ISO 17601:2016

NORME ISO
INTERNATIONALE 17601
Première édition
2016-01-15
Qualité du sol — Estimation de
l’abondance de séquences de gènes
microbiens par amplification par
réaction de polymérisation en chaîne
(PCR) quantitative à partir d’ADN
directement extrait du sol
Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene
sequences by quantitative PCR from DNA directly extracted from soil
Numéro de référence
©
ISO 2016
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Matériel d’essai . 4
5.1 ADN . 4
5.2 Bactéries . 4
5.3 Plasmide . 4
5.4 Enzymes . 4
5.5 Produits chimiques . 4
5.6 Produit pour le milieu de culture bactérienne . 5
5.7 Tampon et réactifs . 5
6 Appareillage . 6
7 Mode opératoire. 6
7.1 Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l’essai de qPCR (tâche 1) . 6
7.1.1 Généralités . 6
7.1.2 Création de l’amplicon (tâche 1, étape 1) . 7
7.1.3 Préparation des étalons de qPCR (tâche 1, étape 2) . 7
7.1.4 ADN d’isolat, ADN environnemental, ADN artificiel . 7
7.1.5 Étalonnage de la qPCR (tâche 1, étape 3) .10
7.2 Préparation d’une matrice d’ADN du sol et test d’inhibition (tâche 2) .11
7.2.1 Généralités .11
7.2.2 Préparation de l’ADN du sol (tâche 2, étape 4) .11
7.2.3 Test d’inhibition (tâche 2, étape 5) .11
7.2.4 Dilution de la matrice d’ADN .12
7.3 Essai de qPCR (tâche 3) .13
7.3.1 Généralités .13
7.3.2 qPCR .13
7.4 Validation et examen de l’essai de qPCR (tâche 4) .13
7.4.1 Généralités .13
7.4.2 Validation de l’essai de qPCR .13
7.4.3 Calcul du nombre de copies du gène d’intérêt dans l’extrait d’ADN du sol .14
8 Examen des étapes critiques de l’essai de qPCR .14
9 Expression des résultats de l’essai de qPCR .15
10 Étude interlaboratoires internationale .15
11 Rapport d’essai .15 ®
Annexe A (informative) Description des principales étapes d’un essai de qPCR TaqMan .16
Annexe B (informative) Étude interlaboratoires internationale relative à l’évaluation de la
qPCR pour quantifier l’abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à
partir d’ADN extrait directement du sol .18
Bibliographie .31
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO, participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 190, Qualité du sol, sous–comité
SC 4, Méthodes biologiques.
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Introduction
L’ADN (acide désoxyribonucléique) est un constituant majeur de tous les organismes vivants codant
pour les enzymes responsables de leurs activités biologiques. L’étude des séquences d’ADN extrait
de différentes matrices environnementales, à l’aide d’approches moléculaires, permet de fournir des
marqueurs moléculaires qui peuvent être utilisés pour différencier et identifier clairement différents
organismes (bactéries, archées et eucaryotes).
Jusqu’à présent, la plupart des études visant à développer des indicateurs microbiens de la qualité du
sol et applicables aux milieux complexes, tels que le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de
nombreux micro-organismes dans des conditions de laboratoire et par le manque de sensibilité des
méthodes de microbiologie classiques. Le développement récent de nombreuses méthodes de biologie
moléculaire reposant sur l’amplification des acides nucléiques extraits du sol a permis de proposer une
alternative pertinente à la microbiologie pasteurienne permettant de décrire en détail la composition,
[2] [3] [4] [5] [6]
la richesse et la structure des communautés microbiennes.   Les approches reposant sur
l’extraction de l’ADN à partir d’échantillons environnementaux sont désormais bien établies dans le
domaine de l’écologie des sols et servent de marqueurs génétiques permettant d’évaluer la diversité
microbienne. Les résultats d’analyses moléculaires des communautés et/ou populations microbiennes
du sol reposent sur deux paramètres principaux: a) l’extraction d’ADN représentatif de la composition
de la communauté microbienne indigène et b) les biais introduits par la PCR, notamment le choix des
amorces oligonucléotidiques, la concentration de l’ADN utilisé comme matrice, les erreurs de PCR ou
[7] [4] [8] [9]
encore la méthode d’analyse post-PCR choisie.
De nombreuses études ont été menées avec ces nouvelles méthodes permettant d’améliorer l’extraction,
[10]
la purification, l’amplification et la quantification de l’ADN des sols. Récemment, l’ISO 11063
décrivant «une méthode pour extraire directement les acides nucléiques d’échantillons de sol», dérivée
de la Référence [10], a ouvert de nouvelles perspectives de développement d’approches moléculaires
[11]
normalisées pour estimer la qualité du sol.
La présente Norme internationale a pour objectif de décrire le mode opératoire utilisé pour mettre en
place et réaliser une PCR quantitative afin de quantifier l’abondance de groupes microbiens du sol ainsi
que celle de groupes fonctionnels à partir d’extrait d’ADN de sol. La quantification des phyla microbiens
du sol ainsi que des groupes fonctionnels par des essais de qPCR peut contribuer au développement
d’outils de routine permettant de surveiller la qualité du sol. La répétabilité et la reproductibilité de la
méthode d’amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) quantitative ont été évaluées
lors d’une étude interlaboratoires internationale (voir Annexe B). La répétabilité de cette méthode a été
évaluée avec succès pour les essais de qPCR ciblant les gènes ARNr 16S ainsi que des gènes codant un
marqueur fonctionnel de bactéries dénitrifiantes (le gène nitrite réductase nirK). La reproductibilité de
cette méthode a révélé un effet de laboratoire qui peut être surmonté en interprétant les résultats de la
quantification de l’abondance de groupes microbiens par comparaison, soit en utilisant une référence
externe (ADN extrait d’une souche témoin) lors de l’essai de qPCR, soit en calculant un pourcentage de
variations entre traitements pour normaliser les données.
NORME INTERNATIONALE ISO 17601:2016(F)
Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences
de gènes microbiens par amplification par réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) quantitative à partir d’ADN
directement extrait du sol
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie les étapes principales d’une méthode d’amplification par
réaction de polymérisation en chaîne (PCR) quantitative (qPCR) permettant de mesurer l’abondance de
séquences spécifiques de gènes microbiens à partir d’un extrait d’ADN du sol qui fournit une estimation
de l’abondance de groupes microbiens spécifiques.
Il convient de noter que le nombre de gènes n’est pas nécessairement lié directement au nombre de
micro-organismes mesurés. Par exemple, le nombre d’opérons ribosomiques est compris entre une
et 20 copies dans différents phyla bactériens. Par conséquent, le nombre de séquences d’ARNr 16S
quantifiées dans des extraits d’ADN du sol ne donne pas une estimation exacte du nombre de bactéries
contenues dans le sol. Par ailleurs, le nombre de séquences n’est pas nécessairement lié à des micro-
organismes vivants et peut comprendre des séquences amplifiées à partir de l’ADN extrait de micro-
organismes morts.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la
manipulation et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire
des processus, de la biomasse et de la diversité microbiens
ISO 11063, Qualité du sol — Méthode pour extraire directement l’ADN d’échantillons de sol
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
ADN du sol
ADN extrait du biote vivant et mort du sol
EXEMPLE Micro-organismes, plantes, animaux.
3.2
amplification par réaction de polymérisation en chaîne
PCR
méthode permettant l’amplification d’une séquence spécifique d’ADN en utilisant un jeu spécifique
d’amorces oligonucléotidiques
3.3
amplification par réaction de polymérisation en chaîne quantitative
qPCR
méthode permettant la quantification dans une matrice (3.4) d’ADN du nombre d’une séquence
spécifique d’ADN en utilisant un jeu spécifique d’amorces oligonucléotidiques
3.4
matrice
échantillon d’ADN utilisé pour réaliser une réaction de PCR (3.2) afin d’amplifier une séquence
spécifique d’ADN
3.5
amplicon
produit de PCR obtenu par PCR (3.2) à partir d’une matrice (3.4)
3.6
vecteur de clonage
molécule d’ADN circulaire dans laquelle l’amplicon (3.5) est inséré par réaction de ligation, utilisée pour
la transformation d’Escherichia coli compétente en vue du clonage de l’amplicon
3.7
étalon de qPCR
ADN cible cloné utilisé comme matrice (3.4) pour la réaction qPCR afin d’établir la courbe d’étalonnage
de l’abondance d’une séquence cible en fonction des valeurs du cycle seuil (Ct)
3.8
témoin négatif
NTC
témoin, généralement de l’eau de qualité biologie moléculaire, qui est utilisé comme témoin négatif dans
l’essai de qPCR pour vérifier l’absence de contaminant dans le mélange de qPCR
3.9
cycle seuil
Ct
nombre de cycles de qPCR requis pour que le signal fluorescent franchisse la valeur seuil (c’est-à-dire
dépasse le bruit de fond)
Note 1 à l’article: La valeur de Ct est inversement proportionnelle à l’abondance de la séquence cible.
4 Principe
La présente Norme internationale décrit l’essai de qPCR utilisant un colorant fluorescent se fixant à
l’ADN comme rapporteur. Cet essai de qPCR a été validé lors d’une étude interlaboratoires internationale
menée avec le SYBR Green, un colorant fluorescent se fixant à l’ADN double brin et pouvant être détecté
en mesurant l’augmentation de fluorescence au cours du cycle.
La méthode vise à mesurer l’abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à partir d’un
extrait d’ADN du sol. La méthode comprend quatre tâches et huit étapes, comme résumé à la Figure 1.
Selon la Référence [1], les trois étapes critiques devant être validées pour chaque essai de qPCR sont
telles qu’indiquées à la Figure 1.
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Figure 1 — Principales tâches et étapes critiques permettant d’estimer l’abondance de
séquences spécifiques de gènes microbiens par un essai de qPCR
La présente Norme internationale décrit l’essai de qPCR basé sur l’utilisation d’un colorant fluorescent
se fixant à l’ADN double brin qui a été validé par une étude interlaboratoires internationale utilisant le
1) 2)
® ®
qPCR SYBR Green . L’Annexe A fournit des informations sur l’essai de qPCR TaqMan qui n’a pas fait
l’objet d’une étude interlaboratoires internationale. La première tâche comporte trois étapes décrivant
la création d’un amplicon optimal pour la qPCR (étape une), la préparation d’étalons de qPCR (étape
deux) et le mode opératoire d’étalonnage de l’essai de qPCR (étape trois). La deuxième tâche comporte
deux étapes supplémentaires décrivant les modes opératoires de préparation des échantillons d’ADN
du sol (étape quatre) et d’essai pour détecter la présence d’inhibiteurs de qPCR dans les échantillons
d’ADN du sol (étape cinq). La troisième tâche comporte une seule étape décrivant le protocole pour
réaliser l’essai qPCR (étape six). Enfin, la quatrième tâche comporte deux étapes, l’une décrivant la
procédure de validation des essais de qPCR (étape sept) afin de vérifier la qualité de l’essai de qPCR,
et l’autre décrivant les différentes options permettant de calculer le nombre de copies de la séquence
du gène d’intérêt à partir du cycle seuil (Ct) obtenu par l’analyse des courbes d’amplification par qPCR
(étape huit).
5 Matériel d’essai
5.1 ADN
5.1.1 ADN, extrait d’isolats bactériens et fongiques purs en utilisant des modes opératoires d’extraction
classiques ou en utilisant un kit commercial pour extraire l’ADN génomique.
5.1.2 ADN du sol, extrait d’aliquotes de sol conformément à l’ISO 11063.
5.2 Bactéries
5.2.1 Souche d’Escherichia coli, habituellement utilisée pour le clonage d’un produit de PCR.
5.3 Plasmide
5.3.1 Vecteur de clonage, habituellement utilisé pour le clonage d’un produit de PCR dans une souche
d’Escherichia coli compétente.
5.4 Enzymes
5.4.1 Taq polymérase.
5.4.2 T4 ADN ligase.
5.4.3 Protéine T32 codée par le gène correspondant du phage T4.
5.4.4 Albumine de sérum de bovin (n° CAS 9048-46-8).
5.5 Produits chimiques
5.5.1 Ampicilline sodique, C H N NaO S (n° CAS 69-52-3).
16 18 3 4
1) SYBR Green est une marque déposée de Molecular Probes. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du
produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est possible de démontrer qu’ils conduisent
aux mêmes résultats.
2) TaqMan est une marque déposée de Roche Molecular Systems, Inc. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du
produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est possible de démontrer qu’ils conduisent
aux mêmes résultats.
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5.5.2 Acide borique, BH O (n° CAS 10043-35-3).
3 3
5.5.3 Solution de désoxynucléotides, dNTPs. ®
5.5.4 Agent intercalent SYBR Safe permettant de visualiser l’ADN sur gel.
5.5.5 Sel disodique de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), C H N O Na ·2 H O
10 14 2 8 2 2
(n° CAS 6381-92 6).
5.5.6 Glucose, C H O (n° CAS 50-99-7).
6 12 6
5.5.7 Acide chlorhydrique, HCl (n° CAS 7647-01-0).
5.5.8 IPTG, Isopropyl-bêta-D-Thiogalactopyranoside (n° CAS 367-93-1).
5.5.9 Chlorure de magnésium, MgCl (n° CAS 7786-30-3).
5.5.10 Sulfate de magnésium, MgSO (n° CAS 7487-88-9).
5.5.11 Eau de qualité biologie moléculaire, H O.
5.5.12 Chlorure de potassium, KCl (n° CAS 7447-40-7).
5.5.13 Chlorure de sodium, NaCl (n° CAS 7647-14-5).
5.5.14 Tris[hydroxyméthyl]aminométhane, C H NO (n° CAS 77-86-1).
4 11 3
5.5.15 X-Gal, bromo-5-chloro-4-indolyl-3-bêta-D-galactopyranoside (n° CAS 7240-90-6).
5.6 Produit pour le milieu de culture bactérienne
3) ®
5.6.1 Bacto tryptone , digestat enzymatique de caséine.
5.6.2 Extrait de levure en poudre (n° CAS 8013-01-2).
5.7 Tampon et réactifs
5.7.1 Solution d’ampicilline, 2 g d’ampicilline sodique dans 4 ml de H O stérilisée à l’aide d’un filtre
de 0,22 µm. Compléter à 20 ml avec H O stérilisée, préparer des aliquotes de 1 ml et conserver à - 20 °C.
-1
5.7.2 EDTA, 0,5 mol·l , 186,10 g d’EDTA dans 1 000 ml de H O, en ajustant le pH à 8,0 à l’aide de NaOH
-1
(10 mol·l ).
5.7.3 Agent intercalant SYBR Safe™ permettant de visualiser l’ADN sur gel, diluer 10 000X de SYBR
Safe™ dans un tampon TBE × 1.
3) Bacto tryptone est la marque déposée d’un produit fourni par Difco Laboratories. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi
exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est possible de démontrer qu’ils
conduisent aux mêmes résultats.
5.7.4 Solution mère d’IPTG, 1 g d’IPTG dans 8 ml de H O. Après l’avoir mélangée soigneusement,
la solution est complétée à 10 ml et stérilisée dans un poste de sécurité microbiologique. Préparer une
aliquote de 1 ml d’IPTG et la conserver à - 20 °C. ®
5.7.5 Milieu LB solide, 10 g de Bacto tryptone , 5 g d’extrait de levure, 5 g de chlorure de sodium et
15 g de gélose, dans 1 000 ml de H O. Après autoclavage pendant 20 min à 120 °C, 1 ml d’une solution
-1
mère d’ampicilline à 100 mg·ml est ajouté au milieu LB et étalé dans des boîtes de Petri (20 ml) dans
un poste de sécurité microbiologique. 100 µl de solution d’IPTG sont étalés sur le milieu LB solide-
ampicilline. Lorsque la solution d’IPTG a pénétré le milieu LB-ampicilline, 20 µl de solution X-Gal sont
étalés sur le milieu LB solide-ampicilline. Le milieu LB solide est conservé à 4 °C jusqu’à son utilisation. ®
5.7.6 Milieu SOC, 20 g de Bacto tryptone , 5 g d’extrait de levure, 0,58 g de NaCl, 0,95 g de MgCl ,
2,46 g de MgSO et 3,60 g de glucose dans 1 l de H O. Stériliser à l’autoclave pendant 20 min à 120 °C.
4 2
Préparer des aliquotes de 950 ml et les conserver à - 20 °C.
-1
5.7.7 Tris-HCl, 1 mol·l , 121,14 g de Tris dans 1 000 ml de H O, en ajustant le pH à 8,0 avec du HCl
4 mol/l.
-1
Tampon TBE × 10, pH 8,0, 108 g de base Tris, 55 g d’acide borique et 40 ml d’EDTA 0,5 mol·l (pH 8,0)
dans 1 000 ml de H O.
5.7.8 Tampon TBE × 1, 100 ml de tampon TBE × 10 dans 900 ml de H O.
-1 -1
5.7.9 Tampon TE × 10, pH 8,0, 100 ml de Tris-HCl 1 mol·l à pH 8,0, 20 ml d’EDTA 50 mmol·l à pH 8,0
dans 880 ml d’eau de qualité biologie moléculaire.
5.7.10 Tampon TE × 1, 100 ml de tampon TE × 10 dans 900 ml de H O.
5.7.11 Solution X-gal, 250 mg de X-Gal dans 5 ml de diméthylformamide. Après homogénéisation,
préparer des aliquotes de 0,5 ml et les conserver à - 20 °C.
6 Appareillage
Utiliser un matériel de laboratoire courant, notamment pipettes, centrifugeuse, poste de sécurité
microbiologique, hotte chimique, système d’électrophorèse horizontale et les éléments suivants.
6.1 PCR quantitative, permettant de quantifier en temps réel des amplicons générés à partir de
diverses matrices d’ADN, avec une limite de détection théorique d’une copie d’une séquence d’ADN cible
dans la prise d’échantillon analysée.
6.2 Spectrophotomètre, permettant de quantifier l’ADN double brin à 260 nm.
6.3 Spectrofluorimètre, permettant de quantifier l’ADN double brin.
NOTE Un seul de ces deux appareils est requis pour estimer la concentration d’ADN.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l’essai de qPCR (tâche 1)
7.1.1 Généralités
L’essai de qPCR est basé sur la quantification des amplicons à la fin de chaque cycle de PCR en utilisant
un colorant d’ADN qui émet une fluorescence lorsqu’il est intercalé dans le double brin des amplicons.
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Le but de cette tâche est de décrire la définition d’un amplicon approprié en vue d’un essai de qPCR
(étape une), de la préparation d’un étalon de qPCR (étape deux) et de l’étalonnage de l’essai de qPCR
(étape trois).
7.1.2 Création de l’amplicon (tâche 1, étape 1)
7.1.2.1 Généralités
La première étape vise à créer un jeu d’amorces oligonucléotidiques. Il peut être conçu in silico à l’aide
de différents programmes en utilisant la séquence du gène microbien d’intérêt devant être quantifiée
par qPCR à partir d’extraits d’ADN de sol. La spécificité des amorces doit être vérifiée in silico en
comparant leurs séquences à des séquences connues disponibles dans la base de données Genbank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Seules les amorces spécifiques pour le gène cible doivent
être prises en compte. Les principaux paramètres à considérer pour la conception d’un jeu d’amorces
oligonucléotidiques en vue d’un essai de qPCR sont indiqués ci-après.
7.1.2.2 qPCR
— La longueur optimale de l’amplicon est comprise entre 100 pb et 250 pb.
— La longueur optimale des amorces est comprise entre 18 pb et 25 pb, avec une teneur en GC de 50 %
et une température de fusion comprise entre 58 °C et 65 °C.
— Il convient que les cinq nucléotides au niveau de l’extrémité 3” de chaque amorce ne contiennent pas
plus de deux bases G et/ou C.
— Éviter la succession de nucléotides identiques, en particulier pour la guanine.
— Il convient de vérifier et d’éviter l’auto-complémentarité 3” de l’amorce, indiquant sa tendance à
former des dimères avec elle-même.
— Éviter la conception d’amorces comportant plus de quatre mésappariements car une dégénérescence
trop importante de l’amorce contribue à la fluctuation des résultats de qPCR.
7.1.3 Préparation des étalons de qPCR (tâche 1, étape 2)
L’étape 2 de la tâche 1 décrit le mode opératoire utilisé pour générer des étalons de qPCR ciblant
une séquence du gène microbien d’intérêt à partir de différentes matrices d’ADN (isolat bactérien ou
fongique pur, ADN environnemental ou ADN artificiel). Elle indique également le mode opératoire
utilisé pour insérer l’étalon de qPCR dans un vecteur de clonage, transformer Escherichia coli et purifier
les plasmides recombinants contenant l’étalon de qPCR en vue de leur utilisation ultérieure pour des
essais de qPCR.
7.1.4 ADN d’isolat, ADN environnemental, ADN artificiel
7.1.4.1 Généralités
La première étape de la préparation d’étalons de qPCR repose sur l’extraction de matrices d’ADN
connues pour contenir le gène microbien d’intérêt. Elle peut être réalisée à partir de différentes
matrices telles que les suivantes:
a) cultures pures de microorganismes;
L’ADN est extrait de cellules prélevées dans une culture fraîche de microorganismes en utilisant des
protocoles d’extraction d’ADN génomique classiques.
b) ADN artificiel.
Si aucun échantillon biologique n’est disponible ou connu pour contenir le gène d’intérêt, il est possible
de synthétiser de l’ADN artificiel constitué de la séquence du gène d’intérêt.
Dans tous les cas, la qualité de la matrice d’ADN utilisée pour amplifier l’étalon de qPCR par PCR doit être
vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 1 % dans un tampon TBE, coloré avec un agent intercalant
approprié (par exemple SYBR Safe™). La concentration d’ADN est mesurée par spectrophotométrie à
-1
260 nm ou par spectrofluorimétrie. La matrice d’ADN est diluée à 10 ng·µl dans un volume final de
20 µl et conservée à - 20 °C.
La séquence étalon de qPCR est amplifiée en utilisant un jeu d’amorces spécifique conçu conformément
aux recommandations données dans la tâche 1 de l’étape 1. La réaction d’amplification est réalisée
-1
dans un volume final de 25 µl contenant 2,5 µl de tampon Taq polymérase 10 ×, 200 µmol·l de chaque
-1 -1
dNTP, 1,5 mmol·l de MgCl , 0,5 µmol·l de chaque amorce et 0,625 U de Taq polymérase. Un volume
de 2,5 µl d’ADN (par exemple 25 ng d’ADN) est utilisé comme matrice pour les réactions PCR. La PCR
est réalisée dans un thermocycleur conformément au programme suivant: un cycle de 4 min à 94 °C;
39 cycles de 1 min à 94 °C, 1 min à la température d’hybridation propre à l’amplicon étalon de qPCR,
1,5 min à 72 °C et une étape finale d’élongation à 72 °C pendant 5 min. La taille attendue de l’amplicon
étalon de qPCR est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 2 % dans un tampon TBE coloré
avec un agent intercalant approprié (par exemple SYBR Safe™). Les amplicons sont purifiés sur gel par
des méthodes appropriées ou en utilisant des colonnes de chromatographie d’exclusion pour éliminer
les amorces. Les amplicons purifiés sont ensuite quantifiés par spectrophotométrie à 260 nm ou par
spectrofluorimétrie.
7.1.4.2 Clonage, préparation des dilutions d’étalon de qPCR
7.1.4.2.1 Ligature d’un amplicon d’étalon de qPCR
Pour un rapport molaire de 3:1 garantissant une réaction de ligation optimale de l’amplicon dans le
vecteur de clonage, la masse de produit de PCR (Q en ng d’ADN) à utiliser pour la ligature peut être
calculée (voir Formule 1):
mn
ADN plasmidiquei× nsert
Q=×3 (1)
n
plasmide
Q = [(quantité d’ADN plasmidique × taille de l’insert (pb))/taille du plasmide (pb)] × (3/1)
où
Q est la masse de produit de PCR, en nanogrammes (ng);
m est la masse d’ADN plasmidique, en nanogrammes (ng);
ADN plasmidique
n est la taille de l’insert, en pb;
insert
n est la taille du plasmide, en pb.
plasmide
Compte tenu d’une taille de plasmide de 3 000 pb, d’un insert ARNr 16S de 200 pb et de 50 ng d’ADN
plasmidique par réaction de ligation, la quantité d’amplicon de PCR à utiliser par ligature est (voir
Formule 2):
50×200
Q= ×=310 (2)
La réaction de ligation est réalisée avec la quantité requise d’amplicon purifié d’étalon de qPCR (Q),
50 ng d’ADN plasmidique, 5 µl de tampon de ligature 2 ×, 3 U de T4 ADN ligase et suffisamment d’eau de
qualité biologie moléculaire pour atteindre un volume final de 10 µl. La réaction de ligation est conduite
à 4 °C pendant toute une nuit ou, pour une T4 ADN ligase appropriée, une heure à température ambiante.
L’efficacité de la ligation est vérifiée par électrophorèse en chargeant 1 µl de plasmide ligué et de
plasmide ouvert (c’est-à-dire 5 ng de plasmide) sur un gel d’agarose à 1 % dans un tampon TBE coloré
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par un agent intercalant approprié. Le plasmide ligué est caractérisé par une plus courte migration
dans le gel d’agarose.
7.1.4.2.2 Transformation d’Escherichia coli compétente
Des cellules E. coli compétentes sont transformées par un choc thermique comme décrit ci-dessous.
8 -1
Des cellules compétentes (10 ufc·µg d’ADN) fraîchement décongelées sont incubées pendant 5 min
dans de la glace. Ensuite, 1 µl du réactif de ligation est ajouté aux cellules, mélangé doucement et incubé
pendant 20 min sur de la glace. Les cellules bactériennes sont alors soumises à un choc thermique par
une incubation de 50 s à 42 °C, immédiatement suivie d’une incubation de 2 min sur de la glace. Ensuite,
950 µl de milieu SOC sont ajoutés et les cellules bactériennes sont incubées à 37 °C sous agitation à
-1
150 min pendant 1 h. Des aliquotes de cellules bactériennes de 100 µl sont étalées sur un milieu
LB/Amp/IPTG/X-Gal solide. Les boîtes de Petri sont ensuite incubées à 37 °C pendant toute une nuit.
7.1.4.2.3 Criblage de clone recombinant
Les boîtes de Petri sont placées à 4 °C pendant plusieurs heures pour accentuer la coloration des colonies
bactériennes. Des colonies blanches sont prélevées, étalées sur un milieu LB/Amp/IPTG/X-Gal solide et
incubées pendant toute une nuit à 37 °C. Plusieurs colonies blanches sont prélevées et suspendues dans
100 µl d’eau de qualité biologie moléculaire. Une PCR est réalisée pour confirmer la présence de l’insert
dans le clone recombinant. L’insert est amplifié par PCR en utilisant des amorces SP6 (5’-ATT TAG GTG
ACA CTA TAG -3’) et T7 (5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG -3’). La réaction d’amplification est réalisée
-1
dans un volume final de 25 µl contenant 2,5 µl de tampon Taq polymérase 10 ×, 200 µmol·l de chaque
-1 -1
dNTP, 1,5 mmol·l de MgCl , 0,5 µmol·l de chaque amorce et 0,625 U de Taq polymérase. Un volume
de 2,5 µl de chaque suspension bactérienne est utilisé comme matrice pour les réactions PCR. La PCR
est réalisée dans un thermocycleur conformément au programme suivant: un cycle de 4 min à 94 °C,
35 cycles de 45 s à 94 °C, 45 s à 55 °C, 1,5 min à 72 °C et une étape finale d’élongation à 72 °C pendant
5 min. La taille de l’amplicon de qPCR attendu est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 2 %
dans un tampon TBE coloré avec un agent intercalant approprié.
7.1.4.2.4 Purification et linéarisation du plasmide recombinant
Les clones recombinants, de couleur blanche confirmée par PCR, sont inoculés dans 10 ml d’un
-1
milieu LB/Amp liquide incubé à 37 °C sous agitation (150 min ) pendant toute une nuit. Le plasmide
recombinant est purifié à partir de 2 ml de suspension cellulaire en utilisant une mini-préparation
classique. L’ADN plasmidique est ensuite quantifié par spectrophotométrie à 260 nm et des aliquotes
sont préparées et conservées à - 20 °C jusqu’à leur utilisation.
Le plasmide est linéarisé par une enzyme de restriction présentant un seul site de restriction dans la
séquence du plasmide. L’utilisateur doit s’assurer que l’enzyme de restriction choisie ne coupe pas aussi
l’insert. La digestion du plasmide est réalisée pendant toute une nuit à 37 °C dans un volume final de
10 µl contenant 250 ng de plasmide recombinant, 0,5 U d’enzyme de restriction, 1 µl de tampon pour
enzyme de restriction 10× et de l’eau de qualité biologie moléculaire. L’efficacité de la restriction du
plasmide est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %. Le plasmide linéarisé est conservé à
- 20 °C et utilisé comme solution mère pour préparer une série de dilutions de l’étalon de qPCR utilisé
pour étalonner l’essai de qPCR.
La concentration en ADN du plasmide linéarisé est mesurée par spectrophotométrie à 260 nm ou par
spectrofluorimétrie afin de déterminer le nombre de copies du plasmide. Cette opération peut être
facilitée par l’utilisation d’un calculateur en ligne tel qu’Oligocalc (http://www.basic.northwestern.
edu/biotools/oligocalc.html). A partir de cette solution mère, une solution initiale contenant
0,5 × 10 copies de l’étalon de qPCR par µl est préparée dans 100 µl d’eau de qualité biologie moléculaire.
Une série de dilutions au dixième est ensuite préparée pour atteindre 0,5 × 10 copies du plasmide par
µl. Des dilutions intermédiaires supplémentaires peuvent également être préparées en fonction de la
gamme dans laquelle les nombres de copies du gène cible sont attendus.
7.1.5 Étalonnage de la qPCR (tâche 1, étape 3)
7.1.5.1 Généralités
La procédure utilisée pour générer la courbe d’étalonnage et évaluer l’efficacité de l’essai de qPCR est
décrite ci-après.
7.1.5.2 Essai de qPCR
L’étalonnage de l’essai de qPCR est réalisé sur une série de dilutions de l’étalon cloné (allant de 10 à
10 copies par µl) en utilisant un jeu d’amorces ciblant le gène d’intérêt. La réaction d’amplification
-1
est réalisée dans un volume final de 15 µl contenant 2 µl de l’étalon de plasmide, 1 µmol·l de chaque
amorce, 7,5 µl du mélange maître Taq 2× ou 1,5 µl du mélange maître Taq 10× contenant un colorant
fluorescent se fixant à l’ADN, les dNTPs, du MgCl et la Taq polymérase, et de l’eau de qualité biologie
moléculaire. La réaction qPCR est réalisée dans un thermocycleur en temps réel conformément
au programme suivant: un cycle de 15 min à 95 °C, 35 cycles de 30 s à 95 °C, 30 s à la température
d’hybridation, 30 s à 72 °C, 30 s à 80 °C au cours desquels la fluorescence est collectée et une étape
finale de dissociation en augmentant la température de 80 °C à 95 °C. L’étalonnage de la qPCR est réalisé
en trois exemplaires et trois témoins négatifs (NTC) sont également inclus.
7.1.5.3 Détermination de la courbe d’étalonnage et calcul de l’efficacité de la qPCR
À la fin de l’essai de qPCR, les résultats sont analysés en utilisant l’option automatique. La validation de
la qPCR exige les observations suivantes: a) aucune amplification pour les témoins négatifs (NTC), b) un
seul pic de dissociation pour chaque dilution de l’étalon de qPCR et c) une courbe d’étalonnage linéaire
avec r supérieur ou égal à 98 %. La courbe d’étalonnage de la qPCR donne le nombre de Ct en fonction
du nombre (log) de copies de la séquence étalon.
L’efficacité de l’essai de qPCR est estimée comme indiqué dans la Formule 3 à partir des valeurs
déterminées à l’aide de la formule de la courbe d’étalonnage:
Ct =⋅aq+c (3)
où
Ct est le cycle seuil mesuré;
q est le nombre de copies de la séquence étalon de la qPCR;
a est la pente de la courbe d’étalonnage;
c est l’ordonnée à l’origine (Ct pour 1 copie de l’étalon de qPCR).
−1 a
()
E =−10 1 (4)
où
E est l’efficacité de la courbe d’étalonnage;
a est la pente de la courbe d’étalonnage.
Il faut noter qu’une courbe d’étalonnage ayant une pente égale à - 3,32 correspond à une efficacité de
100 %. Une dilution au demi ou au dixième d’une matrice d’ADN donnée donne une différence de Ct de 1
8 7
ou de 3,3 respectivement (c’est-à-dire 10 Ct = 10 et 10 Ct = 13,3) pour un essai de qPCR efficace à 100 %.
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7.2 Préparation d’une matrice d’ADN du sol et test d’inhibition (tâche 2)
7.2.1 Généralités
Cette tâche décrit le mode opératoire utilisé pour préparer une matrice d’ADN et pour vérifier la
présence d’inhibiteurs de la Taq polymérase dans les extraits d’ADN utilisés comme matrice pour l’essai
de qPCR. Ce test d’inhibition est un prérequis obligatoire pour valider la qualité des extraits d’ADN et
permettre leur utilisation comme matrice pour mener des essais de qPCR.
7.2.2 Préparation de l’ADN du sol (tâche 2, étape 4)
L’étape 4 de la tâche 2 décrit le mode opératoire utilisé pour extraire l’ADN d’échantillons de sol. Les
échantillons de sols doivent être échantillonnés, manipulés et conservés conformément à l’ISO 10381-6.
L’extraction de l’ADN du sol doit être effectuée conformément à l’ISO 11063. Les échantillons d’ADN du
sol sont dilués à 1 ng/µl et à 0,1 ng/µl et conservés à - 20 °C jusqu’à leur utilisation.
7.2.3 Test d’inhibition (tâche 2, étape 5)
Le mode opératoire utilisé pour détecter la présence d’inhibiteurs de la Taq polymérase dans les extraits
d’ADN du sol est décrit ci-après. Cette étape est un prérequis qui doit être effectué avant de réaliser
un essai de qPCR à partir d’extraits d’ADN du sol. En effet, les inhibiteurs de la Taq polymérase, tels
que les substances humiques, sont souvent co-extraits avec l’ADN du sol et seul un extrait d’ADN du sol
exempt d’inhibiteurs peut être soumis à une analyse par qPCR pour estimer l’abondance de séquences
spécifiques de gènes microbiens dans le sol. Deux tests d’inhibition sont décrits ci-après.
7.2.3.1 Ajout d’une quantité connue d’ADN exogène dans un extrait d’ADN du sol
La recherche d’inhibiteurs peut être effectuée en quantifiant l’abondance d’ADN exogène introduit en
quantité connue dans l’ADN du sol. Le protocole proposé ci-dessous décrit les analyses effectuées après
l’ajout d’une quantité connue d’ADN plasmidique à un extrait d’ADN du sol. Ce mode opératoire peut être
adapté à n’importe quelles autres sources d’ADN exogène en réalisant la qPCR avec un jeu d’amorces
approprié spécifique pour la séquence d’ADN exogène introduit.
La qPCR est réalisée à l’aide d’amorces SP6 et T7 spécifiques du plasmide. La réaction d’amplification
est réalisée dans un volume final de 15 µl contenant 2 µl d’ADN plasmidique, 2 µl d’ADN du sol (en
-1 -1
utilisant les deux dilution 1 et 0,1 ng·µl ), 1,0 µmol·l de chaque amorce, 7,5 µl du mélange maître Taq
2× ou 1,5 µl du mélange maître Taq 10× contenant le colorant fluorescent se fixant à l’ADN, les dNTPs,
du MgCl et la Taq polymérase, et de l’eau de qualité biologie moléculaire. La réaction qPCR est réalisée
dans un thermocycleur en temps réel conformément au programme suivant: un cycle de 15 min à 95 °C;
30 cycles de 15 s à 95 °C, 30 s à 55 °C et 30 s à 72 °C. Le test d’inhibition de SP6-T7de la qPCR est réalisé
pour chaque dilution de l’extrait d’ADN du sol à évaluer, trois témoins positifs contenant uniquement
l’ADN plasmidique et trois témoins négatifs
...