ISO 7405:1997
(Main)Dentistry — Preclinical evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry — Test methods for dental materials
Dentistry — Preclinical evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry — Test methods for dental materials
Art dentaire — Évaluation préclinique de la biocompatibilité des dispositifs médicaux utilisés en art dentaire — Méthodes d'essai des produits dentaires
La présente Norme internationale prescrit les méthodes d'évaluation des effets biologiques des produits dentaires. Elle comporte des essais de produits pharmacologiques qui font partie intégrante du dispositif soumis à l'essai.
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 7405
First edition
1997-08-l 5
Preclinical evaluation of
Dentistry -
biocompatibility of medical devices used in
dentistry - Test methods for dental
materials
Art dentaire - Évaluation préclinique de la biocompa tibilité des dispositifs
- Méthodes d’essai des matériaux
médicaux utilisés en art dentaire
dentaires
Reference number
ISO 7405: 1997(E)
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ISO 7405: 1997(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard ISO 7405 was prepared by Technical Committee ISO/TC 106, Dentistry, in conjunction with
the World Dental Federation (FDI).
This first edition cancels and replaces ISO/TR 7405:1984, which has been technically revised (see Introduction) and
converted into an International Standard.
Annexes A, B and C of this International Standard are for information only.
0 iso 1997
Ail rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
international Organization for Standardization
Case postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Switzerland
Internet central @ iso.ch
x.400 c=ch; a=4OOnet; p=iso; o=isocs; s=central
Printed in Switzerland
ii
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OIS0 ISO 7405:1997(E)
Introduction
This International Standard concerns the preclinical testing of dental materials in medical devices used in dentistry.
It has been developed from and supersedes ISO/TR 7405:1984, Biologica! evaluation of dental materials, and its
supplements, and should be read in conjunction with the ISO 10993, Bio/ogica/ evaluation of medical devices, series
of standards. This International Standard differs from ISO/TR 7405 in several important ways. Firstly, it contains
details of test methods applicable only to dental materials. Many test methods previously included in ISO/TR 7405
are now included in the ISO 10993 series of standards and details of them have therefore been excluded from this
standard. Secondly, only test methods for which the members of the committee considered there was sufficient
published data have been included. Thirdly, in recommending test methods, the need to minimize the use of
animals was given a high priority.
The annexes are informative, to encourage the development of in vitro and in vivo test methods which Will futther
reduce the use of animals in the preclinical evaluation of the biocompatibility of medical devices used in dentistry.
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Page blanche
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INTERNATIONAL STANDARD o ISO ISO 7405:19$7(E)
Dentistry - Preclinical evaluation of biocompatibility of medical
Test methods for dental materials
devices used in dentistry -
1 Scope
This International Standard specifies methods for the evaluation of biological effects of dental materials. It includes
testing of pharmacological agents that are an integral part of the device under test.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this
International Standard. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are subject to
revision, and parties to agreements based on this International Standard are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent editions of the standards indicated below. Members of IEC and ISO maintain
registers of currently valid International Standards.
ISO 1942-2:1989, Dental vocabulary - Part 2: Dental materials
os0 10993-l:- 11, Biological evaluation of medical devices - Part 1: Evaluation and testing
ISO 10993-2:1992, Bio/ogica/ evaluation of medical devices - Part 2: Animal welfare requirements
- Part 3: Tests for genotoxicity, carcinogenicity and
ISO 10993-3: 1992, Bio/ogica/ evaluation of medical devices
reproductive toxicity
ISO 10993~51992, Biological evaluation of medical devices - Part 5: Tests for cytotoxicity: in vitro methods
Part 6: Tests for local effects after implantation
ISO 10993-6:1994, Bio/ogica/ evaluation of medical devices -
- Part 9: Degradation of materials related to
ISOTTR 10993-9: 1994, Bio/ogica/ evaluation of medical devices
biological testing
Part 10: Tests for irritation and sensitiza tion
ISO 10993-I 0:1995, Bio/ogica/ evaluation of medical devices -
- Part 11: Tests for systemic toxicity
ISO 10993-I I:l 993, Bio/ogica/ evaluation of medical devices
- Part 12: Sample preparation and reference materials
ISO 10993-I 2:-z), Bio/ogica/ evaluation of medical devices
- Part 13: Identification and quantification of
ISO 10993-I 3:-2), Biological evaluation of medical devices
degrada tion products from polymers
ISO 10993-I 4:- 21, Biological evaluation of medical devices - Part 14: Identification and quantifica tion of
degradation products from ceramics
.
ISO 10993-I 5:- 2), Biological evaluation of medical devices - Part 15: Identification and quantification of
degradation products from coated and uncoated metals and alloys
ISO 10993-16:- 2) , Biological evaluation of medical devices - Part 16: Toxicokinetic study design for degrada tion
products and leachables.
1) TO be published. (Revision of ISO 10993~1:1992)
2) TO be published
1
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0 ISO
ISO 7405: 1997(E)
3 Definitions
For the purposes of this International Standard, the definitions given in ISO 10993-1, ISO 1942-2 and the following
definitions apply.
3.1 medical device: Any instrument, apparatus, appliance, material or other article, including software, whether
used alone or in combination, intended by the manufacturer to be used for human beings solely or principally for the
pu rpose of
- diagnosis, prevention, monitoring, treatment or alleviation of disease, injury or handicap;
- investigation, replacement or modification of the anatomy or of a physiological process;
- control of conception;
and which does not achieve its principal intended action in or on the human body by pharmacological,
immunological or metabolic means, but which may be assisted in its function by such means.
NOTE 1 Devices are different from drugs, and their biological evaluation requires a different approach.
NOTE 2 In this International Standard, the term “medical device” is understood to include dental devices and dental materials.
3.2 dental material: Substance or combination of substances specially prepared and/or presented for the use of
authorized persons in the practice of dentistry and/or its associated procedures.
3.3 final product: Medical device in its “as-used” state.
NOTE - Many dental materials are used in a freshly mixed state, and evaluation of the materials in both freshly mixed and
set conditions should be considered.
3.4 positive-control material: Material or substance which, when tested by the procedure described,
demonstrates the suitability of the procedure to yield a reproducible, appropriate positive or reactive response in the
test system.
3.5 negative-control material; reference material: Material or substance which, when tested by the procedure
described, demonstrates the suitability of the procedure to yield a reproducible, appropriate negative, nonreactive or
background response in the test system.
4 Categorization of medical devices used in dentistry
4.1 Categorization by nature of contact
For the purposes of this International Standard, the classification of medical devices used in dentistry is derived
from ISO 109934. If a device or material cari be placed in more than one category, the more rigorous testing
requirements shall apply. With multiple exposures the decision into which category a device is placed shall take into
account the potential cumulative effect, bearing in mind the period of time over which these exposures occur.
4.1 .l Noncontact devices
These devices do not contact the patient’s body directly or indirectly, and are not included in ISO 10993.
4.1.2 Surface-contacting devices
These devices include those that contact the surface of intact or breached skin, the surface of intact or breached
oral mucosa, and those that contact the external surfaces of dental hard tissue, including enamel, dentine and
cementum.
NOTE - Dentine and cementum are considered as surfaces; e.g. after gingival recession.
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0 ISO ISO 7405: 1997(E)
4.1.3 External communicating devices
These devices include dental devices that penetrate and are in contact with oral mucosa, dental hard tissues, dental
pulp tissue or bone, or any combination of these, and are exposed to the oral environment.
4.1.4 Implant devices (see ISO 10993-l)
These devices include dental devices and implants that are pattially or fully embedded within the soft tissue, bone
or pulpodentinal system of the tooth, or any combination of these, and are not exposed to the oral environment.
4.2 Categorization by duration of contact
For the purposes of this International Standard, medical devices used in dentistry are classified by duration of
contact as described in ISO 10993-1, i.e.:
4.2.1 Limited exposure devices
Devices whose single or multiple use or contact is likely to be up to 24 h;
4.2.2 Prolonged exposure devices
Devices whose single, multiple or long-term use or contact is likely to exceed 24 h but not 30 days;
4.2.3 Permanent contact devices
Devices whose single, multiple or long-term use or contact exceeds 30 days.
5 Selection of biological evaluation test
5.1 The general guidance for the selection of biological evaluation tests stated in ISO 10993-I shall apply. Tests
should be selected from the methods described in the ISO 10993 series of standards or in this International
Standard or in both. If tests not included in these International Standards are selected, a statement shall be made
that indicates that the tests described in the International Standards have been considered and shall include a
justification for the selection of other tests.
5.2 The selection of tests and the overall assessment of the results shall be carried out by an expert who has
appropriate chemical, physical and biological data concerning the device and who is aware of the intended
conditions of use.
5.3 The selection of test methods shall be based upon consideration of:
a) the intended use of the material;
b) the tissue(s) which the material may contact;
c) the duration of the contact.
5.4 According to the categorization of the device, tests shall be considered for use as summarized in table 1. This
table indicates which types of test method shall be considered, but not that they are necessarily required to be
carried out. A decision not to carry out a type of test identified in table 1 shall be justified in the test report on each
device. The types of test listed are regarded as a framework for the preclinical evaluation of the biocompatibility of
dental materials. For most types of test, particular methods are identified, although for some devices it is recognized
that alternative methods not included in the International Standards listed may be more appropriate.
3
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Table 1 - Types of test for preclinical evaluation of biocompatibility of dental materials
.
Group III
Group II
I
Pulp Endo-
Nature of Duration Cytotoxicrty Cytotoxicity Cytotoxicitj Acute Acute Acute Subchronic Skin irritation Sensitization Subchronic Genotoxicity Local effects Pulp
systemic systemic and ISO 10993- 10, systemic ISO 10993-3, after and dontic
tests systemic systemic CaPPiw
toxicity - intra- 6.2 and 6.3 toxicity - clause 4 implantation dentine test usage
=4lidti ISO 7405, toxicity - toxicity - toxicity -
Application Oral cutaneous Application ISO 10993-6, usage ISO 7405, test
annex A Oral Oral
application reactivity by inhalation clauses 4, 5 test 6.4 ISO 7405
application application
bY
inhalation 30 10993-l 1, ISO 10993-l 0, ISO 10993-l 1, and 6 ISO 7405, 6.5
ISO 10993-l 1 ISO 7405,
6.7.1 5.2 6.7.3 6.3
6.5.1 annex B ISO 10993-l 1
and 5.4
6.5.3
X X
s 24 h
>24hto
Sufface-
X X X X
contacting 30 days
devices ’
> 30 days
Extemal
communi-
cating
devices
X x
NOTE - X indicates test shall be considered for use.
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0 ISO
ISO 7405: 1997(E)
A justification for the choice of all methods shall be included in the test report of each device. This is of particular
importance when methods not included in this International Standard are used.
For convenience, the types of test have been listed in three groups.
a) Group I
This group comprises in V&O tests of cytotoxicity. General guidance for ~II vitro cytotoxicity tests is presented in
ISO 109935 and shall be followed. Detailed test protocols for the agar diffusion and filter diffusion methods,
appropriate to dental materials, are included in this International Standard. The in vitro cytotoxicity methods include:
1) agar diffusion test (6.1);
2) filter diffusion test (6.2);
3) direct contact or extract tests in accordance with ISO 109935;
4) dentine barrier tests (annex A).
NOTE 1 The order of listing does not indicate any preference for one method over another.
NOTE 2 The use of dentine barrier tests is encouraged and reference to these is presented in annex A.
b) Group II
This group comprises tests in accordance with ISO 10993 and particular tests, where appropriate, are identified:
1) acute systemic toxicity - oral application (ISO 10993-l 1, 6.51 and annex B);
2) acute systemic toxicity - application by inhalation (ISO 10993-l 1, 6.53);
3) subchronic systemic toxicity - oral application (ISO 10993-l 1, 6.7.1);
4) skin irritation and intracutaneous reactivity (ISO 10993-10, 5.2 and 5.4);
5) sensitization (ISO 10993-l 0, 6.2 and 6.3);
6) subchronic systemic toxicity - application by inhalation (ISO 10993-l 1, 6.7.3);
7) genotoxicity (ISO 10993-3, clause 4);
8) local effects after implantation (ISO 10993-6, clauses 4, 5 and 6).
NOTE 1 Alternatives to the LDsO tests are encouraged for acute toxicity testing, and information regarding this point is
presented in annex B.
NOTE 2 In the evaluation of materials following local implantation in accordance with ISO 10993-6, examination of
undemineralized sections, in addition to routine demineralized sections, is recommended.
c) Group Ill
This group comprises tests, specific for dental materials, not referred to in ISO 10993:
1) pulp and dentine usage test (6.3);
2) pulp capping test (6.4);
3) endodontic usage test (6.5).
5.5 A device shall be considered for re-evaluation of its biocompatibility as described in 5.4 when revisions or
modifications to the formula, quality and/or performance specifications are made.
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0 OS0
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6 Test procedures specific to dental materials
6.1 Agar diffusion test
6.1 .l Objective
The test is designed to demonstrate the nonspecific cytotoxicity of test materials after diffusion through agar or
agarose.
6.1.2 Cell line
American Type Culture Collection CCL 1 fibroblasts (NCTC clone 929) shall be used; other cell lines may be used if
reproducibility and accuracy of the response cari be demonstrated.
NOTE - Alternative cell lines are presented in annex C.
6.1.3 Culture medium, reagents and equipment
Use Eagle’s Basa1 Medium containing 2,2 g/l sodium bicarbonate, 3,0 g/l HEPES and 50 ml/1 new-born calf serum.
Prepare a double concentration of Eagle’s Basa1 Medium omitting HEPES and reducing sodium bicarbonate to 1 g/l.
Prepare either 3 % agar or 3 % agarose in distilled water.
Sterilize agar by autoclaving and medium by filtration.
Prepare the vital stain by diluting a stock solution of 1 % aqueous neutral red solution (record source) l/lOO with
0,Ol ml/l phosphate-buffered saline solutions immediately before use. Store neutral red solutions protected from the
light. Use Petri dishes of diameter 50 mm to 100 mm suitable for tissue culture.
6.1.4 Sample preparation
For the preparation of test materials, the manufacturer’s recommended instructions shall be followed. The test shall
be performed on either an extract of the material or the material itself, according to the guidance in ISO 10993-5,
clause 4.
For solid materials, prepare circular test specimens of approximately 5 mm diameter, with a flat surface to ensure
adequate contact with the agar overlay.
For setting materials, insert the freshly mixed material into glass or polytetrafluoroethylene rings of internai diameter
5 mm and height 5 mm. When testing materials in the freshly mixed state, place the rings on the agar prior to
inserting the material. When testing after various setting periods, fill the rings SO that the material is flush with the
rim and allow it to set at (37 f 2) “C and a relative humidity of (90 + 10) % until ready for testing.
For fluid specimens or extracts, imbibe 0,l ml of the fluid on a borosilicate microglass filter disc of 5 mm diameter,
placed on the agar.
NOTE - Suitable discs cari be prepared from prefilters3).
6.1.5 Control specimens
Use control specimens as defined in ISO 10993-5, clause 3.
6.1.6 Test procedure
Culture the cells until they reach the end of the log growth phase. Pipette 10 ml of cell suspension
(2,5 x 105 cells/ml) into a sufficient number of Petri dishes and incubate at (37 + 2) “C in a water-saturated
atmosphere with 5 % (I/v) carbon dioxide for 24 h. Heat the sterile agar to 100 “C in a water bath and allow it to
cool to 48 OC. Mix 1 part of agar with 1 part of double-concentration, freshly prepared nutrient medium and heat to
48 OC. Aspirate the liquid nutrient medium from each Petri dish and replace with 10 ml of freshly prepared
agar/nutrient medium mixture.
3) Millipore prefilter AP2502200 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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0 ISO
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Allow the agar nutrient medium to solidify at room temperature (approximately 30 min). Add 10 ml neutral red
solution and keep dark for 15 min to 20 min. Aspirate excess neutral red solution.
Protect the culture from light in the presence of neutral red, as the cells cari be damaged.
Apply to each dish two samples of test material, one positive control, one negative control and one extraction
medium control if the last was used. Keep the specimens as far as possible from each other and from the wall of the
Petri dish. Incubate at (37 + 2) OC in a water-saturated atmosphere with 5 % (VIV) carbon dioxide for 24 h. Examine
each test material at least in quadruplicate (i.e. two dishes per test material).
6.1.7 Parameters of assessment
The decolorization zone around the test materials and controls shall be assessed using an inverted microscope with
a calibrated screen, and a Decolorization Index and a Lysis Index determined for each specimen in accordance with
the following criteria:
a) Decolorization Index Description
No decolorization detectable
0
1 Decolorization only under the test substance
2 Decolorization zone not greater than 5,0 mm from the test substance
3 Decolorization zone not greater than 10,O mm from the test substance
4 Decolorization zone greater than 10,O mm from the test substance
5 The total culture is decolorized
Description
b) Lysis Index
No cell lysis detectable
0
1 Less than 20 % cell lysis
2 20 % to 40 % cell lysis
3 > 40 % to < 60 % cell lysis
4 60 % to 80 % cell lysis
5 More than 80 % cell lysis
Calculate the median Decolorization Index and Lysis Index for each test material and present the cell response as
follows:
Cell response = Decolorization Index/Lysis Index
If the index values for the four replicates of the test substance differ by more than 2 units in the range 0 to 3, repeat
the test. With indices of 4 and 5, no repetition is necessary. When extracts are tested, subtract the median index of
the extraction medium alone from the median index of the extraction medium containing test substance to obtain the
index for the test substance alone. If the median index for the extraction medium serving as a control is greater than
1, repeat the test using a different extraction medium.
NOTE - For a valid test, an intact cell layer should be found under the negative control.
6.1.8 Assessment of results
All information gathered in the test shall be taken into account in assessing the test results, particularly any
differences in results between the experimental and control groups. The cell response is based on the median
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Decolorization Index and Lysis Index of at least four replicate tests. The cell response is therefore not necessarily
an integer and the scale used for interpreting the cell response should be continuous. A useful way to grade test
materials is presented below.
Scale Cell response Interpretation
0 o/o Noncytotoxic
1 l/l Mildly cytotoxic
2 2/2/ to 313 Moderately cytotoxic
3 414 to 515 Severely cytotoxic
The results of the assessment shall be included in the test report.
6.1.9 Test report
The results shall be submitted in a test report that includes a complete record of all procedures followed, all results
obtained and any other data necessary for the assessment of results as described in 6.1.8. Details of the
preparation and methods of application of the test material, together with the batch number of the material when
appropriate, shall be included.
6.2 Filter diffusion test
6.2.1 Objective
The test is designed to demonstrate the nonspecific cytotoxicity of test materials after diffusion through a cellulose
acetate filter.
6.2.2 Cell line
American Type Culture Collection CCL1 fibroblasts (NCTC clone 929) shall be used; other cell lines may be used if
reproducibility and accuracy of the response cari be demonstrated.
NOTE - Alternative cell lines are presented in annex C.
6.2.3 Culture medium, reagents and equipment
Prepare culture medium and agar for use as an overlayer as described in 6.1.3. Prepare solutions either for
succinate dehydrogenase staining or for nonspecific hydrolase staining.
For succinate dehydrogenase staining, prepare the following stock solutions:
a) succinate solution, 13,6 g sodium succinate in 100 ml phosphate buffer, pH 7,6;
b) nitro blue tetrazolium chloride solution, 100 mg nitro blue tetrazolium chloride in 100 ml phosphate buffer,
PH 76;
C) phenazine methosulfate solution, 4 mg phenazine methosulfate in 10 ml distilled water, fresh.
Prepare a staining solution of 1 ml succinate solution, 9 ml nitro blue tetrazolium chloride solution and 1 ml
phenazine methosulfate solution.
For nonspecific hydrolase staining, prepare a stock solution of fluorescein diacetate consisting of 5 mg fluorescein
diacetate in 1 ml acetone. For use add 20 ~1 of stock solution to 100 ml phosphate-buffered saline. Use Petri dishes
of 50 mm to 100 mm diameter, suitable for tissue culture.
Use cellulose acetate filters, 47 mm diameter, 0,45 prn pore size4).
4) Millipore HAWD 04753, HA TF 047 SO is an example of a suitable product available commercially. This information is
given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this
product.
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6.2.4 Sample preparation
Prepare the samples in accordance with 6.1.4. All samples, including solid materials, shall be placed on the filter
rather than the agar overlay. The mass of the test specimens shall not exceed 3,5 g. For the preparation of test
materials, the manufacturer’s recommended instructions shall be followed.
6.2.5 Control specimens
Use control specimens as defined in ISO 10993-5, clause 3.
6.2.6 Test procedure
Culture the cells until they reach the end of the log growth phase. Place cellulose acetate filters in the bottom of a
sufficient number of Petri dishes and pipette 6 ml of cell suspension (2,5 x 1 O5 cells/ml) into each. Incubate at
(37 * 2) OC in a water-saturated atmosphere with 5 % (KV’) carbon dioxide for 24 h.
Pipette 5 ml of freshly prepared agar nutrient medium mixture (see 6.1.6) kept at 48 “C into a sufficient number of
Petri dishes and allow it to solidify at room temperature. Aspirate the excess nutrient medium from the dishes
containing cellulose acetate filters, wash the filters with phosphate-buffered saline at (37 * 2) “C and place them on
top of the agar, cell side down. Apply three to five test specimens on top of the filter in each dish and incubate for a
further 2 h at (37 f: 2) OC in a water-saturated atmosphere with 5 % (KV) carbon dioxide. Ensure that the specimens
are in close contact with the surface of the filter. If the test material does not show toxicity after 2 h incubation,
repeat the test with 24 h incubation. In each dish include one positive control and one negative control. In addition,
further controls of a filter with a cell monolayer but without test specimens, and of a filter without cells but with test
specimens shall be used. When extracts are tested, a control using the extraction medium alone shall also be used.
Each test specimen shall be examined at least in quadruplicate.
After incubation, remove the test specimens and gently loosen the filter from the agar. Assess cytochemically the
area of reduced cell enzyme activity by method A or method B.
a)Method A
Demonstrate succinate dehydrogenase (enzyme classification 1.3.99.1) according to the method of Barka and
Anderson [1963]. The incubation period is 3 h at (37 * 2) OC. Wash the filter in distilled water and air-dry prior to
measurement.
b)Method B
Demonstrate nonspecific hydrolase by incubation with fluorescein diacetate solution for 30 min at 4 OC. Examine the
filter under ultraviolet light.
6.2.7 Assessment of cell damage
Cell damage shall be assessed either
a) by measuring the area of decolorization (e.g. by means of an image analysis system) or
b) by using the following scale.
Scale Grading assessment Area of decolorization
0 No difference in staining intensity across the filter .
None
1 A zone of reduced staining intensity, or an unstained zone
< 20 mm2
with a diameter less than that (5 mm) of the test specimen
2 An unstained zone 5 mm to 7 mm in diameter
20 mm2 to 40 mm2
3 An unstained zone greater than 7 mm in diameter
> 40 mm2
9
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0 os0
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NOTE - The filters beneath negative control specimens and the control filters should be uniformly stained dark blue (if
succinate dehydrogenase is used) or light green (if nonspecific hydrolase is used). The control filters without cells allow
determination of a possible effect of the test specimen on the filter.
6.2.8 Assessment of results
All information gathered in the test shall be taken into account in assessing the test results, particularly any
differences in results between the experimental and control groups. A useful way to grade test materials is
presented below.
Scale Interpretation
0 Noncytotoxic
1 Mildly cytotoxic
2 Moderately cytotoxic
Severely cytotoxic
3
The results of the assessment shall be included in the test report.
6.2.9 Test report
The results shall be submitted in a test report that includes a complete record of all procedures followed, all results
obtained and any other data necessary for the assessment of results as described in 6.2.8. Details of the
preparation and methods of application of the test material, together with the batch number of the material when
appropriate, shall’ be included.
6.3 Ptilp and dentine usage test
6.3.1 Objective
The test is designed to assess the biocompatibility of dental materials with the dentine and dental pulp. Procedures
necessary for the proposed clinical use of the material are included in the assessment.
6.3.2 Animals and animal welfare
6.3.2.1 Animal welfare shall be in accordance with either:
a) ISO 10993-2, or
b) national regulatory requirements for laboratory animals.
NOTE - The animals should be housed individually and have free access to food and water.
6.3.2.2 Nonrodent mammals of one species shall be used. They shall be of such an age that their dentition
contains intact permanent teeth with closed mature apices.
NOTE 1 Monkeys, dogs, ferrets or miniature pigs are suitable species. Other species may be suitable for special purposes.
NOTE 2 Suitable monkeys, dogs and miniature pigs are those in which all the permanent teeth, other than M3, have erupted.
Suitable ferrets are those in
...
ISO
NORME
INTERNATIONALE 7405
Première édition
1997-08-I 5
Corrigée et réimprimée
1997-I 2-01
Art dentaire - Évaluation préclinique de la
biocompatibilité des dispositifs médicaux
utilisés en art dentaire - Méthodes d’essai
des produits dentaires
Preclinical evaluation of biocompatibility of medical devices
Dentistry -
used in dentistry - Test methods for dental materials
Numéro de référence
ISO 7405: 1997(F)
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ISO 7405:1997(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 7405 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 106, Art dentaire, conjointement
avec la Fédération dentaire internationale (FDI).
Cette première édition annule et remplace I’ISO/TR 74031984, qui a fait l’objet d’une révision technique (voir
Introduction) et a été converti en Norme internationale.
Les annexes A, 6 et C de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d’information.
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
central @ iso.ch
Internet
x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
ii
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ISO 7405:1997(F)
Introduction
La présente Norme internationale concerne les essais précliniques de dispositifs médicaux utilisés en art dentaire.
Développée à partir de I’ISOTTR 74051984, Évaluation biologique des produits dentaires, elle remplace ce
document et ses suppléments, et il convient de la lire conjointement avec la série de normes ISO 10993, Évaluation
biologique des dispositifs médicaux. La présente Norme internationale diffère de I’ISOTTR 7405 à plusieurs égards
importants. Premièrement, elle comporte des détails sur les méthodes d’essai applicables uniquement aux produits
dentaires. De nombreuses méthodes d’essai, préalablement incluses dans I’ISO/TR 7405, figurent désormais dans
la série de normes ISO 10993, dont des détails ont ainsi été exclus de la présente norme. Deuxièmement, seules
les méthodes d’essai, pour lesquelles les membres du comité technique ont considéré qu’il y avait suffisamment de
données publiées, ont été incluses. Troisièmement, dans les recommandations de méthodes d’essai, la nécessité
de limiter l’utilisation d’animaux a fait partie des principales priorités.
Les annexes, de nature informative, sont destinées à encourager le développement de méthodes d’essai in vivo et
in vitro qui limiteront ultérieurement l’utilisation d’animaux dans l’évaluation préclinique de la biocompatibilité des
dispositifs médicaux utilisés en art dentaire.
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NORME INTERNATIONALE o Iso ISO 7405: 1997(F)
Art dentaire - Évaluation préclinique de la biocompatibilité des
dispositifs médicaux utilisés en art dentaire - Méthodes d’essai
des produits dentaires
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale prescrit les méthodes d’évaluation des effets biologiques des produits dentaires.
Elle comporte des essais de produits pharmacologiques qui font partie intégrante du dispositif soumis à l’essai.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
ISO 1942-2:1989, Vocabulaire de /‘a~? dentaire - Par?ie 2: Produits dentaires
A), Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Partie 1: Évaluation et essais
ISO 10993-I :
- Partie 2: Exigences concernant la protection
ISO 10993-2: 1992, Évaluation biologique des dispositifs médicaux
des animaux
ISO 10993-3: 1992, Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Partie 3: Essais concernant la génotoxicité, la
cancérogénicité et la toxicité sur la reproduction
ISO 10993-5: 1992, Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Parfie 5: Essais de cytotoxicité: méthodes in
vitro
ISO 10993-6: 1994, Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Partie 6: Essais concernant les effets locaux
après implantation
- Par?ie 9: Dégradation des matériaux
ISOfTR 10993-9: 1994, Évaluation biologique des dispositifs médicaux
relative à l’évaluation biologique
Partie 10: Essais d’irritation et de
ISO 10993-I 0: 1995, Évaluation biologique des dispositifs médicaux -
sensibilisation
- Partie II: Essais de toxicité systémique
ISO 10993-I I:l 993, Évaluation biologique des dispositifs médicaux
ISO 10993-l 2:- 2) , Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Parfie 12: Préparation des échantillons et
matériaux de référence
ISO 10993-l 3:- 2)) Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Partie 13: Identification et quantifica tion de
produits de dégradation de polymères
1) À publier. (Révision de I’ISO 10993-l :1992)
2) À publier.
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ISO 7405: 1997(F)
Partie 14: Identification et quantifica tion de
ISO 10993-I 4:- 21, Évaluation biologique des dispositifs médicaux -
produits de dégradation de céramiques
- Partie 15: Identification et quan tifica tion de
ISO 10993-I 5:- 21, Évaluation biologique des dispositifs médicaux
produits de dégradation de métaux et alliages revêtus et non revêtus
ISO 10993-I 6:- 3, Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Partie 16: Étude toxicocinétique pour produits
de dégradation et de solution
3 Définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les définitions données dans I’ISO 10993-1, I’ISO 1942-2 et
les définitions suivantes s’appliquent.
3.1 dispositif médical: Tout instrument, appareillage, application, produit ou autre article, y compris le logiciel’
utilisé seul ou en combinaison, destiné, selon le fabricant, à être utilisé uniquement pour l’homme ou principalement
pour répondre aux besoins
- de diagnostic, prévention, surveillance, traitement ou soulagement d’un mal, d’une blessure ou d’un handicap,
- de recherche, remplacement ou modification de l’anatomie ou d’un processus physiologique,
- de contrôle de la conception,
et dont l’action principale supposée n’est pas réalisée sur le corps humain, ni à l’intérieur de celui-ci, par des
moyens pharmacologiques, immunologiques ou métaboliques, mais qui peut être aidé dans sa fonction par de tels
moyens.
NOTE 1 Les dispositifs sont différents des médicaments, et leur évaluation biologique nécessite une approche différente.
produits utilisés en
NOTE 2 Dans la présente Norme internationale, le <> comprend les dispositifs et
art dentaire.
3.2 produit dentaire: Substance ou combinaison de substances spécialement préparée(s) et/ou présentée(s)
pour utilisation par les personnes autorisées dans la pratique de l’art dentaire et/ou de techniques associées.
3.3 produit final: Dispositif médical à l’état <>.
NOTE - De nombre utilisés à l’état fraîchement mélangé, et il convient de prendre en
ux produits dentaires sont
l’évaluation
considération des produits à la fois à l’état fraîchement mélangé et à l’état figé.
3.4 produit de contrôle positif: Produit ou substance qui, dans les conditions d’essai de la méthode décrite,
démontre l’aptitude de la méthode à produire un résultat reproductible, positif ou réactif dans le système d’essai.
3.5 produit de contrôle négatif; produit de référence: Produit ou substance qui, dans les conditions d’essai de
la méthode décrite, démontre l’aptitude de la méthode à produire un résultat reproductible respectivement négatif,
non réactif ou en arrière-plan dans le système d’essai.
4 Catégorisation des dispositifs médicaux utilisés en art dentaire
4.1 Catégorisation en fonction de la nature du contact
Pour les besoins de la présente Norme internationale, la catégorisation des dispositifs médicaux utilisés en art
dentaire est extraite de I’ISO 10993-I. Lorsqu’un dispositif ou un produit peut être placé dans plusieurs catégories
de durée, les prescriptions d’essai les plus rigoureuses s’appliquent. En cas d’exposition multiple, il convient de tenir
compte de l’effet cumulé potentiel lors de la décision de placement d’un dispositif dans une catégorie, en gardant à
l’esprit la durée pendant laquelle cette exposition intervient.
2
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ISO 7405: 1997(F)
4.1 A Dispositifs sans contact
Ces dispositifs n’entrent pas en contact direct ou indirect avec le corps du patient, et ne sont pas inclus dans
I’ISO 10993.
4.1.2 Dispositifs de contact par surface
Ces dispositifs comprennent les dispositifs dentaires mis au contact d’une surface de peau intacte ou fissurée et
des muqueuses vestibulaires intactes ou fissurées, ainsi que les dispositifs mis au contact des surfaces externes
d’un tissu dentaire dur, y compris l’émail, la dentine et l’amalgame.
La dentine et l’amalgame sont considérés comme des surfaces, par exemple après récession de la gencive.
NOTE -
4.1.3 Dispositifs de communication externe
Ces dispositifs comprennent les dispositifs dentaires qui pénètrent et sont en contact avec les muqueuses
vestibulaires, les tissus dentaires durs, les tissus dentaires pulpaires ou l’os, ou avec une combinaison quelconque
de ces éléments, et sont exposés à l’environnement buccal.
4.1.4 Dispositifs d’implants (voir I’ISO 10993-l)
Ces dispositifs comprennent les dispositifs et implants dentaires qui sont partiellement ou totalement intégrés aux
tissus mous, à l’os et au système pulpo-dentinaire de la dent, ou à une combinaison quelconque de ces éléments,
et qui ne sont pas exposés à l’environnement buccal.
4.2 Catégorisation en fonction de la durée du contact
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les dispositifs médicaux utilisés en art dentaire sont classés
en fonction de la durée de contact, telle que décrite dans I’ISO 10993-1, soit:
4.2.1 Dispositifs à exposition limitée
Dispositifs dont l’utilisation simple ou multiple, ou dont le contact, est susceptible d’aller jusqu’à 24 h.
4.2.2 Dispositifs à exposition prolongée
Dispositifs dont l’utilisation simple, multiple ou à long terme, ou dont le contact, est susceptible de dépasser 24 h
mais sans aller au-delà de 30 jours.
4.2.3 Dispositifs à contact permanent
Dispositifs dont l’utilisation simple, multiple ou à long terme, ou dont le contact, dépasse 30 jours.
5 S&ection des essais d’évaluation biologique
5.1 Les’ recommandations générales concernant la sélection des essais d’évaluation biologique, établies dans
I’ISO 109W-1, s’appliquent. II convient de sélectionner les essais à partir des méthodes décrites dans la série de
normes ISO 10993, dans la présente Norme internationale, ou dans les deux. Si des essais ne figurant pas dans
ces Normes internationales sont sélectionnés, une déclaration selon laquelle les essais décrits dans ces Normes
internationales ont été pris en compte doit être rédigée et doit inclure une justification relative à la sélection d’autres
essais.
5.2 La sélection des essais et l’évaluation globale des résultats doivent être effectuées par un expert disposant de
données chimiques, physiques et biologiques appropriées relatives au dispositif, et qui a connaissance des
conditions d’utilisation normales.
5.3 La sélection des méthodes d’essai doit être basée sur la prise en compte de
a) l’utilisation normale du produit;
b) le(s) tissu(s) avec le(s)q le produit peut entrer en contact;
c) la durée du contact.
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ISO 7405:1997(F)
5.4 En fonction de la catégorie à laquelle appartient le dispositif, les essais doivent être utilisés d’après les
indications résumées dans le tableau 1. Ce tableau indique quels types de méthodes d’essai considérer sans qu’il
faille nécessairement les exiger. La décision de ne pas effectuer un type d’essai identifié dans le tableau 1 doit être
justifiée dans le rapport relatif à chaque dispositif. Les types d’essais indiqués sont considérés dans le cadre d’une
évaluation préclinique de la biocompatibilité des produits dentaires. Pour la plupart des types d’essai, des méthodes
particulières sont identifiées bien que, pour certains dispositifs, il soit admis que des variantes de méthodes,
figurant dans ces Normes internationales, puissent être mieux appropriées. Une justification du choix de la méthode
doit figurer dans le rapport concernant chaque dispositif, ce qui revêt une importance particulière en cas d’utilisation
de méthodes ne figurant pas dans la présente Norme internationale.
Pour des raison pratiques, les différents types d’essais ont été répartis en trois groupes,
a) Groupe I
Ce groupe comprend les essais in vitro de cytotoxicité. L’ISO 109935 présente des recommandations générales
qui doivent être suivies en matière d’essais in vitro de cytotoxicité. La présente Norme internationale comporte des
protocoles d’essai détaillés sur les méthodes de diffusion par agar-agar et par filtre, adaptées aux produits
dentaires. Les méthodes de cytotoxicité in vitro comprennent
1) l’essai de diffusion sur agar-agar (6.1);
2) l’essai de diffusion sur filtre (6.2);
3) les essais en contact direct ou à partir d’extraits, conformément à I’ISO 109935;
4) les essais de la barrière dentinaire (annexe A).
L’ordre de la liste n’indique aucune préférence pour une méthode plutôt qu’une autre.
NOTE 1
NOTE 2 L’utilisation d’essais de la barrière dentinaire est encouragée, et il y est fait référence dans l’annexe A.
b) Groupe II
Ce groupe comprend des essais conformes à I’ISO 10993 et des essais particuliers sont, le cas échéant, identifiés:
1) toxicité systémique aiguë - Application orale (ISO 10993-I 1, 6.51, et annexe B de la présente Norme
internationale);
2) toxicité systémique aiguë -
Application par inhalation (ISO 10993-I 1, 6.5.3);
3) toxicité systémique subchronique
- Application orale (ISO 10993-I 1, 6.7.1);
4) irritation de la peau et réactivité intracutanée (ISO 10993-10, 5.2 et 5.4);
5) sensibilisation (ISO 10993-10, 6.2 et 6.3);
6) toxicité systémique subchronique - Application par inhalation (ISO 10993-I 1, 6.7.3);
7) génotoxicité (ISO 10993-3, article 4);
8) effets locaux après implantation (ISO 10993-6, articles 4, 5 et 6).
NOTE 1 L’utilisation des essais DLsO pour les de toxicité aiguë est encouragée, et une information concernant cet
est présentée à l’annexe B.
aspect
NOTE 2 Pour l’évaluation des produits après implantation locale conformément à I’ISO 10993-6, il est conseillé de procéder à
l’examen de portions non déminéralisées, en plus de l’examen de routine des portions déminéralisées.
4
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Tableau 1 - Types d’essai pour l’évaluation préclinique de la biocompatibilité des produits dentaires
Groupe I Groupe II Groupe Ill
T
Nature Durée Essais Essais Essais Toxicité Toxicité Toxicité Toxicité Irritation de Sensi bi- Toxicité Génotoxicité Effets Essai Essai de Essai
du du
de de de systémique systémique systémique systémique la peau lisation systémique ISO 10993-3, locaux d’usage coiff age d’usage
contact contact cytotoxicité cytotoxicité cytotoxicité aiguë - aiguë - aiguë - sub- et ISO 10993-10 sub- article 4 après de la pulpaire endo-
ISO 7405, ISO 10993-5 ISO 7405, Application Application Application chronique - réactivité 6.2 et 6.3 chronique - implantation ISO 7405, dontique
pulpe
6.1 et 6.2 annexe A orale orale Application intracutanée Application I SO 10993-6, et de la 6.4 ISO 7405
Par
ISO 10993-I 1 ISO 7405, inhalation orale ISO 10993-10 articles 4, 5 dentine 6.5
Par
65.1 annexe B ISO 10993-l 1 ISO 10993-I 1 j inhalation et 6 SO 7405
5.2
6.5.3 6.7.1 et 5.4 ISO 10993-l 1, 6.3
6.7.3
s 24 h x X
Dispositifs
>24hà X X X
X X X
au contact
30 jours
d’une
surface
> 30 jours X X X X X X X
+-
s 24 h X X X X X X X X
X
Dispositifs
communi-
>24hà X X X X
X X X X X X X
quant
30 jours
avec
l’extérieur
> 30 jours X X X X X X X X X X X
s
s 24 h X X X X X X
Dispositifs
>24hà X X X
X X X X X X
implan-
30 jours
tables
> 30 jours X X X X X X
X X X
NOTE - Les X indiquent les essais à considérer.
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c) Groupe III
Ce groupe comprend les essais propres aux produits dentaires auxquels il n’est pas fait référence dans
I’ISO 10993:
1) essai d’usage de la pulpe et de la dentine (6.3);
essai de coiffage pulpaire et de pulpotomie (6.4);
2)
essai d’usage endodontique (6.5).
3)
5.5 II est nécessaire de prendre en considération la réévaluation de la biocompatibilité d’un dispositif, décrite en
5.4, en cas de révisions ou de modifications de sa formule, de sa qualité et/ou de ses performances.
6 Méthodes d’essai spécifiques aux produits dentaires
6.1 Essai de diffusion sur agar-agar
6.1 .l Objectif
L’essai a été conçu afin de démontrer la cytotoxicité non spécifique de produits d’essai après diffusion par gélose
(agar-agar) et/ou composé d’agar-agar.
6.1.2 Lignée cellulaire
Utiliser des cultures American Type Culture Collection CCL 1 fibroblasts (NCTC clone 929); d’autres lignées
cellulaires peuvent être utilisées, s’il est possible d’apporter la preuve de la reproductibilité et de la précision de leur
réaction.
NOTE - Des variantes de lignées cellulaires sont présentées dans l’annexe C.
6.1.3 Milieu de culture, réactifs et matériel
Utiliser un milieu Eagle’s Basa1 contenant 2,2 g/l de bicarbonate de sodium, 3,0 g/l de HEPES et 50 ml/1 de sérum
de veau nouveau-né. Préparer une double concentration de milieu Eagle’s Basai, à ceci près que la concentration
de I’HEPES est réduite à 1 g/l. Préparer soit 3 % de gélose (agar-agar), soit 3 % de composé d’agar-agar dans de
l’eau distillée.
Procéder à la stérilisation de I’agar-agar en autoclave et à celle du milieu par filtration.
Préparer la coloration vitale en diluant une solution mère à 1 % de solution aqueuse de rouge neutre 100 fois
(source d’enregistrement) avec 0,Ol ml/1 de solution saline tamponnée au phosphate immédiatement avant
l’utilisation. Entreposer les solutions de rouge neutre en les protégeant de la lumière. Utiliser des boîtes de Pétri de
diamètre compris entre 50 mm et 100 mm, adaptées à la culture des tissus.
6.1.4 Préparation d’un échantillon
Pour la préparation des produits d’essai, les instructions recommandées par le fabricant doivent être observées.
L’essai doit être effectué ou bien sur un extrait de produit, ou bien sur le produit lui-même, conformément aux
indications de I’ISO 10993-5, article 4.
Dans le cas des produits solides, préparer des échantillons circulaires d’environ 5 mm de diamètre et de surface
plane, permettant d’assurer un contact adéquat avec la surimposition d’agar-agar.
Dans le cas des produits faisant prise, insérer le produit fraîchement mélangé dans des anneaux en verre ou en
polytétrafluoroéthylène de 5 mm de diamètre intérieur et de 5 mm de hauteur. Lorsque les produits sont soumis à
l’essai à l’état fraîchement mélangé, placer les anneaux sur I’agar-agar avant d’insérer le produit. Lors d’essais suite
à différentes périodes de prise, remplir les anneaux de façon que le produit soit égalisé au bord et laisser reposer à
(37 + 2) OC, avec une humidité relative de (90 + 10) %, jusqu’à ce que le produit soit prêt pour les essais.
-
Dans le cas d’échantillons ou d’extraits fluides, imbiber 0,l ml de fluide sur un disque filtrant en verre de borosilicate
de 5 mm de diamètre, placé sur I’agar-agar.
6
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NOTE - Des disques appropriés peuvent être préparés à partir de préfiltres Millipore AP25022003).
6.1.5 Échantillons témoins
Utiliser des échantillons témoins tels que définis dans I’ISO 10993-5, article 3.
6.1.6 Mode opératoire
Cultiver les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent la fin de la phase de croissance logarithmique. Introduire à la
pipette 10 ml de suspension cellulaire (2,5 x 105 cellules/ml) dans un nombre suffisant de boîtes de Pétri et laisser
incuber à (37 k 2) OC dans une atmosphère saturée d’eau avec 5 % (WV) de dioxyde de carbone pendant 24 h.
Faire chauffer I’agar-agar stérile à 100 OC dans un bain-marie et le laisser refroidir à 48 OC. Mélanger une part
d’agar-agar à une part de milieu nutritif à double concentration, fraîchement préparé, et chauffer à 48 OC. Aspirer le
milieu nutritif liquide de chaque boîte de Pétri et le remplacer par 10 ml de mélange agar-agar/milieu nutritif
fraîchement préparé.
Laisser le mélange agar-agar/milieu nutritif se solidifier à température ambiante (environ 30 min). Ajouter 10 ml de
solution de rouge neutre et tenir dans l’obscurité durant 15 min à 20 min. Aspirer le surplus de solution de rouge
neutre.
Protéger la culture de la lumière en présence de rouge neutre, les cellules pouvant être endommagées.
Appliquer à chaque boîte deux échantillons de produit d’essai, un contrôle positif, un contrôle négatif et un contrôle
de milieu d’extraction, si ce dernier a été utilisé. Éloigner le plus possible les échantillons les uns des autres, ainsi
que des parois de la boîte de Pétri. Laisser incuber à (37 * 2) OC dans une atmosphère saturée d’eau avec
5 % (WV) de dioxyde de carbone pendant 24 h. Examiner chaque produit d’essai au moins quatre fois (c’est-à-dire
deux boîtes par produit d’essai).
6.1.7 Paramètres d’évaluation
La zone de décoloration située autour des produits et des témoins d’essai doit être vérifiée à l’aide d’un microscope
inversé à écran calibré, un indice de décoloration et un indice de lyse étant déterminés pour chaque échantillon
selon les critères suivants:
a) Indice de décoloration Description
0 Aucune décoloration détectable
1 Décoloration uniquement de la substance d’essai
2 Zone de décoloration inférieure ou égale à 5,0 mm de la substance d’essai
3 Zone de décoloration inférieure ou égale à 10,O mm de la substance d’essai
4 Zone de décoloration supérieure à 10,O mm de la substance d’essai
5 Totalité de la culture décolorée
b) Indice de lyse Description
0 Aucune lyse de cellule détectable
1 Moins de 20 % de lyse de cellule
2 20 % à 40 % de lyse de cellule
3 > 40 % à c 60 % de lyse de cellule
4 60 % à 80 % de lyse de cellule
5 Plus de 80 % de lyse de cellule
3) Les préfiltres Millipore AP2502200 sont un exemple de produits appropriés disponibles dans le commerce. Cette
information est donnée par commodité aux utilisateurs de la présente Norme internationale et ne saurait engager la
responsabilité de I’ISO sur ce produit.
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Calculer l’indice de décoloration et l’indice de lyse moyens de chaque produit d’essai et présenter la réaction
cellulaire comme suit:
Réaction cellulaire = indice de décoloration/indice de lyse
Si les valeurs d’indice des quatre échantillons du produit d’essai diffèrent de plus de deux unités dans la plage de 0
à 3, reproduire l’essai. Pour les indices 4 et 5, il n’est pas nécessaire de reproduire l’essai. Lors de la soumission
des extraits à l’essai, soustraire de l’indice moyen du milieu d’extraction contenant le produit d’essai, l’indice moyen
du milieu d’extraction seul, afin d’obtenir l’indice de produit d’essai seul. Si l’indice moyen du milieu d’extraction
utilisé comme contrôle est supérieur à 1, reproduire l’essai en utilisant un milieu d’extraction différent.
NOTE - Pour que l’essai soit valable, il convient de trouver une couche de cellules intactes sous le contrôle négatif.
6.1.8 Évaluation des résultats
Toute information rassemblée durant l’essai doit être prise en compte dans l’évaluation des résultats d’essai, en
particulier toute différence de résultat entre les groupes expérimentaux et les groupes témoins. La réaction
cellulaire repose sur l’indice de décoloration moyen et sur l’indice de lyse d’au moins quatre essais répétés. La
réaction cellulaire n’est donc pas nécessairement un nombre entier, et il convient que l’échelle employée pour son
interprétation soit continue. Un mode de graduation des produits d’essai est présenté ci-après.
Échelle Réponse de cellule Interprétation
0 o/o Non cytotoxique
1 Ill Légèrement cytotoxique
2 212 à 313 Moyennement cytotoxique
3 414 à 515 Fortement cytotoxique
Les résultats de l’évaluation doivent être mentionnés dans le rapport d’essai.
6.1.9 Rapport d’essai
Les résultats doivent figurer dans un rapport d’essai, qui comporte la liste complète des modes opératoires suivis,
tous les résultats obtenus et toute autre information nécessaire à l’évaluation des résultats, comme indiqué en
6.1.8. Des détails relatifs à la préparation et aux méthodes d’application du produit d’essai, ainsi que le numéro du
lot du produit doivent y figurer, le cas échéant.
6.2 Essai par diffusion sur filtre
6.2.1 Objectif
L’essai a pour but de démontrer la cytotoxicité non spécifique des produits d’essai après diffusion dans un filtre en
acétate de cellulose.
6.2.2 Lignée cellulaire
Utiliser des cultures American Type Culture Collection CCL1 fibroblasts (NCTC clone 929); d’autres lignées
cellulaires peuvent être utilisées, s’il est possible d’apporter la preuve de la reproductibilité et de la précision de leur
réaction.
NOTE - Des variantes de lignées cellulaires sont présentées dans l’annexe C.
6.2.3 Milieu de culture, réactifs et matériel
Préparer un milieu de culture et un agar-agar à utiliser en surimposition, tel que décrit en 6.1.3. Préparer les
solutions soit pour une coloration au succinate déshydrogénée, soit pour une coloration hydrolase non spécifique.
8
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Pour une coloration au succinate déshydrogénée, préparer la solution mère suivante:
a) solution au succinate, contenant 13,6 g de succinate de sodium dans un tampon de 100 ml de phosphate, de
pH 76;
b) solution de chlorure de tétrazole de bleu azoté, contenant 100 mg de chlorure de tétrazole de bleu azoté
dans un tampon de 100 ml de phosphate, de pH 7,6;
c) solution de méthosulfate de phénazine, contenant 4 mg de solution de méthosulfate de phénazine dans 10 ml
d’eau distillée fraîche.
Préparer une solution de coloration contenant 1 ml de solution au succinate, 9 ml de solution de chlorure de
tétrazole de bleu azoté, et 1 ml de solution de méthosulfate de phénazine.
Pour la coloration hydrolase non spécifique, préparer une solution mère de diacétate fluorescent, contenant 5 mg
de diacétate fluorescent dans 1 ml d’acétone. L’utiliser en ajoutant 20 ~1 de solution mère à une solution saline
tampon de phosphate de 100 ml. Utiliser des boîtes de Pétri de diamètre compris entre 50 mm et 100 mm,
adaptées à la culture des tissus.
Utiliser des filtres en acétate de cellulose, de 47 mm de diamètre, de 0,45 prn de taille de pore&
6.2.4 Préparation des échantillons
Préparer les échantillons conformément à 6.1.4. La totalité des échantillons, y compris les produits solides, doivent
être disposés sur le filtre en acétate de cellulose plutôt que sur la surimposition d’agar-agar. La masse des
échantillons ne doit pas dépasser 3,5 g. Suivre, pour effectuer la préparation des produits d’essai, les instructions
recommandées par le fabricant.
6.2.5 Échantillons témoins
Utiliser les échantillons témoins tels que définis dans I’ISO 10993-5, article 3.
6.2.6 Mode opératoire
Cultiver les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent la fin de la phase de croissance logarithmique. Placer les filtres en
acétate de cellulose au fond de boîtes de Pétri en quantité suffisante, et introduire à la pipette 6 ml de suspension
cellulaire (2,5 x 105 cellules/ml). Laisser incuber à (37 ir 2) OC dans une atmosphère saturée d’eau avec 5 % (WV)
de dioxyde de carbone, pendant 24 h.
Introduire à la pipette 5 ml de mélange agar-agar/milieu nutritif (voir 6.1.6) maintenu à 48 “C dans des boîtes de
Pétri en quantité suffisante, et laisser solidifier à la température ambiante. Aspirer l’excédent de milieu nutritif dans
les boîtes contenant des filtres en acétate de cellulose, laver les filtres dans une solution saline tamponnée de
phosphate à (37 * 2) OC et les placer par-dessus l’agar-agar, côté cellule vers le bas. Appliquer trois à cinq
échantillons sur le filt
...
ISO
NORME
INTERNATIONALE 7405
Première édition
1997-08-I 5
Corrigée et réimprimée
1997-I 2-01
Art dentaire - Évaluation préclinique de la
biocompatibilité des dispositifs médicaux
utilisés en art dentaire - Méthodes d’essai
des produits dentaires
Preclinical evaluation of biocompatibility of medical devices
Dentistry -
used in dentistry - Test methods for dental materials
Numéro de référence
ISO 7405: 1997(F)
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ISO 7405:1997(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 7405 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 106, Art dentaire, conjointement
avec la Fédération dentaire internationale (FDI).
Cette première édition annule et remplace I’ISO/TR 74031984, qui a fait l’objet d’une révision technique (voir
Introduction) et a été converti en Norme internationale.
Les annexes A, 6 et C de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d’information.
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
central @ iso.ch
Internet
x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
ii
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0 ISO
ISO 7405:1997(F)
Introduction
La présente Norme internationale concerne les essais précliniques de dispositifs médicaux utilisés en art dentaire.
Développée à partir de I’ISOTTR 74051984, Évaluation biologique des produits dentaires, elle remplace ce
document et ses suppléments, et il convient de la lire conjointement avec la série de normes ISO 10993, Évaluation
biologique des dispositifs médicaux. La présente Norme internationale diffère de I’ISOTTR 7405 à plusieurs égards
importants. Premièrement, elle comporte des détails sur les méthodes d’essai applicables uniquement aux produits
dentaires. De nombreuses méthodes d’essai, préalablement incluses dans I’ISO/TR 7405, figurent désormais dans
la série de normes ISO 10993, dont des détails ont ainsi été exclus de la présente norme. Deuxièmement, seules
les méthodes d’essai, pour lesquelles les membres du comité technique ont considéré qu’il y avait suffisamment de
données publiées, ont été incluses. Troisièmement, dans les recommandations de méthodes d’essai, la nécessité
de limiter l’utilisation d’animaux a fait partie des principales priorités.
Les annexes, de nature informative, sont destinées à encourager le développement de méthodes d’essai in vivo et
in vitro qui limiteront ultérieurement l’utilisation d’animaux dans l’évaluation préclinique de la biocompatibilité des
dispositifs médicaux utilisés en art dentaire.
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Page blanche
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NORME INTERNATIONALE o Iso ISO 7405: 1997(F)
Art dentaire - Évaluation préclinique de la biocompatibilité des
dispositifs médicaux utilisés en art dentaire - Méthodes d’essai
des produits dentaires
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale prescrit les méthodes d’évaluation des effets biologiques des produits dentaires.
Elle comporte des essais de produits pharmacologiques qui font partie intégrante du dispositif soumis à l’essai.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
ISO 1942-2:1989, Vocabulaire de /‘a~? dentaire - Par?ie 2: Produits dentaires
A), Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Partie 1: Évaluation et essais
ISO 10993-I :
- Partie 2: Exigences concernant la protection
ISO 10993-2: 1992, Évaluation biologique des dispositifs médicaux
des animaux
ISO 10993-3: 1992, Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Partie 3: Essais concernant la génotoxicité, la
cancérogénicité et la toxicité sur la reproduction
ISO 10993-5: 1992, Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Parfie 5: Essais de cytotoxicité: méthodes in
vitro
ISO 10993-6: 1994, Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Partie 6: Essais concernant les effets locaux
après implantation
- Par?ie 9: Dégradation des matériaux
ISOfTR 10993-9: 1994, Évaluation biologique des dispositifs médicaux
relative à l’évaluation biologique
Partie 10: Essais d’irritation et de
ISO 10993-I 0: 1995, Évaluation biologique des dispositifs médicaux -
sensibilisation
- Partie II: Essais de toxicité systémique
ISO 10993-I I:l 993, Évaluation biologique des dispositifs médicaux
ISO 10993-l 2:- 2) , Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Parfie 12: Préparation des échantillons et
matériaux de référence
ISO 10993-l 3:- 2)) Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Partie 13: Identification et quantifica tion de
produits de dégradation de polymères
1) À publier. (Révision de I’ISO 10993-l :1992)
2) À publier.
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ISO 7405: 1997(F)
Partie 14: Identification et quantifica tion de
ISO 10993-I 4:- 21, Évaluation biologique des dispositifs médicaux -
produits de dégradation de céramiques
- Partie 15: Identification et quan tifica tion de
ISO 10993-I 5:- 21, Évaluation biologique des dispositifs médicaux
produits de dégradation de métaux et alliages revêtus et non revêtus
ISO 10993-I 6:- 3, Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Partie 16: Étude toxicocinétique pour produits
de dégradation et de solution
3 Définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les définitions données dans I’ISO 10993-1, I’ISO 1942-2 et
les définitions suivantes s’appliquent.
3.1 dispositif médical: Tout instrument, appareillage, application, produit ou autre article, y compris le logiciel’
utilisé seul ou en combinaison, destiné, selon le fabricant, à être utilisé uniquement pour l’homme ou principalement
pour répondre aux besoins
- de diagnostic, prévention, surveillance, traitement ou soulagement d’un mal, d’une blessure ou d’un handicap,
- de recherche, remplacement ou modification de l’anatomie ou d’un processus physiologique,
- de contrôle de la conception,
et dont l’action principale supposée n’est pas réalisée sur le corps humain, ni à l’intérieur de celui-ci, par des
moyens pharmacologiques, immunologiques ou métaboliques, mais qui peut être aidé dans sa fonction par de tels
moyens.
NOTE 1 Les dispositifs sont différents des médicaments, et leur évaluation biologique nécessite une approche différente.
produits utilisés en
NOTE 2 Dans la présente Norme internationale, le <> comprend les dispositifs et
art dentaire.
3.2 produit dentaire: Substance ou combinaison de substances spécialement préparée(s) et/ou présentée(s)
pour utilisation par les personnes autorisées dans la pratique de l’art dentaire et/ou de techniques associées.
3.3 produit final: Dispositif médical à l’état <>.
NOTE - De nombre utilisés à l’état fraîchement mélangé, et il convient de prendre en
ux produits dentaires sont
l’évaluation
considération des produits à la fois à l’état fraîchement mélangé et à l’état figé.
3.4 produit de contrôle positif: Produit ou substance qui, dans les conditions d’essai de la méthode décrite,
démontre l’aptitude de la méthode à produire un résultat reproductible, positif ou réactif dans le système d’essai.
3.5 produit de contrôle négatif; produit de référence: Produit ou substance qui, dans les conditions d’essai de
la méthode décrite, démontre l’aptitude de la méthode à produire un résultat reproductible respectivement négatif,
non réactif ou en arrière-plan dans le système d’essai.
4 Catégorisation des dispositifs médicaux utilisés en art dentaire
4.1 Catégorisation en fonction de la nature du contact
Pour les besoins de la présente Norme internationale, la catégorisation des dispositifs médicaux utilisés en art
dentaire est extraite de I’ISO 10993-I. Lorsqu’un dispositif ou un produit peut être placé dans plusieurs catégories
de durée, les prescriptions d’essai les plus rigoureuses s’appliquent. En cas d’exposition multiple, il convient de tenir
compte de l’effet cumulé potentiel lors de la décision de placement d’un dispositif dans une catégorie, en gardant à
l’esprit la durée pendant laquelle cette exposition intervient.
2
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0 ISO
ISO 7405: 1997(F)
4.1 A Dispositifs sans contact
Ces dispositifs n’entrent pas en contact direct ou indirect avec le corps du patient, et ne sont pas inclus dans
I’ISO 10993.
4.1.2 Dispositifs de contact par surface
Ces dispositifs comprennent les dispositifs dentaires mis au contact d’une surface de peau intacte ou fissurée et
des muqueuses vestibulaires intactes ou fissurées, ainsi que les dispositifs mis au contact des surfaces externes
d’un tissu dentaire dur, y compris l’émail, la dentine et l’amalgame.
La dentine et l’amalgame sont considérés comme des surfaces, par exemple après récession de la gencive.
NOTE -
4.1.3 Dispositifs de communication externe
Ces dispositifs comprennent les dispositifs dentaires qui pénètrent et sont en contact avec les muqueuses
vestibulaires, les tissus dentaires durs, les tissus dentaires pulpaires ou l’os, ou avec une combinaison quelconque
de ces éléments, et sont exposés à l’environnement buccal.
4.1.4 Dispositifs d’implants (voir I’ISO 10993-l)
Ces dispositifs comprennent les dispositifs et implants dentaires qui sont partiellement ou totalement intégrés aux
tissus mous, à l’os et au système pulpo-dentinaire de la dent, ou à une combinaison quelconque de ces éléments,
et qui ne sont pas exposés à l’environnement buccal.
4.2 Catégorisation en fonction de la durée du contact
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les dispositifs médicaux utilisés en art dentaire sont classés
en fonction de la durée de contact, telle que décrite dans I’ISO 10993-1, soit:
4.2.1 Dispositifs à exposition limitée
Dispositifs dont l’utilisation simple ou multiple, ou dont le contact, est susceptible d’aller jusqu’à 24 h.
4.2.2 Dispositifs à exposition prolongée
Dispositifs dont l’utilisation simple, multiple ou à long terme, ou dont le contact, est susceptible de dépasser 24 h
mais sans aller au-delà de 30 jours.
4.2.3 Dispositifs à contact permanent
Dispositifs dont l’utilisation simple, multiple ou à long terme, ou dont le contact, dépasse 30 jours.
5 S&ection des essais d’évaluation biologique
5.1 Les’ recommandations générales concernant la sélection des essais d’évaluation biologique, établies dans
I’ISO 109W-1, s’appliquent. II convient de sélectionner les essais à partir des méthodes décrites dans la série de
normes ISO 10993, dans la présente Norme internationale, ou dans les deux. Si des essais ne figurant pas dans
ces Normes internationales sont sélectionnés, une déclaration selon laquelle les essais décrits dans ces Normes
internationales ont été pris en compte doit être rédigée et doit inclure une justification relative à la sélection d’autres
essais.
5.2 La sélection des essais et l’évaluation globale des résultats doivent être effectuées par un expert disposant de
données chimiques, physiques et biologiques appropriées relatives au dispositif, et qui a connaissance des
conditions d’utilisation normales.
5.3 La sélection des méthodes d’essai doit être basée sur la prise en compte de
a) l’utilisation normale du produit;
b) le(s) tissu(s) avec le(s)q le produit peut entrer en contact;
c) la durée du contact.
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0 ISO
ISO 7405:1997(F)
5.4 En fonction de la catégorie à laquelle appartient le dispositif, les essais doivent être utilisés d’après les
indications résumées dans le tableau 1. Ce tableau indique quels types de méthodes d’essai considérer sans qu’il
faille nécessairement les exiger. La décision de ne pas effectuer un type d’essai identifié dans le tableau 1 doit être
justifiée dans le rapport relatif à chaque dispositif. Les types d’essais indiqués sont considérés dans le cadre d’une
évaluation préclinique de la biocompatibilité des produits dentaires. Pour la plupart des types d’essai, des méthodes
particulières sont identifiées bien que, pour certains dispositifs, il soit admis que des variantes de méthodes,
figurant dans ces Normes internationales, puissent être mieux appropriées. Une justification du choix de la méthode
doit figurer dans le rapport concernant chaque dispositif, ce qui revêt une importance particulière en cas d’utilisation
de méthodes ne figurant pas dans la présente Norme internationale.
Pour des raison pratiques, les différents types d’essais ont été répartis en trois groupes,
a) Groupe I
Ce groupe comprend les essais in vitro de cytotoxicité. L’ISO 109935 présente des recommandations générales
qui doivent être suivies en matière d’essais in vitro de cytotoxicité. La présente Norme internationale comporte des
protocoles d’essai détaillés sur les méthodes de diffusion par agar-agar et par filtre, adaptées aux produits
dentaires. Les méthodes de cytotoxicité in vitro comprennent
1) l’essai de diffusion sur agar-agar (6.1);
2) l’essai de diffusion sur filtre (6.2);
3) les essais en contact direct ou à partir d’extraits, conformément à I’ISO 109935;
4) les essais de la barrière dentinaire (annexe A).
L’ordre de la liste n’indique aucune préférence pour une méthode plutôt qu’une autre.
NOTE 1
NOTE 2 L’utilisation d’essais de la barrière dentinaire est encouragée, et il y est fait référence dans l’annexe A.
b) Groupe II
Ce groupe comprend des essais conformes à I’ISO 10993 et des essais particuliers sont, le cas échéant, identifiés:
1) toxicité systémique aiguë - Application orale (ISO 10993-I 1, 6.51, et annexe B de la présente Norme
internationale);
2) toxicité systémique aiguë -
Application par inhalation (ISO 10993-I 1, 6.5.3);
3) toxicité systémique subchronique
- Application orale (ISO 10993-I 1, 6.7.1);
4) irritation de la peau et réactivité intracutanée (ISO 10993-10, 5.2 et 5.4);
5) sensibilisation (ISO 10993-10, 6.2 et 6.3);
6) toxicité systémique subchronique - Application par inhalation (ISO 10993-I 1, 6.7.3);
7) génotoxicité (ISO 10993-3, article 4);
8) effets locaux après implantation (ISO 10993-6, articles 4, 5 et 6).
NOTE 1 L’utilisation des essais DLsO pour les de toxicité aiguë est encouragée, et une information concernant cet
est présentée à l’annexe B.
aspect
NOTE 2 Pour l’évaluation des produits après implantation locale conformément à I’ISO 10993-6, il est conseillé de procéder à
l’examen de portions non déminéralisées, en plus de l’examen de routine des portions déminéralisées.
4
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Tableau 1 - Types d’essai pour l’évaluation préclinique de la biocompatibilité des produits dentaires
Groupe I Groupe II Groupe Ill
T
Nature Durée Essais Essais Essais Toxicité Toxicité Toxicité Toxicité Irritation de Sensi bi- Toxicité Génotoxicité Effets Essai Essai de Essai
du du
de de de systémique systémique systémique systémique la peau lisation systémique ISO 10993-3, locaux d’usage coiff age d’usage
contact contact cytotoxicité cytotoxicité cytotoxicité aiguë - aiguë - aiguë - sub- et ISO 10993-10 sub- article 4 après de la pulpaire endo-
ISO 7405, ISO 10993-5 ISO 7405, Application Application Application chronique - réactivité 6.2 et 6.3 chronique - implantation ISO 7405, dontique
pulpe
6.1 et 6.2 annexe A orale orale Application intracutanée Application I SO 10993-6, et de la 6.4 ISO 7405
Par
ISO 10993-I 1 ISO 7405, inhalation orale ISO 10993-10 articles 4, 5 dentine 6.5
Par
65.1 annexe B ISO 10993-l 1 ISO 10993-I 1 j inhalation et 6 SO 7405
5.2
6.5.3 6.7.1 et 5.4 ISO 10993-l 1, 6.3
6.7.3
s 24 h x X
Dispositifs
>24hà X X X
X X X
au contact
30 jours
d’une
surface
> 30 jours X X X X X X X
+-
s 24 h X X X X X X X X
X
Dispositifs
communi-
>24hà X X X X
X X X X X X X
quant
30 jours
avec
l’extérieur
> 30 jours X X X X X X X X X X X
s
s 24 h X X X X X X
Dispositifs
>24hà X X X
X X X X X X
implan-
30 jours
tables
> 30 jours X X X X X X
X X X
NOTE - Les X indiquent les essais à considérer.
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ISO 7405:1997(F)
c) Groupe III
Ce groupe comprend les essais propres aux produits dentaires auxquels il n’est pas fait référence dans
I’ISO 10993:
1) essai d’usage de la pulpe et de la dentine (6.3);
essai de coiffage pulpaire et de pulpotomie (6.4);
2)
essai d’usage endodontique (6.5).
3)
5.5 II est nécessaire de prendre en considération la réévaluation de la biocompatibilité d’un dispositif, décrite en
5.4, en cas de révisions ou de modifications de sa formule, de sa qualité et/ou de ses performances.
6 Méthodes d’essai spécifiques aux produits dentaires
6.1 Essai de diffusion sur agar-agar
6.1 .l Objectif
L’essai a été conçu afin de démontrer la cytotoxicité non spécifique de produits d’essai après diffusion par gélose
(agar-agar) et/ou composé d’agar-agar.
6.1.2 Lignée cellulaire
Utiliser des cultures American Type Culture Collection CCL 1 fibroblasts (NCTC clone 929); d’autres lignées
cellulaires peuvent être utilisées, s’il est possible d’apporter la preuve de la reproductibilité et de la précision de leur
réaction.
NOTE - Des variantes de lignées cellulaires sont présentées dans l’annexe C.
6.1.3 Milieu de culture, réactifs et matériel
Utiliser un milieu Eagle’s Basa1 contenant 2,2 g/l de bicarbonate de sodium, 3,0 g/l de HEPES et 50 ml/1 de sérum
de veau nouveau-né. Préparer une double concentration de milieu Eagle’s Basai, à ceci près que la concentration
de I’HEPES est réduite à 1 g/l. Préparer soit 3 % de gélose (agar-agar), soit 3 % de composé d’agar-agar dans de
l’eau distillée.
Procéder à la stérilisation de I’agar-agar en autoclave et à celle du milieu par filtration.
Préparer la coloration vitale en diluant une solution mère à 1 % de solution aqueuse de rouge neutre 100 fois
(source d’enregistrement) avec 0,Ol ml/1 de solution saline tamponnée au phosphate immédiatement avant
l’utilisation. Entreposer les solutions de rouge neutre en les protégeant de la lumière. Utiliser des boîtes de Pétri de
diamètre compris entre 50 mm et 100 mm, adaptées à la culture des tissus.
6.1.4 Préparation d’un échantillon
Pour la préparation des produits d’essai, les instructions recommandées par le fabricant doivent être observées.
L’essai doit être effectué ou bien sur un extrait de produit, ou bien sur le produit lui-même, conformément aux
indications de I’ISO 10993-5, article 4.
Dans le cas des produits solides, préparer des échantillons circulaires d’environ 5 mm de diamètre et de surface
plane, permettant d’assurer un contact adéquat avec la surimposition d’agar-agar.
Dans le cas des produits faisant prise, insérer le produit fraîchement mélangé dans des anneaux en verre ou en
polytétrafluoroéthylène de 5 mm de diamètre intérieur et de 5 mm de hauteur. Lorsque les produits sont soumis à
l’essai à l’état fraîchement mélangé, placer les anneaux sur I’agar-agar avant d’insérer le produit. Lors d’essais suite
à différentes périodes de prise, remplir les anneaux de façon que le produit soit égalisé au bord et laisser reposer à
(37 + 2) OC, avec une humidité relative de (90 + 10) %, jusqu’à ce que le produit soit prêt pour les essais.
-
Dans le cas d’échantillons ou d’extraits fluides, imbiber 0,l ml de fluide sur un disque filtrant en verre de borosilicate
de 5 mm de diamètre, placé sur I’agar-agar.
6
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ISO 7405: 1997(F)
NOTE - Des disques appropriés peuvent être préparés à partir de préfiltres Millipore AP25022003).
6.1.5 Échantillons témoins
Utiliser des échantillons témoins tels que définis dans I’ISO 10993-5, article 3.
6.1.6 Mode opératoire
Cultiver les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent la fin de la phase de croissance logarithmique. Introduire à la
pipette 10 ml de suspension cellulaire (2,5 x 105 cellules/ml) dans un nombre suffisant de boîtes de Pétri et laisser
incuber à (37 k 2) OC dans une atmosphère saturée d’eau avec 5 % (WV) de dioxyde de carbone pendant 24 h.
Faire chauffer I’agar-agar stérile à 100 OC dans un bain-marie et le laisser refroidir à 48 OC. Mélanger une part
d’agar-agar à une part de milieu nutritif à double concentration, fraîchement préparé, et chauffer à 48 OC. Aspirer le
milieu nutritif liquide de chaque boîte de Pétri et le remplacer par 10 ml de mélange agar-agar/milieu nutritif
fraîchement préparé.
Laisser le mélange agar-agar/milieu nutritif se solidifier à température ambiante (environ 30 min). Ajouter 10 ml de
solution de rouge neutre et tenir dans l’obscurité durant 15 min à 20 min. Aspirer le surplus de solution de rouge
neutre.
Protéger la culture de la lumière en présence de rouge neutre, les cellules pouvant être endommagées.
Appliquer à chaque boîte deux échantillons de produit d’essai, un contrôle positif, un contrôle négatif et un contrôle
de milieu d’extraction, si ce dernier a été utilisé. Éloigner le plus possible les échantillons les uns des autres, ainsi
que des parois de la boîte de Pétri. Laisser incuber à (37 * 2) OC dans une atmosphère saturée d’eau avec
5 % (WV) de dioxyde de carbone pendant 24 h. Examiner chaque produit d’essai au moins quatre fois (c’est-à-dire
deux boîtes par produit d’essai).
6.1.7 Paramètres d’évaluation
La zone de décoloration située autour des produits et des témoins d’essai doit être vérifiée à l’aide d’un microscope
inversé à écran calibré, un indice de décoloration et un indice de lyse étant déterminés pour chaque échantillon
selon les critères suivants:
a) Indice de décoloration Description
0 Aucune décoloration détectable
1 Décoloration uniquement de la substance d’essai
2 Zone de décoloration inférieure ou égale à 5,0 mm de la substance d’essai
3 Zone de décoloration inférieure ou égale à 10,O mm de la substance d’essai
4 Zone de décoloration supérieure à 10,O mm de la substance d’essai
5 Totalité de la culture décolorée
b) Indice de lyse Description
0 Aucune lyse de cellule détectable
1 Moins de 20 % de lyse de cellule
2 20 % à 40 % de lyse de cellule
3 > 40 % à c 60 % de lyse de cellule
4 60 % à 80 % de lyse de cellule
5 Plus de 80 % de lyse de cellule
3) Les préfiltres Millipore AP2502200 sont un exemple de produits appropriés disponibles dans le commerce. Cette
information est donnée par commodité aux utilisateurs de la présente Norme internationale et ne saurait engager la
responsabilité de I’ISO sur ce produit.
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ISO 7405: 1997(F)
Calculer l’indice de décoloration et l’indice de lyse moyens de chaque produit d’essai et présenter la réaction
cellulaire comme suit:
Réaction cellulaire = indice de décoloration/indice de lyse
Si les valeurs d’indice des quatre échantillons du produit d’essai diffèrent de plus de deux unités dans la plage de 0
à 3, reproduire l’essai. Pour les indices 4 et 5, il n’est pas nécessaire de reproduire l’essai. Lors de la soumission
des extraits à l’essai, soustraire de l’indice moyen du milieu d’extraction contenant le produit d’essai, l’indice moyen
du milieu d’extraction seul, afin d’obtenir l’indice de produit d’essai seul. Si l’indice moyen du milieu d’extraction
utilisé comme contrôle est supérieur à 1, reproduire l’essai en utilisant un milieu d’extraction différent.
NOTE - Pour que l’essai soit valable, il convient de trouver une couche de cellules intactes sous le contrôle négatif.
6.1.8 Évaluation des résultats
Toute information rassemblée durant l’essai doit être prise en compte dans l’évaluation des résultats d’essai, en
particulier toute différence de résultat entre les groupes expérimentaux et les groupes témoins. La réaction
cellulaire repose sur l’indice de décoloration moyen et sur l’indice de lyse d’au moins quatre essais répétés. La
réaction cellulaire n’est donc pas nécessairement un nombre entier, et il convient que l’échelle employée pour son
interprétation soit continue. Un mode de graduation des produits d’essai est présenté ci-après.
Échelle Réponse de cellule Interprétation
0 o/o Non cytotoxique
1 Ill Légèrement cytotoxique
2 212 à 313 Moyennement cytotoxique
3 414 à 515 Fortement cytotoxique
Les résultats de l’évaluation doivent être mentionnés dans le rapport d’essai.
6.1.9 Rapport d’essai
Les résultats doivent figurer dans un rapport d’essai, qui comporte la liste complète des modes opératoires suivis,
tous les résultats obtenus et toute autre information nécessaire à l’évaluation des résultats, comme indiqué en
6.1.8. Des détails relatifs à la préparation et aux méthodes d’application du produit d’essai, ainsi que le numéro du
lot du produit doivent y figurer, le cas échéant.
6.2 Essai par diffusion sur filtre
6.2.1 Objectif
L’essai a pour but de démontrer la cytotoxicité non spécifique des produits d’essai après diffusion dans un filtre en
acétate de cellulose.
6.2.2 Lignée cellulaire
Utiliser des cultures American Type Culture Collection CCL1 fibroblasts (NCTC clone 929); d’autres lignées
cellulaires peuvent être utilisées, s’il est possible d’apporter la preuve de la reproductibilité et de la précision de leur
réaction.
NOTE - Des variantes de lignées cellulaires sont présentées dans l’annexe C.
6.2.3 Milieu de culture, réactifs et matériel
Préparer un milieu de culture et un agar-agar à utiliser en surimposition, tel que décrit en 6.1.3. Préparer les
solutions soit pour une coloration au succinate déshydrogénée, soit pour une coloration hydrolase non spécifique.
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0 ISO
ISO 7405:1997(F)
Pour une coloration au succinate déshydrogénée, préparer la solution mère suivante:
a) solution au succinate, contenant 13,6 g de succinate de sodium dans un tampon de 100 ml de phosphate, de
pH 76;
b) solution de chlorure de tétrazole de bleu azoté, contenant 100 mg de chlorure de tétrazole de bleu azoté
dans un tampon de 100 ml de phosphate, de pH 7,6;
c) solution de méthosulfate de phénazine, contenant 4 mg de solution de méthosulfate de phénazine dans 10 ml
d’eau distillée fraîche.
Préparer une solution de coloration contenant 1 ml de solution au succinate, 9 ml de solution de chlorure de
tétrazole de bleu azoté, et 1 ml de solution de méthosulfate de phénazine.
Pour la coloration hydrolase non spécifique, préparer une solution mère de diacétate fluorescent, contenant 5 mg
de diacétate fluorescent dans 1 ml d’acétone. L’utiliser en ajoutant 20 ~1 de solution mère à une solution saline
tampon de phosphate de 100 ml. Utiliser des boîtes de Pétri de diamètre compris entre 50 mm et 100 mm,
adaptées à la culture des tissus.
Utiliser des filtres en acétate de cellulose, de 47 mm de diamètre, de 0,45 prn de taille de pore&
6.2.4 Préparation des échantillons
Préparer les échantillons conformément à 6.1.4. La totalité des échantillons, y compris les produits solides, doivent
être disposés sur le filtre en acétate de cellulose plutôt que sur la surimposition d’agar-agar. La masse des
échantillons ne doit pas dépasser 3,5 g. Suivre, pour effectuer la préparation des produits d’essai, les instructions
recommandées par le fabricant.
6.2.5 Échantillons témoins
Utiliser les échantillons témoins tels que définis dans I’ISO 10993-5, article 3.
6.2.6 Mode opératoire
Cultiver les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent la fin de la phase de croissance logarithmique. Placer les filtres en
acétate de cellulose au fond de boîtes de Pétri en quantité suffisante, et introduire à la pipette 6 ml de suspension
cellulaire (2,5 x 105 cellules/ml). Laisser incuber à (37 ir 2) OC dans une atmosphère saturée d’eau avec 5 % (WV)
de dioxyde de carbone, pendant 24 h.
Introduire à la pipette 5 ml de mélange agar-agar/milieu nutritif (voir 6.1.6) maintenu à 48 “C dans des boîtes de
Pétri en quantité suffisante, et laisser solidifier à la température ambiante. Aspirer l’excédent de milieu nutritif dans
les boîtes contenant des filtres en acétate de cellulose, laver les filtres dans une solution saline tamponnée de
phosphate à (37 * 2) OC et les placer par-dessus l’agar-agar, côté cellule vers le bas. Appliquer trois à cinq
échantillons sur le filt
...
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