ISO 16387:2004
(Main)Soil quality - Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) - Determination of effects on reproduction and survival
Soil quality - Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) - Determination of effects on reproduction and survival
ISO 16387:2004 describes a method for determining the effects of substances or contaminated soils on reproduction and on survival of the worm Enchytraeus albidus (Enchytraeidae). The animals are exposed to the substances by dermal and alimentary uptake using a defined artificial soil substrate to which specified amounts of that substance are added, or by using a soil substrate of unknown quality. ISO 16387:2004 is applicable to test substances that are either insoluble or soluble in water, although the method of application differs. The method is not applicable to volatile test substances, i.e. substances for which H (Henry's constant) or the air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,013 3 Pa at 25 °C. For optimum applicability, the water solubility and the vapour pressure of the test substance should be known. Additionally, information on the persistence of the test substance in soil is desirable. Basic information on the ecology and ecotoxicology of Enchytraeidae in the terrestrial environment can be found in the bibliographic references. The stability of the test substance cannot be ensured over the test period. No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the test substance. Recommendations for adapting the method to comparing or monitoring soil quality are given in Annex B.
Qualité du sol — Effets des polluants sur les Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) — Détermination des effets sur la reproduction et la survie
L'ISO 16387:2004 décrit une méthode de détermination des effets des substances ou des sols contaminés sur la reproduction et la survie du ver Enchytraeus albidus (Enchytraeidae). Les animaux sont exposés aux substances par absorption cutanée et ingestion soit en utilisant un substrat de sol artificiel déterminé dans lequel des quantités définies de la substance sont incorporées, soit en utilisant un substrat de sol de qualité inconnue. L'ISO 16387:2004 est applicable aux substances d'essai solubles ou insolubles dans l'eau, bien que la méthode de préparation diffère. La méthode ne s'applique pas aux substances d'essai volatiles, c'est-à-dire aux substances dont H (la constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou dont la pression de vapeur à 25 °C excède 0,013 3 Pa. Il convient de connaître la solubilité dans l'eau, le logarithme Pow et la pression de vapeur de la substance expérimentée. En outre, des informations sur la persistance de la substance expérimentée dans le sol sont souhaitables. Des informations écologiques et écotoxicologiques de base sur les Enchytraeidae en milieu terrestre sont fournies dans les références énumérées dans la Bibliographie. La stabilité de la substance expérimentée ne peut pas être garantie pendant toute la durée de l'essai. La méthode d'essai ne comporte aucune disposition relative au contrôle de la persistance de la substance expérimentée. L'Annexe B donne des recommandations d'adaptation de la méthode pour la comparaison et la surveillance de la qualité des sols.
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Relations
Frequently Asked Questions
ISO 16387:2004 is a standard published by the International Organization for Standardization (ISO). Its full title is "Soil quality - Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) - Determination of effects on reproduction and survival". This standard covers: ISO 16387:2004 describes a method for determining the effects of substances or contaminated soils on reproduction and on survival of the worm Enchytraeus albidus (Enchytraeidae). The animals are exposed to the substances by dermal and alimentary uptake using a defined artificial soil substrate to which specified amounts of that substance are added, or by using a soil substrate of unknown quality. ISO 16387:2004 is applicable to test substances that are either insoluble or soluble in water, although the method of application differs. The method is not applicable to volatile test substances, i.e. substances for which H (Henry's constant) or the air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,013 3 Pa at 25 °C. For optimum applicability, the water solubility and the vapour pressure of the test substance should be known. Additionally, information on the persistence of the test substance in soil is desirable. Basic information on the ecology and ecotoxicology of Enchytraeidae in the terrestrial environment can be found in the bibliographic references. The stability of the test substance cannot be ensured over the test period. No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the test substance. Recommendations for adapting the method to comparing or monitoring soil quality are given in Annex B.
ISO 16387:2004 describes a method for determining the effects of substances or contaminated soils on reproduction and on survival of the worm Enchytraeus albidus (Enchytraeidae). The animals are exposed to the substances by dermal and alimentary uptake using a defined artificial soil substrate to which specified amounts of that substance are added, or by using a soil substrate of unknown quality. ISO 16387:2004 is applicable to test substances that are either insoluble or soluble in water, although the method of application differs. The method is not applicable to volatile test substances, i.e. substances for which H (Henry's constant) or the air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,013 3 Pa at 25 °C. For optimum applicability, the water solubility and the vapour pressure of the test substance should be known. Additionally, information on the persistence of the test substance in soil is desirable. Basic information on the ecology and ecotoxicology of Enchytraeidae in the terrestrial environment can be found in the bibliographic references. The stability of the test substance cannot be ensured over the test period. No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the test substance. Recommendations for adapting the method to comparing or monitoring soil quality are given in Annex B.
ISO 16387:2004 is classified under the following ICS (International Classification for Standards) categories: 13.080.30 - Biological properties of soils. The ICS classification helps identify the subject area and facilitates finding related standards.
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16387
First edition
2004-02-01
Soil quality — Effects of pollutants on
Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) —
Determination of effects on reproduction
and survival
Qualité du sol — Effets des polluants sur les Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Détermination des effets sur la reproduction et la
survie
Reference number
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ISO 2004
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Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope. 1
2 Normative references. 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 2
5 Materials. 3
6 Apparatus. 4
7 Test environment. 5
8 Procedure. 5
8.1 Preparation of the test substrates. 5
8.2 Preparation of test vessel contents . 6
8.3 Range-finding test. 6
8.4 Definitive test. 6
8.5 Reference substance. 7
8.6 Summary and timetable of the test . 8
9 Calculation and expression of results . 9
9.1 General. 9
9.2 Range-finding test. 9
9.3 Definitive test. 9
10 Validity of the test . 10
11 Test report. 10
Annex A (informative) Detailed description of extraction techniques . 11
Annex B (normative) Determination of the effects of contaminated soil on Enchytraeidae
reproduction . 12
Annex C (informative) Determination of the pH value . 17
Annex D (informative) Determination of maximum water-holding capacity. 18
Annex E (informative) Conditions for culture of Enchytraeus sp. 19
Annex F (informative) Test procedure using other Enchytraeus species . 21
Annex G (informative) Overview of the statistical assessment of data (NOEC determination) . 23
Bibliography . 24
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 16387 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
methods.
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Introduction
This International Standard has been drawn up taking into consideration test procedures recommended by the
International Organization for Standardization (ISO) and the Organization for Economic Cooperation and
Development (OECD) (see Clause 2 and Bibliography).
The method described was developed for testing the effects of chemicals added to an artificial soil. An
adaptation for testing or comparing soils to assess, for example, the effects of remediation treatments is given
in Annex B. It can also be adapted for assessing sublethal effects and determining no-effect levels for
pesticides.
Soil-dwelling annelids of the genus Enchytraeus are ecologically relevant, i.e. they are abundant in many soils
where earthworms are scarce, but can also reach high population densities in soils well inhabited by earthworms.
Enchytraeidae can be used in laboratory tests as well as in semi-field and field studies. From a practical point of
view, many Enchytraeus species are easy to handle and breed, and their generation time is significantly shorter
than that of earthworms [the test duration for a reproduction test with Enchytraeidae is 4 weeks to 6 weeks,
compared to 12 weeks (including synchronization) with earthworms].
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16387:2004(E)
Soil quality — Effects of pollutants on Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Determination of effects on reproduction
and survival
1 Scope
This International Standard describes a method for determining the effects of substances or contaminated
soils on reproduction and on survival of the worm Enchytraeus albidus (Enchytraeidae). The animals are
exposed to the substances by dermal and alimentary uptake using a defined artificial soil substrate to which
specified amounts of that substance are added, or by using a soil substrate of unknown quality.
This International Standard is applicable to test substances that are either insoluble or soluble in water,
although the method of application differs. The method is not applicable to volatile test substances, i.e.
substances for which H (Henry's constant) or the air/water partition coefficient is greater than 1, or for which
the vapour pressure exceeds 0,013 3 Pa at 25 °C. The water solubility and the vapour pressure of the test
substance should be known. Additionally, information on the persistence of the test substance in soil is
desirable.
NOTE 1 Basic information on the ecology and ecotoxicology of Enchytraeidae in the terrestrial environment can be
found in the bibliographic references.
NOTE 2 The stability of the test substance cannot be ensured over the test period. No provision is made in the test
method for monitoring the persistence of the test substance.
NOTE 3 Recommendations for adapting the method to comparing or monitoring soil quality are given in Annex B.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 11268-2:1998, Soil quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) — Part 2: Determination of
effects on reproduction
OECD Guideline No. 207, 1984, Earthworm Acute Toxicity Tests, Organization for Economic Cooperation and
Development, Paris
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
reproduction
increase in the mean number of juveniles per test vessel after 6 weeks
3.2
concentration lethal to 50 % of the test organisms
LC50
that concentration of the test substance which kills 50 % of the test animals within the period of the range-
finding test or the definitive test
NOTE 1 The LC50 is expressed as mass of test substance per dry mass of the test substrate.
NOTE 2 It is the median lethal concentration.
3.3
lowest observed effect concentration
LOEC
lowest tested concentration at which the test substance is observed to have a statistically significant effect on
reproduction (probability p < 0,05) when compared with the control
NOTE 1 The concentration is expressed as mass of test substance per dry mass of test substrate over a given
exposure time.
NOTE 2 In addition, all test concentrations above the LOEC should have a harmful effect equal or greater than that
observed at the LOEC. If these two conditions are not satisfied, a full explanation should be given for how the LOEC [and
hence the NOEC (see 3.4)] has been selected.
NOTE 3 In this test, the effect on reproduction (number of juveniles) is used as test parameter.
3.4
no observed effect concentration
NOEC
test concentration immediately below the LOEC which, when compared with the control, has no statistically
significant effect (probability p > 0,05) within a given exposure time
NOTE In this test, the effect on reproduction (number of juveniles) is used as test parameter.
3.5
effect concentration
ECx
concentration at which a specific effect is detected [where x is the percentage (10, 25, 50) of this effect, e.g.
on reproduction, in relation to a control]
NOTE For example, EC50 means the concentration estimated to reduce the reproduction rate at the end of the test
to 50 % compared to the control. All effect concentrations are expressed as mass of test substance per dry mass of the
test substrate.
4 Principle
Adult Enchytraeidae worms are exposed to a range of concentrations of the test substance mixed in artificial
soil. The test can be divided into two distinct steps: a short (2 weeks) range-finding test in which the range of
toxic effects (mainly mortality) is determined, and a long-term (6 weeks) definitive test in which the survival of
parental worms and the fecundity (number of juveniles) are measured. Therefore, the test is usually
conducted as follows.
a) For test substances of unknown toxicity exposure, it is recommended to conduct a range-finding test for a
period of 14 d, indicating the concentrations for total mortality and for the absence of mortality. The
resulting dose-response relationship is important for the proper design of the definitive test.
b) The definitive test is designed to determine the concentration of a test substance mixed into the artificial
soil that causes a defined significant or specified effect on reproduction. This test design includes the
investigation of lethal effects on the parental Enchytraeidae. The total duration of the definitive test is
6 weeks (if another Enchytraeus species than E. albidus is used, it can be shorter). After the first 3 weeks,
the adult worms are removed, the number of living worms and morphological changes (e.g. body lesions
or fragmentation of the worm) are recorded. After another 3 weeks, the number of offspring hatched from
the cocoons is counted. The NOEC and the ECx for reproduction are determined.
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5 Materials
The test substrate and the test substance are set up with standard laboratory equipment and kept in glass
vessels.
5.1 Biological material.
The recommended test species is Enchytraeus albidus Hence 1837 (white potworm; Enchytraeidae,
Oligochaeta, Annelida). E. albidus is one of the largest enchytraeid species, measuring 15 mm to 40 mm, and
has a world-wide distribution (see Bibliography). It can easily be recognised by two characteristics: four setae
per bundle ventrally, and the very long seminal duct in the clitellum region as well as some segments behind it.
The species can be found in marine, limnic and terrestrial habitats, mainly in decaying organic matter
(seaweed, compost) and only rarely in meadows. This broad ecological tolerance and some morphological
variations indicate that the species may consist of several races (or ecotypes).
E. albidus can be obtained commercially, since it is sold as food for fish. It should be verified whether such a
culture is contaminated by other, usually smaller species (see Bibliography). If contamination occurs, all
worms are washed in water in a Petri dish. With the help of a stereomicroscope, large adult specimens of E.
albidus are selected to start a new culture. All other worms of the original culture are discarded. E. albidus can
be bred easily in a wide range of organic waste materials (see Annex E) and has a short life cycle, reaching
maturity between 33 d (at 18 °C) and 74 d (at 12 °C). Only cultures which have been kept in the laboratory for
at least 5 weeks (one generation cycle) without problems can be used for testing purposes.
Other species of the genus Enchytraeus, e.g. the true soil-inhabiting but smaller species E. buchholzi
Vejdovsky 1879 or E. crypticus Westheide and Graefe 1992, are also suitable as test organisms (see
Annex F). If other species of Enchytraeus are used, they shall be clearly identified and the rationale for the
selection of the species as well as deviations of the experimental method should be reported in this case.
The worms used in the tests should be adult with eggs (white spots) in the clitellum region and should have
approximately the same size (approximately 15 mm). A synchronisation of the breeding culture is not
necessary. The Enchytraeidae should be acclimatised in untreated artificial soil under test conditions for at
least 24 h prior to testing. During this period, the same food which is used as a food source in the test should
be given in sufficient amount.
For one test, an excess number of adult clitellate worms should be taken from the culture box without
observing them in detail in order to get enough suitable worms. At the end of the acclimatization period, only
worms with eggs and behaving normally (e.g. not trying to leave the artificial soil) are selected for the test.
This selection is made by placing the worms in a Petri dish filled with a small amount of water under a
stereomicroscope, and discarding the animals without eggs. A freshwater medium (e.g. reconstituted water as
described in OECD Guideline 202) should preferably be used, since demineralized water or tap water (risk of
copper contamination) could harm the Enchytraeidae. During this process, other organisms living in the
cultures, such as mites, are also removed from the worms.
5.2 Test substrate.
Artificial soil shall be prepared in accordance with OECD Guideline 207 and ISO 11268-2. It consists of the
following components (based on dry mass):
10 % sphagnum peat [air-dried and finely ground (2 mm ± 1 mm)]; new batches of peat should be
checked for toxicity to worms before use in tests;
20% kaolin clay (kaolinite content preferably above 30 %);
approximately 69 % (depending on the amount of CaCO needed) air-dried industrial quartz sand
(predominantly fine sand, with more than 50 % mass fraction having particle size 0,05 mm to 0,2 mm).
Add approximately 0,3 % to 1,0 % calcium carbonate (CaCO , pulverised, analytical grade) to obtain a pH of
6,0 ± 0,5.
The amount of calcium carbonate required can vary, depending on properties of the individual batch
(particularly of the peat), and should be determined by measuring sub-samples immediately before the test.
The artificial soil is prepared by thoroughly mixing the dry constituents listed above in a large-scale laboratory
mixer approximately one week before starting the test. The mixed artificial soil shall be stored at room
temperature for at least 2 d to equilibrate acidity.
To determine pH and the maximum water-holding capacity, the dry artificial soil is pre-moistened 1 d or 2 d
before starting the test by adding enough deionized water to obtain approximately half of the required final
water content (40 % to 60 % of the maximum water-holding capacity). The pH value is measured after mixing
the soil with KCl solution [c(KCl) = 1 mol/l] in a ratio of 1 to 5 (see suggested method in Annex C). If the
measured pH is not within the required range, a sufficient amount of CaCO shall be added or a new batch of
artificial soil shall be prepared. Parallel to determining the pH, the maximum water-holding capacity of the
artificial soil shall be determined in accordance with Annex D.
Afterwards, the artificial soil is divided into as many batches as the number of concentrations plus controls that
will be used in the test. Evaporation from the test substrate shall be avoided until the start of the test.
The final moisture content is reached by adding water together with, or in parallel to, the application of the test
substance. The moisture content at the beginning and end of the test is determined by drying a small sample
at 105 °C overnight and re-weighing. In any case, the substrate should be optimal for the worms (even if, due
to the batch of peat used, these moisture values are not met). In case of doubt, the moisture should be
checked by gently squeezing the soil by hand; only small drops of water should appear between the fingers.
5.3 Food source, of a quality shown to be capable of at least maintaining the Enchytraeidae population.
Rolled oats, preferably autoclaved (heating is also possible) before use to avoid infection with other organisms,
were found to be suitable. The first feeding is made by mixing 50 mg of ground rolled oats per test vessel into
the soil (after application of the test substance but before adding the worms); additional feedings (25 mg per
vessel per week except after 28 d) are made only on the surface to avoid harming the worms. Since the need
for food may vary in the different vessels, feeding should be adjusted to demand (i.e. over-feeding shall be
avoided). Some soil particles should be placed on top of the flakes in order to reduce fungal growth.
5.4 Bengal red, ethanol.
6 Apparatus
Usual laboratory equipment and especially the following materials are necessary.
6.1 Glass beakers, of capacity 0,20 l to 0,25 l, diameter approx. 6 cm, with lids (e.g. glass or perforated
plastic film).
The beakers shall be suitable as test vessels, containing an amount of artificial soil corresponding to 20 g dry
mass. The lids shall permit gaseous exchange between the soil substrate and the atmosphere.
6.2 Drying cabinet.
6.3 Stereomicroscope.
6.4 Balances with a weighing range of 50 g to 32 kg; precision at least 1 g.
6.5 Analytical balance with a weighing range of 25 mg to 200 g; precision at least 1 mg.
6.6 pH-meter.
6.7 Temperature registration (e.g. temperature/humidity recorder).
6.8 Lux meter.
4 © ISO 2004 – All rights reserved
6.9 Mixer.
6.10 Incubator or small room with air-conditioner.
6.11 Jeweller´s tweezers, hooks, loops or a small brush.
6.12 Photo basins with ribbed bottoms.
7 Test environment
Cover the test vessels (6.1) with glass lids to prevent the test substrate from drying, and keep under test
conditions for 2 weeks (range-finding test) or 6 weeks (definitive test). The test temperature shall be
20 °C ± 2 °C; higher temperatures may affect reproduction. Carry out testing in a controlled light-dark cycle of
long-day conditions, preferably 16 h to 8 h at 400 lx to 800 lx in the area of the test vessels, to prevent the
worms from escaping from the soil.
Weigh the vessels at the beginning of the test and thereafter once a week. Replenish the mass loss with the
appropriate amount of deionized water. This loss can be minimized by maintaining a high humidity (> 80 %) in
the test incubator (6.10). Place all test vessels in the test incubator in a random order, which should be
changed every week.
At the beginning and the end of both the range-finding test and the definitive test, the moisture content and the
pH should be measured. To facilitate checking of the pH and humidity of the test substrate, use of additional
containers (replicates) for each concentration and for the control is recommended.
8 Procedure
8.1 Preparation of the test substrates
8.1.1 Water-soluble test substances
Immediately before starting the test, prepare an emulsion or dispersion of the test substance in deionized
water in quantity sufficient for all replicates of one concentration. It is convenient to use the amount of water
necessary to reach the final moisture content of the artificial soil as required in 5.2 (40 % to 60 % of the
maximum water-holding capacity). Mix the emulsion or dispersion thoroughly with each batch of artificial soil
(5.2) before introducing it into a test vessel.
8.1.2 Test substances insoluble in water but soluble in organic solvents
Dissolve the quantity of test substance required to obtain the desired concentration in a volatile solvent (such
as acetone or hexane) and mix it with a portion of the quartz sand required. Evaporate the solvent by placing
the container in a fume hood for at least 1 h, add the remainder of the artificial soil (5.2) (allowing for the
amount of sand used to prepare the test substance) and the water, and mix thoroughly before introducing it
into the test vessels.
Ultrasonic dispersion, small amounts of organic solvents, emulsifiers or dispersants may be used to disperse
substances with low water solubility. When such auxiliary substances are used, all test concentrations and an
additional control should contain the same minimum amount of auxiliary substance.
WARNING — Take appropriate precautions when dealing with solvent vapour to avoid danger from
inhalation or explosion, and to avoid damage to extraction equipment, pumps, etc.
8.1.3 Test substances insoluble in water or organic solvents
A mixture of 10 g of finely ground quartz sand and the quantity of the test substance required to obtain the
desired concentration is prepared. Afterwards, this mixture is mixed thoroughly with the pre-moistened
artificial soil (5.2) and with the amount of deionized water necessary in order to obtain the final moisture level
required before introducing it into the test vessels.
8.2 Preparation of test vessel contents
An amount of test substrate (8.1) corresponding to 20 g dry mass is placed into each test vessel (6.1).
Then the food source (5.3) is mixed in and 10 Enchytraeidae (5.1) are placed carefully on the test substrate
surface, using a suitable device (6.11). The selection of the individual worms and their assignment to batches
of 10 should be made in a randomized fashion.
8.3 Range-finding test
If it is necessary to determine the range of concentrations to be applied in the definitive test, a range-finding
test is conducted at about five different concentrations of the test substance in the range of 0,1 mg/kg;
1,0 mg/kg; 10 mg/kg; 100 mg/kg and 1 000 mg/kg (dry mass of artificial soil). Test substances do not need to
be tested at concentrations higher than 1 000 mg/kg dry mass of artificial soil. One test vessel (each
containing 10 worms) for each concentration plus control is recommended. The test duration is 2 weeks, after
which the mortality of the worms is determined. Worms are classified as dead if they do not respond to a
gentle mechanical stimulus to the front end. Additionally, the presence of juveniles should be checked, using
the staining method in Annex A, at the end of the test in order to obtain more information on the
concentrations to be tested in the definitive test.
NOTE Due to the short test duration, only few juveniles can occur; therefore, this is primarily a qualitative evaluation.
Based on the mortality data from the range-finding test, the LC50 is roughly determined by calculating the
geometrical mean. This value is used to determine the concentration range of the definitive test. For example,
the NOEC or the EC10 is assumed to be lower than the LC50 by a factor of up to 10. However, it must be
stressed that this is just an empirical relationship which might be different in any given case. Therefore
additional information, such as the occurrence of juveniles, is helpful for the determination of the concentration
range for the definitive test.
If no effects are observed, even at the highest concentration of 1 000 mg/kg, the definitive test can be
designed as a limit test, comparing only eight control vessels with eight test vessels containing artificial soil
with a concentration of 1 000 mg/kg.
8.4 Definitive test
The statistical design for the definitive test cannot be defined at this point since, on the one hand, the NOEC
will still be required by regulatory authorities for the foreseeable future. On the other hand, statistical
considerations and experiences with the ring test speak in favour of an ECx design. Additionally, practical
reasons impose limits on replication and the number of concentrations that are feasible in the test. Therefore,
three alternative designs are proposed until OECD recommendations concerning general rules on how to
design a test are available.
For the definitive test, one of the following three designs is recommended (the concentrations shall be spaced
by a factor not exceeding 2).
For the NOEC approach, at least five concentrations in a geometric series should be used. Four
replicates for each concentration plus eight controls are recommended.
For the ECx approach, 12 concentrations should be used. Two replicates for each concentration plus six
controls are recommended. The spacing factor may vary; being smaller at low concentrations, larger at
high concentrations.
For the mixed approach, six to eight concentrations in a geometric series should be used. Four replicates
for each concentration plus eight controls are recommended. This mixed approach allows an NOEC as
well as an ECx evaluation. It was originally proposed by the task force of the ring test (see Bibliography).
If mortality is the main endpoint of the test, the same options are possible but the concentrations (based on
the results of the range-finding-test) shall be adjusted accordingly.
6 © ISO 2004 – All rights reserved
Ten adult worms per test vessel should be used. The duration of the first part of the test is 21 d (assessment
of mortality). The adult worms are fed once a week with 50 mg at the beginning of the test and afterwards with
25 mg dry mass rolled oats per vessel. If the worms do not consume the food, feeding should be minimized in
order to avoid fungal growth or moulding. After 21 d, the test substrate is carefully searched manually (e.g.
using a jeweller's tweezer, a hook or loop, or a small brush with a hook) for the adult worms, which are then
removed and counted. Morphological and behavioural changes of the adult worms are noted. If mortality is the
main endpoint of the test, the whole procedure is stopped at this point.
The same test substrate to which the adult worms were exposed, including cocoons laid down during the first
3 weeks of the test, is incubated under the same test conditions for another 3 weeks. The juvenile worms
hatched in the second half of the definitive test are fed with 25 mg dry mass rolled oats per vessel per week
(except after 4 weeks). Again, over-feeding shall be avoided (see 5.3).
After a total test duration of 6 weeks, the juveniles hatched in the meantime are counted by staining with
Bengal red. Wet (but not heat) extraction techniques have also proved to be suitable (see Annex A). The first
method is recommended, since wet extraction is difficult to use with artificial soil because the clay particles
make the water turbid.
8.5 Reference substance
The NOEC and/or the ECx of a reference substance shall be determined once a year or parallel to the
determination of the toxicity of a test substance, as a means of assuring that the laboratory test conditions
(including the condition and sensitivity of the test organisms) are adequate and have not changed significantly.
A suitable reference substance is carbendazim, which has been shown to affect mortality and reproduction of
Enchytraeidae. The EC50 (reproduction) should be in the range of 1,2 mg ± 0,8 mg carbendazim/kg dry mass
using an ECx design as determined in an international ring test (see Bibliography).
If testing of a positive control in parallel to each individual test is required, it should be done as for the
untreated (water or negative) control; i.e. eight replicates are used for one concentration (preferably two to
three concentrations covering the range of expected concentrations should be tested). It is recommended that
the reference substance carbendazim be used as a positive control. If tested as a liquid formulation, a
concentration of 1,2 mg a.i./kg dry mass should cause a decrease in the number of juveniles in comparison to
the untreated control of approximately 50 % ± 20 %.
8.6 Summary and timetable of the test
The individual steps of this test can be summarized as follows, where AS is the artificial soil and WHC is the
water-holding capacity:
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9 Calculation and expression of results
9.1 General
It is recommended that a statistician be involved in the analysis of the test since in this International Standard,
specific guidance on statistical procedures is given only in limited detail (for an overview, see Annex G).
9.2 Range-finding test
The test parameter (endpoint) is mortality after 14 d of exposure. Changes in behaviour (e.g. inability to
burrow into the soil; lying motionless against the glass wall of the test vessel) and morphology (e.g. open
wounds) of the worms should also be recorded. Probit analysis should be applied to determine the LC50 (see
Bibliography). In case of failure (e.g. if less than three concentrations with partial kills are available),
alternative methods can be used, such as the trimmed Spearman-Kärber method, moving averages after
Thompson, or simple interpolation (e.g. geometrical mean of LC0 and LC100, as computed by the square root
of LC0 × LC100).
9.3 Definitive test
9.3.1 General
The test parameter (endpoint) is reproduction (number of juveniles present during the experimental period)
and adult mortality after 21 d of exposure. As in the range-finding test, all other signs of toxic impact should be
recorded.
The data should be presented in tabular form, indicating the mean number of adults and juveniles for each
concentration. Further statistical testing will depend on
a) whether the NOEC or the ECx approach has been chosen, and
b) whether the replicate values are normally distributed and are homogeneous regarding their variance.
It should be kept in mind that the proposed statistical methods are not appropriate in case of hormetic effects
(see Annex G for details on how to proceed).
9.3.2 NOEC approach
For each concentration, a statistical analysis of the homogeneity and normality of replicate results shall be
made, e.g. by using Kolmogoroff-Smirnov’s and Bartlett’s test procedures respectively. With normally
distributed and homogeneous data, an appropriate statistical analysis, e.g. multiple t-tests such as the
Dunnett or Williams test (α = 0,05, one-sided) should be performed. If these requirements are not fulfilled, it is
recommended to use non-parametric methods, e.g. the Mann and Whitney U-test or the Bonferroni U-test.
If a limit test has been performed and the prerequisites (normality, homogeneity) of parametric test procedures
are fulfilled, the pair-wise Student t-test or the Mann and Whitney U-test procedure should be used.
9.3.3 ECx approach
To compute any ECx value, the treatment means are used for regression analysis after an appropriate dose-
response function has been found. A desired ECx is obtained by inserting a value corresponding to x % of the
control mean into the equation found by regression analysis. Confidence limits can be calculated according to
[15]
Fieller .
Alternatively, treatment results may be expressed as percentages of the control result or as percentage
inhibition relative to the control. The normal (logistic) sigmoid can then be fitted to the results by means of the
probit regression procedure.
10 Validity of the test
The results are considered to be valid if the following conditions are met in the control.
The mortality should not exceed 20 % on average at the end of the range-finding test and after the first
three weeks of the definitive test.
In the definitive test, the average number of juveniles should be higher than 25 per test vessel at the end
of the definitive test, assuming that 10 adult worms (with eggs in the clitellum region) per test vessel were
introduced at the beginning of the test.
The coefficient of variation calculated for the reproduction data should be not higher than 50 % at the end
of the definitive test.
11 Test report
The test report shall refer to this International Standard and shall contain a summary of the results obtained,
the methods and parameters used during the study. The test report shall provide the following information:
a) a full description of the experimental design and procedures, including a description of the artificial soil
and test equipment used;
b) chemical identification of the test substance according to IUPAC nomenclature, batch, lot and CAS
number, structural formula, and purity of the test substance;
c) properties of the test and reference substance (e.g. stability in soil);
d) method of application;
e) identification of the test organism and description of stock cultures;
f) description of the culturing conditions;
g) source of supply of the test organism;
h) description of the test conditions, including moisture content and pH value of the artificial soil at the start
and end of the test;
i) mortality of the adults and the number of juveniles at the end of the range-finding test;
j) mortality of adults after 3 weeks and the average number of juveniles at the end of the definitive test;
k) description of obvious physical or pathological symptoms or distinct changes in behaviour observed in the
test organisms;
l) statistically calculated values (LC50, NOEC and/or ECx) including 95% confidence limits, method of
calculation, plot of the dose-response relationship;
m) all information, including all measured raw data, developed during all phases of testing with the test and
reference substances;
n) discussion of the results;
o) all details not specified in this International Standard or which are optional, as well as any incident which
may have affected the results.
10 © ISO 2004 – All rights reserved
Annex A
(informative)
Detailed description of extraction techniques
A.1 Staining with Bengal red
This method, originally developed in limnic ecology, was first proposed for the counting of juvenile
Enchytraeidae in this test by de Coen (University of Ghent, Belgium). Independently, a modified version
[23]
(Bengal red mixed with formaldehyde instead of ethanol) was developed by Posthuma et al. .
At the end of the definitive test (i.e. after 6 weeks), transfer the artificial soil in the test vessels to a shallow
container [e.g. a Bellaplast vessel or a photo basin with ribbed bottom (6.12)] and fix the juveniles with ethanol
(approximately 5 ml per replicate). Then fill the vessels with water up to a depth of 1 cm to 2 cm. Then add a few
drops (200 µl to 300 µl) of Bengal red (1 % solution in ethanol) or alternatively 0,5 % eosin, and mix the two
components carefully. After 12 h, the worms are completely reddish-coloured and now very easy to count
because they are lying on the surface of the substrate.
Another possibility is to press the substrate/alcohol mixture through a sieve of mesh size 0,250 mm before
counting the worms. The kaolinite clay, the peat and some sand grains are removed and the reddish-coloured
worms are easier to see.
The use of illuminated lenses (lens dimensions at least 100 mm × 75 mm; magnification factor ×2 to ×3) also
facilitates counting the already reddish juveniles.
Due to these improvements, the counting time can be reduced to a few minutes per vessel. Using the staining
method, the vessels of one test can be assessed by a single person within 1 d (maximum 2 d), starting several
hours or days after the end of the test.
A.2 Wet extraction
The wet extraction process should be started immediately after the end of the test. The artificial soil from each
test vessel is placed into a common plastic sieve. The sieves are put in plastic bowls without touching the
bottom. The bowls are carefully filled with water until the samples in the sieves are completely under the water
surface. As they are in constant motion, the worms fall through the sieve openings (∅1 mm). To ensure a
recovery rate of more than 90 %, the soil extraction time should be 3 d at 20 °C ± 2 °C. At the end of the
extraction time, the sieves are removed and the water (except for a small amount) is slowly decanted. The
sediment at the bottom of the bowls should not be disturbed. Then the plastic bowls are shaken slightly to
suspend the sediment in the supernatant water, which is transferred to a Petri dish. After clarification of the
water (i.e. the soil particles have settled), the Enchytraeidae can now be collected from the Petri dish under a
stereomicroscope, using a soft steel forceps or a small brush.
A.3 Flotation
Alternatively, according to Kuperman (US Army Edgewood Chemical Biological Center), the following
procedure is also possible: after fixing the content of a test vessel with ethanol, the artificial soil is flooded with
Ludox [AM-30 colloidal silica, 30 % (mass fraction) suspension in water] up to 10 mm to 15 mm above the soil
surface. After thoroughly mixing the soil with the flotation agent, the juvenile worms floating on the surface can
easily be counted after 2 min to 3 min. To ensure that all juveniles have emerged on the surface of the
solution, stirring should be repeated once or twice.
Annex B
(normative)
Determination of the effects of contaminated soil on Enchytraeidae
reproduction
B.1 General
The method described in this International Standard can be adapted to compare Enchytraeidae reproduction
in a number of soils. Different species of the genus Enchytraeus can be used to assess the quality of a
specific soil (sample). In order to distinguish between effects (e.g. mortality or a decrease in reproduction) of a
toxic test substance or of soil parameters, two prerequisites shall be fulfilled:
a control soil shall be available in order to evaluate effects of the soil to be tested;
the ecological requirements of the selected species shall be known.
[18]
Concerning a control soil, only three choices a), b) and c) below are possible . The best option is to use a)
and c) in parallel. If a) is not available (which is probably often the case), b) and c) should be used accordingly.
a) a field soil uncontaminated but in every other respect pedologically comparable to the soil sample being
tested;
1)
b) a well-characterized field soil, such as the German standard soils , which are often used as a test
substrate in pesticide registration studies;
c) a standardized artificial soil (for example in accordance with OECD 1984 or ISO 11268-2); however, one
natural component (the peat) is often difficult to handle since its properties can vary considerably.
Depending on the test species, different control soils can affect the worms even without any contamination
(e.g. due to pH preferences). Therefore, it is very important to identify the ecological requirements of those
Enchytraeus species which are potential test organisms for soil quality assessment. In any case, it is
recommended to l
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16387
Première édition
2004-02-01
Qualité du sol — Effets des polluants sur
les Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) —
Détermination des effets sur la
reproduction et la survie
Soil quality — Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus
sp.) — Determination of effects on reproduction and survival
Numéro de référence
©
ISO 2004
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Publié en Suisse
ii © ISO 2004 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives. 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 2
5 Matériels. 3
6 Appareillage. 5
7 Environnement d’essai. 5
8 Mode opératoire. 6
8.1 Préparation des substrats d'essai. 6
8.2 Préparation des contenus des récipients d'essai .6
8.3 Essai préliminaire. 6
8.4 Essai définitif. 7
8.5 Substance de référence. 8
8.6 Récapitulatif et planification de l’essai. 9
9 Calcul et expression des résultats. 10
9.1 Généralités. 10
9.2 Essai préliminaire. 10
9.3 Essai définitif. 10
10 Validité de l’essai . 11
11 Rapport d’essai. 11
Annexe A (normative) Description détaillée des techniques d'extraction . 13
Annexe B (normative) Détermination des effets du sol contaminé sur la reproduction des
Enchytraeidae. 15
Annexe C (informative) Détermination du pH . 20
Annexe D (informative) Détermination de la capacité maximale de rétention d'eau. 21
Annexe E (informative) Conditions de culture des espèces du genre Enchytraeus. 22
Annexe F (informative) Réalisation d’essais avec d’autres espèces du genre Enchytraeus. 24
Annexe G (informative) Présentation de l’évaluation statistique des données (détermination de la
CSEO). 26
Bibliographie . 27
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 16387 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4, Méthodes
biologiques.
iv © ISO 2004 – Tous droits réservés
Introduction
La présente Norme internationale a été élaborée en tenant compte des modes opératoires recommandés par
l’Organisation internationale de normalisation (ISO) et l’Organisation de coopération et de développement
économiques (OCDE) (voir l’Article 2 et la Bibliographie).
La méthode décrite a été mise au point en vue d’expérimenter les effets liés à l’ajout de substances chimiques
dans un sol artificiel. L’Annexe B décrit une adaptation de la méthode pour la mise à l’essai ou la comparaison
de sols afin, par exemple, d’évaluer les résultats des traitements de dépollution. Cette méthode peut
également être adaptée pour déterminer les effets sub-létaux et les niveaux sans effets des pesticides.
Les annélides du genre Enchytraeus vivant dans le sol sont pertinents sur le plan écologique. En effet, ils sont
abondants dans de nombreux sols faiblement peuplés de lombriciens, mais leur densité de population peut
également être élevée dans des sols où les lombriciens sont très répandus. Les Enchytraeidae peuvent être
utilisés aussi bien pour des essais en laboratoire que pour des études en conditions naturelles ou semi-naturelles.
Du point de vue pratique, de nombreuses espèces du genre Enchytraeus sont faciles à manipuler et à élever et
présentent un cycle de reproduction nettement plus court que les lombriciens [la durée des essais de
reproduction des Enchytraeidae est de quatre semaines à six semaines, contre douze semaines
(synchronisation comprise) pour les lombriciens].
NORME INTERNATIONALE ISO 16387:2004(F)
Qualité du sol — Effets des polluants sur les Enchytraeidae
(Enchytraeus sp.) — Détermination des effets sur la
reproduction et la survie
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale décrit une méthode de détermination des effets des substances ou des sols
contaminés sur la reproduction et la survie du ver Enchytraeus albidus (Enchytraeidae). Les animaux sont
exposés aux substances par absorption cutanée et ingestion soit en utilisant un substrat de sol artificiel
déterminé dans lequel des quantités définies de la substance sont incorporées, soit en utilisant un substrat de
sol de qualité inconnue.
La présente Norme internationale est applicable aux substances d’essai solubles ou insolubles dans l’eau,
bien que la méthode de préparation diffère. La méthode ne s’applique pas aux substances d’essai volatiles,
c’est-à-dire aux substances dont H (la constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à
1, ou dont la pression de vapeur à 25 °C excède 0,013 3 Pa. Il convient de connaître la solubilité dans l’eau,
et la pression de vapeur de la substance expérimentée. En outre, des informations sur la persistance de la
substance expérimentée dans le sol sont souhaitables.
NOTE 1 Des informations écologiques et écotoxicologiques de base sur les Enchytraeidae en milieu terrestre sont
fournies dans les références énumérées dans la Bibliographie.
NOTE 2 La stabilité de la substance expérimentée ne peut pas être garantie pendant toute la durée de l’essai. La
méthode d’essai ne comporte aucune disposition relative au contrôle de la persistance de la substance expérimentée.
NOTE 3 L’Annexe B donne des recommandations d’adaptation de la méthode pour la comparaison et la surveillance
de la qualité des sols.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 11268-2:1998, Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre (Eisenia fetida) —
Partie 2: Détermination des effets sur la reproduction
OCDE (Organisation de coopération et de développement économiques), 1984, Earthworm, Acute Toxicity
Tests (Ver de terre, Essais de toxicité aiguë), ligne directrice n° 207, OCDE, Paris
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
reproduction
augmentation du nombre moyen de jeunes par récipient d’essai après six semaines
3.2
concentration létale pour 50 % des organismes soumis à l’essai
CL 50
concentration létale moyenne, c’est-à-dire la concentration de la substance expérimentée qui provoque la
mort de 50 % des animaux soumis à l’essai pendant l’essai préliminaire ou l’essai définitif
NOTE La CL 50 est exprimée en masse de substance expérimentée par masse sèche de substrat d’essai.
3.3
concentration minimale avec effet observé
CMEO
plus faible concentration d’essai à laquelle la substance expérimentée produit un effet statistiquement
significatif sur la reproduction (p < 0,05) par rapport au témoin
NOTE 1 La concentration est exprimée en masse de substance expérimentée par masse sèche de substrat d’essai
pendant un temps d’exposition donné.
NOTE 2 Toutefois, toutes les concentrations d’essai supérieures à la CMEO doivent impérativement avoir un effet
nocif supérieur ou égal au niveau observé pour la CMEO. Lorsque ces deux conditions ne peuvent être satisfaites, il
convient que le choix de la CMEO [et donc de la CSEO (voir 3.4)] fasse l’objet d’explications exhaustives.
NOTE 3 Pour le présent essai, les effets sur la reproduction (nombre de jeunes) servent de paramètre de mesure.
3.4
concentration sans effet observable
CSEO
concentration d’essai immédiatement inférieure à la CMEO qui, comparée au témoin, ne produit aucun effet
statistiquement significatif (p > 0,05) pendant un temps d’exposition donné
NOTE Pour le présent essai, les effets sur la reproduction (nombre de jeunes) servent de paramètre de mesure.
3.5
CEx
concentration à laquelle un effet spécifique est détecté [où x est le pourcentage (10, 25, 50) de cet effet, par
exemple sur la reproduction]
NOTE À titre d’exemple, la CE 50 correspond à la concentration estimée qui réduit de 50 % le taux de reproduction
par rapport au témoin. Toutes les CEx sont exprimées en masse de substance expérimentée par masse sèche du
substrat d’essai.
4 Principe
Des vers Enchytraeidae adultes sont exposés à une gamme de concentrations de la substance expérimentée
mélangée à un sol artificiel. L’essai peut être scindé en deux étapes distinctes: un essai préliminaire de courte
durée (deux semaines), durant lequel la gamme de concentrations entraînant des effets toxiques
(principalement la mortalité) est déterminée, et un essai définitif à long terme (six semaines), au cours duquel
la survie des vers adultes et la fécondité (nombre de jeunes) sont mesurées. L’essai est donc généralement
effectué comme suit:
a) pour les substances expérimentées de toxicité inconnue, il est recommandé d’effectuer un essai
préliminaire d’une durée de 14 j, qui indique les concentrations provoquant la mortalité totale et l’absence
de mortalité. La relation dose/effet ainsi obtenue est importante pour concevoir l’essai définitif de façon
adéquate;
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b) l’essai définitif est conçu pour déterminer la concentration d’une substance expérimentée qui, mélangée
au sol artificiel, entraîne un effet significatif défini ou un effet précis sur la reproduction. L’essai est
également conçu pour étudier les effets létaux sur les Enchytraeidae adultes. La durée totale de l’essai
définitif est de six semaines (une durée plus courte est possible si des espèces du genre Enchytraeus
autres que E. albidus sont employées). Au bout des trois premières semaines, les vers adultes sont
retirés et le nombre de vers vivants, ainsi que les modifications morphologiques (telles que lésions
corporelles ou fragmentation du ver) sont enregistrés. Après une nouvelle période de trois semaines, le
nombre de jeunes est comptabilisé après éclosion des cocons. Les valeurs de CSEO et CEx sur la
reproduction sont déterminées.
5 Matériels
Le substrat d’essai et la substance expérimentée sont préparés à l’aide d’un matériel courant de laboratoire et
conservés dans des récipients en verre.
5.1 Matériel biologique.
L’espèce recommandée pour l’essai est Enchytraeus albidus Hence 1837 (ver blanc; Enchytraeidae,
Oligochaeta, Annelida). E. albidus, l’une des plus grandes espèces d'Enchytraeidae, se caractérise par une
taille de 15 mm à 40 mm et une distribution géographique mondiale (voir la Bibliographie). Cette espèce est
facilement reconnaissable grâce à deux caractéristiques: quatre soies par faisceau sur la face ventrale et un
très long canal séminal dans la région du clitellum et de quelques segments postérieurs. On rencontre cette
espèce en habitat marin, limnique et terrestre, principalement dans les matières organiques en décomposition
(varech, compost) et seulement rarement dans les prairies. Cette tolérance écologique très étendue, ainsi que
certaines variations morphologiques, indiquent que cette espèce peut englober plusieurs races (ou écotypes).
E. albidus peut être obtenu dans le commerce, puisqu'il est vendu comme aliment pour poissons. Il convient
de vérifier si une culture est contaminée par d’autres espèces de taille généralement inférieure (voir la
Bibliographie). En cas de contamination, tous les vers sont lavés à l’eau dans une boîte de Petri. Les
spécimens adultes de E. albidus de grande taille sont sélectionnés à l’aide d’une loupe binoculaire pour
démarrer une nouvelle culture. Tous les autres vers issus de la culture initiale sont éliminés. E. albidus peut
être facilement élevé dans un grand nombre de déchets organiques (voir l’Annexe E) et présente un cycle de
vie court, la maturité étant atteinte entre 33 j (à 18 °C) et 74 j (à 12 °C). Seules les cultures ayant été
conservées au laboratoire pendant au moins cinq semaines sans problèmes (soit un cycle de génération) sont
utilisables pour les essais.
D’autres espèces du genre Enchytraeus, telles que E. buchholzi Vejdovsky 1879 ou E. crypticus Westheide et
Graefe 1992, populations réellement indigènes mais plus petites, sont également admises en tant
qu’organismes d’essai (voir l’Annexe F). En cas d’utilisation d’autres espèces du genre Enchytraeus, il est
obligatoire de les identifier clairement et il convient de mentionner les raisons pour lesquelles ces espèces ont
été choisies, ainsi que les écarts par rapport à la méthode d'essai.
Il convient que les vers soumis aux essais soient des individus adultes porteurs d’œufs (points blancs) dans la
région du clitellum et qu’ils soient de taille approximativement égale (environ 15 mm). Il n’est pas nécessaire
de synchroniser la culture d’élevage. Il convient d’acclimater les Enchytraeidae dans un sol artificiel non traité,
dans les conditions de l’essai pendant au minimum les 24 h qui précèdent l’essai. Durant cette période, il
convient de distribuer des quantités suffisantes de la nourriture qui sera également utilisée comme source
d’alimentation durant l’essai.
Il convient, pour un essai, de prélever dans la boîte d’élevage un échantillon surnuméraire de vers adultes
possédant un clitellum, sans les observer en détail, afin de disposer d’une population de vers suffisante. Au
terme de la période d’acclimatation, seuls les vers porteurs d’œufs et présentant un comportement normal
(par exemple, n’essayant pas de s’échapper du sol artificiel) sont sélectionnés pour l’essai. La sélection est
effectuée en observant à la loupe binoculaire les vers placés dans une boîte de Petri contenant une faible
quantité d’eau et en éliminant les animaux dépourvus d’œufs. Il convient, de préférence, d’utiliser un milieu
d’eau douce (telle que de l’eau reconstituée conformément à la ligne directrice n° 202 de l’OCDE), car l’eau
déminéralisée ou l’eau du robinet (en cas de contamination au cuivre) risque d'être nocive pour les
Enchytraeidae. Au cours de ce processus, les autres organismes vivant dans les cultures, tels que les mites,
sont également séparés des vers.
5.2 Substrat d’essai.
La composition du sol artificiel préparé conformément à la ligne directrice n° 207 de l’OCDE et à
l’ISO 11268-2 est la suivante (pourcentages exprimés en masse sèche):
10 % de tourbe de sphaigne [séchée à l’air et finement moulue (2 mm ± 1 mm)]; il convient de contrôler
les nouveaux lots de tourbe avant de les utiliser pour l'essai car la tourbe peut être toxique pour les vers;
20 % d’argile kaolinique (contenant de préférence plus de 30 % de kaolinite);
environ 69 % (suivant la quantité de CaCO requise) de sable de quartz industriel séché à l'air (sable fin
dominant dans lequel plus de 50 % des grains présentent une granulométrie comprise entre 0,05 mm et
0,2 mm).
Ajouter environ 0,3 % à 1,0 % de carbonate de calcium (CaCO , pulvérisé, de qualité analytique) pour obtenir
un pH de 6,0 ± 0,5.
Il convient de déterminer la quantité de carbonate de calcium nécessaire en mesurant des sous-échantillons
immédiatement avant l’essai. Cette quantité de carbonate de calcium peut en effet varier en fonction des
caractéristiques du lot particulier (principalement celles de la tourbe).
Le sol artificiel est préparé en mélangeant soigneusement les composants secs énumérés plus haut à l’aide
d’un mélangeur de laboratoire de grandes dimensions, environ une semaine avant le début de l’essai. Le sol
artificiel mélangé doit être conservé à température ambiante pendant au moins deux jours afin d’équilibrer
l’acidité.
Afin de déterminer le pH et la capacité maximale de rétention d’eau, le sol artificiel sec est préalablement
humidifié un ou deux jours avant le début de l’essai avec assez d’eau déionisée pour atteindre environ la
moitié de la teneur en eau finale requise, à savoir 40 % à 60 % de la capacité de rétention d’eau maximale. La
valeur du pH est mesurée en mélangeant le sol avec une solution de KCl [c(KCl) = 1 mol/l] selon un rapport
de 1 à 5 (voir l’Annexe C). Si le pH mesuré est hors de la plage de valeurs requises, une quantité suffisante
de CaCO doit être ajoutée ou un nouveau lot de sol artificiel doit être préparé. La capacité maximale de
rétention d’eau du sol artificiel doit être déterminée en parallèle de la détermination du pH. Cette opération est
décrite en détail à l’Annexe D.
Ensuite, le sol artificiel est divisé en un nombre de lots égal au total du nombre de concentrations et de
témoins utilisés durant l’essai. L’évaporation du substrat d’essai doit être évitée jusqu’au début de l’essai.
La teneur en eau finale est obtenue en ajoutant de l’eau contenant la substance expérimentée ou en ajoutant
de l’eau parallèlement à l’introduction de la substance expérimentée. La teneur en eau au début et à la fin de
l’essai est déterminée, par pesée, en séchant une petite quantité d’échantillon à 105 °C durant une nuit, puis
en la pesant à nouveau. Dans tous les cas, il convient que le substrat soit optimal pour les vers (même si, en
raison du lot de tourbe utilisé, ces valeurs d'humidité ne sont pas atteintes). En cas de doute, il convient de
contrôler l’humidité en procédant comme suit, lorsque le sol est légèrement pressé entre les doigts, il convient
que seules des gouttelettes d’eau se forment.
5.3 Source d'alimentation, d'une qualité permettant au minimum d’assurer la survie de la population
d'Enchytraeidae.
Les flocons d’avoine, de préférence autoclavés (ou éventuellement chauffés) avant usage afin d'éviter
l’infection par d’autres organismes, se sont révélés adaptés. La première addition de nourriture est effectuée
en mélangeant au sol 50 mg de flocons d’avoine réduits en poudre par récipient d’essai (après application de
la substance expérimentée, mais avant d'ajouter les vers); les ajouts de nourriture ultérieurs (25 mg par
récipient et par semaine, sauf au-delà de 28 j) sont effectués uniquement en surface afin d’éviter de blesser
les vers. Les besoins en nourriture pouvant varier d’un récipient à l’autre, il convient d’ajuster la distribution à
la demande (en d’autres termes, d'éviter toute suralimentation). Il convient de recouvrir les flocons de
quelques particules de sol afin de réduire l’activité fongique.
5.4 Rouge bengale, éthanol.
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6 Appareillage
Un matériel courant de laboratoire, et notamment les appareils suivants, sont nécessaires:
6.1 Récipients en verre, munis d’un couvercle (en verre ou en plastique perforé), de 0,20 l à 0,25 l de
contenance et d’environ 6 cm de diamètre.
Les récipients en verre doivent convenir comme récipients d’essai, contenant une quantité de sol artificiel
équivalant à 20 g de masse sèche. Les couvercles doivent permettre les échanges gazeux entre le substrat
de sol et l’atmosphère.
6.2 Étuve.
6.3 Loupe binoculaire.
6.4 Balances, permettant des pesées de 50 g à 32 kg et d’une précision d’au moins 1 g.
6.5 Balance d'analyse, permettant des pesées de 25 mg à 200 g et d’une précision d’au moins 1 mg.
6.6 pH-mètre.
6.7 Enregistreur de température, par exemple thermomètre/hygromètre.
6.8 Luxmètre.
6.9 Mélangeur.
6.10 Incubateur ou petit local équipé d’un climatiseur.
6.11 Pince d’horloger, crochets, anses ou une petite brosse.
6.12 Bacs de développement photographique, à fond rainuré.
7 Environnement d’essai
Les récipients (6.1) sont recouverts d’un couvercle en verre pour empêcher la déshydratation du substrat
d’essai, puis conservés dans les conditions d’essai pendant deux semaines (essai préliminaire) ou six
semaines (essai définitif). La température d’essai est de 20 °C ± 2 °C. Il convient que la température ne
dépasse pas cette valeur sous peine de nuire à la reproduction. L’essai est effectué dans des conditions de
jours longs avec un cycle de lumière-obscurité contrôlé (de préférence de 16 h à 8 h, sous une lumière de
400 lx à 800 lx à proximité des récipients d’essai) afin d’empêcher les vers de s’échapper du sol.
Les récipients sont pesés au début de l’essai, puis une fois par semaine, la perte de masse étant compensée
par l’apport de quantités appropriées d’eau déionisée. Cette déperdition peut être minimisée par le maintien
d’un degré d’hygrométrie élevé (> 80 %) dans l’incubateur d’essai (6.10). Tous les récipients sont disposés
dans l’incubateur dans un ordre aléatoire qu’il convient de modifier chaque semaine.
Au début et à la fin de l’essai préliminaire et de l’essai définitif, il convient de mesurer la teneur en eau et le
pH. Pour faciliter le contrôle du pH et de l’humidité du substrat d’essai, il est recommandé d’utiliser des
conteneurs supplémentaires (réplicats) pour chaque concentration et pour le témoin.
8 Mode opératoire
8.1 Préparation des substrats d'essai
8.1.1 Substances expérimentées solubles dans l’eau
Immédiatement avant le début de l’essai, préparer une émulsion ou une dispersion de la substance
expérimentée dans de l’eau déionisée, en quantité suffisante pour tous les réplicats d’une même
concentration. Il est pratique d’utiliser une quantité d’eau permettant d’obtenir le taux d’humidité final du sol
artificiel tel que requis en 5.2 (40 % à 60 % de la capacité maximale de rétention d’eau). Mélanger
soigneusement l’émulsion ou la dispersion à la quantité de sol artificiel avant de l’introduire dans un récipient
d’essai.
8.1.2 Substances expérimentées non solubles dans l’eau mais solubles dans les solvants
organiques
Dissoudre la quantité de substance expérimentée nécessaire pour obtenir la concentration souhaitée dans un
solvant volatil (par exemple acétone ou hexane) et la mélanger à une quantité du sable de quartz
recommandé. Après l’évaporation du solvant, obtenue en plaçant le conteneur sous une hotte aspirante
pendant au moins une heure, ajouter le reste de sol artificiel (5.2) (dont la quantité de sable utilisée pour
préparer la substance expérimentée) et l’eau, et mélanger soigneusement l'ensemble avant de l’introduire
dans les récipients d’essai.
Il est possible d'effectuer la dispersion des substances faiblement solubles dans l’eau au moyen d’ultrasons,
de solvants organiques, d’émulsifiants ou de produits dispersants. En cas d’utilisation de substances
auxiliaires de ce type, il convient que toutes les concentrations d’essai et un témoin additionnel contiennent la
même quantité minimale de substance auxiliaire.
AVERTISSEMENT — Compte tenu des vapeurs de solvant, il convient de prendre des précautions
appropriées pour éviter les dangers d’inhalation ou d’explosion et pour éviter d’endommager
l’équipement d’extraction, les pompes, etc.
8.1.3 Substances expérimentées insolubles dans l’eau ou dans les solvants organiques
Préparer un mélange à partir de 10 g de sable de quartz finement moulu et de la quantité de substance
expérimentée nécessaire pour obtenir la concentration souhaitée. Mélanger ensuite cette mixture
soigneusement au sol artificiel préalablement humidifié et à la quantité d’eau déionisée nécessaire pour
obtenir le taux d’humidité final requis avant l’introduction dans les récipients d’essai.
8.2 Préparation des contenus des récipients d'essai
Introduire une quantité de substrat d’essai (8.1) correspondant à 20 g de masse sèche dans chaque récipient
d’essai (6.1).
Mélanger ensuite la nourriture (5.3) à l’ensemble et déposer 10 Enchytraeidae avec précaution à la surface du
substrat d’essai à l’aide d’un instrument approprié (6.11). Il convient d’effectuer la sélection des vers et leur
répartition par lots de 10 de manière aléatoire.
8.3 Essai préliminaire
S’il est nécessaire de déterminer la gamme de concentrations à utiliser au cours de l’essai définitif, effectuer
un essai préliminaire avec environ cinq concentrations de la substance expérimentée dans la gamme
0,1 mg/kg, 1,0 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg et 1 000 mg/kg (masse sèche de sol artificiel). Il n’est pas
nécessaire de soumettre à l’essai les substances expérimentées à des concentrations supérieures à
1 000 mg/kg de masse sèche de sol artificiel. Il est recommandé d’utiliser un seul récipient (contenant
10 vers) pour chaque concentration et pour le témoin. La durée de l’essai est de 2 semaines, au bout
desquelles la mortalité des vers est déterminée. Les vers sont considérés comme morts lorsqu’ils ne
présentent aucune réaction à un léger stimulus mécanique au niveau de leur partie antérieure. En outre, il
convient de vérifier la présence de jeunes en appliquant la méthode par coloration (voir l’Annexe A) à la fin de
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l’essai, de manière à recueillir davantage d’informations sur les concentrations à expérimenter au cours de
l’essai définitif.
NOTE Compte tenu de la courte durée de l’essai, seul un petit nombre d’éclosions peut avoir lieu. Cette évaluation a
donc un caractère principalement qualitatif.
À partir des données de mortalité recueillies au cours de l’essai préliminaire, déterminer la CL 50
approximativement en calculant la moyenne géométrique. Cette valeur sert à déterminer la gamme de
concentrations utilisée pour l’essai définitif. Par exemple, on prend pour hypothèse que les valeurs de CSEO
ou CE 10 sont inférieures à la CL 50 d'un facteur pouvant aller jusqu'à 10. Il est important toutefois de
souligner qu’il s’agit seulement d’une relation empirique, qui peut être différente selon les cas particuliers. Par
conséquent, des informations complémentaires telles que les naissances sont utiles pour déterminer la
gamme de concentrations pour l’essai définitif.
Si aucun effet n’est observé, même à la concentration maximale de 1 000 mg/kg, l’essai définitif peut être
conçu comme un essai limite, en comparant seulement huit récipients témoin à huit récipients contenant du
sol artificiel contaminé à une concentration de 1 000 mg/kg.
8.4 Essai définitif
La conception statistique de l’essai définitif ne peut pas être déterminée actuellement puisque, d’une part,
dans un avenir prévisible les autorités continueront à exiger la valeur de CSEO, et que d’autre part, les
considérations statistiques et que l’expérience de l’essai circulaire sont favorables à une conception de type
CEx. Des raisons pratiques imposent en outre des limites quant au nombre de réplicats et au nombre de
concentrations réalisés au cours de l’essai. Trois variantes sont donc proposées, jusqu’à ce que des
recommandations de l’OCDE permettent de définir des règles générales sur la mise en œuvre de l’essai.
Pour l’essai définitif, trois conceptions sont possibles (les concentrations doivent être espacées d’un facteur
ne dépassant pas 2).
Pour l’approche CSEO, il convient d’utiliser au moins cinq concentrations réparties selon une progression
géométrique. Il est recommandé d’utiliser quatre réplicats pour chaque concentration, ainsi que huit
témoins.
Pour l’approche CEx, il convient d’utiliser 12 concentrations. Il est recommandé de réaliser deux réplicats
pour chaque concentration, ainsi que six témoins. Le facteur d'espacement peut varier, et être plus petit
aux faibles concentrations et plus important aux concentrations élevées.
Pour l’approche mixte, il convient d’utiliser six à huit concentrations réparties selon une progression
géométrique. Il est recommandé de réaliser quatre réplicats pour chaque concentration, ainsi que huit
témoins. Cette approche mixte permet de procéder à une évaluation de la CSEO et de la CEx. Elle avait
été proposée, à l’origine, par le groupe chargé de l’essai circulaire (voir la Bibliographie).
Si la mortalité constitue le principal critère d’effet de l’essai, les mêmes options sont possibles mais les
concentrations (définies d’après l’essai préliminaire) doivent être ajustées en conséquence.
Il convient d’utiliser dix vers adultes par récipient d’essai. La durée d’essai de la première partie est de 21 j
(évaluation de la mortalité). Les vers adultes sont alimentés une fois par semaine avec des rations de 50 mg
au début de l’essai, puis de 25 mg de masse sèche de flocons d’avoine par récipient. Dans les cas où les vers
ne consomment pas la nourriture, il convient de réduire l’alimentation afin d’éviter le développement de
champignons ou de moisissures. Au bout de 21 j, le substrat d’essai est examiné manuellement et avec
précaution (par exemple à l’aide d’une pince d’horloger, de crochets, d’une anse ou d’une petite brosse munie
d’un crochet) à la recherche des vers adultes qui sont ensuite retirés et dénombrés. Les changements
morphologiques et comportementaux des vers adultes sont consignés. Si la mortalité constitue le principal
critère d’effet de l’essai, l’ensemble du mode opératoire prend fin à ce stade.
Le même substrat d’essai que celui auquel les vers adultes ont été exposés, et qui contient les cocons
déposés au cours des trois premières semaines de l’essai, est incubé dans des conditions identiques pendant
une nouvelle période de trois semaines. Les jeunes dont l’éclosion est survenue au cours de la seconde
moitié de l’essai définitif sont nourris avec 25 mg de masse sèche de flocons d’avoine par récipient et par
semaine (excepté après quatre semaines). Là encore, toute suralimentation doit être évitée (voir 5.3).
Au bout d’une durée d’essai totale de six semaines, les jeunes éclos entre temps sont dénombrés par
coloration au rouge bengale (6.12). Des techniques d’extraction humide à froid se sont également révélées
appropriées (voir l’Annexe A). La première méthode est recommandée dans la mesure où l’extraction humide
est difficile à réaliser dans du sol artificiel en raison de la turbidité de l’eau engendrée par les particules
d’argile.
8.5 Substance de référence
Les valeurs de CSEO et/ou CEx d’une substance de référence doivent être déterminées une fois par an ou
parallèlement à la détermination de la toxicité d’une substance expérimentée, afin de garantir que les
conditions d’essai en laboratoire (y compris l’état et la sensibilité des organismes soumis à l’essai) sont
adéquates et n’ont pas subi de variation significative. Un exemple de substance de référence appropriée est
le carbendazime, dont il a été démontré qu'il affecte la mortalité et la reproduction des Enchytraeidae. Il
convient que la CE 50 (reproduction) soit comprise dans la plage 1,2 mg ± 0,8 mg de carbendazime par
kilogramme de sol (masse sèche), en utilisant une conception de type CEx telle que déterminée au cours d’un
essai circulaire international (voir la Bibliographie).
Si la réalisation d’un témoin positif est requise en parallèle de chaque essai individuel, il convient de procéder
de la même façon que pour le témoin non traité (témoin eau ou témoin négatif), c’est-à-dire à raison de huit
réplicats pour une concentration (il convient de tester de préférence deux et trois concentrations couvrant la
plage des concentrations attendues). Il est recommandé que le carbendazime soit la substance de référence
utilisée comme témoin positif. Si ce composé de référence est soumis à essai en tant que formulation liquide,
il convient qu’une concentration de 1,2 mg de matière active par kilogramme de masse sèche provoque une
diminution du nombre de jeunes de l’ordre de (50 ± 20) % par rapport au témoin non traité.
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8.6 Récapitulatif et planification de l’essai
Les différentes étapes de cet essai peuvent être récapitulées comme suit (SA = sol artificiel;
CREmax = capacité maximale de rétention d'eau):
9 Calcul et expression des résultats
9.1 Généralités
Il est recommandé d’impliquer un statisticien dans l’analyse des résultats de cet essai, dans la mesure où la
présente Norme internationale ne définit que de façon limitée les lignes directrices spécifiques des procédures
statistiques (pour une présentation, voir l’Annexe G).
9.2 Essai préliminaire
Le paramètre de mesure (critère d’effet) est la mortalité après 14 j d'exposition. Il convient également de
consigner les changements comportementaux (par exemple, inaptitude d’un ver à s’enfouir dans le sol,
immobilité contre la paroi en verre du récipient d’essai) et morphologiques (par exemple, plaies ouvertes)
affectant les vers. Il convient d'utiliser la méthode des probits pour déterminer la CL 50 (voir la Bibliographie).
Dans le cas où cette méthode est inapplicable (par exemple si moins de trois concentrations produisant une
mortalité partielle sont disponibles), des variantes de cette méthode peuvent être utilisées, telles que les
méthodes de Spearman-Kärber, des moyennes mobiles de Thompson ou d’interpolation simple (par exemple
la moyenne géométrique à partir de la CL 0 et de la CL 100, calculée à l'aide de la racine carrée de
CL 0 ¥ CL 100).
9.3 Essai définitif
9.3.1 Généralités
Le paramètre de mesure (critère d’effet) est la reproduction (nombre de jeunes au cours de la période d'essai)
et la mortalité chez les adultes après 21 j d'exposition. De même que pour l’essai préliminaire, il convient de
noter tous les autres signes d’impact toxique.
Il convient de présenter les données sous forme de tableau, en indiquant le nombre moyen d'adultes et de
jeunes pour chaque concentration. Les essais statistiques ultérieurs seront fonction
a) du choix entre l’approche CSEO ou l'approche CEx, et
b) du fait que les valeurs entre les différents réplicats sont ou non réparties normalement et sont ou non
homogènes en termes de variance.
Il convient de garder à l’esprit que les méthodes statistiques proposées sont inadaptées dans le cas d’effets
hormétiques (voir l’Annexe G pour connaître les détails de la procédure).
9.3.2 Approche CSEO
Pour chaque concentration, une analyse statistique de l’homogénéité et de la normalité des résultats des
différents réplicats doit être effectuée, par exemple selon les méthodes d’essai de Kolmogoroff - Smirnov et
Bartlett, respectivement. En cas de distribution normale et homogène des données, il convient d’effectuer une
analyse statistique appropriée, telle que des tests t multiples de Dunnett ou Williams (α = 0,05, unilatéral). En
cas de non-respect de ces exigences, il est recommandé de recourir à des méthodes non paramétriques,
telles que les tests U de Mann et Whitney ou de Bonferroni.
Si un essai limite a été réalisé et si les conditions préalables (normalité, homogénéité) sont vérifiées, il
convient d’effectuer un test t apparié (Student), ou d’appliquer dans les autres cas le test U de Mann et
Whitney.
9.3.3 Approche CEx
Pour calculer une valeur de CEx, les moyennes des traitements sont utilisées pour effectuer une analyse de
régression après obtention de la relation dose/effet appropriée. Pour obtenir une valeur souhaitée de CEx, on
insère une valeur correspondant à x % de la moyenne des témoins dans l’équation obtenue par analyse de
[15]
régression. Les limites de confiance peuvent être calculées d’après la méthode de Fieller .
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Sinon, les résultats du traitement peuvent être exprimés en pourcentage du résultat du témoin ou en
pourcentage d’inhibitions par rapport au témoin. Il est possible d’ajuster une sigmoïde suivant une loi normale
(logistique) en utilisant une régression de type probits.
10 Validité de l’essai
Les résultats sont considérés comme valables si le témoin satisfait aux conditions suivantes:
il convient que le taux de mortalité n’excède pas 20 % en moyenne à la fin de l’essai préliminaire, ainsi
qu’au bout des trois premières semaines de l’essai définitif;
au cours de l’essai définitif, il convient que le nombre moyen de jeunes soit supérieur à 25 par récipient à
la fin de l’essai, en supposant que 10 vers adultes (c’est-à-dire porteurs d’œufs dans la région du
clitellum) ont été introduits par récipient au début de l’essai;
il convient que le coefficient de variation calculé pour les données concernant la reproduction ne dépasse
pas 50 % à la fin de l’essai définitif.
11 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit faire référence à la présente Norme internationale et inclure un récapitulatif des
résultats obtenus, ainsi que des méthodes et paramètres utilisés durant l’étude. Le rapport d’essai doit
comporter les informations suivantes:
a) une description complète de la conception et des modes opératoires, ainsi qu’une description du sol
artificiel et de l’appareillage d’essai employés;
b) l’identification chimique de la substance expérimentée conformément à la nomenclature de l’IUPAC, le
numéro de fabrication, le numéro de lot, le numéro CAS, la formule structurale et la pureté de la
substance expérimentée;
c) les propriétés de la substance expérimentée et de la substance de référence (par exemple la stabilité
dans le sol);
d) la méthode d’application;
e) l’identification de l’organisme soumis à l’essai et la description des cultures mères;
f) la description des conditions de culture;
g) l’origine de l’organisme soumis à l’essai;
h) la description des conditions d’essai, y compris l’humidité et le pH du sol artificiel au début et à la fin de
l’essai;
i) le taux de mortalité des adultes et le nombre de jeunes à la fin de l’essai préliminaire;
j) le taux de mortalité des adultes au bout de trois semaines et le nombre moyen de jeunes à la fin de
l’essai définitif;
k) la description des symptômes physiques ou pathologiques manifestes ou des chan
...
Questions, Comments and Discussion
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