendant 5 min. La taille attendue de l’amplicon
étalon de qPCR est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 2 % dans un tampon TBE coloré
avec un agent intercalant approprié (par exemple SYBR Safe™). Les amplicons sont purifiés sur gel par
des méthodes appropriées ou en utilisant des colonnes de chromatographie d’exclusion pour éliminer
les amorces. Les amplicons purifiés sont ensuite quantifiés par spectrophotométrie à 260 nm ou par
spectrofluorimétrie.
7.1.4.2 Clonage, préparation des dilutions d’étalon de qPCR
7.1.4.2.1 Ligature d’un amplicon d’étalon de qPCR
Pour un rapport molaire de 3:1 garantissant une réaction de ligation optimale de l’amplicon dans le
vecteur de clonage, la masse de produit de PCR (Q en ng d’ADN) à utiliser pour la ligature peut être
calculée (voir Formule 1):
mn
ADN plasmidiquei× nsert
Q=×3 (1)
n
plasmide
Q = [(quantité d’ADN plasmidique × taille de l’insert (pb))/taille du plasmide (pb)] × (3/1)
où
Q est la masse de produit de PCR, en nanogrammes (ng);
m est la masse d’ADN plasmidique, en nanogrammes (ng);
ADN plasmidique
n est la taille de l’insert, en pb;
insert
n est la taille du plasmide, en pb.
plasmide
Compte tenu d’une taille de plasmide de 3 000 pb, d’un insert ARNr 16S de 200 pb et de 50 ng d’ADN
plasmidique par réaction de ligation, la quantité d’amplicon de PCR à utiliser par ligature est (voir
Formule 2):
50×200
Q= ×=310 (2)
La réaction de ligation est réalisée avec la quantité requise d’amplicon purifié d’étalon de qPCR (Q),
50 ng d’ADN plasmidique, 5 µl de tampon de ligature 2 ×, 3 U de T4 ADN ligase et suffisamment d’eau de
qualité biologie moléculaire pour atteindre un volume final de 10 µl. La réaction de ligation est conduite
à 4 °C pendant toute une nuit ou, pour une T4 ADN ligase appropriée, une heure à température ambiante.
L’efficacité de la ligation est vérifiée par électrophorèse en chargeant 1 µl de plasmide ligué et de
plasmide ouvert (c’est-à-dire 5 ng de plasmide) sur un gel d’agarose à 1 % dans un tampon TBE coloré
8 © ISO 2016 – Tous droits réservés

par un agent intercalant approprié. Le plasmide ligué est caractérisé par une plus courte migration
dans le gel d’agarose.
7.1.4.2.2 Transformation d’Escherichia coli compétente
Des cellules E. coli compétentes sont transformées par un choc thermique comme décrit ci-dessous.
8 -1
Des cellules compétentes (10 ufc·µg d’ADN) fraîchement décongelées sont incubées pendant 5 min
dans de la glace. Ensuite, 1 µl du réactif de ligation est ajouté aux cellules, mélangé doucement et incubé
pendant 20 min sur de la glace. Les cellules bactériennes sont alors soumises à un choc thermique par
une incubation de 50 s à 42 °C, immédiatement suivie d’une incubation de 2 min sur de la glace. Ensuite,
950 µl de milieu SOC sont ajoutés et les cellules bactériennes sont incubées à 37 °C sous agitation à
-1
150 min pendant 1 h. Des aliquotes de cellules bactériennes de 100 µl sont étalées sur un milieu
LB/Amp/IPTG/X-Gal solide. Les boîtes de Petri sont ensuite incubées à 37 °C pendant toute une nuit.
7.1.4.2.3 Criblage de clone recombinant
Les boîtes de Petri sont placées à 4 °C pendant plusieurs heures pour accentuer la coloration des colonies
bactériennes. Des colonies blanches sont prélevées, étalées sur un milieu LB/Amp/IPTG/X-Gal solide et
incubées pendant toute une nuit à 37 °C. Plusieurs colonies blanches sont prélevées et suspendues dans
100 µl d’eau de qualité biologie moléculaire. Une PCR est réalisée pour confirmer la présence de l’insert
dans le clone recombinant. L’insert est amplifié par PCR en utilisant des amorces SP6 (5’-ATT TAG GTG
ACA CTA TAG -3’) et T7 (5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG -3’). La réaction d’amplification est réalisée
-1
dans un volume final de 25 µl contenant 2,5 µl de tampon Taq polymérase 10 ×, 200 µmol·l de chaque
-1 -1
dNTP, 1,5 mmol·l de MgCl , 0,5 µmol·l de chaque amorce et 0,625 U de Taq polymérase. Un volume
de 2,5 µl de chaque suspension bactérienne est utilisé comme matrice pour les réactions PCR. La PCR
est réalisée dans un thermocycleur conformément au programme suivant: un cycle de 4 min à 94 °C,
35 cycles de 45 s à 94 °C, 45 s à 55 °C, 1,5 min à 72 °C et une étape finale d’élongation à 72 °C pendant
5 min. La taille de l’amplicon de qPCR attendu est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 2 %
dans un tampon TBE coloré avec un agent intercalant approprié.
7.1.4.2.4 Purification et linéarisation du plasmide recombinant
Les clones recombinants, de couleur blanche confirmée par PCR, sont inoculés dans 10 ml d’un
-1
milieu LB/Amp liquide incubé à 37 °C sous agitation (150 min ) pendant toute une nuit. Le plasmide
recombinant est purifié à partir de 2 ml de suspension cellulaire en utilisant une mini-préparation
classique. L’ADN plasmidique est ensuite quantifié par spectrophotométrie à 260 nm et des aliquotes
sont préparées et conservées à - 20 °C jusqu’à leur utilisation.
Le plasmide est linéarisé par une enzyme de restriction présentant un seul site de restriction dans la
séquence du plasmide. L’utilisateur doit s’assurer que l’enzyme de restriction choisie ne coupe pas aussi
l’insert. La digestion du plasmide est réalisée pendant toute une nuit à 37 °C dans un volume final de
10 µl contenant 250 ng de plasmide recombinant, 0,5 U d’enzyme de restriction, 1 µl de tampon pour
enzyme de restriction 10× et de l’eau de qualité biologie moléculaire. L’efficacité de la restriction du
plasmide est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %. Le plasmide linéarisé est conservé à
- 20 °C et utilisé comme solution mère pour préparer une série de dilutions de l’étalon de qPCR utilisé
pour étalonner l’essai de qPCR.
La concentration en ADN du plasmide linéarisé est mesurée par spectrophotométrie à 260 nm ou par
spectrofluorimétrie afin de déterminer le nombre de copies du plasmide. Cette opération peut être
facilitée par l’utilisation d’un calculateur en ligne tel qu’Oligocalc (http://www.basic.northwestern.
edu/biotools/oligocalc.html). A partir de cette solution mère, une solution initiale contenant
0,5 × 10 copies de l’étalon de qPCR par µl est préparée dans 100 µl d’eau de qualité biologie moléculaire.
Une série de dilutions au dixième est ensuite préparée pour atteindre 0,5 × 10 copies du plasmide par
µl. Des dilutions intermédiaires supplémentaires peuvent également être préparées en fonction de la
gamme dans laquelle les nombres de copies du gène cible sont attendus.
7.1.5 Étalonnage de la qPCR (tâche 1, étape 3)
7.1.5.1 Généralités
La procédure utilisée pour générer la courbe d’étalonnage et évaluer l’efficacité de l’essai de qPCR est
décrite ci-après.
7.1.5.2 Essai de qPCR
L’étalonnage de l’essai de qPCR est réalisé sur une série de dilutions de l’étalon cloné (allant de 10 à
10 copies par µl) en utilisant un jeu d’amorces ciblant le gène d’intérêt. La réaction d’amplification
-1
est réalisée dans un volume final de 15 µl contenant 2 µl de l’étalon de plasmide, 1 µmol·l de chaque
amorce, 7,5 µl du mélange maître Taq 2× ou 1,5 µl du mélange maître Taq 10× contenant un colorant
fluorescent se fixant à l’ADN, les dNTPs, du MgCl et la Taq polymérase, et de l’eau de qualité biologie
moléculaire. La réaction qPCR est réalisée dans un thermocycleur en temps réel conformément
au programme suivant: un cycle de 15 min à 95 °C, 35 cycles de 30 s à 95 °C, 30 s à la température
d’hybridation, 30 s à 72 °C, 30 s à 80 °C au cours desquels la fluorescence est collectée et une étape
finale de dissociation en augmentant la température de 80 °C à 95 °C. L’étalonnage de la qPCR est réalisé
en trois exemplaires et trois témoins négatifs (NTC) sont également inclus.
7.1.5.3 Détermination de la courbe d’étalonnage et calcul de l’efficacité de la qPCR
À la fin de l’essai de qPCR, les résultats sont analysés en utilisant l’option automatique. La validation de
la qPCR exige les observations suivantes: a) aucune amplification pour les témoins négatifs (NTC), b) un
seul pic de dissociation pour chaque dilution de l’étalon de qPCR et c) une courbe d’étalonnage linéaire
avec r supérieur ou égal à 98 %. La courbe d’étalonnage de la qPCR donne le nombre de Ct en fonction
du nombre (log) de copies de la séquence étalon.
L’efficacité de l’essai de qPCR est estimée comme indiqué dans la Formule 3 à partir des valeurs
déterminées à l’aide de la formule de la courbe d’étalonnage:
Ct =⋅aq+c (3)
où
Ct est le cycle seuil mesuré;
q est le nombre de copies de la séquence étalon de la qPCR;
a est la pente de la courbe d’étalonnage;
c est l’ordonnée à l’origine (Ct pour 1 copie de l’étalon de qPCR).
−1 a
()
E =−10 1 (4)
où
E est l’efficacité de la courbe d’étalonnage;
a est la pente de la courbe d’étalonnage.
Il faut noter qu’une courbe d’étalonnage ayant une pente égale à - 3,32 correspond à une efficacité de
100 %. Une dilution au demi ou au dixième d’une matrice d’ADN donnée donne une différence de Ct de 1
8 7
ou de 3,3 respectivement (c’est-à-dire 10 Ct = 10 et 10 Ct = 13,3) pour un essai de qPCR efficace à 100 %.
10 © ISO 2016 – Tous droits réservés

7.2 Préparation d’une matrice d’ADN du sol et test d’inhibition (tâche 2)
7.2.1 Généralités
Cette tâche décrit le mode opératoire utilisé pour préparer une matrice d’ADN et pour vérifier la
présence d’inhibiteurs de la Taq polymérase dans les extraits d’ADN utilisés comme matrice pour l’essai
de qPCR. Ce test d’inhibition est un prérequis obligatoire pour valider la qualité des extraits d’ADN et
permettre leur utilisation comme matrice pour mener des essais de qPCR.
7.2.2 Préparation de l’ADN du sol (tâche 2, étape 4)
L’étape 4 de la tâche 2 décrit le mode opératoire utilisé pour extraire l’ADN d’échantillons de sol. Les
échantillons de sols doivent être échantillonnés, manipulés et conservés conformément à l’ISO 10381-6.
L’extraction de l’ADN du sol doit être effectuée conformément à l’ISO 11063. Les échantillons d’ADN du
sol sont dilués à 1 ng/µl et à 0,1 ng/µl et conservés à - 20 °C jusqu’à leur utilisation.
7.2.3 Test d’inhibition (tâche 2, étape 5)
Le mode opératoire utilisé pour détecter la présence d’inhibiteurs de la Taq polymérase dans les extraits
d’ADN du sol est décrit ci-après. Cette étape est un prérequis qui doit être effectué avant de réaliser
un essai de qPCR à partir d’extraits d’ADN du sol. En effet, les inhibiteurs de la Taq polymérase, tels
que les substances humiques, sont souvent co-extraits avec l’ADN du sol et seul un extrait d’ADN du sol
exempt d’inhibiteurs peut être soumis à une analyse par qPCR pour estimer l’abondance de séquences
spécifiques de gènes microbiens dans le sol. Deux tests d’inhibition sont décrits ci-après.
7.2.3.1 Ajout d’une quantité connue d’ADN exogène dans un extrait d’ADN du sol
La recherche d’inhibiteurs peut être effectuée en quantifiant l’abondance d’ADN exogène introduit en
quantité connue dans l’ADN du sol. Le protocole proposé ci-dessous décrit les analyses effectuées après
l’ajout d’une quantité connue d’ADN plasmidique à un extrait d’ADN du sol. Ce mode opératoire peut être
adapté à n’importe quelles autres sources d’ADN exogène en réalisant la qPCR avec un jeu d’amorces
approprié spécifique pour la séquence d’ADN exogène introduit.
La qPCR est réalisée à l’aide d’amorces SP6 et T7 spécifiques du plasmide. La réaction d’amplification
est réalisée dans un volume final de 15 µl contenant 2 µl d’ADN plasmidique, 2 µl d’ADN du sol (en
-1 -1
utilisant les deux dilution 1 et 0,1 ng·µl ), 1,0 µmol·l de chaque amorce, 7,5 µl du mélange maître Taq
2× ou 1,5 µl du mélange maître Taq 10× contenant le colorant fluorescent se fixant à l’ADN, les dNTPs,
du MgCl et la Taq polymérase, et de l’eau de qualité biologie moléculaire. La réaction qPCR est réalisée
dans un thermocycleur en temps réel conformément au programme suivant: un cycle de 15 min à 95 °C;
30 cycles de 15 s à 95 °C, 30 s à 55 °C et 30 s à 72 °C. Le test d’inhibition de SP6-T7de la qPCR est réalisé
pour chaque dilution de l’extrait d’ADN du sol à évaluer, trois témoins positifs contenant uniquement
l’ADN plasmidique et trois témoins négatifs
...