ISO 15952:2006
(Main)Soil quality - Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) - Determination of the effects on growth by soil contamination
Soil quality - Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) - Determination of the effects on growth by soil contamination
ISO 15952:2005 specifies a semi-static method for the determination of the effects of contaminants on growth and survival of young snails, usually Helix aspersa aspersa Müller. The animals are exposed via the cutaneous and digestive route using a test substrate (artificial or natural soil according to the objective of the study) to which defined amounts of the following are added: substances or preparations; and soils (contaminated or of unknown quality) or waste materials. A static method is also described. ISO 15952:2005 does not apply to volatile substances, i.e. substances for which the Henry constant, H, or the air/water partition coefficient is over 1, or for which the vapour pressure is over 0,013 3 Pa at 25 °C. This test takes into account possible changes in the test substance, preparation, soil or waste material because the test mixture is prepared and renewed every 7 days during the 28-day test period.
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des escargots juvéniles (Helicidae) — Détermination des effets sur la croissance par contamination du sol
L'ISO 15952:2005 s'applique à une méthode semi-statique pour la détermination des effets de contaminants sur la croissance et la survie d'escargots juvéniles, généralement Helix aspersa aspersa Müller. Les animaux sont exposés par les voies cutanée et digestive à un substrat d'essai (sol artificiel ou naturel selon l'objectif de l'étude) auquel sont ajoutées des quantités définies de substances ou de préparations, de sols (contaminés ou de qualité inconnue) ou de déchets. Une méthode statique est aussi décrite. L'ISO 15952:2005 ne s'applique pas aux substances volatiles, c'est-à-dire aux substances dont la constante de Henry, H, ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression de vapeur est supérieure à 0,013 3 Pa à 25 °C. Cet essai prend en considération le changement éventuel de la substance d'essai, de la préparation, du sol ou des déchets, étant donné que le mélange d'essai est préparé et renouvelé tous les 7 jours pendant la période d'essai de 28 jours.
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ISO 15952:2006 is a standard published by the International Organization for Standardization (ISO). Its full title is "Soil quality - Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) - Determination of the effects on growth by soil contamination". This standard covers: ISO 15952:2005 specifies a semi-static method for the determination of the effects of contaminants on growth and survival of young snails, usually Helix aspersa aspersa Müller. The animals are exposed via the cutaneous and digestive route using a test substrate (artificial or natural soil according to the objective of the study) to which defined amounts of the following are added: substances or preparations; and soils (contaminated or of unknown quality) or waste materials. A static method is also described. ISO 15952:2005 does not apply to volatile substances, i.e. substances for which the Henry constant, H, or the air/water partition coefficient is over 1, or for which the vapour pressure is over 0,013 3 Pa at 25 °C. This test takes into account possible changes in the test substance, preparation, soil or waste material because the test mixture is prepared and renewed every 7 days during the 28-day test period.
ISO 15952:2005 specifies a semi-static method for the determination of the effects of contaminants on growth and survival of young snails, usually Helix aspersa aspersa Müller. The animals are exposed via the cutaneous and digestive route using a test substrate (artificial or natural soil according to the objective of the study) to which defined amounts of the following are added: substances or preparations; and soils (contaminated or of unknown quality) or waste materials. A static method is also described. ISO 15952:2005 does not apply to volatile substances, i.e. substances for which the Henry constant, H, or the air/water partition coefficient is over 1, or for which the vapour pressure is over 0,013 3 Pa at 25 °C. This test takes into account possible changes in the test substance, preparation, soil or waste material because the test mixture is prepared and renewed every 7 days during the 28-day test period.
ISO 15952:2006 is classified under the following ICS (International Classification for Standards) categories: 13.080.30 - Biological properties of soils. The ICS classification helps identify the subject area and facilitates finding related standards.
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15952
First edition
2006-02-15
Soil quality — Effects of pollutants on
juvenile land snails (Helicidae) —
Determination of the effects on growth by
soil contamination
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des escargots juvéniles
(Helicidae) — Détermination des effets sur la croissance par
contamination du sol
Reference number
©
ISO 2006
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Web www.iso.org
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Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 2
4 Principle. 3
5 Test environment. 3
6 Reagents. 3
7 Apparatus . 5
8 Storage and preparation of the samples. 6
8.1 Soil to be tested . 6
8.2 Waste material. 6
9 Procedure . 6
9.1 Preparation of the test. 6
9.2 Distribution of the test mixture . 8
9.3 Introduction of the feed. 8
9.4 Introduction of the biological reagent . 8
9.5 Handling during the tests . 8
10 Reference substance. 10
11 Calculations and expression of results. 10
11.1 Calculations. 10
11.2 Expression of results . 12
12 Validity of test for Helix aspersa aspersa . 13
13 Test report . 13
Annex A (normative) Static method . 15
Annex B (informative) Breeding technique for snails . 16
Annex C (informative) Example of composition of snail feed . 21
Annex D (informative) Example of table of data. 22
Annex E (informative) Example of results with Helix aspersa aspersa . 23
Annex F (informative) Determination of the effects on growth by food contamination . 26
Annex G (informative) Test performance with other snail species. 30
Bibliography . 31
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 15952 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
methods.
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Introduction
Because of the limited amount of data available concerning toxicity of contaminants on soil organisms, the
problems of assessing the ecotoxicity of soils and waste are cause for serious concern at both national and
international levels. Currently available tests use soil-fauna organisms restricted to annelid (earthworms and
Enchytraeidae) and arthropod phyla (insects: Collembola and Coleoptera). Among the latter, two standards
[5]
assess acute toxicity [earthworms (ISO 11268-1) and coleoptera larvae ] and three other standards assess
[2] [1] [3]
sublethal effects of soil contaminants on reproduction (earthworms , Collembola , Enchytraeidae ). In
the biological cycles of organisms, it appears that growth is, like reproduction, a fundamental ecophysiological
[33]
parameter to be taken into consideration for the sustainability of species and ecosystems .
[15]
Snails are pertinent ecological indicators for assessing the quality of soils , as they are characteristic of the
soil surface layer (saprophagous and phytophagous) of which a large part of the biological cycle takes place in
[6], [17], [26]
the soil (egg-laying, hatching, initial stages of development, hibernation, etc.) . During the other
phases of their cycle, they eat soil and are in contact with the soil via their moist pedal sole (foot) covered with
mucus and participate in the permanent exchanges with the soil (water, mineral salts, excrement and finally
[6], [17], [28]
shell and organic matter when they die) . In addition, they constitute an important link between
plants, fauna and soil microorganisms. They correspond fully to the criteria for a good biological indicator:
[8, 10 to 14, 16, 17, 19, 21,
easy to sample and identify, they are widely distributed; they accumulate contaminants
26, 27, 35 to 43] [6], [9], [29]
; their ecological and physiological characteristics are well-known ; and they are now
[19], [23, [29]
easy to breed under controlled conditions . Their susceptibility to common contaminants of their
[10 to 15, 18 to 27, 32, 33, 36 to 42]
environment has been demonstrated .
This International Standard describes a method for determining the effects on survival and growth of young
snails of substances, preparations, soils or waste materials added to an artificial or a natural soil. The
described method is thus applicable to test contaminated soils or to compare different uncontaminated soils.
The recommended species is Helix aspersa aspersa Müller (also commonly called: common garden snail,
brown garden snail, garden snail, land snail, “Petit-Gris”). Among land snails (stylommatophoran pulmonate
gastropod molluscs of the Helicidae family), Helix aspersa aspersa Müller is the most ubiquitous. This
palearctic species can be acclimated to regions with different types of climate: Mediterranean, oceanic
temperate, midcontinental temperate and even tropical. Helix aspersa aspersa Müller is of European origin
[9]
and has been introduced into all parts of the world. They are now on all continents except Antarctica .
Indeed, in their natural environment, snails integrate the contaminants by contact (with various substrates
such as soil, soil leachates, plant litter), by ingestion (of plants and soil), as well as through the respiratory
[6], [26]
tract . So, for specific testing purposes (evaluation of the toxicity of a pesticide, for example), another
test design, which is focussed on exposure via food uptake, is optionally available (Annex F and
Reference [4]).
INTERNATIONAL STANDARD ISO 15952:2006(E)
Soil quality — Effects of pollutants on juvenile land snails
(Helicidae) — Determination of the effects on growth by soil
contamination
1 Scope
This International Standard specifies a semi-static method for the determination of the effects of contaminants
on growth and survival of young snails, usually Helix aspersa aspersa Müller. The animals are exposed via
the cutaneous and digestive route using a test substrate (artificial or natural soil according to the objective of
the study) to which defined amounts of the following are added:
⎯ substances or preparations;
⎯ soils (contaminated or of unknown quality) or waste materials.
A static method may be implemented in addition to the semi-static method (optional). This method is
described in Annex A.
This method does not apply to volatile substances, i.e. substances for which the Henry constant, H, or the
air/water partition coefficient is over 1, or for which the vapour pressure is over 0,013 3 Pa at 25 °C.
This test takes into account the possible change in the test substance, preparation, soil or waste material
because the test mixture is prepared and renewed every 7 days during the 28-day test period.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis)
ISO 11268-1, Soil quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) — Part 1: Determination of
acute toxicity using artificial soil substrate
ISO 11269-2, Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora — Part 2: Effects of
chemicals on the emergence and growth of higher plants
ISO 11274, Soil quality — Determination of the water-retention characteristic — Laboratory methods
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method
EN 14735, Characterization of waste — Preparation of waste samples for ecotoxicity tests
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
test substrate
artificial soil or natural soil used as control and dilution substrate
3.2
matrix
soil or waste material under test
3.3
test mixture
mixture of the test substance, preparation or matrix with the test substrate
3.4
growth
increase in the biomass, i.e. in the total fresh mass (body and shell) of the organisms and increase in the
maximum shell diameter, between the start and completion of the test
NOTE It is expressed in the form of a growth coefficient.
3.5
effect concentration
EC
x
concentration at which a specific effect is detected; x is the percentage (10, 25, 50) of this effect, e.g. growth
inhibition
EXAMPLE EC means the concentration estimated to reduce growth at the end of the test to 50 % compared to the
control.
3.6
median lethal concentration
LC
concentration of the substance, of the test preparation initially present, or the concentration of the matrix
causing the death of 50 % of the snails submitted to testing
3.7
lowest observed effect concentration
LOEC
lowest tested concentration at which the test substance is observed to have a statistically significant effect
(p < 0,05) when compared with the control
NOTE All test concentrations above the LOEC have a harmful effect equal to or greater than those observed at the
LOEC. When these two conditions cannot be satisfied, a full explanation should be given for how the LOEC (and hence
the NOEC) has been selected.
3.8
no observed effect concentration
NOEC
test concentration immediately below the LOEC, which, when compared with the control, has no statistically
significant effect (p > 0,05) within a given exposure time
NOTE 1 The NOEC is the concentration just below the LOEC.
NOTE 2 For 3.5, 3.6, 3.7 and 3.8, results are given:
⎯ in dry mass of test substance or preparation per dry mass of the test substrate;
⎯ in mass percentage of the tested matrix in the test mixture (expressed in dry mass).
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4 Principle
Juvenile land snails (usually Helix aspersa aspersa Müller) are exposed during a period of 28 days to a test
mixture containing the test substance, preparation or matrix at different concentrations. The test mixture is
freshly prepared and renewed every 7 days.
According to the objectives, the test mixture may be prepared with artificial soil (6.3.2) or with a suitable
natural soil (6.3.3).
The snails are fed during the test with uncontaminated food.
The effects on growth (fresh mass and shell diameter) and on survival are measured after 28 days of
exposure (optionally, effects could be measured every 7 days during 28 days).
The results obtained during testing are compared with those of a control to determine the NOEC or LOEC and
to allow the estimation of the concentration which reduces the growth of the snails by 50 % within 28 days with
respect to the fresh mass [EC (28 days)] and to the shell diameter [EC (28 days)] or other values
50,m 50,d
of EC .
x
If the concentrations selected result in lethal effects, the results obtained during testing are compared with
those of a control and used for estimating the concentration which causes the death of 50 % of the snails
[LC (28 days)].
For particular applications, various parameters (EC , NOEC, LOEC, LC ) can be assessed (optional) after
x 50
exposure periods lower than 28 days (7 days, 14 days or 21 days).
The test is conducted in two stages:
⎯ a preliminary test intended to indicate both the non-observed effect concentration, NOEC, and the
complete growth inhibition. The resulting dose-response relationship is important for the proper design of
the definitive test;
⎯ a definitive test specifying the concentrations which cause between 10 % and 90 % of growth inhibition. It
is not necessary to perform a final test where the preliminary test has not revealed any inhibitory effects
at the maximum concentration tested.
5 Test environment
The test shall be carried out at a temperature of (20 ± 2) °C under a day-night photoperiod of 18 h to 6 h. The
illumination intensity (artificial light of daylight type), without any natural light in the test containers shall be
50 lux to 100 lux.
6 Reagents
6.1 Water, of purity at least deionized
6.2 Biological material
Test organisms shall be juvenile snails. The recommended species is Helix aspersa aspersa Müller which
shall be 3 to 5 weeks old, having a mean fresh mass of (1 ± 0,3) g and a shell diameter of (15,5 ± 1) mm.
NOTE The use of some other genus and/or species of Helicidae is possible (see examples and conditions in
Annex G).
The snails shall be selected from synchronous breeding in order to form a population as homogeneous as
possible with respect to size, mass and age. The breeding techniques for snails are described in Annex B.
After a nursery period (3 to 5 weeks, see Annex B), the young snails shall be used after at least 1 week of
aestivation and no more than 5 months. The aestivation is carried out in round wooden boxes (approximately
12 cm in diameter by 4 cm in height), with the snails under dry conditions, at a temperature of 17 °C to 20 °C.
Two to three days before starting the test, snails shall be woken by spraying water (6.1) into the boxes used
for aestivation. The proportion of snails not woken shall be less than 10 %. As soon as they have resumed
activity (snails not stuck to the walls of the box and which are beginning to move about), the snails shall be
transferred to a box (7.1) that has been moistened with water (6.1). The bottom of this box either can be
covered with absorbent paper that has also been moistened, or can contain some test substrate (6.3)
moistened to 50 % to 60 % of its water-holding capacity. Between waking and the start of the test (2 to 3 days),
the snails shall be fed (6.4).
6.3 Test substrate
6.3.1 General
According to the objectives of the study, either an artificial soil (6.3.2) or a suitable natural soil (6.3.3) is used
as test substrate.
NOTE Artificial soil may be used as a control and dilution substrate to assess the effect of a substance or of a
preparation, or to compare different soils or waste, or to assess the effects of a contaminated soil.
Natural soil (field soil) may be used as a control and dilution substrate in order to assess, for example, the effect of the
incorporation of wastewater treatment plant sludge into the field soil or to test the effect of a contaminated soil (in this case
an uncontaminated soil comparable to the soil sample to be tested ought to be used).
6.3.2 Artificial soil
The artificial soil shall have the following composition (as defined by ISO 11268-1).
Table 1 — Composition of artificial soil
Composition Percentage expressed in dry mass
Sphagnum peat air-dried and finely ground (2 ± 1) mm without
10 %
any visible plant remains.
Kaolinite clay, preferably containing not less than 30 % kaolinite. 20 %
Air-dried industrial quartz sand (predominantly fine sand with Approximately 69 % (depending on the amount of
more than 50 % by mass of particle size 0,05 mm to 0,2 mm). CaCO needed).
Calcium carbonate (CaCO , pulverised, analytical grade) to bring Approximately 0,3 % to 1,0 %
the pH of the wetted artificial soil to 6,0 ± 0,5.
The artificial soil shall be prepared, at least two days prior to starting the test, by mixing the dry constituents
listed above thoroughly in a large-scale laboratory mixer. The amount of calcium carbonate required might
vary, depending on the properties of the individual batch (mainly the peat) and should be determined by
measuring subsamples immediately before the test.
The mixed artificial soil shall be stored at room temperature for at least two days to equilibrate acidity. To
determine pH and the maximum water-holding capacity, the dry artificial soil shall be pre moistened one or
two days before starting the test by adding deionized water to obtain half of the required final water content of
50 % to 60 % of the maximum water-holding capacity.
The pH value shall be measured according to ISO 10390. If the measured pH is not within the required range,
a sufficient amount of CaCO shall be added or a new batch of artificial soil shall be prepared. The maximum
water-holding capacity of the artificial soil shall be determined according to ISO 11274 or to Annex A of
ISO 11269-2.
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6.3.3 Natural soil
Determine the following parameters on the selected natural soil which shall be sieved through a 4-mm square
mesh sieve to remove large fragments:
⎯ pH, according to ISO 10390;
⎯ water-holding capacity, according to ISO 11274 or Annex A of ISO 11269-2;
⎯ water content, according to ISO 11465;
⎯ content of organic matter, according to ISO 10694.
It is also recommended to determine the cation exchange capacity, according to ISO 11260.
6.4 Feed
The feed shall be provided in the form of flour at its natural moisture content (5 % to 10 %).
In order to obtain sufficient growth, it is recommended to carry out the tests with a flour-based feed comprising
1)
cereals, forage, mineral salts and vitamins which properly covers the needs of the snails . An example of
feed composition is given in Annex C.
7 Apparatus
Use ordinary laboratory apparatus and the following.
7.1 Test containers
2)
Disposable mouse boxes made of transparent polystyrene or any other container having a volume of
approximately 1,6 l [advised approximate dimensions: 24 cm (length) × 10,5 cm (width) × 8 cm (height)].
7.2 Containers for food
Petri dishes, approximately 5,5 cm in diameter and approximately 1 cm in height or any other containers of
equivalent dimensions.
7.3 Calliper rule, having a precision of 0,1 mm
7.4 Balances
One analytical balance having a precision of at least 1 mg. Two other balances, one having a precision of
0,1 g, another having a precision of 1 g.
1) The snail feed “Helixal” manufactured and distributed by Établissements Chays Frères, 6, rue du Collège, BP 21,
25800 Valdahon, France, or the INRA formulation snail feed manufactured and distributed by Établissements Berton
SARL, Lieu-dit Berton / Départementale 23, 85510 Le Boupère, France, or the snail feed manufactured and distributed by
UCAAB, rue de l'Église, BP 19, 02400 Château-Thierry Cedex, France, are examples of suitable products available on the
market. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement
by ISO of these products.
2) The disposable transparent polystyrene mouse boxes referenced E1DBBAC001 distributed by Charles River
Laboratories France, BP 0109, 69592 L'Arbresle Cedex, France, are examples of suitable products available on the
market. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement
by ISO of these products.
8 Storage and preparation of the samples
8.1 Soil to be tested
The soil samples received at the laboratory shall be stored in accordance with ISO 10381-6.
The soil sample submitted for testing shall be sieved through a 4-mm square mesh sieve to remove coarse
fragments.
For each soil, the same characteristics than for natural soil (6.3.3) that can be used as control or dilution
substrate, shall be determined.
8.2 Waste material
The samples of waste material received at the laboratory shall be stored according to EN 14735 [less than
2 months at (4 ± 3) °C].
For conducting the tests, the grading of the waste shall be less than 4 mm. Where this condition is not fulfilled,
the particle size of the waste material shall be reduced so that all of the particles pass through a 4-mm square
mesh sieve.
9 Procedure
9.1 Preparation of the test
9.1.1 Selection of the concentrations to be tested
9.1.1.1 Preliminary test
This test is performed within a wide range of concentrations.
⎯ Four concentrations of the substance or preparation and one control (e.g. 0 mg/kg; 50 mg/kg; 100 mg/kg;
500 mg/kg and 1 000 mg/kg of test substrate) with five snails per concentration and per container. The
preliminary test may be conducted without replication.
⎯ Four percentages of the matrix under examination and one control (e.g. 0 %; 12,5 %; 25 %; 50 %; 100 %)
with five snails per percentage and per container. The preliminary test may be conducted without
replication.
9.1.1.2 Final test
Select a range of at least five concentrations of the test substance, preparation or matrix according to a
geometric progression, so as to cover and extend beyond the range of those concentrations or percentages
which in the preliminary test did not have any effect on the growth or which inhibited it completely. The ratio of
this geometric progression shall preferably not exceed 2.
If the ratio exceeds 2, it is necessary to have available two concentrations for which the provoked effect is
between 10 % and 90 %.
For the definitive test, three replicates are carried out per concentration.
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9.1.2 Preparation of the test mixtures
9.1.2.1 General
The test mixture (3.3) is made up of test substrate and of test substance, preparation or matrix. Prepare
enough test mixture in order to cover the bottom of the test container with a layer of the test mixture of at least
1 cm.
If the test substance is used in the raw state (without dehydration prior to use), take into account its moisture
rate so as to express the concentrations in milligrams of substance or of preparation per kilogram of dry test
substrate and, for the matrixes, in mass percentage of matrix (expressed in dry mass) in the test mixture
(expressed in dry mass).
9.1.2.2 Water-soluble or emulsifiable substances and preparations
For each examined concentration, dissolve the appropriate quantity of test substance or preparation required
for obtaining the desired concentration in the same water (6.1) used for moistening the test substrate. Spray
the solution over the dry or raw test substrate (6.3), then mix carefully.
The final test mixture shall have a moisture content corresponding to 50 % to 60 % of its total water-holding
capacity (determined according to ISO 11274 or according to Annex A of ISO 11269-2).
Measure the pH for each test concentration according to ISO 10390.
Proceed likewise for the control treatment apart from the addition of test substance or preparation.
Continue the test as specified in 9.2.
9.1.2.3 Water-insoluble substances and preparations, but soluble in organic solvents
Dissolve the quantity of test substance or preparation required for obtaining the desired concentration into a
volatile solvent (e.g. methanol or acetone). Spray the obtained solution over the dry or raw test substrate (6.3).
Carefully mix the totality and let the organic solvent to evaporate under a fume cupboard for 24 h.
Moisten the mixture with water (6.1) up to 50 % to 60 % of its total water-holding capacity (determined
according to ISO 11274 or according to Annex A of ISO 11269-2), then mix carefully.
Measure the pH for each test concentration according to ISO 10390.
Proceed likewise for the control treatment apart from the addition of test substance or preparation.
Continue the test as specified in 9.2.
9.1.2.4 Substances and preparations insoluble in both water and organic solvents
For a substance or preparation that is insoluble in a volatile solvent, prepare a mixture of 10 g of industrial
quartz sand (6.3.2) (previously sampled from the quantity of sand required for the preparation of the test
substrate) and of the quantity of test substance or preparation required in order to obtain the desired
concentration. Pour the thus obtained mixture into a container containing the dry or raw test substrate (6.3)
(except the 10 g used for the contamination). Mix carefully.
Moisten the mixture with water (6.1) up to 50 % to 60 % of its total water-holding capacity (determined
according to ISO 11274 or according to Annex A of ISO 11269-2), then mix carefully.
Measure the pH for each test concentration according to ISO 10390.
Proceed likewise for the control treatment apart from the addition of test substance or preparation.
Continue the test as specified in 9.2.
9.1.2.5 Solid matrixes
Increasing proportions of test matrix are mixed to the dry or raw test substrate (6.3) (e.g. 0 %; 12,5 %; 25 %;
50 %; 100 %).
The control treatment corresponds to 0 % of test matrix, i.e. 100 % of artificial soil (6.3.2) or natural soil (6.3.3).
Moisten the mixture with water (6.1) up to 50 % to 60 % of its total water-holding capacity (determined
according to ISO 11274 or according to Annex A of ISO 11269-2), then mix carefully. (The added water
corresponds to the volume of water required in order to rehydrate the quantity of test substrate of the mixture
and to the volume of water required in order to rehydrate the quantity of matrix of the mixture.)
If it is necessary to reduce the humidity of the solid matrixes, do it by dehydration outdoors or in a drying oven
at a temperature not exceeding 30 °C, in order to limit the loss of volatile products.
Measure the pH for each test concentration according to ISO 10390.
Continue the test as specified in 9.2.
9.2 Distribution of the test mixture
In preparation for the test, add sufficient test mixture (9.1.2) into the test containers (7.1) to fill the bottoms of
the test containers to a depth of at least 1 cm.
NOTE If the test substrate (6.3) is artificial soil, the quantity of test mixture is about 140 g (dry mass) for each test
container.
Smooth the surface of the test mixture and compact the soil slightly.
9.3 Introduction of the feed
Place the container (7.2) containing the feed (6.4) on the bottom of the test container (7.1). The feed shall be
provided ad libitum.
9.4 Introduction of the biological reagent
Select five snails (6.2) randomly for each per test container (7.1).
9.5 Handling during the tests
9.5.1 General
Cover the containers with a transparent perforated sheet [e.g. in polyalkylmethacrylate (Plexiglas) of
approximate dimensions 26,5 cm × 13,5 cm] held in place by any appropriate device during the first two
weeks of the test. During the following two weeks, use, to form the lid, a second container (7.1) turned upside
down. This arrangement doubles the volume of the test chamber thus avoiding a negative group effect on the
growth of the snails (see Figure B.2).
NOTE The plate and the container used to cover the test containers can be perforated by 3 to 4 holes with a
diameter smaller than 2 mm.
Place the test containers with the snails in conditions of the test (5). Observe them regularly and note any
anomaly that could interfere with the conducting of the test.
8 © ISO 2006 – All rights reserved
9.5.2 Three times a week
Three times a week (for example Monday, Wednesday and Friday) perform the following operations for each
test container.
⎯ Using a spatula, regularly remove the excrement on the test mixture in order to avoid its accumulation
and the development of mould.
⎯ Clean the side walls of the container with absorbent paper moistened with water (6.1) and wash the lid
with tap water, then dry it and remoisten it with water (6.1).
⎯ Moisten the test mixture (9.1.2) by spraying it with water (6.1) so that it is at 50 % to 60 % of its water-
holding capacity. To ensure that the moisture content of the test mixture remains at 50 % to 60 %
throughout the test duration, it is possible to prepare a container without snails which will be weighed
regularly in order to estimate the quantity of water to be sprayed into the test containers.
⎯ Renew the feed (6.4).
NOTE It is advisable to carry out the operations described above at regular times, if possible (morning or afternoon).
Note the mortality, if any.
9.5.3 Every 7 days
If effects need to be assessed weekly (optional, see Clause 4), snails are weighed and measured every week.
If not, snails are weighed and measured only at the end of the test (28 days).
Every 7 days:
⎯ prior to changing the feed and cleaning the side walls and the lid, weigh the snails individually (with a
precision of 0,1 g) and measure the shell diameter (with a precision of 0,1 mm); see Figure 1;
⎯ renew the test mixture (9.1.2) by a freshly-prepared one.
Figure 1 — Measure of the shell diameter, i.e. the longest size that can be measured
(white arrow on the photo)
The mass of the snails may be uncertain if they have test substrate on their shell or their foot. Before each
weighing, using a spatula, remove the substrate from the shell or the foot. It is possible to leave the snails to
move about on the clean container lid or on slightly moist paper so that they get rid of the substrate adhering
to their foot.
Note the obvious or pathological symptoms (e.g. excessive production of mucus, extended oedematous body,
drooping eyestalk like those described in References [11] or [41]), or any noticeable modifications in
behaviour (e.g. lethargy on the test mixture, lack of feeding), observed on the snails.
At the end of the test, measure the pH of a control container and of a container for each concentration in
accordance with ISO 10390. It is recommended to measure the pH of any containers in which the mortality
rate or growth rate is unusual.
Optional: at the end of the test (28 days), after final weighing and measurement of the shell diameter, let the
snails of each container fasted during 48 h in moist boxes without test substrate (until they no longer excrete),
then deep-freeze them in view of possibly analysing the concentration of contaminants present in their tissues
or organs.
10 Reference substance
A control test is regularly conducted with a reference substance to check the occurrence of changes in the
sensitivity of the test organisms.
NOTE Experience has shown that cadmium chloride is a suitable reference substance.
On a regular basis, determine the values of EC (28 days) and EC (28 days) of the cadmium chloride by
50,m 50,d
applying the protocol described in this International Standard.
WARNING — Appropriate precautions should be taken when dealing with cadmium chloride which is a
harmful substance.
The EC (28 days) of the CdCl shall be between 350 mg and 650 mg of Cd per kg of dry test substrate.
50,m 2
The EC (28 days) of the CdCl shall be between 500 mg and 800 mg of Cd per kg of dry test substrate.
50,d 2
Mention the obtained values and their obtaining dates in the test report.
Four laboratories participated in 2000 in an interlaboratory test concerning cadmium chloride. The results are
given in Table 2.
Table 2 — Results of the interlaboratory test with Helix aspersa aspersa (substrate contamination;
semi-static method)
EC (28 days) EC (28 days)
50,m 50,d
Substance
mg Cd/kg mg Cd/kg
Mean Range Mean Range
CdCl 500 398 to 622 600 507 to 781
11 Calculations and expression of results
11.1 Calculations
For each concentration, determine the percentage of mortality, if any, at the time of the final test.
At the end of the test (28 days) (optional: week by week), calculate the mean masses and the mean shell
diameters, and the associated standard deviations, of the snails for each container and for each concentration.
An example of a data table is given in Annex D.
For each container, calculate the biomass growth coefficient (designated k ) and the shell diameter growth
GC,m
coefficient (designated k ) according respectively to Equations (1) and (2).
GC,d
mm−
()
tn t0
k=×100 (1)
GC,m
m
t0
10 © ISO 2006 – All rights reserved
where
k is the biomass growth coefficient;
GC,m
m is the mean mass of the snails per replicate at time tn, in grams (g);
tn
m is the mean mass of the snails per replicate at time t0, in grams (g).
t0
dd−
()
tn t0
k=×100 (2)
GC,d
d
t0
where
k is the shell diameter growth coefficient;
GC,d
d is the mean shell diameter of the snails per replicate at time tn, in millimetres (mm);
tn
d is the mean shell diameter of the snails per replicate at time t0, in millimetres (mm).
t0
For each concentration, calculate the mean percentage of biomass growth inhibition (designated p ) and of
I,m
shell diameter growth inhibition (designated p ) according respectively to Equations (3) and (4).
I,d
mm−−m''−m
()()
00tn t0 tn t0
p=×100 (3)
I,m
mm−
()
00tn t0
where
p is the mean percentage of biomass growth inhibition;
I,m
m is the mean mass of the snails at time tn in the control, in grams (g);
0tn
m is the mean mass of the snails at time t0 in the control, in grams (g);
00t
m' is the mean mass of the snail per concentration at time tn, in grams (g);
tn
m' is the mean mass of the snail per concentration at time t0, in grams (g).
t0
dd−−d''−d
()()
00tn t0 tn t0
p=×100 (4)
I,d
dd−
()
00tn t0
where
p is the mean percentage of shell diameter growth inhibition;
I,d
d is the mean shell diameter at time tn in the control, in millimetres (mm);
0tn
d is the mean shell diameter at time t0 in the control, in millimetres (mm);
00t
d ' is the mean shell diameter per concentration at time tn, in millimetres (mm);
tn
d ' is the mean shell diameter per concentration at time t0, in millimetres (mm).
t0
11.2 Expression of results
For each concentration and at various times of measurement, present the percentage of mortality for each
replicate, and for the parameters masses and diameter of shell:
⎯ the calculated mean values and the standard deviation per replicate;
⎯ the growth coefficient per replicate (see examples in E.1 and E.2);
⎯ the mean percentage of growth inhibition (see examples in E.3 and E.4);
⎯ a graphic presentation of the results of the test, giving a clear image of the dose-response relationship for
the effects on growth.
It is possible (optional) to determine the LOEC using an appropriate multiple comparison and to deduce from it
the NOEC, the next lower concentration to the LOEC.
Possibly, for the test substances, preparations or matrixes for which the mortality is dose-dependent, calculate,
using any appropriate statistical method, the LC (28 days) and its 95 % confidence interval (the method
used for determining growth inhibition is suitable).
In order to estimate the concentration which would cause x % of growth inhibition (EC , for instance EC ,
x 10
EC or EC ), it is possible to fit a model to the test results (k or k ). For this, the values of EC and
20 50 GC,m GC,d x
the parameters characterizing this model shall, if possible, be estimated with their confidence interval (e.g.
95 %).
The fitting of the model to the data shall be assessed either using a statistical test, or by graphic
representation.
It is possible to use the logistic model which is generally suitable for the statistical analysis of the produced
data.
NOTE 1 This model is used in the framework of the analysis of interlaboratory test results (see Clause 10).
This model is characterized by Equation (5):
a
Y= (5)
b
⎛⎞
C
1+
⎜⎟
⎜⎟
EC
⎝⎠
where
Y is the growth coefficient of the live snails per replicate (k or k );
GC,m GC,d
C is the concentration under test (test variable).
The following parameters, characterizing the model, are estimated from the obtained data (e.g. by the least
squares method).
EC is the concentration causing 50 % of growth inhibition;
a is the growth coefficient of the snails expected in the control;
b is a parameter which characterizes the slope of the curve.
12 © ISO 2006 – All rights reserved
The EC can then be estimated by Equation (6):
x
⎛⎞x b
EC = EC (6)
x 50⎜⎟
100− x
⎝⎠
where
x is the sought-after effect level for calculating the EC (initially fixed parameter).
x
Other models can be used. In this case, a description of the model used shall be given in the test report. For
example statistical methods are described in Reference [44].
For the substances or preparations, express the values of EC (28 days), EC (28 days) and, if needed ,
50,m 50,d
NOEC and LOEC in mg of test substance or preparation per kilogram of test substrate (expressed in dry
mass).
For soils and waste, express the values of EC (28 days), EC (28 days) and, if needed, NOEC and
50,m 50,d
LOEC in mass percentage of soil or waste in the test mixture (expressed in dry mass).
NOTE 2 It is also possible (optional) to determine other values of EC (for example x = 10 %, 25 %, etc.). Various
x
parameters (EC , NOEC, LOEC, LC ) can also be determinate at other times of measurement (7, 14 or 21 days).
x 50
12 Validity of test for Helix aspersa aspersa
The results are considered to be valid if the following conditions are met:
⎯ the percentage of mortality observed in the control containers is less than or equal to 10 % at the end of
the test;
⎯ the coefficient of variation calculated for the growth in the controls is less than or equal to 40 %;
⎯ the mean mass of the snails in the controls has been multiplied at least by 4 throughout the test duration;
⎯ the shell diameter of the snails in the controls has been multiplied at least by 1,5 throughout the test
duration.
13 Test report
The test report shall make reference
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 15952
Première édition
2006-02-15
Qualité du sol — Effets des polluants
vis-à-vis des escargots juvéniles
(Helicidae) — Détermination des effets
sur la croissance par contamination du
sol
Soil quality — Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) —
Determination of the effects on growth by soil contamination
Numéro de référence
©
ISO 2006
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Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 2
4 Principe. 3
5 Environnement de l'essai. 3
6 Réactifs . 4
7 Appareillage . 6
8 Stockage et préparation des échantillons. 6
8.1 Sol à étudier . 6
8.2 Déchets . 6
9 Mode opératoire . 7
9.1 Préparation de l'essai. 7
9.2 Répartition du mélange d'essai. 8
9.3 Introduction de la nourriture . 9
9.4 Introduction du réactif biologique . 9
9.5 Manipulations pendant les essais. 9
10 Substance de référence . 10
11 Calculs et expression des résultats. 11
11.1 Calculs . 11
11.2 Expression des résultats . 12
12 Validité de l'essai pour Helix aspersa aspersa . 14
13 Rapport d'essai . 14
Annexe A (normative) Méthode statique . 16
Annexe B (informative) Technique d'élevage des escargots . 17
Annexe C (informative) Exemple de composition de la nourriture pour escargots. 22
Annexe D (informative) Exemple de tableau de données . 23
Annexe E (informative) Exemple de résultats avec Helix aspersa aspersa . 24
Annexe F (informative) Détermination des effets sur la croissance par contamination
de la nourriture. 27
Annexe G (informative) Réalisation de l'essai avec d'autres espèces d'escargots . 31
Bibliographie . 32
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 15952 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4, Méthodes
biologiques.
iv © ISO 2006 – Tous droits réservés
Introduction
En raison du nombre limité de données disponibles sur la toxicité des contaminants sur les organismes vivant
dans le sol, les problèmes d'évaluation de l'écotoxicité des sols et des déchets sont très préoccupants tant au
niveau national qu'au niveau international. Les essais actuellement disponibles utilisent les organismes de la
faune du sol limités aux embranchements annélides (vers de terre et Enchytraeidae) et des arthropodes
(insectes: Collemboles et Coléoptères). Parmi ces derniers, deux normes évaluent la toxicité aiguë [vers de
[5]
terre (ISO 11268-1) et larves de coléoptères ] et trois autres normes évaluent les effets sublétaux des
[2] [1] [3]
contaminants du sol sur la reproduction (vers de terre , Collemboles ), Enchytraeidae ). Dans les cycles
biologiques des organismes, il semble que la croissance est, tout comme la reproduction, un paramètre
écophysiologique fondamental à prendre en considération pour la viabilité des espèces et des
[33]
écosystèmes .
[15]
Les escargots sont des indicateurs écologiques pertinents pour l'évaluation de la qualité des sols , étant
donné qu'ils sont caractéristiques de la couche superficielle du sol (saprophages et phytophages) et qu'une
grande partie de leur cycle biologique a lieu dans le sol (ponte, éclosion, premiers stades du développement,
[6], [17], [26]
hibernation, etc.) . Pendant les autres phases de leur cycle, ils ingèrent du sol et sont en contact
avec celui-ci par l'intermédiaire de leur sole pédieuse humide (pied), recouverte de mucus, et participent aux
échanges permanents avec le sol (eau, sels minéraux, excréments, puis finalement la coquille et la matière
[6], [17], [28]
organique quand ils meurent) . De plus, ils représentent un lien important entre les plantes, la faune
et les micro-organismes du sol. Ils répondent entièrement aux critères d'un bon indicateur biologique: faciles à
[8, 10 à 14, 16, 17, 19,
collecter et à identifier, ils présentent une large répartition, ils accumulent les contaminants
21, 26, 27, 35 à 43] [6], [9], [29]
, leurs caractéristiques écologiques et physiologiques sont bien connues et ils sont,
[19], [23], [29]
à présent, faciles à élever dans des conditions contrôlées . Leur sensibilité aux contaminants
[10 à 15, 18 à 27, 32, 33, 36 à 42]
courants dans leur environnement a été démontrée .
Le présent document décrit une méthode pour déterminer les effets sur la survie et la croissance des
escargots juvéniles de substances, de préparations, de sols ou de déchets ajoutés à un sol artificiel ou naturel.
La méthode décrite est donc applicable aux essais de sols contaminés ou à la comparaison de différents sols
non contaminés. L'espèce recommandée est Helix aspersa aspersa Müller (aussi communément appelée:
escargot petit-gris, escargot de jardin, Petit-Gris). Parmi les escargots terrestres (mollusques gastéropodes
pulmonés stylommatophores de la famille Helicidae), Helix aspersa aspersa Müller est le plus répandu. Cette
espèce paléarctique peut s'acclimater à des régions présentant des climats de types différents: méditerranéen,
océanique tempéré, continental tempéré, voire tropical. Helix aspersa aspersa Müller est d'origine
européenne et a été introduit dans le monde entier. On en trouve à présent sur tous les continents hormis
[9]
l'Antarctique .
Dans leur environnement naturel, les escargots assimilent les contaminants par contact (avec des substrats
variés tels que le sol, les lixiviats du sol et la litière végétale), par ingestion (de plantes et de sol), de même
[6], [26]
que par les voies respiratoires . Ainsi, pour des objectifs particuliers (évaluation de la toxicité d'un
pesticide, par exemple), une autre méthode d'exposition basée sur l'exposition par ingestion d'aliments est
disponible en option (Annexe F et Référence [4]).
NORME INTERNATIONALE ISO 15952:2006(F)
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des escargots
juvéniles (Helicidae) — Détermination des effets sur la
croissance par contamination du sol
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale s'applique à une méthode semi-statique pour la détermination des effets de
contaminants sur la croissance et la survie d'escargots juvéniles, généralement Helix aspersa aspersa Müller.
Les animaux sont exposés par les voies cutanée et digestive à un substrat d'essai (sol artificiel ou naturel
selon l'objectif de l'étude) auquel sont ajoutées des quantités définies
⎯ de substances ou de préparations;
⎯ de sols (contaminés ou de qualité inconnue) ou de déchets.
Il est admis de mettre en œuvre une méthode statique en sus de la méthode semi-statique (facultatif). Cette
méthode est décrite dans l'Annexe A.
Cette méthode ne s'applique pas aux substances volatiles, c'est-à-dire aux substances dont la constante de
Henry, H, ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression de vapeur est
supérieure à 0,013 3 Pa à 25 °C.
Cet essai prend en considération le changement éventuel de la substance d'essai, de la préparation, du sol
ou des déchets, étant donné que le mélange d'essai est préparé et renouvelé tous les 7 jours pendant la
période d'essai de 28 jours.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation de sols destinés à une étude en laboratoire des processus microbiens aérobies
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11268-1, Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre (Eisenia fetida) — Partie 1:
Détermination de la toxicité aiguë en utilisant des substrats de sol artificiel
ISO 11269-2, Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du sol — Partie 2: Effets
des substances chimiques sur l'émergence et la croissance des végétaux supérieurs
ISO 11274, Qualité du sol — Détermination de la caractéristique de la rétention en eau — Méthodes de
laboratoire
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
EN 14735, Caractérisation des déchets — Préparation des échantillons de déchets en vue d'essais
écotoxicologiques
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
substrat d'essai
sol artificiel ou sol naturel utilisé comme témoin et comme substrat de dilution
3.2
matrice
sol ou déchet soumis à l'essai
3.3
mélange d'essai
mélange de la substance d'essai, de la préparation ou de la matrice avec le substrat d'essai
3.4
croissance
augmentation de la biomasse, c'est-à-dire de la masse fraîche totale (corps et coquille) des organismes et
augmentation du diamètre maximal de la coquille, entre le début et la fin de l'essai
NOTE Elle s'exprime sous forme d'un coefficient de croissance.
3.5
concentration efficace
CE
x
concentration à laquelle est décelé un effet spécifique; x est le pourcentage (10, 25, 50) de cet effet, par
exemple inhibition de la croissance
NOTE Par exemple, CE est la concentration estimée conduire à une réduction de la croissance, à la fin de l'essai,
de 50 % par rapport au témoin.
3.6
CL
concentration létale médiane, c'est-à-dire la concentration de la substance d'essai ou de la préparation
présente à l'origine ou la concentration de la matrice entraînant la mort de 50 % des escargots soumis à
l'essai
3.7
concentration minimale avec effet observé
CMEO
concentration la plus basse soumise à l'essai, à laquelle il est observé que la substance d'essai a un effet
statistiquement significatif (p < 0,05) par rapport au témoin
NOTE Toutes les concentrations d'essai supérieures à la CMEO ont un effet nocif supérieur ou égal à ceux observés
à la CMEO. Lorsqu'il n'est pas possible de satisfaire ces deux conditions, il convient d'expliquer dans le détail comment a
été sélectionnée la CMEO (et par conséquent la CSEO).
2 © ISO 2006 – Tous droits réservés
3.8
concentration sans effet observable
CSEO
concentration de l'essai immédiatement inférieure à la CMEO, qui, lorsqu'elle est comparée à celle du témoin,
ne produit aucun effet statistiquement significatif (p > 0,05) pendant un temps d'exposition donné
NOTE 1 La CSEO est la concentration immédiatement inférieure à la CMEO.
NOTE 2 Dans le cas de 3.5,de 3.6, de 3.7 et de 3.8, les résultats sont exprimés:
⎯ en masse sèche de la substance d'essai ou de la préparation par masse sèche du substrat d'essai;
⎯ en pourcentage de la masse de la matrice étudiée dans le mélange d'essai (exprimé en masse sèche).
4 Principe
Des escargots terrestres juvéniles (généralement Helix aspersa aspersa Müller) sont exposés pendant une
période de 28 jours à un mélange d'essai contenant la substance d'essai, la préparation ou la matrice à
différentes concentrations. Le mélange d'essai est fraîchement préparé et renouvelé tous les 7 jours.
En fonction des objectifs, le mélange d'essai peut être préparé avec du sol artificiel (6.3.2) ou un sol naturel
adapté (6.3.3).
Pendant l'essai, les escargots sont nourris avec un aliment non contaminé.
Les effets sur la croissance (masse fraîche et diamètre de la coquille) et sur la survie sont mesurés après
28 jours d'exposition (en option, les effets peuvent être mesurés tous les 7 jours pendant 28 jours).
Les résultats obtenus au cours de l'essai sont comparés avec ceux d'un témoin afin de déterminer la CSEO
ou la CMEO et ils permettent d'estimer la concentration qui réduit la croissance des escargots de 50 % en
l'espace de 28 jours par rapport à la masse fraîche [CE (28 jours)] et au diamètre de la coquille
50,m
[CE (28 jours)] ou à d'autres valeurs de CE .
50,d x
Si les concentrations sélectionnées provoquent des effets létaux, les résultats obtenus au cours de l'essai
sont comparés à ceux d'un témoin et sont utilisés pour estimer la concentration qui entraîne la mort de 50 %
des escargots [CL (28 jours)].
Dans certaines applications, il est possible d'évaluer (facultatif) certains paramètres (CE , CSEO, CMEO,
x
CL ) après des périodes d'exposition inférieures à 28 jours (7 jours, 14 jours ou 21 jours).
L'essai comprend deux étapes:
⎯ un essai préliminaire dont le but est de déterminer aussi bien la concentration sans effet observable
(CSEO) et l'inhibition totale de la croissance. La relation dose/effet obtenue est importante pour la
conception correcte de l'essai définitif;
⎯ un essai définitif spécifiant les concentrations entraînant une inhibition de 10 % à 90 % de la croissance.
Il n'est pas nécessaire d'effectuer un essai définitif lorsque l'essai préliminaire n'a pas révélé d'effets
inhibiteurs à la concentration maximale étudiée.
5 Environnement de l'essai
L'essai doit être réalisé à une température de (20 ± 2) °C avec une photopériode jour-nuit de 18 h à 6 h.
L'intensité lumineuse (lumière artificielle de type lumière du jour), sans lumière naturelle dans les récipients
d'essai, doit être de 50 lux à 100 lux.
6 Réactifs
6.1 Eau, de pureté au minimum déionisée
6.2 Matériel biologique
Les organismes d'essai doivent être des escargots juvéniles. L'espèce recommandée est Helix aspersa
aspersa Müller, dont les individus doivent être âgés de 3 à 5 semaines et présenter une masse fraîche
moyenne de (1 ± 0,3) g et un diamètre de coquille de (15,5 ± 1) mm.
NOTE Il est possible d'utiliser un autre genre et/ou une autre espèce d'Helicidae (voir les exemples et les conditions
dans l'Annexe G).
Les escargots doivent être sélectionnés à partir d'un élevage synchrone afin d'obtenir une population la plus
homogène possible au regard de la taille, de la masse et de l'âge. Les techniques d'élevage des escargots
sont décrites dans l'Annexe B. Après une période de nursery (de 3 à 5 semaines, voir l'Annexe B), les
escargots juvéniles doivent être utilisés après une période d'estivation d'au moins 1 semaine et de 5 mois au
plus. L'estivation a lieu dans des boîtes rondes en bois (diamètre de 12 cm et hauteur de 4 cm environ), les
escargots étant soumis à des conditions sèches à une température de 17 °C à 20 °C.
De deux à trois jours avant de commencer l'essai, les escargots doivent être réveillés par une pulvérisation
d'eau (6.1) dans les boîtes ayant servi à l'estivation. La proportion d'escargots non réveillés doit être inférieure
à 10 %. Dès que les escargots reprennent leur activité (ils se décollent des parois de la boîte et commencent
à se déplacer), ils doivent être transférés vers une boîte (7.1) ayant été préalablement humidifiée avec de
l'eau (6.1). Le fond de cette boîte peut être soit recouvert de papier absorbant ayant aussi été humidifié, soit
contenir du substrat d'essai (6.3) humidifié de 50 % à 60 % de sa capacité de rétention d'eau. Il est
nécessaire de nourrir les escargots (6.4) entre le moment du réveil et le début de l'essai (de 2 à 3 jours).
6.3 Substrat d'essai
6.3.1 Généralités
En fonction des objectifs de l'étude, le substrat d'essai peut être préparé avec du sol artificiel (6.3.2) ou un sol
naturel adapté (6.3.3).
NOTE Il est admis d'utiliser un sol artificiel en tant que témoin et substrat de dilution pour évaluer l'effet d'une
substance ou d'une préparation, pour comparer différents sols ou déchets ou pour évaluer les effets d'un sol contaminé.
Il est admis d'utiliser un sol naturel (sol d'un champ) en tant que témoin et substrat de dilution pour évaluer, par exemple,
l'effet de l'incorporation de boues de stations d'épuration d'eaux usées dans le sol d'un champ ou pour étudier l'effet d'un
sol contaminé (dans ce cas, il est recommandé d'utiliser un sol non contaminé, comparable à l'échantillon de sol à étudier).
6.3.2 Sol artificiel
Le sol artificiel doit présenter la composition suivante (telle que définie par l'ISO 11268-1).
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Tableau 1 — Composition du sol artificiel
Pourcentage exprimé en masse
Composition
sèche
Tourbe de sphaigne séchée à l'air et finement moulue (2 ± 1) mm, dépourvue de
10 %
résidus végétaux visibles.
Argile à kaolinite, contenant de préférence au moins 30 % de kaolinite. 20 %
Sable quartzeux industriel séché à l'air (prédominance de sable fin avec plus de
Environ 69 % (en fonction de la
50 % de la masse présentant une granulométrie comprise entre 0,05 mm et
quantité nécessaire de CaCO ).
0,2 mm).
Carbonate de calcium (CaCO , pulvérisé, de qualité analytique) pour ramener le
Environ 0,3 % à 1,0 %.
pH du sol artificiel humide à 6,0 ± 0,5.
Le sol artificiel doit être préparé au moins deux jours avant le début de l'essai, en mélangeant parfaitement les
constituants secs, indiqués ci-dessus, dans un mélangeur de laboratoire de grande dimension. La quantité de
carbonate de calcium requise peut varier en fonction des propriétés de chaque lot (en particulier de la tourbe)
et il convient de la déterminer en mesurant des sous-échantillons immédiatement avant l'essai.
Il convient de stocker le sol artificiel mélangé à température ambiante pendant deux jours au moins, afin d'en
équilibrer l'acidité. Pour déterminer le pH et la capacité de rétention d'eau maximale, le sol artificiel sec doit
être préhumidifié un ou deux jours avant le début de l'essai, en ajoutant de l'eau déionisée, afin d'obtenir la
moitié de la teneur en eau finale requise de 50 % à 60 % de la capacité de rétention d'eau maximale.
La valeur du pH doit être mesurée selon l'ISO 10390. Si la valeur du pH ne se trouve pas dans la plage
requise, il est nécessaire d'ajouter une quantité suffisante de CaCO ou de préparer un nouveau lot de sol
artificiel. La capacité de rétention d'eau maximale du sol artificiel doit être déterminée selon l'ISO 11274 ou
l'Annexe A de l'ISO 11269-2.
6.3.3 Sol naturel
Déterminer les paramètres suivants pour le sol naturel sélectionné qui doit être passé au tamis de 4 mm afin
d'en extraire les fragments de grosse taille:
⎯ pH, selon l'ISO 10390;
⎯ capacité de rétention d'eau selon l'ISO 11274 ou l'Annexe A de l'ISO 11269-2;
⎯ teneur en eau selon l'ISO 11465;
⎯ teneur en matière organique selon l'ISO 10694.
Il est aussi recommandé de déterminer la capacité d'échange cationique selon l'ISO 11260.
6.4 Nourriture
La nourriture doit être fournie sous forme de farine avec son taux d'humidité naturel (de 5 % à 10 %).
Afin que la croissance soit suffisante, il est recommandé d'effectuer les essais avec un aliment sous forme de
farine comprenant des céréales, du fourrage, des sels minéraux et des vitamines couvrant convenablement
1)
les besoins des escargots . Un exemple de composition de la nourriture est donné dans l'Annexe C.
1) La nourriture pour escargots «Helixal» fabriquée et distribuée par les Établissements Chays Frères, 6, rue du Collège,
BP 21, 25800 Valdahon, France, ou la préparation de nourriture pour escargots de l’INRA fabriquée et distribuée par les
Établissements Berton SARL, Lieu-dit Berton / Départementale 23, 85510 Le Boupère, France, ou la nourriture pour
escargots fabriquée et distribuée par UCAAB, rue de l'Église, BP 19, 02400 Château-Thierry Cedex, France, sont des
exemples de produits adaptés disponibles sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la
présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif des produits
ainsi désignés.
7 Appareillage
Le matériel de laboratoire habituel et ce qui suit.
7.1 Récipients d'essai
2)
Boîtes à souris jetables en polystyrène transparent ou tout autre récipient dont le volume est égal à 1,6 l
environ [dimensions approximatives recommandées: 24 cm (longueur) × 10,5 cm (largeur) × 8 cm (hauteur)].
7.2 Récipients pour la nourriture
Boîtes de Petri de 5,5 cm de diamètre environ et de 1 cm de hauteur environ ou tout autre récipient de
dimensions équivalentes.
7.3 Pied à coulisse, d'une précision de 0,1 mm
7.4 Balances
Une balance analytique d'une précision de 1 mg au moins. Deux autres balances, l'une avec une précision de
0,1 g, l'autre avec une précision de 1 g.
8 Stockage et préparation des échantillons
8.1 Sol à étudier
Les échantillons de sol reçus au laboratoire doivent être stockés selon l'ISO 10381-6.
L'échantillon de sol soumis à l'essai doit être passé au tamis de 4 mm afin d'en extraire les fragments de
grande taille.
Il est nécessaire de déterminer, pour chaque sol, les mêmes caractéristiques que pour le sol naturel (6.3.3)
qui peut être utilisé comme témoin ou comme substrat de dilution.
8.2 Déchets
Les échantillons de déchets reçus au laboratoire doivent être stockés selon l'EN 14735 [moins de 2 mois à
(4 ± 3) °C].
Pour les essais, la granulométrie des déchets doit être inférieure à 4 mm. Si tel n'est pas le cas, il est
nécessaire de réduire la granulométrie des déchets de telle manière que toutes les particules traversent un
tamis de 4 mm .
2) Les boîtes à souris jetables en polystyrène transparent portant la référence E1DBBAC001 distribuées par Charles
River Laboratories France, BP 0109, 69592 L'Arbresle Cedex, France, sont des exemples de produits adaptés disponibles
sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie
nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif des produits ainsi désignés.
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9 Mode opératoire
9.1 Préparation de l'essai
9.1.1 Sélection des concentrations à étudier
9.1.1.1 Essai préliminaire
Cet essai est réalisé avec une vaste plage de concentrations.
⎯ Quatre concentrations de la substance ou de la préparation et un témoin (par exemple 0 mg/kg;
50 mg/kg; 100 mg/kg; 500 mg/kg et 1 000 mg/kg de substrat d'essai) avec cinq escargots par
concentration et par récipient. L'essai préliminaire peut être effectué sans répétition.
⎯ Quatre pourcentages de la matrice étudiée et un témoin (par exemple 0 %; 12,5 %; 25 %; 50 % et 100 %)
avec cinq escargots par pourcentage et par récipient. L'essai préliminaire peut être réalisé sans répétition.
9.1.1.2 Essai définitif
Sélectionner une plage de cinq concentrations au moins de la substance d'essai, préparation ou matrice avec
une progression géométrique, de manière à couvrir et à dépasser la plage des concentrations ou des
pourcentages qui n'ont pas eu d'effet, lors de l'essai préliminaire, sur la croissance ou qui l'ont complètement
inhibée. Le facteur de cette progression géométrique ne doit pas être supérieur à 2, de préférence.
Si le facteur est supérieur à 2, il est nécessaire d'avoir à disposition deux concentrations pour lesquelles l'effet
provoqué est compris entre 10 % et 90 %.
Trois répétitions par concentration sont effectuées pour l'essai définitif.
9.1.2 Préparation des mélanges d'essai
9.1.2.1 Généralités
Le mélange d'essai (3.3) comprend le substrat d'essai et la substance d'essai, la préparation ou la matrice.
Préparer une quantité suffisante de mélange d'essai pour recouvrir le fond du récipient d'essai d'une couche
de mélange d'essai d'au moins 1 cm.
Si la substance d'essai est utilisée à l'état brut (sans déshydratation préalable à l'utilisation), prendre en
considération son taux d'humidité de manière à exprimer les concentrations en milligrammes de substance ou
de préparation par kilogramme de substrat d'essai sec et, dans le cas des matrices, en pourcentage de
masse de la matrice (exprimé en masse sèche) dans le mélange d'essai (exprimé en masse sèche).
9.1.2.2 Substances et préparations solubles dans l'eau ou émulsifiables
Pour chaque concentration étudiée, dissoudre la quantité adéquate de substance d'essai ou de préparation
nécessaire à l'obtention de la concentration souhaitée dans la même eau (6.1) que celle utilisée pour
humidifier le substrat d'essai. Vaporiser la solution sur le substrat d'essai sec ou brut (6.3), puis mélanger
soigneusement.
Le mélange d'essai définitif doit présenter un taux d'humidité correspondant de 50 % à 60 % de sa capacité
de rétention d'eau totale (déterminée selon l'ISO 11274 ou selon l'Annexe A de l'ISO 11269-2).
Mesurer le pH pour chacune des concentrations d'essai selon l'ISO 10390.
Procéder de même pour le traitement du témoin, hormis l'ajout de substance d'essai ou de préparation.
Poursuivre l'essai comme indiqué en 9.2.
9.1.2.3 Substances et préparations insolubles dans l'eau, mais solubles dans des solvants
organiques
Dissoudre la quantité adéquate de substance d'essai ou de préparation nécessaire à l'obtention de la
concentration souhaitée dans un solvant volatil (du méthanol ou de l'acétone, par exemple). Vaporiser la
solution obtenue sur le substrat d'essai sec ou brut (6.3). Mélanger le tout soigneusement puis laisser le
solvant organique s'évaporer sous hotte aspirante pendant 24 h.
Humidifier le mélange avec de l'eau (6.1) à hauteur de 50 % à 60 % de sa capacité de rétention d'eau totale
(déterminée selon l'ISO 11274 ou selon l'Annexe A de l'ISO 11269-2), puis mélanger soigneusement.
Mesurer le pH pour chacune des concentrations d'essai selon l'ISO 10390.
Procéder de même pour le traitement du témoin, hormis l'ajout de substance d'essai ou de préparation.
Poursuivre l'essai comme indiqué en 9.2.
9.1.2.4 Substances et préparations insolubles à la fois dans l'eau et dans les solvants organiques
Lorsqu'une substance ou une préparation est insoluble dans un solvant volatil, préparer un mélange de 10 g
de sable quartzeux industriel (6.3.2) (prélevé au préalable de la quantité de sable nécessaire pour la
préparation du substrat d'essai) et de la quantité de substance d'essai ou de préparation nécessaire pour
obtenir la concentration souhaitée. Verser le mélange ainsi obtenu dans un récipient contenant le substrat
d'essai sec ou brut (6.3) (hormis les 10 g utilisés pour la contamination). Mélanger soigneusement.
Humidifier le mélange avec de l'eau (6.1) à hauteur de 50 % à 60 % de sa capacité de rétention d'eau totale
(déterminée selon l'ISO 11274 ou selon l'Annexe A de l'ISO 11269-2), puis mélanger soigneusement.
Mesurer le pH pour chacune des concentrations d'essai selon l'ISO 10390.
Procéder de même pour le traitement du témoin, hormis l'ajout de substance d'essai ou de préparation.
Poursuivre l'essai comme spécifié en 9.2.
9.1.2.5 Matrices solides
Des proportions croissantes de la matrice d'essai sont mélangées au substrat d'essai sec ou brut (6.3) (par
exemple 0 %; 12,5 %; 25 %; 50 %; 100 %).
Le traitement du témoin correspond à 0 % de matrice d'essai, c'est-à-dire 100 % de sol artificiel (6.3.2) ou de
sol naturel (6.3.3).
Humidifier le mélange avec de l'eau (6.1) à hauteur de 50 % à 60 % de sa capacité de rétention d'eau totale
(déterminée selon l'ISO 11274 ou selon l'Annexe A de l'ISO 11269-2), puis mélanger soigneusement (l'eau
ajoutée correspond au volume d'eau nécessaire pour réhydrater la quantité de substrat d'essai du mélange et
au volume d'eau nécessaire pour réhydrater la quantité de matrice du mélange).
S'il est nécessaire de réduire l'humidité des matrices solides, réaliser la déshydratation en plein air ou dans
une étuve de séchage sans dépasser une température de 30 °C, afin de limiter la perte de produits volatils.
Mesurer le pH pour chacune des concentrations d'essai selon l'ISO 10390.
Poursuivre l'essai comme indiqué en 9.2.
9.2 Répartition du mélange d'essai
En préparation de l'essai, ajouter une quantité suffisante de mélange d'essai (9.1.2) dans les récipients
d'essai (7.1) pour remplir les fonds des récipients d'essai sur une hauteur d'au moins 1 cm.
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NOTE Si le substrat d'essai (6.3) est un sol artificiel, la quantité de mélange d'essai est d'environ 140 g (masse
sèche) pour chaque récipient d'essai.
Égaliser la surface du mélange d'essai et compacter légèrement le sol.
9.3 Introduction de la nourriture
Placer le récipient (7.2) contenant la nourriture (6.4) sur le fond du récipient d'essai (7.1). La nourriture doit
être administrée ad libitum.
9.4 Introduction du réactif biologique
Sélectionner cinq escargots (6.2) au hasard pour chaque récipient d'essai (7.1).
9.5 Manipulations pendant les essais
9.5.1 Généralités
Pendant les deux premières semaines de l'essai, recouvrir les récipients d'une plaque transparente perforée
[par exemple en polyalkylméthacrylate (Plexiglas) mesurant environ 26,5 cm × 13,5 cm] maintenue en place à
l'aide d'un dispositif approprié. Pendant les deux semaines suivantes, utiliser un deuxième récipient (7.1)
renversé pour former le couvercle. Cette disposition permet de doubler le volume de l'enceinte d'essai et
d'éviter un effet de groupe négatif sur la croissance des escargots (voir la Figure B.2).
NOTE Il est possible de perforer la plaque et le récipient utilisés pour couvrir les récipients d'essai de 3 à 4 trous de
diamètre inférieur à 2 mm.
Placer les récipients d'essai avec les escargots dans les conditions de l'essai (5). Les observer régulièrement
et noter toute anomalie pouvant interférer avec le déroulement de l'essai.
9.5.2 Trois fois par semaine
Pour chaque récipient d'essai, effectuer les opérations suivantes trois fois par semaine (par exemple le lundi,
le mercredi et le vendredi):
⎯ à l'aide d'une spatule, extraire régulièrement les excréments déposés sur le mélange d'essai, afin d'éviter
leur accumulation et le développement de moisissures;
⎯ nettoyer les parois latérales du récipient avec du papier absorbant humecté avec de l'eau (6.1) et
nettoyer le couvercle avec de l'eau du robinet, puis le sécher et l'humecter de nouveau avec de l'eau
(6.1);
⎯ humidifier le mélange d'essai (9.1.2) en vaporisant de l'eau (6.1) à hauteur de 50 % à 60 % de sa
capacité de rétention d'eau. Pour s'assurer que le taux d'humidité du mélange d'essai reste de 50 % à
60 % tout au long de la durée de l'essai, il est possible de préparer un récipient dépourvu d'escargots qui
sera régulièrement pesé pour estimer la quantité d'eau à pulvériser dans les récipients d'essai;
⎯ renouveler la nourriture (6.4).
NOTE Il est recommandé d'effectuer les opérations décrites ci-dessus, si possible, à heures régulières (le matin ou
l'après-midi).
Noter la mortalité, le cas échéant.
9.5.3 Tous les 7 jours
S'il est nécessaire d'évaluer les effets tous les 7 jours (ce qui est optionnel, voir l'Article 4), les escargots sont
pesés et mesurés chaque semaine. Sinon, les escargots ne sont pesés et mesurés qu'à la fin de l'essai
(28 jours).
Tous les 7 jours:
⎯ avant de changer la nourriture et de nettoyer les parois latérales et le couvercle, peser les escargots
individuellement (avec une précision de 0,1 g) et mesurer le diamètre de la coquille (avec une précision
de 0,1 mm); voir la Figure 1;
⎯ remplacer le mélange d'essai (9.1.2) par un mélange fraîchement préparé.
Figure 1 — Mesure du diamètre de la coquille, c'est-à-dire la plus longue dimension qui peut être
mesurée (flèche blanche sur la photo)
La masse des escargots peut être faussée si du substrat d'essai adhère à la coquille ou sur le pied des
escargots. Avant chaque pesée, débarrasser la coquille ou le pied de tout substrat à l'aide d'une spatule. Il est
possible de laisser les escargots se déplacer sur le couvercle propre du récipient ou sur du papier légèrement
humecté, de manière à débarrasser leur pied de toute trace de substrat collé.
Relever les symptômes évidents ou pathologiques observés chez les escargots (par exemple production
excessive de mucus, corps œdémateux étendu, tentacules oculaires tombants, comme décrit dans les
Références [11] ou [41]), ou toute modification perceptible du comportement (par exemple léthargie sur le
mélange d'essai, manque d'alimentation).
À la fin de l'essai, mesurer le pH d'un récipient témoin et d'un récipient pour chacune des concentrations
selon l'ISO 10390. Il est recommandé de mesurer le pH de tout récipient dans lequel le taux de mortalité ou la
croissance sort de l'ordinaire.
Facultatif: à la fin de l'essai (28 jours), après la pesée finale et le mesurage final du diamètre de la coquille,
laisser les escargots de chaque récipient jeûner pendant 48 h dans des boîtes humides, dépourvues de
substrat d'essai (jusqu'à ce qu'ils n'excrètent plus), puis les surgeler en vue d'une analyse éventuelle de la
concentration de contaminants présents dans leurs tissus ou organes.
10 Substance de référence
Un essai du témoin est régulièrement effectué avec une substance de référence afin de contrôler la survenue
de changements dans la sensibilité des organismes d'essai.
NOTE Il a été démontré par expérience que le chlorure de cadmium convient en tant que substance de référence.
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Déterminer régulièrement les valeurs de la CE (28 jours) et de la CE (28 jours) pour le chlorure de
50,m 50,d
cadmium en appliquant le protocole décrit dans la présente Norme internationale.
AVERTISSEMENT — Il convient de prendre les précautions nécessaires pour la manipulation du
chlorure de cadmium qui est une substance nocive.
La CE (28 jours) du CdCl doit être comprise entre 350 mg et 650 mg de Cd par kg de substrat d'essai
50,m 2
sec.
La CE (28 jours) du CdCl doit être comprise entre 500 mg et 800 mg de Cd par kg de substrat d'essai sec.
50,d 2
Noter les valeurs obtenues ainsi que la date de leur obtention dans le rapport d'essai.
En 2000, quatre laboratoires ont participé à un essai interlaboratoires portant sur le chlorure de cadmium. Les
résultats sont indiqués dans le Tableau 2.
Tableau 2 — Résultats de l'essai interlaboratoires avec Helix aspersa aspersa
(contamination du substrat; méthode semi-statique)
CE (28 jours) CE (28 jours)
50,m 50,d
Substance mg Cd/kg mg Cd/kg
Moyenne Plage Moyenne Plage
CdCl 500 398 à 622 600 507 à 781
11 Calculs et expression des résultats
11.1 Calculs
Pour chaque concentration, déterminer le pourcentage de mortalité, le cas échéant, au moment de l'essai
définitif.
À la fin de l'essai (28 jours; en option: chaque semaine), calculer les masses moyennes et le diamètre moyen
de la coquille, ainsi que les écarts-type associés, pour les escargots de chaque récipient et pour chaque
concentration.
Un exemple de tableau de données est fourni dans l'Annexe D.
Pour chaque récipient, calculer le coefficient de croissance de la biomasse (désigné k ) et le coefficient de
CC,m
croissance du diamètre de la coquille (désigné k ) selon les Équations (1) et (2), respectivement.
CC,d
mm−
()
tn t0
k=×100 (1)
CC,m
m
t0
où
k est le coefficient de croissance de la biomasse;
CC,m
m est la masse moyenne des escargots par réplicat à l'instant tn, en grammes (g);
tn
m est la masse moyenne des escargots par réplicat à l'instant t0, en grammes (g).
t0
dd−
()
tn t0
k=×100 (2)
CC,d
d
t0
où
k est le coefficient de croissance du diamètre de la coquille;
CC,d
d est le diamètre moyen de la coquille des escargots par réplicat à l'instant tn, en
tn
millimètres (mm);
d est le diamètre moyen de la coquille des escargots par réplicat à l'instant t0, en millimètres (mm).
t0
Pour chaque concentration, calculer le pourcentage moyen d'inhibition de la croissance de la biomasse
(désigné p ) et d'inhibition de la croissance du diamètre de la coquille (désigné p ) selon les Équations (3)
I,m I,d
et (4), respectivement.
mm−−m''−m
()()
00tn t0 tn t0
p=×100 (3)
I,m
mm−
()
00tn t0
où
p est le pourcentage moyen d'inhibition de la croissance de la biomasse;
I,m
m est la masse moyenne des escargots pour le témoin à l'instant tn, en grammes (g);
0tn
m est la masse moyenne des escargots pour le témoin à l'instant t0, en grammes (g);
00t
m' est la masse moyenne des escargots par concentration à l'instant tn, en grammes (g);
tn
m' est la masse moyenne des escargots par concentration à l'instant t0, en grammes (g).
t0
dd−−d''−d
()()
00tn t0 tn t0
p=×100 (4)
I,d
dd−
()
00tn t0
où
p est le pourcentage moyen d'inhibition de la croissance du diamètre de la coquille;
I,d
d est le diamètre moyen de la coquille pour le témoin à l'instant tn, en millimètres (mm);
0tn
d est le diamètre moyen de la coquille pour le témoin à l'instant t0, en millimètres (mm);
00t
d ' est le diamètre moyen de la coquille par concentration à l'instant tn, en millimètres (mm);
tn
d ' est le diamètre moyen de la coquille par concentration à l'instant t0, en m
...
Questions, Comments and Discussion
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