ISO 16387:2014

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16387
Second edition
2014-01-15
Soil quality — Effects of contaminants
on Enchytraeidae (Enchytraeus
sp.) — Determination of effects on
reproduction
Qualité du sol — Effets des contaminants sur les Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Détermination des effets sur la survie et la
reproduction
Reference number
©
ISO 2014
© ISO 2014
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2014 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
5 Reagents and material . 3
6 Apparatus . 6
7 Test environment . 6
8 Procedure. 7
8.1 Experimental design . 7
8.2 Preparation of test mixtures . 8
8.3 Addition of the biological material . 9
8.4 Test conditions and measurements . 9
8.5 Reference substance . 9
9 Calculation and expression of results .10
9.1 Calculation .10
9.2 Expression of results .10
10 Validity of the test .10
11 Statistical analysis .10
11.1 General .10
11.2 Range-finding test .10
11.3 Definitive test .11
12 Test report .11
Annex A (informative) Conditions for culture of Enchytraeus sp .13
Annex B (informative) Test procedure using other Enchytraeus species .15
Annex C (informative) Determination of maximum water-holding capacity .17
Annex D (informative) Detailed description of extraction techniques .18
Annex E (informative) Overview of the statistical assessment of data (NOEC determination) .19
Bibliography .20
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any
patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or on
the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information.
The committee responsible for this document is ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 16387:2004), which has been technically
revised.
iv © ISO 2014 – All rights reserved

Introduction
Ecotoxicological test systems are applied to obtain information about the effects of contaminants in
soil and are proposed to complement conventional chemical analysis. ISO 15799 includes a list and
short characterization of recommended and standardized test systems. Aquatic test systems with soil
eluate are applied to obtain information about the fraction of contaminants potentially reaching the
groundwater by the water path (retention function of soils), whereas terrestrial test systems are used
to assess the habitat function of soils. For the latter, a standardized test system using Enchytraeidae (a
chronic test with end-point reproduction) is proposed.
This International Standard describes a method that is based on the determination of acute and sublethal
effects of contaminated soils to adult Enchytraeidae of the genus Enchytraeus. Optionally, the method
can be used for testing substances added to standard soils (e.g. artificial soil) for their sublethal hazard
potential to Enchytraeidae.
Soil-dwelling annelids of the genus Enchytraeus are ecologically relevant, i.e. they are abundant in
many soils where earthworms are scarce, but can also reach high population densities in soils well
inhabited by earthworms. Enchytraeidae can be used in laboratory tests as well as in semi-field and
field studies. From a practical point of view, many Enchytraeus species are easy to handle and breed,
and their generation time is significantly shorter than that of earthworms [the test duration for a
reproduction test with Enchytraeidae is four weeks to six weeks, compared to eight weeks (12 weeks
including synchronization) with earthworms]. In addition, a much smaller volume of soil is needed in the
enchytraeid test compared to the amount needed in earthworm tests.
This International Standard has been drawn up taking into consideration test procedures recommended
[22] [24]
by the Organization for Economic Cooperation and Development (see , ).
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16387:2014(E)
Soil quality — Effects of contaminants on Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Determination of effects on
reproduction
1 Scope
This International Standard specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils
and determining effects of soil contaminants and substances on the reproduction of Enchytraeus sp. by
dermal and alimentary uptake in a chronic test. It is applicable to soils and soil materials of unknown
quality, e.g. from contaminated sites, amended soils, soils after remediation, agricultural or other sites
under concern and waste materials.
Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For
contaminated soils, the effects are determined in the soil to be tested and in a control soil. According to
the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) are
either an uncontaminated soil comparable to the soil to be tested (reference soil) or a standard soil (e.g.
artificial soil).
This International Standard provides information on how to use this method for testing substances
under temperate conditions.
The method is not applicable to volatile substances, i.e. substances for which H (Henry’s constant) or the
air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,013 3 Pa at
25 °C.
NOTE No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the substance under test.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under
aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis)
ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level
using barium chloride solution
ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
reproduction
mean number of offspring per test vessel after incubation under the specified test conditions
Note 1 to entry: The test period for the determination of the reproduction (definitive test) is six weeks.
Note 2 to entry: offspring = hatched juvenile enchytraeids
3.2
reproduction rate
mean number of offspring produced per a number of adults over the test period
Note 1 to entry: The test period for the determination of the reproduction (definitive test) is six weeks.
Note 2 to entry: offspring = hatched juvenile enchytraeids
3.3
ECx
effect concentration for x % effect
concentration (mass fraction) of a test substance that causes x % of an effect on a given endpoint within
a given exposure period when compared with a control
EXAMPLE An EC50 is a concentration estimated to cause an effect on a test end point in 50 % of an exposed
population over a defined exposure period.
Note 1 to entry: The ECx is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture (dry mass).
When substances are tested, the ECx is expressed as mass of the test substance per dry mass of soil, in milligrams
per kilogram.
3.4
LOEC
lowest observed effect concentration
lowest test substance concentration that has a statistically significant effect (probability p < 0,05)
Note 1 to entry: In this test the LOEC is expressed as a mass of test substance per dry mass of the soil to be tested.
All test concentrations above the LOEC should usually show an effect that is statistically different from the control.
3.5
NOEC
no observed effect concentration
highest test substance concentration immediately below the LOEC at which no effect is observed
Note 1 to entry: In this test, the concentration corresponding to the NOEC, has no statistically significant effect
(p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control.
3.6
test mixture
mixture of contaminated soil or test substance (e.g. chemical, biosolid, waste) with control soil
3.7
test mixture ratio
ratio between the soil to be tested and the control soil in a test mixture
3.8
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
3.9
reference soil
uncontaminated soil with comparable pedological properties (nutrient concentrations, pH, organic
carbon content and texture) to the soil being studied
2 © ISO 2014 – All rights reserved

3.10
standard soil
field-collected soil or artificial soil whose main properties (pH, texture, organic matter content) are
within a known range
EXAMPLE Euro soils, artificial soil, LUFA Standard soil
Note 1 to entry: The properties of standard soils can differ from the soil to be tested.
3.11
control soil
reference or standard soil used as a control and as a medium for preparing dilution series with soils to
be tested or a reference substance, which fulfils the validity criteria
Note 1 to entry: In the case of natural soil, it is advisable to demonstrate its suitability for a test and for achieving
the test validity criteria before using the soil in a definitive test.
4 Principle
The effects on survival and reproduction of adult Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) exposed to a dilution
range of contaminated soil or range of concentrations of a test substance are determined. Test mixtures
are prepared at the start of the test and are not renewed within the test period.
The test can be divided into two distinct steps: a short (two weeks) test in which the range of toxic effects
(mainly mortality) is determined, and a long-term (six weeks) definitive test in which the survival of
parental worms and the fecundity (number of juveniles) are measured. The results obtained from the
tests are compared with a control and are used to determine the dilutions or concentrations which
cause no effects on survival and reproduction (NOEC) and the concentration (dilution) resulting in x %
reduction of juveniles hatched from cocoons compared to the control (ECx, 42 d).
All test dilutions/concentrations above the LOEC have a harmful effect equal to, or greater than that
observed at the LOEC. Where there is no prior knowledge of the dilution/concentration of the test
substance likely to have an effect, then it is useful to conduct the test in two steps:
— an acute toxicity test (range-finding test) is carried out, to give an indication of the effect
dilution/concentration, and the dilution/concentration giving no mortality (NOEC).
Dilutions/concentrations to be used in the definitive test can then be selected;
— the definitive test on reproduction to determine sublethal effects of (dilutions of) contaminated
soil or the concentration of a substance which, when evenly mixed into the standard soil, causes
no significant effects on numbers of offsprings hatched from cocoons compared with the control
(NOEC), and the lowest concentration causing effects (LOEC).
NOTE The use of a suitable reference soil is an essential requirement to demonstrate the present status of the
test population, and to avoid misinterpretation of results.
5 Reagents and material
5.1 Biological material, recommended test species is Enchytraeus albidus Henle 1837 (white potworm;
Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). E. albidus is one of the largest enchytraeid species, measuring
[21] [31]
15 mm to 40 mm, and has a world-wide distribution (see e.g. , ). It can be easily recognized by two
characteristics: four setae per bundle ventrally, and the very long seminal duct in the clitellum region
as well as some segments behind it. The species can be found in marine, limnic and terrestrial habitats,
mainly in decaying organic matter (seaweed, compost) and only rarely in meadows. This broad ecological
tolerance and some morphological variations indicate that the species probably consists of several
races (or ecotypes). E. albidus can be obtained commercially, since it is sold as food for fish. It should be
[7] [10] [32]
verified whether such a culture is contaminated by other, usually smaller species (see e.g. , , ). If
contamination of the culture occurs, all worms are washed in water in a Petri dish. With the help of a
stereomicroscope, large adult specimens of E. albidus are selected to start a new culture. All other worms
of the original culture are discarded. E. albidus can be bred easily in a wide range of organic materials (see
Annex A) and has a short life cycle, reaching maturity between 33 d (at 18 °C) and 74 d (at 12 °C). Only
cultures which have been kept in the laboratory for at least five weeks (one generation cycle) without
problems shall be used for testing purposes.
Other species of the genus Enchytraeus, especially the true soil-inhabiting but smaller species E. crypticus
Westheide and Graefe 1992 or E. buchholzi Vejdovsky 1879, are also suitable as test organisms (see
Annex B). If other species of Enchytraeus are used, they shall be clearly identified and the rationale for
the selection of the species as well as deviations of the experimental method should be reported in this
case. The worms used in the tests should be adult with eggs (white spots) in the clitellum region and
should have approximately the same size (approximately 15 mm). A synchronisation of the breeding
culture is not necessary. The Enchytraeidae should be acclimatised in untreated artificial soil under test
conditions for at least 24 h prior to testing. During this period, the same food which is used as a food
source in the test should be given in sufficient amount.
For one test, an excess number of adult clitellate worms should be taken from the culture box without
observing them in detail in order to get enough suitable worms. At the end of the acclimatization period,
only worms with eggs and behaving as usual (e.g. not trying to leave the artificial soil) are selected
for the test. This selection is made by placing the worms in a Petri dish filled with a small amount of
water under a stereomicroscope, and discarding the animals without eggs. A freshwater medium (e.g.
[23]
reconstituted water as described in ) should preferably be used, since demineralized water or tap
water (risk of copper contamination) can harm the Enchytraeidae. During this process, other organisms
living in the cultures, such as mites, are also removed from the worms.
NOTE An example of culturing Enchytraeus sp. is given in Annex A.
5.2 Test mixture, which may consist of field-collected soil or control soil amended by the test substance.
5.2.1 Field-collected soil or waste
The sample(s) can be field-collected soil from an industrial, agricultural or other site of concern, or
waste materials (e.g. dredged material, municipal sludge from a wastewater treatment plant, composed
material, or manure) under consideration for possible land disposal.
The fields soils used in the test shall be passed through a sieve of 4 mm square mesh to remove coarse
fragments and thoroughly mixed. If necessary, soil may be air-dried without heating before sieving.
Storage of soils to be tested should be as short as possible. The soil shall be stored in accordance with
ISO 10381-6 using containers that minimize losses of soil contaminants by volatilisation and sorption to
the container walls. Soil pH should not be corrected as it can influence bioavailability of soil contaminants.
For interpretation of test results, the following characteristics shall be determined for each soil sampled
from a field site:
a) pH in accordance with ISO 10390;
b) texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277;
c) water content in accordance with ISO 11465;
d) water holding capacity according to Annex C;
e) cation exchange capacity in accordance with ISO 11260;
f) organic carbon in accordance with ISO 10694.
NOTE It is important to measure the water holding capacity of all mixtures used in the test.
5.2.2 Control soil, either a) reference (3.9) or b) standard soil (3.10) that allows the presence of
Enchytraeidae (at least the validity criteria shall be fulfilled). Control soil and soil used for dilution shall
not differ in one test (either a) or b)).
4 © ISO 2014 – All rights reserved

a) If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should
be treated and characterized like the soils to be tested. If a toxic contamination or unusual soil
properties cannot be ruled out, standard control soils should be preferred.
b) For testing the effects of substances mixed into soil, standard soils (e.g. artificial soil, LUFA) shall be
used as test substrate. The properties of the field-collected standard soil shall be reported.
The substrate called artificial soil can be used as a standard soil and has the following composition:
Percentage expressed on
dry mass basis
− Sphagnum peat finely ground and with no visible plant          10 %
remains
− Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite         20 %
− Industrial quartz sand (dominant fine sand with more          69 %
than 50 % of particle size 0,05 mm to 0,2 mm)
Approximately 0,3 % to 1,0 % calcium carbonate (CaCO , pulverised, analytical grade) are necessary to
get a pH of 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Taking the properties of highly non-polar (log K > 2) or ionizing substances into account, 5 % of peat
ow
[22]
have proven to be sufficient for maintaining the desired structure of the artificial soil.
Prepare the artificial soil at least three days prior to start the test, by mixing the dry constituents
listed above thoroughly in a large-scale laboratory mixer. A portion of the deionized water required
is added while mixing is continued. The amount of calcium carbonate required can vary, depending
on properties of the individual batch of sphagnum peat and should be determined by measuring sub-
samples immediately before the test. Store the mixed artificial soil at room temperature for at least two
days to equilibrate acidity. To determine pH and the maximum water holding capacity, the dry artificial
soil is pre-moistened one or two days before starting the test by adding deionised water to obtain half of
the required final water content of 40 % to 60 % of the maximum water holding capacity.
The total water holding capacity is determined according to Annex C, the pH is determined according to
ISO 10390.
NOTE 2 Allowance should be made for any water that is to be used for introducing the test substance into the
soil.
5.3 Food
Rolled oats, preferably autoclaved (heating is also possible) before use to avoid infection with other
[31]
organisms, were found to be suitable . The first feeding is made by mixing 50 mg of ground rolled
oats per test vessel into the soil (after application of the test substance but before adding the worms);
additional feedings (25 mg per vessel per week except after 28 d) are made only on the surface to avoid
harming the worms. Since the need for food can vary in the different vessels, feeding should be adjusted
to demand (i.e. over-feeding shall be avoided). Some soil particles should be placed on top of the flasks
in order to reduce fungal growth.
5.4 Reagents
5.4.1 Bengal red.
5.4.2 Ethanol.
5.4.3 Boric acid, suitable as reference substance.
6 Apparatus
Usual laboratory equipment and the following.
6.1 Test container, of capacity 0,20 l to 0,25 l, with a diameter (e.g. 5 cm) enabling a depth of 1,5 cm to
2 cm of soil, with lids (e.g. glass or perforated plastic film). The beakers shall be suitable as test vessels,
containing an amount of artificial soil corresponding to 20 g dry mass. The lids shall permit gaseous
exchange between the soil substrate and the atmosphere.
6.2 Drying cabinet.
6.3 Stereomicroscope.
6.4 Balances with a weighing range of 50 g to 32 kg; precision at least 1 g.
6.5 Analytical balance with a weighing range of 10 mg to 200 g; precision at least 1 mg.
6.6 pH-meter.
6.7 Temperature registration (e.g. temperature/humidity recorder).
6.8 Lux meter.
6.9 Mixer.
6.10 Incubator or small room with air-conditioner.
6.11 Jeweller’s tweezers, hooks, loops or a small brush.
6.12 Photo basins with ribbed bottoms.
7 Test environment
Cover the test vessels (6.1) with glass lids to prevent the test substrate from drying, and keep under test
conditions for two weeks (range-finding test) or six weeks (definitive test). The test temperature shall
be (20 ± 2) °C; higher temperatures can affect reproduction. Carry out testing in a controlled light-dark
cycle of long-day conditions, preferably 16 h to 8 h at 400 lx to 800 lx in the area of the test vessels, to
prevent the worms from escaping from the soil.
Weigh the vessels at the beginning of the test and thereafter once a week. Replenish the mass loss with
the appropriate amount of deionized water. This loss can be minimized by maintaining a high humidity
(>80 %) in the test incubator (6.10). Place all test vessels in the test incubator in a random order, which
should be changed every week.
At the beginning and the end of both the range-finding test and the definitive test, the water content and
the pH should be measured. To facilitate checking of the pH and water content of the test substrate, use
of additional containers (replicates) for each concentration and for the control is recommended.
6 © ISO 2014 – All rights reserved

8 Procedure
8.1 Experimental design
8.1.1 General
A sample of field-collected soil can be tested at a single concentration (typically 100 %) or evaluated
for toxicity in a multi-concentration test whereby a series of concentrations (dilutions) are prepared
by mixing measured quantities with a control soil (5.2.2). Depending on the knowledge of relevant
response levels a range-finding test may precede the definitive test. Each definitive test consists of a
series of soil mixtures (treatments). Each treatment is replicated at least four times.
8.1.2 Range-finding test
A test to find the range of mixture ratio affecting Enchytraeidae is optional. If it is necessary to determine
the range of concentrations (dilutions) for use in the definitive test, perform a range-finding (acute) test
in a large range of concentrations (dilutions) of the contaminated soil, e. g. 0 % – 1 % – 5 % – 25 % – 50 %
– 75 % – 100 %, or of the test substance, e.g. 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg and 1 000 mg/kg
(the concentrations being expressed in milligrams of test substance per kilogram of dried standard soil
(5.2.2) and a control using 10 worms per container.
The range-finding test is conducted without replication.
8.1.3 Definitive test
The design of the definitive test depends on the test objectives. Typically the habitat properties of
samples of a field-collected soil are characterized by a comparison of the biological effects for the soil(s)
to be tested with the effects found in a reference soil or, if not available or not appropriate due to toxicity
or atypical physicochemical characteristics, in a standard soil. Results for the standard soil assist in
distinguishing contaminant effects from non-contaminant effects caused by soil physicochemical
properties. Regardless of whether a reference soil or standard soil is used for the statistical comparisons,
[14]
the results from standard soil shall be used to judge the validity and acceptability of the test.
If, for characterization purposes, a test design including dilution series is required, three designs are
possible (the concentrations shall be spaced by a factor not exceeding 2):
— For the NOEC approach, at least five concentrations in a geometric series should be used. Four
replicates for each concentration plus eight controls are recommended.
— For the ECx approach, 12 concentrations should be used. Two replicates for each concentration
plus at least six controls are recommended. The spacing factor can be variable; smaller at low
concentrations, larger at high concentrations.
— For the mixed approach, six to eight concentrations in a geometric series should be used. Four
replicates for each concentration plus at least eight controls are recommended. This mixed approach
allows a NOEC as well as an ECx evaluation.
A limit test can be sufficient if in the range-finding test no toxic effect was observed. In the limit test only
the soil to be tested without any dilution and the control (or the soil to be tested vs. the control soil) shall
be tested with at least four replicates each.
If the soil to be tested has properties that are quite different from the usual standard control soils (e.g.
OECD artificial soil or LUFA 2.2 soil), for instance a rather low or high pH, or very low or high organic
matter or clay contents, it is essential to have a reference soil that has similar properties. In that case,
control performance of the enchytraeids can, however, be less good than ‘usual’ and quality control of
the test is not possible on the basis of the reference soil. For assessing toxicity of the soil to be tested, it
is important however to have such a reference soil, which can also be used to prepare dilution series of
the soil to be tested. For test quality assessment it is essential in such case to include both a reference
and a standard control soil.
8.2 Preparation of test mixtures
8.2.1 Testing contaminated soil
According to the selected dilution range, the soil to be tested is mixed with the reference soil or the
standard soil thoroughly (either manually or by using a hand mixer). The homogeneity of the mixture is
checked visually. The total mass of the soil to be tested and the reference soil or the standard soil shall
be equal to 20 g (dry mass) in each test container (6.1). The test mixture shall be wetted with deionised
water to reach 40 % to 60 % of the total water holding capacity determined according to Annex C. In
some cases e.g. when testing waste materials, higher percentages are required. This can be easily tested
by compressing the substrate by the fist and looking for water coming through the fingers.
Determine the pH for each test mixture (one container per concentration) according to ISO 10390 at the
beginning and end of the test (do not adjust the pH).
WARNING — Contaminated soils can contain unknown mixtures of toxic, mutagenic, or otherwise
harmful chemicals or infectious microorganisms. Occupational health risks can arise from dust
or evaporated chemicals as well as via dermal contact during handling and incubation.
8.2.2 Testing substances added to the test substrate
For each test container (6.1), the quantity of substrate used shall be equivalent to 20 g (dry mass).
Standard soil (5.2.2) is used as test substrate. Substances are added to the test substrate and mixed
thoroughly.
For the introduction of test substances use either method a), b) or c), as appropriate:
a) Water-soluble substance
Immediately before starting the test, dissolve the quantity of the test substance in the water required
for the replicates of each concentration (or that portion of it necessary to wet the soil) in order to meet
the requirements of 5.2.2, and mix it thoroughly with the soil before introducing it into a test container.
b) Substances insoluble in water but soluble in organic solvents
Dissolve the quantity of test substance required to obtain the desired concentration in a volatile solvent
(such as acetone or hexane) and mix it with a portion of the quartz sand required. After evaporating the
solvent by placing the container under a fume hood, add the remainder of the soil and the water and mix
it thoroughly before introducing it into the test containers.
NOTE Ultrasonic dispersion, organic solvents, emulsifiers or dispersants can be used to disperse substances
with low aqueous solubility. When such auxiliary substances are used, all test concentrations and an additional
control should contain the same minimum amount of auxiliary substance.
WARNING — Take appropriate precautions when dealing with solvent vapour to avoid danger
from inhalation or explosion, and to avoid damage to extraction equipment, pumps, etc.
c) Substances insoluble in water or organic solvents
For a substance insoluble in a volatile solvent, prepare a mixture of 10 g of finely ground industrial quartz
sand (see 5.2.2) and the quantity of the test substance required to obtain the desired concentration.
Place the mixture, the remainder of the soil (5.2.2) and the water into the test container (6.1) and mix
thoroughly.
Base the concentrations selected to provide the LOEC/NOEC on the results of the range-finding test.
Space the concentrations by a factor not exceeding 2.
Substances mixed into the substrate do not need to be tested at concentrations higher than 1 000 mg/kg
mass of test substrate.
Proceed simultaneously with at least four replicates per concentration and the control(s).
8 © ISO 2014 – All rights reserved

Determine the pH for each test mixture (one container per concentration) according to ISO 10390 at the
beginning and end of the test (do not adjust the pH).
8.2.3 Preparation of control container
The control container contains the control soil (5.2.2) wetted with deionised water to reach 40 % to
60 % of the total water holding capacity (determined according to Annex C).
Use one control container for the range-finding test and four to eight control containers, depending on
the test design (see 8.1.3).
Prepare the control containers in the same way as the test containers. If the preparation of the test
requires the use of a solvent (see 8.2.2), use an additional control prepared with solvent but without the
test substance. Cover the containers as indicated in 6.1.
8.3 Addition of the biological material
Into each test container and the control container 10 Enchytraeidae (5.1) are placed carefully on the
test mixture surface, using a suitable device (6.11). The selection of the individual worms and their
assignment to batches of 10 should be made in a randomized fashion.
Cover the container as indicated in 6.1 and place it in the incubator or small room with air-conditioner
(6.10).
8.4 Test conditions and measurements
The duration of the first part of the test is 21 d (assessment of mortality). The adult worms are fed once a
week with 50 mg at the beginning of the test and afterwards with 25 mg dry mass rolled oats per vessel.
If food consumption is low, reduce feeding to a minimum to avoid fungal growth or moulding. After 21 d,
the soil to be tested is carefully searched manually (e.g. using a jeweller’s tweezers, a hook or loop, or a
small brush with a hook) for the adult worms, which are then removed and counted. Morphological and
behavioural changes of the adult worms are recorded. If mortality is the main end point of the test, the
whole procedure is stopped at this point.
The same soil to be tested to which the adult worms were exposed, including cocoons deposited during
the first three weeks of the test, is incubated under the same test conditions for another three weeks.
The juvenile worms hatched in the second half of the definitive test are fed with 25 mg dry mass rolled
oats per vessel per week (except after four weeks). Again, over-feeding shall be avoided (see 5.3). After
total test duration of six weeks, the juveniles hatched in the meantime are counted by staining with
Bengal red (5.4). Wet (but not heat) extraction techniques have also proved to be suitable (see Annex D).
The first method is recommended, since wet extraction is difficult to use with artificial soil because the
clay particles make the water turbid.
NOTE Annex D gives examples of two suitable methods, including one which allows counting of cocoons.
8.5 Reference substance
The NOEC and/or the ECx of a reference substance shall be determined to provide assurance that
the laboratory test conditions are adequate and to verify that the response of the test organism does
not change statistically over time. It is advisable to test a reference substance at least twice a year
or, when testing is carried out in lower frequency, in parallel to the determination of the toxicity of
a test substance. Boric acid is recommended as a reference substance. If the compound is mixed into
the substrate, observe the effects on reproduction (α = 0,05) at concentrations of between 400 mg and
600 mg boric acid per kilogram dry mass of substrate.
9 Calculation and expression of results
9.1 Calculation
For each dilution or concentration, determine the percent mortality, of the adults and number of offspring
produced in the definitive test.
Compare means by suitable statistical methods, e.g. Williams, Dunnetts or Student-t-test and test for
significance (α = 0,05) of differences from control(s).
9.2 Expression of results
A graphical presentation of the mean values of the end points including standard deviation of the
measured values against the soil(s) to be tested, control soil(s) or test mixture ratio should be prepared.
This comparison or curve gives an impression of the quality of effects and their magnitudes. Express the
mixture ratio as based on soil dry mass.
If dilution series were performed indicate:
— in % soil to be tested based on dry mass or in milligrams per kilogram of dried soil substrate, the
median percent dilution of contaminated soil or median lethal concentration of the test substance,
which reduces the number of juvenile worms to 50 % compared to the control within the test period
and
— the soil mixture ratio immediately below the LOEC or highest tested concentration of a test substance
which when compared to the control has no statistically significant lethal or other effect such as
reproduction (p < 0,05).
10 Validity of the test
The results are considered to be valid if the following conditions are met in the control:
a) The mortality of the adult worms should not exceed 20 % on average at the end of the range-finding
test and after the first three weeks of the definitive test.
b) In the definitive test, the average number of juveniles should be higher than 25 per test vessel at the
end of the definitive test, assuming that 10 adult worms (with eggs in the clitellum region) per test
vessel were introduced at the beginning of the test.
c) The coefficient of variation calculated for the reproduction data should be not higher than 50 % at
the end of the definitive test.
11 Statistical analysis
11.1 General
Analyses of the results differ according to the purposes and particular designs of the test. Standard
statistical procedures (e.g. Analysis of variance and multiple comparisons) generally are sufficient for
analysing the results.
11.2 Range-finding test
If a clear dose-response is obvious, ECx-values can be estimated by using regression techniques like
logistic regression function or probit analysis. In other cases the effect range should be determined by
expert knowledge.
10 © ISO 2014 – All rights reserved

11.3 Definitive test
Analysis of variance (ANOVA) involving multiple comparisons of end-point data derived for undiluted
soils to be tested (single-concentration test) including field replicates of field-collected soil from more
than one sampling location is commonly used for statistical interpretation of the significance of findings
from soil toxicity tests (see Annex E). This is a hypothesis-testing approach, and is subject to appreciable
[7]
weaknesses. The parametric analyses (e.g. ANOVA and multiple comparisons) for such data assume
that the data are normally distributed, that the treatments are independent, and that the variance is
homogenous among the different treatments. These assumptions shall be tested. If the data satisfy these
assumptions, analysis may proceed. If not, data may be transformed and tested again. As parametric
tests are reasonably robust in the face of moderate deviations from normality and equality of vari
...

PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 16387
ISO/TC 190/SC 4 Secrétariat: AFNOR
Début de vote Vote clos le
2012-04-26 2012-09-26
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION    МЕЖДУНАРОДНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ    ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION

Qualité du sol — Effets des polluants sur les Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Détermination des effets sur la survie et
la reproduction
Soil quality — Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) — Determination of effects on
reproduction
[Révision de la première édition (ISO 16387:2004)]
ICS 13.080.30
TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
Le présent projet a été élaboré dans le cadre de l'Organisation internationale de normalisation (ISO) et
soumis selon le mode de collaboration sous la direction de l'ISO, tel que défini dans l'Accord de
Vienne.
Le projet est par conséquent soumis en parallèle aux comités membres de l'ISO et aux comités
membres du CEN pour enquête de cinq mois.
En cas d'acceptation de ce projet, un projet final, établi sur la base des observations reçues, sera
soumis en parallèle à un vote d'approbation de deux mois au sein de l'ISO et à un vote formel au sein
du CEN.
Pour accélérer la distribution, le présent document est distribué tel qu'il est parvenu du
secrétariat du comité. Le travail de rédaction et de composition de texte sera effectué au
Secrétariat central de l'ISO au stade de publication.
To expedite distribution, this document is circulated as received from the committee
secretariat. ISO Central Secretariat work of editing and text composition will be undertaken at
publication stage.
CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE
PEUT ETRE CITE COMME NORME INTERNATIONALE AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D'ETRE EXAMINES POUR ETABLIR S'ILS SONT ACCEPTABLES A DES FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET
COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ETRE
CONSIDERES DU POINT DE VUE DE LEUR POSSIBILITE DE DEVENIR DES NORMES POUVANT SERVIR DE REFERENCE DANS LA
REGLEMENTATION NATIONALE.
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE.
©  Organisation Internationale de Normalisation, 2012

ISO/DIS 16387
Notice de droit d'auteur
Ce document de l'ISO est un projet de Norme internationale qui est protégé par les droits d'auteur de l'ISO.
Sauf autorisé par les lois en matière de droits d'auteur du pays utilisateur, aucune partie de ce projet ISO ne
peut être reproduite, enregistrée dans un système d'extraction ou transmise sous quelque forme que ce soit
et par aucun procédé électronique ou mécanique, y compris la photocopie, les enregistrements ou autres,
sans autorisation écrite préalable.
Les demandes d'autorisation de reproduction doivent être envoyées à l'ISO à l'adresse ci-après ou au
comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56  CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Toute reproduction est soumise au paiement de droits ou à un contrat de licence.
Les contrevenants pourront être poursuivis.

ii © ISO 2012 – Tous droits réservés

ISO/DIS 16387
Sommaire Page
Avant-propos . iv
Introduction . v
1  Domaine d'application . 1
2  Références normatives . 1
3  Termes et définitions . 2
4  Principe . 3
5  Réactifs . 4
6  Appareillage . 6
7  Environnement d'essai . 7
8  Mode opératoire . 7
8.1  Dispositif expérimental . 7
8.1.2  Essai préliminaire . 8
8.1.3  Essai définitif . 8
8.2  Préparation des mélanges d'essai . 9
8.2.1  Essais menés avec un sol contaminé . 9
8.2.2  Essais menés avec des substances ajoutées au substrat d’essai . 9
8.2.3  Préparation du récipient témoin . 10
8.3  Ajout du matériel biologique . 10
8.4  Conditions d’essai et mesurages . 10
8.5  Substance de référence . 11
9  Calcul et expression des résultats . 11
9.1  Calcul . 11
9.2  Expression des résultats . 11
10  Validité de l’essai . 11
11  Analyse statistique . 12
11.1  Essai préliminaire . 12
11.2  Essai définitif . 12
12  Rapport d'essai . 13
Annexe A (informative) Conditions de culture de Enchytraeus sp. . 14
Annexe B (informative) Mode opératoire d’essais menés avec d’autres espèces du genre
Enchytraeus . 16
Annexe C (informative) Description détaillée des techniques d'extraction . 18
Annexe D (informative) Détermination de la capacité maximale de rétention d’eau . 20
Annexe E (informative) Présentation de l'évaluation statistique des données (détermination de la
CSEO) . 21
Bibliographie . 22

ISO/DIS 16387
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 16387 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4, Méthodes
biologiques, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 345, Qualité du sol.
iv © ISO 2012 – Tous droits réservés

ISO/DIS 16387
Introduction
Les systèmes d’essais écotoxicologiques sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur les effets des
contaminants du sol et sont proposés en complément des analyses chimiques conventionnelles. L’ISO 15799
comporte une liste ainsi qu’une brève caractérisation des systèmes d’essais recommandés et normalisés. Les
systèmes d’essais aquatiques mis en œuvre sur éluat de sol sont mis en œuvre pour obtenir des informations
sur la fraction de contaminants susceptible d’atteindre les eaux souterraines du fait de la circulation de l'eau
(fonction de rétention des sols), tandis que les systèmes d’essais terrestres servent à évaluer la fonction
d’habitat des sols. Concernant les seconds, un système d’essai normalisé utilisant Enchytraeidae (un essai
chronique prenant la reproduction comme critère d'effet final) est proposé.
L’ISO 16387 décrit une méthode basée sur la détermination des effets aigus et sublétaux des sols contaminés
sur les Enchytraeidae adultes du genre Enchytraeus. La méthode peut éventuellement être utilisée pour
évaluer le potentiel toxique aigu vis-à-vis des Enchytraeidae de substances chimiques ajoutées à un sol
standard (par exemple, un sol artificiel).
Les annélides du genre Enchytraeus vivant dans le sol sont pertinents sur le plan écologique car ils abondent
dans un grand nombre de sols pauvres en vers de terre ; cependant, ils peuvent également atteindre de fortes
densités de population dans des sols abondamment peuplés en vers de terre. Les Enchytraeidae se prêtent à
des essais en laboratoire ainsi qu'à des études en conditions semi-contrôlées et à des études de terrain. D’un
point de vue pratique, de nombreuses espèces d'Enchytraeus sont faciles à manipuler et à élever et leur
temps de génération est nettement plus court que celui des vers de terre [la durée des essais de reproduction
des Enchytraeidae est de quatre à six semaines, contre huit semaines (12 semaines en incluant la
synchronisation) pour les vers de terre]. De plus, le volume de sol nécessaire pour les essais menés sur les
Enchytraeidae est de loin inférieur au volume nécessaire pour les essais sur les vers de terre.
La présente partie de l’ISO 16387 a été rédigée en tenant compte des modes opératoires d’essai
recommandés par l’Organisation de coopération et de développement économiques (voir les références
bibliographiques).
PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 16387

Qualité du sol — Effets des polluants sur les Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Détermination des effets sur la survie et
la reproduction
1 Domaine d'application
La présente partie de l’ISO 16387 spécifie une des méthodes permettant d'évaluer la fonction d’habitat des
sols et de déterminer les effets des contaminants du sol et des substances chimiques sur la reproduction
d’Enchytraeus sp. par absorption cutanée et ingestion dans un essai chronique. Elle est applicable aux sols et
aux matériaux de type sol de qualité inconnue, provenant par exemple, de sites contaminés, de sols
amendés, de sols après remédiation, de sols agricoles ou autres sites d'intérêt, et de déchets.
Les effets des substances sont évalués à l'aide d'un sol standard, de préférence un substrat de sol artificiel
défini. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un sol témoin.
Selon l'objectif de l'étude, il convient que le substrat témoin et de dilution (gamme de dilutions d'un sol
contaminé) soit un sol non contaminé comparable à l'échantillon de sol à soumettre à essai (sol de référence)
ou un sol standard (par exemple, sol artificiel).
Des informations sont fournies sur la manière d'utiliser cette méthode pour évaluer des substances chimiques
en conditions tempérées.
Cette méthode ne s'applique pas aux substances volatiles, c'est-à-dire aux substances pour lesquelles H
(constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression de
vapeur à 25 °C est supérieure à 0,013 3 Pa.
NOTE La méthode d'essai ne contient aucune disposition permettant de surveiller la persistance de la
substance soumise à essai.
AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de substances
chimiques toxiques, mutagènes ou nocives d'une autre manière ou des micro-organismes infectieux.
Des risques pour la santé au travail peuvent survenir en raison de la poussière ou de l'évaporation de
substances chimiques pendant la manipulation et l’incubation, de même que par contact cutané.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence (y compris les éventuels amendements)
s'applique.
ISO 10381-6, Qualité du sol – Échantillonnage – Partie 6 : Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l'évaluation en laboratoire des processus,
de la biomasse et de la diversité microbiens.
ISO 10390, Qualité du sol – Détermination du pH.
ISO 10694, Qualité du sol – Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire).
ISO 11260, Qualité du sol – Détermination de la capacité d'échange cationique effective et du taux de
saturation en bases échangeables à l'aide d'une solution de chlorure de baryum.
ISO/DIS 16387
ISO 11268-1, Qualité du sol – Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre (Eisenia fetida/Eisenia andrei) –
Partie 1 : Détermination de la toxicité aiguë.
ISO 11465, Qualité du sol – Détermination de la teneur en matière sèche et en eau pondévale – Méthode
gravimétrique.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
reproduction
nombre moyen de jeunes produits par récipient d'essai après six semaines d'incubation dans les conditions
d'essai spécifiées
3.2
taux de reproduction
nombre moyen de jeunes éclos des cocons et ayant survécu jusqu'à la fin de la période d'essai, par ver adulte
encore vivant après six semaines
3.3
ECx
concentration efficace
concentration de la substance d'essai ou pourcentage de dilution du sol contaminé dont on estime qu'elle ou il
réduit le taux de reproduction à la fin de l'essai à x %, par rapport au témoin, pendant la période d'essai (x est
le pourcentage (10, 20, 25, 50) de cet effet)
3.4
CMEO
concentration minimale avec effet observé
plus faible rapport testé du mélange de sols soumis à essai avec un sol de référence ou un sol témoin
standard, pour lequel un effet statistiquement significatif est observé, ou plus faible concentration testée d'une
substance d'essai à laquelle un effet statistiquement significatif par rapport au témoin est observé. Tous les
mélanges d’essai au-dessus de la CMEO ont un effet nocif égal ou supérieur à l’effet observé à la CMEO
3.5
CSEO
concentration sans effet observé
rapport du mélange de sols immédiatement inférieur à la CMEO ou plus forte concentration testée d'une
substance d'essai qui, comparé(e) au témoin, n’a aucun effet létal ou autre effet statistiquement significatif [tel
qu'une modification du poids (p < 0,05)]
3.6
mélange d'essai
mélange de la substance d'essai avec le sol standard, mélange de sol contaminé avec le sol témoin ou
mélange de sol contaminé avec un sol non contaminé comparable à l'échantillon de sol à soumettre à essai
3.7
ratio du mélange d’essai
rapport entre le sol contaminé et le sol témoin dans un mélange d'essai
3.8
contaminant
substance ou agent présent dans le sol du fait de l'activité humaine
[ISO 15176]
ISO/DIS 16387
3.9
sol de référence
sol non contaminé spécifique du site (par exemple, prélevé aux voisinage d’un site contaminé), ayant des
propriétés similaires (concentrations en éléments nutritifs, pH, teneur en carbone organique et texture) à
celles du sol soumis à essai
3.10
sol standard
sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les propriétés principales (par exemple, pH, texture, teneur en
matières organiques) se situent dans une gamme connue, par exemple sols Euro [15], sol artificiel [20], sol
standard LUFA
[11268-1]
Note 1 à l’article : Les propriétés des sols standards peuvent être différentes de celles du sol soumis à essai.
3.11
sol témoin
sol de référence ou sol standard utilisé comme témoin et comme milieu de préparation des gammes de
dilutions avec les sols soumis à essai ou une substance de référence, qui permet la présence des enchytrées
(les critères de validité doivent être satisfaits)
Note 1 à l’article : Toutes les concentrations efficaces sont exprimées en milligrammes de substance d’essai par
kilogramme de masse sèche du substrat d’essai (5.2). Les mélanges de sols sont indiqués en pourcentage sur la base du
poids sec de sol.
4 Principe
Les effets sur la survie et la reproduction d’Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) adultes exposés à une gamme
de dilutions d’un sol contaminé ou à une gamme de concentrations d’une substance d’essai sont déterminés.
Les mélanges d'essai sont préparés au début de l'essai et ne sont pas renouvelés au cours de la période
d’essai.
L'essai peut être scindé en deux étapes distinctes : un essai préliminaire de courte durée (deux semaines), au
cours duquel la gamme de concentrations entraînant des effets toxiques (principalement la mortalité) est
déterminée, et un essai définitif à long terme (six semaines), au cours duquel la survie des vers adultes et la
fécondité (nombre de jeunes) sont mesurées. Les résultats obtenus lors des essais sont comparés à ceux
obtenus avec un essai témoin et utilisés pour déterminer les dilutions ou les concentrations qui ne provoquent
pas d'effet sur la survie et la reproduction (CSEO) et la concentration (dilution) qui entraîne une réduction de
x % du nombre de jeunes éclos des cocons par rapport au témoin (CEx, 42 j).
Toutes les dilutions/concentrations d'essai supérieures à la CMEO ont un effet dommageable égal ou
supérieur à celui observé à la CMEO. Lorsque la dilution/concentration à laquelle la substance d'essai est
susceptible de produire un effet n’est pas connue au préalable, il est utile de conduire l'essai en deux étapes :
⎯ un essai préliminaire de toxicité aiguë, pour obtenir une indication de la dilution/concentration
produisant un effet et de la dilution/concentration n’entraînant pas de mortalité (CSEO). Les
dilutions/concentrations à utiliser pour l'essai définitif peuvent ensuite être choisies ;
⎯ l’essai définitif sur la reproduction, pour déterminer les effets sublétaux (des dilutions) du sol
contaminé ou de la concentration d'une substance chimique qui, réparti(e) de façon homogène dans
le sol standard, n'a pas d'effet significatif sur le nombre de jeunes éclos des cocons comparé au
témoin (CSEO), ainsi que la plus faible concentration produisant un effet (CMEO).
NOTE L’utilisation d’un sol de référence est une exigence essentielle pour démontrer l'état actuel de la population
soumise à essai et pour éviter toute erreur d’interprétation des résultats.
ISO/DIS 16387
Si le sol à soumettre à essai a des propriétés très différentes de celles des sols témoins standards normaux
(par exemple, sol artificiel de l’OCDE ou sol LUFA 2.2), par exemple un pH plutôt bas ou plutôt haut ou une
teneur très faible ou très élevée en matières organiques ou en argile, il est essentiel d’avoir un sol de
référence doté des mêmes propriétés. Dans ce cas, les performances de contrôle des enchytrées risquent
toutefois d’être moins bonnes que la « normale » et le sol de référence ne peut servir de base au contrôle
qualité de l’essai. Cependant, pour évaluer la toxicité du sol soumis à essai, il est important de disposer d’un
sol de référence, qui peut également servir à la préparation des gammesde dilutions du sol soumis à essai. Il
est donc essentiel, dans ce cas, d’inclure à la fois un sol de référence et un sol témoin.
5 Réactifs
5.1 Matériel biologique
L'espèce recommandée pour l'essai est Enchytraeus albidus Hence 1837 (ver blanc ; Enchytraeidae,
Oligochaeta, Annelida). E. albidus, l'une des plus grandes espèces d'Enchytraeidae, se caractérise par une
taille de 15 mm à 40 mm et une distribution géographique mondiale (voir la Bibliographie). Cette espèce est
facilement reconnaissable grâce à deux caractéristiques : quatre soies par faisceau sur la face ventrale et un
très long canal séminal dans la région du clitellum et de quelques segments postérieurs. On rencontre cette
espèce en habitat marin, limnique et terrestre, principalement dans les matières organiques en décomposition
(varech, compost) et seulement rarement dans les prairies. Cette tolérance écologique très étendue, ainsi que
certaines variations morphologiques, indiquent que cette espèce peut englober plusieurs races (ou écotypes).
E. albidus peut être obtenu dans le commerce, puisqu'il est vendu comme aliment pour poissons. Il convient
de vérifier si ce type de culture n’est pas contaminé par d’autres espèces de taille généralement inférieure
(voir la Bibliographie). En cas de contamination, tous les vers sont lavés à l'eau dans une boîte de Petri. Les
spécimens adultes de E. albidus de grande taille sont sélectionnés à l'aide d'une loupe binoculaire pour
démarrer une nouvelle culture. Tous les autres vers issus de la culture initiale sont éliminés. E. albidus peut
être facilement élevé dans un grand nombre de déchets organiques (voir l'Annexe A) et présente un cycle de
vie court, la maturité étant atteinte entre 33 j (à 18 °C) et 74 j (à 12 °C). Seules les cultures ayant été
conservées au laboratoire pendant au moins cinq semaines (soit un cycle de génération) sans problèmes sont
utilisables pour les essais.
D'autres espèces du genre Enchytraeus, telles que E. crypticus Westheide et Graefe 1992 ou E. buchholzi
Vejdovsky 1879, populations réellement indigènes mais plus petites, sont également admises en tant
qu'organismes d'essai (voir l'Annexe B). Si d'autres espèces du genre Enchytraeus sont utilisées, elles
doivent être clairement identifiées et il convient de mentionner les raisons pour lesquelles ces espèces ont été
choisies, ainsi que les écarts par rapport à la méthode d'essai. Il convient que les vers soumis aux essais
soient des individus adultes porteurs d'œufs (points blancs) dans la région du clitellum et qu'ils soient de taille
approximativement égale (environ 15 mm). Il n'est pas nécessaire de synchroniser la culture d'élevage. Il
convient d'acclimater les Enchytraeidae dans un sol artificiel non traité, dans les conditions de l'essai, pendant
au minimum les 24 h qui précèdent l'essai. Durant cette période, il convient de distribuer des quantités
suffisantes de la nourriture qui sera également utilisée comme source d'alimentation durant l'essai.
Il convient, pour un essai, de prélever dans la boîte d'élevage un échantillon surnuméraire de vers adultes
possédant un clitellum, sans les observer en détail, afin de disposer d'une population de vers suffisante. Au
terme de la période d'acclimatation, seuls les vers porteurs d'œufs et présentant un comportement normal
(par exemple, n'essayant pas de s'échapper du sol artificiel) sont sélectionnés pour l'essai. La sélection est
effectuée en observant à la loupe binoculaire les vers placés dans une boîte de Petri contenant une faible
quantité d'eau et en éliminant les animaux dépourvus d'œufs. Il convient d'utiliser, de préférence, un milieu
o
d'eau douce (par exemple, de l'eau reconstituée conformément à la ligne directrice n 202 de l'OCDE), car
l'eau déminéralisée ou l'eau du robinet (en cas de contamination au cuivre) risque d'être nocive pour les
Enchytraeidae. Au cours de ce processus, les autres organismes vivant dans les cultures, tels que les mites,
sont également séparés des vers.
NOTE Un exemple de culture d’Enchytraeus sp.est donné dans l’Annexe A.
ISO/DIS 16387
5.2 Sols soumis à essai
5.2.1 Sol prélevé sur le terrain
Le (les) échantillon(s) de sol peut (peuvent) être un sol prélevé sur un site industriel, agricole ou autre site
d’intérêt, ou des déchets (par exemple, matériau de dragage, boue de station d’épuration des eaux urbaines,
matériau composite ou fumier) dont un éventuel dépôt terrestre est envisagé.
Les sols utilisés dans l’essai doivent être tamisés au moyen d'un tamis à mailles carrées de 4 mm pour
éliminer les fragments grossiers, puis soigneusement mélangés. Si nécessaire, le sol peut être séché à l’air,
sans chauffage, avant d’être tamisé. Il convient que la durée de conservation des sols soumis à essai soit la
plus courte possible. Le sol doit être conservé conformément à l’ISO 10381-6 en utilisant des récipients qui
réduisent au minimum les pertes de contaminants du sol par volatilisation et par sorption sur les parois du
récipient. Il convient de ne pas corriger le pH du sol car il peut avoir une influence sur la biodisponibilité des
contaminants du sol.
Pour l’interprétation des résultats d’essai, il convient de déterminer les caractéristiques suivantes pour chaque
échantillon de sol prélevé sur site :
a) le pH conformément à l'ISO 10390 ;
b) la texture (sable, limon, vase) conformément à l’ISO 11277 ;
c) la teneur en eau conformément à l'ISO 11465 ;
d) la capacité de rétention d’eau selon l'Annexe D ;
e) la capacité d'échange cationique conformément à l'ISO 11260 ;
f) la teneur en carbone organique conformément à l’ISO 10694.
NOTE Il est important de mesurer la capacité de rétention d’eau de tous les mélanges utilisés dans l’essai.
5.2.2 Sol témoin
Selon l'objectif de l'étude, il convient que le substrat utilisé pour le témoin et pour les dilutions (gamme de
dilutions de sol contaminé) soit a) un sol de référence (3.9) ou b) un sol standard (3.10) qui permet la
présence des enchytrées (les critères de validité doivent être satisfaits).
5.1.1.1 Sols de référence
Si l’on dispose de sols de référence provenant de zones non contaminées proches d’un site contaminé, il
convient de les traiter et de les caractériser de la même manière que les sols soumis à essai. Si une
contamination toxique ou des propriétés pédologiques inhabituelles ne peuvent être exclues, il convient de
privilégier des sols témoins standards.
5.1.1.2 Sols standards
Pour évaluer les effets des substances mélangées au sol ou pour réaliser des dilutions du sol soumis à essai,
des sols standards doivent être utilisés comme substrat d’essai. Les propriétés du sol standard prélevé sur le
terrain doivent être consignées dans le rapport.
ISO/DIS 16387
Le substrat appelé « sol artificiel » a la composition suivante :
Pourcentage exprimé sur
la base de la masse sèche
− Tourbe de sphaigne finement broyée et exempte de tout résidu 10 %
végétal visible
− Argile kaolinite contenant au minimum 30 % de kaolinite 20 %
− Sable de quartz industriel (sable fin dominant dont plus de 69 %
50 % des grains présentent une granulométrie de 0,05 mm à
0,2 mm)
Entre 0,3 % et 1,0 % environ de carbonate de calcium (CaCO , pulvérisé, de qualité analytique) est
nécessaire pour obtenir un pH de 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Considérant les propriétés des substances fortement non polaires (log K W > 2) ou des substances
ow
ionisantes, un pourcentage de 5 % de tourbe s’est avéré suffisant pour maintenir la structure souhaitée du sol artificiel.
Le sol artificiel est préparé, au moins trois jours avant le début de l’essai, en mélangeant soigneusement les
constituants secs énumérés ci-dessus dans un mélangeur de laboratoire de grande capacité. Une partie de
l'eau déionisée nécessaire est ajoutée au cours du mélange. La quantité de carbonate de calcium requise
peut varier en fonction des propriétés du lot donné de tourbe de sphaigne ; il convient par conséquent de la
déterminer en mesurant des sous-échantillons juste avant l’essai. Le sol artificiel mélangé est conservé à
température ambiante pendant au moins deux jours pour équilibrer l’acidité. Pour déterminer le pH et la
capacité maximale de rétention d’eau, le sol artificiel sec est pré-humidifié un ou deux jours avant le début de
l’essai en ajoutant de l’eau déionisée de manière à atteindre la moitié de la teneur en eau finale requise,
correspondant à 40 % à 60 % de la capacité maximale de rétention d’eau.
La capacité de rétention d’eau totale est déterminée selon l’Annexe D, le pH est déterminé selon l’ISO 10390.
NOTE 2 Il convient de tenir compte de l’eau qui sera éventuellement utilisée pour introduire la substance d’essai dans
le sol.
5.3 Alimentation
Les flocons d'avoine, de préférence autoclavés (ou éventuellement chauffés) avant usage afin d'éviter
l'infection par d'autres organismes, se sont révélés adaptés. La première distribution de nourriture est
effectuée en mélangeant au sol 50 mg de flocons d'avoine réduits en poudre par récipient d'essai (après
application de la substance d’essai, mais avant d'ajouter les vers) ; les distributions ultérieures (25 mg par
récipient et par semaine, sauf au-delà de 28 j) sont effectuées uniquement en surface afin d'éviter de blesser
les vers. Les besoins en nourriture pouvant varier d'un récipient à l'autre, il convient d'ajuster la distribution à
la demande (en d'autres termes, éviter toute suralimentation). Il convient de recouvrir les flocons de quelques
particules de sol afin de réduire l'activité fongique.
5.4 Rouge bengale, éthanol.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et
6.1 Béchers en verre, de 0,20 l à 0,25 l de contenance et d’un diamètre (par exemple, 5 cm) permettant
d’avoir une épaisseur de 1,5 cm à 2 cm de sol, munis de couvercle (par exemple, verre ou film plastique
perforé).Les béchers en verre doivent convenir comme récipients d'essai, contenant une quantité de sol
artificiel équivalant à 20 g de masse sèche. Les couvercles doivent permettre les échanges gazeux entre le
substrat de sol et l'atmosphère.
ISO/DIS 16387
6.2 Étuve.
6.3 Loupe binoculaire.
6.4 Balances, permettant des pesées de 50 g à 32 kg et d'une précision d'au moins 1 g.
6.5 Balance d'analyse, permettant des pesées de 25 mg à 200 g et d'une précision d'au moins 1 mg.
6.6 pH-mètre.
6.7 Enregistreur de température (par exemple, thermomètre/hygromètre).
6.8 Luxmètre.
6.9 Mélangeur.
6.10 Incubateur ou petit local équipé d'un climatiseur.
6.11 Pince d'horloger, crochets, anses ou une petite brosse.
6.12 Bacs de développement photographique, à fond rainuré.
7 Environnement d'essai
Les récipients d’essai (6.1) sont recouverts d'un couvercle en verre pour empêcher la déshydratation du
substrat d'essai, puis conservés dans les conditions d'essai pendant deux semaines (essai préliminaire) ou
six semaines (essai définitif). La température d'essai doit être de (20 ± 2) °C et ne doit pas dépasser cette
valeur sous peine de nuire à la reproduction. L'essai est effectué dans des conditions de jours longs avec un
cycle de lumière-obscurité contrôlé, de préférence de 16 h à 8 h, sous une lumière de 400 lx à 800 lx à
proximité des récipients d'essai, afin d'empêcher les vers de s'échapper du sol.
Les récipients sont pesés au début de l’essai, puis une fois par semaine. La perte de masse est compensée
par l'apport de quantités appropriées d'eau déionisée. Cette déperdition peut être minimisée par le maintien
d’un degré d’hygrométrie élevé (> 80 %) dans l’incubateur d’essai (6.10). Tous les récipients sont disposés
dans l'incubateur dans un ordre aléatoire qu'il convient de modifier chaque semaine.
Au début et à la fin de l'essai préliminaire et de l'essai définitif, il convient de mesurer la teneur en humidité et
le pH. Pour faciliter le contrôle du pH et de l'humidité du substrat d'essai, il est recommandé d'utiliser des
conteneurs supplémentaires (réplicats) pour chaque concentration et pour le témoin.
8 Mode opératoire
8.1 Dispositif expérimental
8.1.1 Généralités
Un échantillon de sol prélevé sur le terrain peut être soumis à essai à une concentration unique
(généralement 100 %) ou faire l’objet d’une évaluation de sa toxicité lors d’un essai à plusieurs concentrations
pour lequel une gamme de concentrations (dilutions) est préparée en mélangeant des quantités mesurées à
un sol témoin (5.2.2). Selon la connaissance des niveaux de réponse pertinents, un essai préliminaire peut
précéder l’essai définitif. Chaque essai définitif consiste en une gamme de mélanges de sols (traitements).
Pour chaque traitement, on prépare au moins quatre réplicats.
ISO/DIS 16387
8.1.2 Essai préliminaire
Un essai préliminaire pour déterminer la gamme de mélanges affectant les Enchytraeidae est facultatif. S'il
est nécessaire de déterminer la gamme de concentrations (dilutions) à utiliser lors de l'essai définitif, effectuer
un essai préliminaire de toxicité aiguë dans une large gamme de concentrations (dilutions) du sol contaminé,
par exemple, 0 % – 1 % – 5 % – 25 % – 50 % – 75 % – 100 %, ou de la substance d'essai, par exemple
0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg et 1 000 mg/kg (les concentrations étant exprimées en milligrammes
de substance d'essai par kilogramme de sol standard sec (5.2.2)), avec un sol témoin en utilisant dix vers par
récipient.
Conduire l'essai préliminaire sans répétition.
8.1.3 Essai définitif
La conception de l’essai définitif dépend des objectifs de l’essai. Les propriétés d’habitat des échantillons d'un
sol soumis à essai prélevé sur le terrain sont généralement caractérisées en comparant les effets biologiques
observés pour le(s) sol(s) soumis à essai et ceux observés dans un sol de référence ou dans un sol standard
si l’on ne dispose pas de sol de référence ou si celui-ci s’avère inapproprié en raison de sa toxicité ou de
caractéristiques physico-chimiques atypiques. Les résultats obtenus pour le sol standard aident à faire la
distinction entre les effets liés à un contaminant et les effets non liés à un contaminant et provoqués par les
propriétés physico-chimiques du sol. Que l’on utilise un sol de référence ou un sol standard pour les
comparaisons statistiques, les résultats obtenus pour le sol standard doivent être utilisés pour apprécier la
validité et l’acceptabilité de l’essai [14].
Si, à des fins de caractérisation, une conception d'essai incluant une gamme de dilutions est nécessaire, trois
conceptions sont possibles (les concentrations doivent être espacées par un facteur inférieur ou égal à 2) :
Pour l'approche CSEO, il convient d'utiliser une série géométrique d’au moins cinq concentrations.
Quatre réplicats de chaque concentration, et huit témoins, sont recommandés.
Pour l'approche CEx, il convient d'utiliser 12 concentrations. Il est recommandé de réaliser deux réplicats pour
chaque concentration, et de disposer d’au moins six témoins. Le facteur de séparation peut être variable :
plus petit aux faibles concentrations, plus grand aux concentrations élevées.
Pour l'approche mixte, il convient d'utiliser une série géométrique de six à huit concentrations. Quatre
réplicats pour chaque concentration, et au moins huit témoins, sont recommandés. Cette approche mixte
permet de procéder à une évaluation de la CSEO et de la CEx.
Un essai limite peut suffire si aucun effet toxique n’a été observé au cours de l’essai préliminaire. Dans l’essai
limite, seuls le sol soumis à essai, sans dilution, et le témoin (ou le sol soumis à essai par rapport au sol
témoin) doivent être testés, avec au moins quatre réplicats pour chacun d’eux.
Si le sol à soumettre à essai a des propriétés très différentes de celles des sols témoins standards normaux
(par exemple, sol artificiel de l’OCDE ou sol LUFA 2.2), il est essentiel d’avoir un sol de référence doté des
mêmes propriétés (qui sert également à préparer des séries de dilutions du sol soumis à essai). Par
conséquent, dans ce cas, il faut inclure un sol de référence et un sol standard.
ISO/DIS 16387
8.2 Préparation des mélanges d'essai
8.2.1 Essais menés avec un sol contaminé
En fonction de la gamme de dilutions choisie, le sol soumis à essai est soigneusement mélangé au sol de
référence ou au sol standard (soit manuellement, soit en utilisant un batteur manuel). L’homogénéité du
mélange est vérifiée visuellement. La masse totale du sol soumis à essai et du sol de référence ou du sol
standard doit être égale à 20 g (masse sèche) dans chaque récipient d'essai (6.1). Le mélange d’essai doit
être humidifié avec de l’eau déionisée de manière à atteindre 40 % à 60 % de la capacité totale de rétention
d’eau déterminée selon l’Annexe D. Des pourcentages plus élevés sont nécessaires dans certains cas, par
exemple lors d’essais réalisés sur des déchets. On peut procéder facilement à cette vérification en serrant
une poignée du substrat pour voir si de l’eau s’en échappe.
Déterminer le pH pour chaque mélange d’essai (un récipient par concentration) conformément à l’ISO 10390
au début et à la fin de l’essai (ne pas ajuster le pH).
8.2.2 Essais menés avec des substances ajoutées au substrat d’essai
La quantité de substrat utilisé par récipient d'essai (6.1) doit être équivalente à 20 g de matière sèche. Un sol
standard (5.2.2.2) est utilisé comme substrat d’essai. Les substances sont ajoutées et soigneusement
mélangées au substrat d’essai.
Pour introduire les substances d'essai, choisir, selon le cas, la méthode a), b) ou c) :
a) Substance solubles dans l'eau
Immédiatement avant le début de l'essai, dissoudre la quantité de substance d'essai dans une quantité d'eau
suffisante pour effectuer des répétitions d'une concentration dans l'eau (ou la quantité nécessaire pour
humidifier le substrat de sol) de façon à satisfaire aux exigences de 5.2.2.2, puis la mélanger soigneusement
au substrat de sol avant d'introduire le tout dans un récipient d'essai.
b) Substances insolubles dans l’eau mais solubles dans les solvants organiques
Dissoudre la quantité de substance d’essai nécessaire pour obtenir la concentration souhaitée dans un
solvant volatil (par exemple, acétone ou hexane) et la mélanger à une quantité du sable de quartz
recommandé. Après avoir évaporé le solvant en installant le récipient sous une hotte aspirante, ajouter le
reste du substrat de base et l'eau et mélanger soigneusement le tout avant de l'introduire dans les récipients
d'essai.
NOTE Pour disperser les substances peu solubles dans l’eau, il est possible d'avoir recours aux ultrasons, à des
solvants organiques, à des émulsifiants ou à des dispersants. En cas d'utilisation de substances auxiliaires de ce type, il
convient que toutes les concentrations d'essai et un témoin additionnel contiennent la même quantité minimale de
substance auxiliaire.
AVERTISSEMENT — Les vapeurs de solvant imposent que l'on prenne des précautions appropriées
pour éviter les risques d'inhalation ou d'explosion, ainsi que l'endommagement du matériel pour
extraction, des pompes, etc.
c) Substances insolubles dans l'eau ou dans les solvants organiques
Pour une substance insoluble dans un solvant volatil, préparer un mélange de 10 g de sable de quartz
industriel finement broyé (voir 5.2.2.2) et de la quantité de substance d'essai nécessaire pour obtenir la
concentration souhaitée. Ajouter ce mélange au reste du substrat de sol (5.2.2.2) et à l'eau dans un récipient
d'essai (6.1) et mélanger soigneusement.
Mélanger la substance d'essai au substrat de sol artificiel conformément à l'ISO 11268-1 avant d'ajouter les
vers.
ISO/DIS 16387
Les concentrations permettant d'obtenir la CMEO/CSEO doivent être choisies sur la base des résultats de
l'essai préliminaire. Les concentrations doivent être espacées par un facteur inférieur ou égal à 2.
Il n'est pas nécessaire de soumettre à essai les substances mélangées au substrat à des concentrations
supérieures à 1 000 mg/kg de substrat d'essai.
Effectuer l'essai simultanément avec au moins quatre réplicats par concentration et pour le (les) témoin(s).
Déterminer le pH pour chaque mélange d’essai (un récipient par concentration) conformément à l’ISO 10390
au début et à la fin de l’essai (ne pas ajuster le pH).
8.2.3 Préparation du récipient témoin
Le récipient témoin contient le sol témoin (5.2.2) humidifié avec de l’eau déionisée pour atteindre 40 % à 60 %
de la capacité totale de rétention d'eau (déterminée selon l’Annexe D).
Préparer un récipient témoin pour l’essai préliminaire et quatre récipients témoins pour l’essai définitif.
Préparer les récipients témoins de la même manière que les récipients d'essai. Si la préparation de l'essai
nécessite l'emploi d'un solvant (voir 8.2.2), utiliser un récipient témoin supplémentaire contenant le solvant
mais sans la substance d’essai. Couvrir les récipients comme indiqué en 6.1.
8.3 Ajout du matériel biologique
Dans chaque récipient d’essai et dans le récipient témoin, placer avec soin 10 Enchytraeidae (5.1) à la
surface du substrat d’essai au moyen d’un dispositif approprié (6.11). Il convient d'effectuer la sélection des
individus et leur répartition par lots de 10 de manière aléatoire.
Couvrir le réci
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 16387
Deuxième édition
2014-01-15
Qualité du sol — Effets des
contaminants sur les Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Détermination
des effets sur la survie et la
reproduction
Soil quality — Effects of contaminants on Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Determination of effects on reproduction
Numéro de référence
©
ISO 2014
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2014
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2014 – Tous droits réservés

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Réactifs et matériel . 4
6 Appareillage . 6
7 Environnement d’essai . 7
8 Mode opératoire. 7
8.1 Dispositif expérimental . 7
8.2 Préparation des mélanges d’essai . 8
8.3 Ajout du matériel biologique .10
8.4 Conditions d’essai et mesurages .10
8.5 Substance de référence .10
9 Calcul et expression des résultats .10
9.1 Calcul .10
9.2 Expression des résultats .11
10 Validité de l’essai .11
11 Analyse statistique .11
11.1 Généralités .11
11.2 Essai préliminaire .11
11.3 Essai définitif .11
12 Rapport d’essai .12
Annexe A (informative) Conditions de culture d’Enchytraeus sp .14
Annexe B (informative) Mode opératoire d’essais menés avec d’autres espèces du
genre Enchytraeus .16
Annexe C (informative) Détermination de la capacité maximale de rétention d’eau.18
Annexe D (informative) Description détaillée des techniques d’extraction .19
Annexe E (informative) Présentation de l’évaluation statistique des données (détermination de
la CSEO) .20
Bibliographie .21
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/CEI, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou sur la liste ISO des déclarations de brevets reçues
(voir www.iso.org/brevets).
Les éventuelles appellations commerciales utilisées dans le présent document sont données pour
information à l’intention des utilisateurs et ne constituent pas une approbation ou une recommandation.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation
de la conformité, aussi bien que pour des informations au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de
l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC) voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 16387:2004), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
iv © ISO 2014 – Tous droits réservés

Introduction
Les systèmes d’essais écotoxicologiques sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur les effets
des contaminants du sol et sont proposés en complément des analyses chimiques conventionnelles.
L’ISO 15799 comporte une liste ainsi qu’une brève caractérisation des systèmes d’essais recommandés
et normalisés. Les systèmes d’essais aquatiques mis en œuvre sur éluat de sol sont utilisés pour obtenir
des informations sur la fraction de contaminants susceptible d’atteindre les eaux souterraines du fait de
la circulation de l’eau (fonction de rétention des sols), tandis que les systèmes d’essais terrestres servent
à évaluer la fonction d’habitat des sols. Concernant les seconds, un système d’essai normalisé utilisant
des Enchytraeidae (un essai chronique prenant la reproduction comme critère d’effet) est proposé.
La présente Norme internationale décrit une méthode basée sur la détermination des effets aigus
et sublétaux des sols contaminés sur les Enchytraeidae adultes du genre Enchytraeus. La méthode
peut éventuellement être utilisée pour évaluer le potentiel toxique sublétal sur les Enchytraeidae de
substances ajoutées à un sol standard (par exemple un sol artificiel).
Les annélides du genre Enchytraeus vivant dans le sol sont pertinents sur le plan écologique, car ils
abondent dans un grand nombre de sols pauvres en vers de terre; cependant, ils peuvent également
atteindre de fortes densités de population dans des sols largement peuplés de vers de terre. Les
Enchytraeidae se prêtent à des essais en laboratoire ainsi qu’à des études en conditions semi-contrôlées
et à des études in situ. D’un point de vue pratique, de nombreuses espèces d’Enchytraeus sont faciles à
manipuler et à élever et leur temps de génération est nettement plus court que celui des vers de terre [la
durée des essais de reproduction des Enchytraeidae est de quatre à six semaines, contre huit semaines
(12 semaines en incluant la synchronisation) pour les vers de terre]. De plus, le volume de sol nécessaire
pour les essais menés sur les Enchytraeidae est nettement inférieur au volume nécessaire pour les essais
sur les vers de terre.
La présente Norme internationale a été rédigée en tenant compte des modes opératoires d’essai
[22] [24]
recommandés par l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) (voir , ).
NORME INTERNATIONALE ISO 16387:2014(F)
Qualité du sol — Effets des contaminants sur les
Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) — Détermination des
effets sur la survie et la reproduction
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie l’une des méthodes permettant d’évaluer la fonction d’habitat
des sols et de déterminer les effets des contaminants et des substances du sol sur la reproduction
d’Enchytraeus sp. par absorption cutanée et ingestion au cours d’un essai chronique. Elle est applicable
aux sols et aux matériaux de type sol de qualité inconnue provenant, par exemple, de sites contaminés,
de sols amendés, de sols après remédiation, de sols agricoles ou d’autres sites d’intérêt, et de déchets.
Les effets des substances sont évalués à l’aide d’un sol standard, de préférence un substrat de sol artificiel
défini. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un sol
témoin. Selon l’objectif de l’étude, il convient que les substrats témoin et de dilution (gamme de dilutions
d’un sol contaminé) soient un sol non contaminé comparable au soumis à essai (sol de référence) ou un
sol standard (par exemple, sol artificiel).
La présente Norme internationale fournit des informations sur la manière d’utiliser cette méthode pour
évaluer des substances en conditions tempérées.
Cette méthode ne s’applique pas aux substances volatiles, c’est-à-dire aux substances pour lesquelles H
(constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression
de vapeur à 25 °C est supérieure à 0,013 3 Pa.
NOTE La méthode d’essai ne contient aucune disposition permettant de surveiller la persistance de la
substance soumise à essai.
2 Références normatives
Les documents suivants, en totalité ou en partie, sont référencés de manière normative dans le présent
document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée
s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y
compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire des processus,
de la biomasse et de la diversité microbiens
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d’échange cationique effective et du taux de
saturation en bases échangeables à l’aide d’une solution de chlorure de baryum
ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des
sols — Méthode par tamisage et sédimentation
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
reproduction
nombre moyen de jeunes produits par récipient d’essai après incubation dans les conditions d’essai
spécifiées
Note 1 à l’article: La période d’essai d’évaluation de la reproduction (essai définitif) est de six semaines.
Note 2 à l’article: Jeunes produits = jeunes Enchytraeidae éclos.
3.2
taux de reproduction
nombre moyen de jeunes produits par un certain nombre d’adultes au cours de la période d’essai
Note 1 à l’article: La période d’essai d’évaluation de la reproduction (essai définitif) est de six semaines.
Note 2 à l’article: Jeunes produits = jeunes Enchytraeidae éclos.
3.3
CEx
concentration efficace à x %
concentration (fraction massique) d’une substance soumise à essai qui, par rapport à un témoin,
engendre x % d’un effet sur un critère d’effet donné pendant une période d’exposition définie
EXEMPLE CE50 est une concentration dont on estime qu’elle provoque un effet sur un critère d’effet faisant
l’objet d’un essai chez 50 % d’une population exposée sur une période d’exposition définie.
Note 1 à l’article: La CEx est exprimée en pourcentage du sol soumis à essai (masse sèche) par mélange de sols
(masse sèche). Lorsque des substances sont soumises à essai, la CEx est exprimée en masse de la substance
soumise à essai par masse sèche de sol, en milligrammes par kilogramme.
3.4
CMEO
concentration minimale avec effet observé
plus faible concentration de substance soumise à essai ayant un effet statistiquement significatif
(p < 0,05)
Note 1 à l’article: Dans le présent essai, la CMEO est exprimée en masse de substance soumise à essai par
masse sèche du sol soumis à essai. Il convient que toutes les concentrations d’essai supérieures à la CMEO aient
généralement un effet statistiquement différent du témoin.
3.5
CSEO
concentration sans effet observé
plus haute concentration de substance soumise à essai immédiatement inférieure à la CMEO, à laquelle
aucun effet n’est observé
Note 1 à l’article: Dans le présent essai, la concentration correspondant à la CSEO n’a pas d’effet statistiquement
significatif (p < 0,05) par rapport au témoin au cours d’une période d’exposition définie.
3.6
mélange d’essai
mélange de sol contaminé ou de substance soumise à essai (par exemple substance chimique, biosolides,
déchets) et de sol témoin
3.7
rapport du mélange d’essai
rapport entre le sol soumis à essai et le sol témoin dans un mélange d’essai
2 © ISO 2014 – Tous droits réservés

3.8
contaminant
substance ou agent présent dans le sol du fait de l’activité humaine
3.9
sol de référence
sol non contaminé possédant des propriétés pédologiques similaires (concentrations en éléments
nutritifs, pH, teneur en carbone organique et texture) à celles du sol analysé
3.10
sol standard
sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les propriétés principales (pH, texture, teneur en matières
organiques) se situent dans une gamme connue
EXEMPLE Sols Euro, sol artificiel, sol standard LUFA.
Note 1 à l’article: Les propriétés des sols standard peuvent être différentes de celles du sol soumis à essai.
3.11
sol témoin
sol de référence ou sol standard satisfaisant aux critères de validité, et utilisé comme témoin et comme
milieu de préparation des gammes de dilutions avec les sols soumis à essai ou avec une substance de
référence
Note 1 à l’article: Dans le cas d’un sol naturel, il est conseillé de démontrer son aptitude à l’essai et sa capacité à
satisfaire aux critères de validité de l’essai avant de l’utiliser dans un essai définitif.
4 Principe
Les effets sur la survie et la reproduction d’Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) adultes exposés à une
gamme de dilutions d’un sol contaminé ou à une gamme de concentrations d’une substance soumise à
essai sont déterminés. Les mélanges d’essai sont préparés au début de l’essai et ne sont pas renouvelés
au cours de la période d’essai.
L’essai peut être scindé en deux étapes distinctes: un essai de courte durée (deux semaines), au cours
duquel la gamme de concentrations entraînant des effets toxiques (principalement la mortalité) est
déterminée, et un essai définitif à long terme (six semaines), au cours duquel la survie des vers adultes
et la fécondité (nombre de jeunes) sont mesurées. Les résultats obtenus lors des essais sont comparés
à ceux obtenus avec un témoin et utilisés pour déterminer les dilutions ou les concentrations qui ne
provoquent pas d’effet sur la survie et la reproduction (CSEO) et la concentration (dilution) qui entraîne
une réduction de x % du nombre de jeunes éclos des cocons par rapport au témoin (CEx, 42 j).
Toutes les dilutions/concentrations d’essai supérieures à la CMEO ont un effet nocif égal ou supérieur
à celui observé à la CMEO. Lorsque la dilution/concentration à laquelle la substance soumise à essai
est susceptible de produire un effet n’est pas connue au préalable, il est utile de réaliser l’essai en deux
étapes:
— un essai de toxicité aiguë (essai préliminaire), pour obtenir une indication de la dilution/concentration
produisant un effet et de la dilution/concentration n’entraînant pas de mortalité (CSEO). Les
dilutions/concentrations à utiliser pour l’essai définitif peuvent ensuite être choisies;
— l’essai définitif sur la reproduction, pour déterminer les effets sublétaux (des dilutions) du
sol contaminé ou de la concentration d’une substance qui, réparti(e) de façon homogène dans
le sol standard, n’a pas d’effet significatif sur le nombre de jeunes éclos des cocons comparé au
témoin (CSEO), ainsi que la plus faible concentration produisant un effet (CMEO).
NOTE L’utilisation d’un sol de référence approprié est une exigence essentielle pour démontrer l’état actuel
de la population soumise à essai et pour éviter toute erreur d’interprétation des résultats.
5 Réactifs et matériel
5.1 Matériel biologique, l’espèce recommandée pour l’essai est Enchytraeus albidus Henle 1837 (ver
blanc; Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). E. albidus, l’une des plus grandes espèces d’Enchytraeidae,
se caractérise par une taille de 15 mm à 40 mm et une répartition géographique mondiale (voir par
[21] [31]
exemple , ). Cette espèce est facilement reconnaissable grâce à deux caractéristiques: quatre soies
par faisceau sur la face ventrale et un très long canal séminal dans la région du clitellum et de quelques
segments postérieurs. On rencontre cette espèce en habitat marin, limnique et terrestre, principalement
dans les matières organiques en décomposition (varech, compost) et seulement rarement dans les
prairies. Cette tolérance écologique très étendue, ainsi que certaines variations morphologiques,
indiquent que cette espèce englobe probablement plusieurs races (ou écotypes). E. albidus peut être
obtenu dans le commerce, puisqu’il est vendu comme nourriture pour poissons. Il convient de vérifier
si ce type de culture n’est pas contaminé par d’autres espèces de taille généralement inférieure (voir par
[7] [10] [32]
exemple , , ). En cas de contamination, tous les vers sont lavés à l’eau dans une boîte de Petri. Les
spécimens adultes d’E. albidus de grande taille sont sélectionnés à l’aide d’une loupe binoculaire pour
démarrer une nouvelle culture. Tous les autres vers issus de la culture initiale sont éliminés. E. albidus
peut être facilement élevé dans un grand nombre de matériaux organiques (voir l’Annexe A) et présente
un cycle de vie court, la maturité étant atteinte entre 33 j (à 18 °C) et 74 j (à 12 °C). Seules les cultures
ayant été conservées au laboratoire pendant au moins cinq semaines (soit un cycle de génération) sans
problème doivent être utilisées pour les essais.
D’autres espèces du genre Enchytraeus, telles que E. crypticus Westheide et Graefe 1992 ou E. buchholzi
Vejdovsky 1879, populations vivant réellement dans le sol, mais plus petites, sont également admises
en tant qu’organismes soumis à essai (voir l’Annexe B). Si d’autres espèces du genre Enchytraeus sont
utilisées, elles doivent être clairement identifiées et il convient de mentionner les raisons pour lesquelles
ces espèces ont été choisies, ainsi que les écarts par rapport à la méthode d’essai. Il convient que les
vers soumis aux essais soient des individus adultes porteurs d’œufs (points blancs) dans la région du
clitellum et qu’ils soient de taille approximativement égale (environ 15 mm). Il n’est pas nécessaire
de synchroniser la culture d’élevage. Il convient d’acclimater les Enchytraeidae dans un sol artificiel
non traité, dans les conditions de l’essai, pendant au moins 24 h avant l’essai. Durant cette période, il
convient de distribuer, en quantité suffisante, la nourriture qui sera également utilisée comme source
d’alimentation durant l’essai.
Il convient, pour un essai, de prélever dans la boîte d’élevage un échantillon surnuméraire de vers adultes
possédant un clitellum, sans les observer en détail, afin de disposer d’une population de vers appropriée
suffisante. Au terme de la période d’acclimatation, seuls les vers porteurs d’œufs et présentant un
comportement habituel (par exemple n’essayant pas de s’échapper du sol artificiel) sont sélectionnés
pour l’essai. La sélection est effectuée en observant à la loupe binoculaire les vers placés dans une boîte
de Petri contenant une faible quantité d’eau et en éliminant les animaux dépourvus d’œufs. Il convient
[23]
d’utiliser, de préférence, un milieu d’eau douce (par exemple, de l’eau reconstituée selon ), car l’eau
déminéralisée ou l’eau du robinet (risque de contamination au cuivre) peut s’avérer nocive pour les
Enchytraeidae. Au cours de ce processus, les autres organismes vivant dans les cultures, tels que les
acariens, sont également séparés des vers.
NOTE Un exemple de culture d’Enchytraeus sp. est donné dans l’Annexe A.
5.2 Mélange d’essai, qui peut être constitué d’un sol prélevé sur le terrain ou d’un sol témoin amendé
par la substance soumise à essai.
5.2.1 Sol prélevé sur le terrain ou déchets
Le (les) échantillon(s) de sol peut (peuvent) être un sol prélevé sur un site industriel, agricole ou un autre
site d’intérêt, ou des déchets (par exemple, matériau de dragage, boue de station d’épuration des eaux
usées urbaines, matériau composite ou fumier) dont une éventuelle mise en décharge est envisagée.
Les sols prélevés sur le terrain et utilisés pour l’essai doivent être tamisés au moyen d’un tamis à mailles
carrées de 4 mm pour éliminer les fragments grossiers, puis soigneusement mélangés. Si nécessaire, le
sol peut être séché à l’air, sans chauffage, avant d’être tamisé. Il convient que la durée de conservation des
4 © ISO 2014 – Tous droits réservés

sols soumis à essai soit la plus courte possible. Le sol doit être conservé conformément à l’ISO 10381-6,
en utilisant des récipients qui réduisent au minimum les pertes de contaminants du sol par volatilisation
et par sorption sur les parois du récipient. Il convient de ne pas corriger le pH du sol car il peut influer
sur la biodisponibilité des contaminants du sol.
Pour l’interprétation des résultats d’essai, les caractéristiques suivantes doivent être déterminées pour
chaque échantillon de sol prélevé sur site:
a) le pH conformément à l’ISO 10390;
b) la texture (sable, limon, vase) conformément à l’ISO 11277;
c) la teneur en eau conformément à l’ISO 11465;
d) la capacité de rétention d’eau selon l’Annexe C;
e) la capacité d’échange cationique conformément à l’ISO 11260;
f) la teneur en carbone organique conformément à l’ISO 10694.
NOTE Il est important de mesurer la capacité de rétention d’eau de tous les mélanges utilisés dans l’essai
5.2.2 Sol témoin, soit a) un sol de référence (3.9), soit b) un sol standard (3.10) qui permet la présence
des Enchytraeidae [les critères de validité doivent être satisfaits, au minimum). Le sol témoin et le sol
utilisé pour la dilution doivent être les mêmes dans tous les essais (soit a), soit b)].
a) Si l’on dispose de sols de référence provenant de zones non contaminées proches d’un site contaminé,
il convient de les traiter et de les caractériser de la même manière que les sols soumis à essai. Si
une contamination toxique ou des propriétés pédologiques inhabituelles ne peuvent être exclues, il
convient de privilégier des sols témoins standard.
b) Pour évaluer les effets des substances mélangées au sol, des sols standard (par exemple, sol artificiel,
sol LUFA) doivent être utilisés comme substrat d’essai. Les propriétés du sol standard prélevé sur le
terrain doivent être consignées dans le rapport.
Le substrat appelé «sol artificiel» peut être utilisé comme sol standard et présente la composition
suivante:
Pourcentage exprimé sur
la base de la masse sèche
− Tourbe de sphaigne finement broyée et exempte de tout          10 %
résidu végétal visible
− Argile kaolinite contenant au minimum 30 % de kaoli-         20 %
nite
− Sable de quartz industriel (sable fin dominant, avec plus          69 %
de 50 % des grains présentant une granulométrie de 0,05 mm à
0,2 mm)
Une quantité de 0,3 % à 1,0 % environ de carbonate de calcium (CaCO , pulvérisé, de qualité analytique)
est nécessaire pour obtenir un pH de 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Considérant les propriétés des substances fortement apolaires (log K > 2) ou des substances
ow
ionisantes, un pourcentage de 5 % de tourbe s’est avéré suffisant pour maintenir la structure souhaitée du sol
[22]
artificiel.
Préparer le sol artificiel au moins trois jours avant le début de l’essai, en mélangeant soigneusement les
constituants secs énumérés ci-dessus dans un mélangeur de laboratoire de grande capacité. Une partie
de l’eau déionisée nécessaire est ajoutée au cours du mélange. La quantité de carbonate de calcium
requise peut varier en fonction des propriétés du lot de tourbe de sphaigne concerné; il convient par
conséquent de la déterminer en mesurant des sous-échantillons juste avant l’essai. Conserver le sol
artificiel mélangé à température ambiante pendant au moins deux jours pour équilibrer l’acidité. Pour
déterminer le pH et la capacité maximale de rétention d’eau, le sol artificiel sec est pré-humidifié un ou
deux jours avant le début de l’essai en ajoutant de l’eau déionisée, de manière à atteindre la moitié de la
teneur en eau finale requise, correspondant à 40 % à 60 % de la capacité maximale de rétention d’eau.
La capacité de rétention d’eau totale est déterminée selon l’Annexe C, le pH est déterminé conformément
à l’ISO 10390.
NOTE 2 Il convient de tenir compte de l’eau qui sera éventuellement utilisée pour introduire la substance
soumise à essai dans le sol.
5.3 Alimentation
Les flocons d’avoine, de préférence autoclavés (ou éventuellement chauffés) avant usage afin d’éviter
[31]
l’infection par d’autres organismes, se sont révélés adaptés . La première distribution de nourriture est
effectuée en mélangeant au sol 50 mg de flocons d’avoine broyés par récipient d’essai (après application
de la substance soumise à essai, mais avant d’ajouter les vers); les distributions ultérieures (25 mg par
récipient et par semaine, sauf au-delà de 28 j) sont effectuées uniquement en surface, afin d’éviter de
blesser les vers. Les besoins en nourriture pouvant varier d’un récipient à l’autre, il convient d’ajuster
la distribution à la demande (en d’autres termes, toute suralimentation doit être évitée). Il convient de
recouvrir les flocons de quelques particules de sol afin de réduire le développement de champignons.
5.4 Réactifs
5.4.1 Rouge bengale.
5.4.2 Éthanol.
5.4.3 Acide borique, adapté pour servir de substance de référence.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et les éléments suivants.
6.1 Récipients d’essai, de 0,20 l à 0,25 l de contenance et d’un diamètre (par exemple 5 cm) permettant
de recevoir une épaisseur de sol de 1,5 cm à 2 cm, munis de couvercles (par exemple verre ou film
plastique perforé). Les béchers doivent convenir comme récipients d’essai, et contiennent une quantité
de sol artificiel équivalant à 20 g de masse sèche. Les couvercles doivent permettre les échanges gazeux
entre le substrat de sol et l’atmosphère.
6.2 Étuve de séchage.
6.3 Loupe binoculaire.
6.4 Balances, permettant des pesées de 50 g à 32 kg et d’une exactitude d’au moins 1 g.
6.5 Balance d’analyse, permettant des pesées de 10 mg à 200 g et d’une exactitude d’au moins 1 mg.
6.6 pH-mètre.
6.7 Enregistreur de température (par exemple thermomètre/hygromètre).
6.8 Luxmètre.
6 © ISO 2014 – Tous droits réservés

6.9 Mélangeur.
6.10 Incubateur ou petit local équipé d’un climatiseur.
6.11 Pince d’horloger, crochets, anses ou une petite brosse.
6.12 Bacs de développement photographique, à fond rainuré.
7 Environnement d’essai
Les récipients d’essai (6.1) sont recouverts de couvercles en verre pour empêcher la déshydratation du
substrat d’essai, puis conservés dans les conditions d’essai pendant deux semaines (essai préliminaire)
ou six semaines (essai définitif). La température d’essai doit être de (20 ± 2) °C, les températures
supérieures pouvant nuire à la reproduction. L’essai est effectué dans des conditions de jours longs avec
un cycle de lumière-obscurité contrôlé, de préférence de 16 h à 8 h, sous un éclairage de 400 lx à 800 lx
dans l’environnement des récipients d’essai, afin d’empêcher les vers de s’échapper du sol.
Les récipients sont pesés au début de l’essai, puis une fois par semaine. La perte de masse est compensée
par l’apport de quantités appropriées d’eau déionisée. Cette déperdition peut être réduite au minimum
par le maintien d’un degré d’hygrométrie élevé (>80 %) dans l’incubateur d’essai (6.10). Tous les
récipients d’essai sont disposés dans l’incubateur dans un ordre aléatoire qu’il convient de modifier
chaque semaine.
Au début et à la fin de l’essai préliminaire et de l’essai définitif, il convient de mesurer la teneur en eau
et le pH. Pour faciliter le contrôle du pH et de la teneur en eau du substrat d’essai, il est recommandé
d’utiliser des récipients supplémentaires (réplicats) pour chaque concentration et pour le témoin.
8 Mode opératoire
8.1 Dispositif expérimental
8.1.1 Généralités
Un échantillon de sol prélevé sur le terrain peut être soumis à essai à une concentration unique
(généralement 100 %) ou faire l’objet d’une évaluation de sa toxicité dans le cadre d’un essai à plusieurs
concentrations pour lequel une gamme de concentrations (dilutions) est préparée en mélangeant des
quantités mesurées à un sol témoin (5.2.2). Selon la connaissance des niveaux de réponse pertinents,
un essai préliminaire peut précéder l’essai définitif. Chaque essai définitif consiste en une gamme de
mélanges de sols (traitements). Pour chaque traitement, on prépare au moins quatre réplicats.
8.1.2 Essai préliminaire
Un essai préliminaire pour déterminer la gamme de rapports de mélange affectant les Enchytraeidae est
facultatif. S’il est nécessaire de déterminer la gamme de concentrations (dilutions) à utiliser lors de l’essai
définitif, effectuer un essai préliminaire (de toxicité aiguë) dans une large gamme de concentrations
(dilutions) du sol contaminé, par exemple 0 % – 1 % – 5 % – 25 % – 50 % à – 75 % – 100 %, ou de la
substance soumise à essai, par exemple 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg et 1 000 mg/kg [les
concentrations étant exprimées en milligrammes de substance soumise à essai par kilogramme de sol
standard sec (5.2.2)], avec un sol témoin, en utilisant dix vers par récipient.
Réaliser l’essai préliminaire sans répétition.
8.1.3 Essai définitif
La conception de l’essai définitif dépend des objectifs de l’essai. Les propriétés d’habitat des échantillons
d’un sol prélevé sur le terrain sont généralement caractérisées en comparant les effets biologiques
observés pour le(s) sol(s) soumis à essai et ceux observés dans un sol de référence ou dans un sol
standard, si l’on ne dispose pas de sol de référence ou si celui-ci s’avère inapproprié en raison de sa
toxicité ou de caractéristiques physico-chimiques atypiques. Les résultats obtenus pour le sol standard
aident à faire la distinction entre les effets liés à un contaminant et les effets non liés à un contaminant
et provoqués par les propriétés physico-chimiques du sol. Que l’on utilise un sol de référence ou un sol
standard pour les comparaisons statistiques, les résultats obtenus pour le sol standard doivent être
[14]
utilisés pour apprécier la validité et l’acceptabilité de l’essai .
Si, à des fins de caractérisation, une conception d’essai incluant une gamme de dilutions est nécessaire,
trois conceptions sont possibles (le facteur entre deux concentrations doit être inférieur ou égal à 2):
— Pour l’approche CSEO, il convient d’utiliser une série géométrique d’au moins cinq concentrations.
Quatre réplicats de chaque concentration et huit témoins sont recommandés.
— Pour l’approche CEx, il convient d’utiliser 12 concentrations. Il est recommandé de réaliser
deux réplicats pour chaque concentration, et de disposer d’au moins six témoins. Le facteur entre
deux concentrations peut être variable: plus petit aux faibles concentrations, plus grand aux
concentrations élevées.
— Pour l’approche mixte, il convient d’utiliser une série géométrique de six à huit concentrations.
Quatre réplicats pour chaque concentration et au moins huit témoins sont recommandés. Cette
approche mixte permet de procéder à une évaluation de la CSEO et de la CEx.
Un essai limite peut suffire si aucun effet toxique n’a été observé au cours de l’essai préliminaire. Dans
l’essai limite, seuls le sol soumis à essai, sans dilution, et le témoin (ou le sol soumis à essai par rapport
au sol témoin) doivent être soumis à essai, avec au moins quatre réplicats pour chacun d’eux.
Si le sol soumis à essai a des propriétés très différentes de celles des sols témoins standard habituels
(par exemple sol artificiel de l’OCDE ou sol LUFA 2.2), notamment un pH plutôt bas ou plutôt haut ou
une teneur très faible ou très élevée en matières organiques ou en argile, il est essentiel d’avoir un
sol de référence possédant des propriétés similaires. Dans ce cas, les performances de contrôle des
Enchytraeidae peuvent toutefois être inférieures à la normale et le sol de référence ne peut servir de base
au contrôle qualité de l’essai. Cependant, pour évaluer la toxicité du sol soumis à essai, il est important
de disposer d’un sol de référence, qui peut également servir à la préparation des gammes de dilutions du
sol soumis à essai. Pour évaluer la qualité de l’essai, il est essentiel, dans ce cas, d’inclure à la fois un sol
de référence et un sol témoin standard.
8.2 Préparation des mélanges d’essai
8.2.1 Essais sur sol contaminé
En fonction de la gamme de dilutions choisie, le sol soumis à essai est soigneusement mélangé au sol de
référence ou au sol standard (soit manuellement, soit en utilisant un mélangeur manuel). L’homogénéité
du mélange est vérifiée visuellement. La masse totale du sol soumis à essai et du sol de référence ou du
sol standard doit être égale à 20 g (masse sèche) dans chaque récipient d’essai (6.1). Le mélange d’essai
doit être humidifié avec de l’eau déionisée de manière à atteindre 40 % à 60 % de la capacité totale
de rétention d’eau déterminée selon l’Annexe C. Des pourcentages plus élevés sont nécessaires dans
certains cas, par exemple lors d’essais réalisés sur des déchets. On peut procéder facilement à cette
vérification en serrant une poignée du substrat pour voir si de l’eau s’en échappe.
Au début et à la fin de l’essai, déterminer le pH conformément à l’ISO 10390 pour chaque mélange d’essai
(un récipient par concentration, ne pas ajuster le pH).
AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de substances
chimiques toxiques, mutagènes ou nocives d’une autre manière ou des micro-organismes
infectieux. Des risques pour la santé au travail peuvent survenir en raison de la poussière ou de
l’évaporation de substances chimiques, de même que par contact cutané pendant la manipulation
et l’incubation.
8 © ISO 2014 – Tous droits réservés

8.2.2 Essais sur substances ajoutées au substrat d’essai
La quantité de substrat utilisée par récipient d’essai (6.1) doit être équivalente à 20 g de matière sèche.
Un sol standard (5.2.2) est utilisé comme substrat d’essai. Les substances sont ajoutées et soigneusement
mélangées au substrat d’essai.
Pour introduire les substances soumises à essai, choisir, selon le cas, la méthode a), b) ou c):
a) Substance solubles dans l’eau
Immédiatement avant le début de l’essai, dissoudre la quantité de substance soumise à essai dans la
quantité d’eau requise pour obtenir des réplicats de chaque concentration (ou la quantité nécessaire
pour humidifier le sol) de façon à satisfaire aux exigences de 5.2.2, puis la mélanger soigneusement au
sol avant d’introduire le tout dans un récipient d’essai.
b) Substances insolubles dans l’eau mais solubles dans les solvants organiques
Dissoudre la quantité de substance soumise à essai nécessaire pour obtenir la concentration souhaitée
dans un solvant volatil (par exemple acétone ou hexane) et la mélanger à une aliquote du sable de quartz
recommandé. Après avoir évaporé le solvant en installant le récipient sous une hotte aspirante, ajouter
le reste du sol et l’eau et mélanger soigneusement le tout avant de l’introduire dans les récipients d’essai.
NOTE Pour disperser les substances peu solubles dans l’eau, il est possible de procéder à une dispersion par
ultrasons ou d’avoir recours à des solvants organiques, à des émulsifiants ou à des dispersants. En cas d’utilisation
de substances auxiliaires de ce type, il convient que toutes les concentrations d’essai et un témoin supplémentaire
contiennent la même quantité minimale de substance auxiliaire.
AVERTISSEMENT — Les vapeurs de solvant imposent que l’on prenne des précautions appropriées
pour éviter les risques d’inhalation ou d’explosion, ainsi que l’endommagement du matériel
d’extraction, des pompes, etc.
c) Substances insolubles dans l’eau ou dans les solvants organiques
Pour une substance insoluble dans un solvant volatil, préparer un mélange de 10 g de sable de quartz
industriel finement broyé (voir 5.2.2) et de la quantité de substance soumise à essai nécessaire pour
obtenir la concentration souhaitée. Ajouter ce mélange au reste du sol (5.2.2) et à l’eau dans un récipient
d’essai (6.1) et mélanger soigneusement.
Choisir les concentrations permettant d’obtenir la CMEO/CSEO sur la base des résultats de l’essai
préliminaire. Le facteur entre deux concentrations doit être inférieur ou égal à 2.
Il n’est pas nécessaire de soumettre à essai les substances mélangées au substrat à des concentrations
supérieures à 1 000 mg/kg de substrat d’essai.
Effectuer l’essai simultanément avec au moins quatre réplicats par concentration et le (les) témoin(s).
Au début et à la fin de l’essai, déterminer le pH conformément à l’ISO 10390 pour chaque mélange d’essai
(un récipient par concentration, ne pas ajuster le pH).
8.2.3 Préparation du récipient témoin
Le récipient témoin contient le sol témoin (5.2.2) humidifié avec de l’eau déionisée pour atteindre 40 %
à 60 % de la capacité totale de rétention d’eau (déterminée selon l’Annexe C).
Utiliser un récipient témoin pour l’essai préliminaire et quatre à huit récipients témoins pour l’essai
définitif, en fonction de la conception d’essai (voir 8.1.3).
Préparer les récipients témoins de la même manière que les récipients d’essai. Si la préparation de l’essai
nécessite l’emploi d’un solvant (voir 8.2.2), utiliser un récipient témoin supplémentaire contenant le
solvant mais pas la substance d’essai. Couvrir les récipients comme indiqué en 6.1.
8.3 Ajout du matériel biologique
Dans chaque récipient d’essai et dans le récipient témoin, placer avec soin 10 Enchytraeidae (5.1) à la
surface du mélange d’essai, au moyen d’un dispositif approprié (6.11). Il convient d’effectuer la sélection
des individus et leur répartition par lots de 10 de manière aléatoire.
Couvrir le récipient comme indiqué en 6.1 et le placer dans l’incubateur ou le petit local équipé d’un
climatiseur (6.10).
8.4 Conditions d’essai et mesurages
La durée de la première partie de l’essai est de 21 j (évaluation de la mortalité). Les vers adultes sont
alimentés une fois par semaine avec des rations de flocons d’avoine de 50 mg de masse s
...