ISO/TS 10832:2009

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 10832
First edition
2009-10-15
Corrected version
2010-01-15
Soil quality — Effects of pollutants on
mycorrhizal fungi — Spore germination
test
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des champignons
mycorhizogènes — Essai de germination des spores

Reference number
©
ISO 2009
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electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
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Published in Switzerland
ii © ISO 2009 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
Introduction.vi
1 Scope.1
2 Normative references.1
3 Terms, definitions and abbreviated terms.1
4 Test methods .2
4.1 Principle.2
4.2 Standard conditions.3
5 Test materials .3
5.1 Distilled water .3
5.2 Biological material.3
5.3 Control substrate.3
5.4 Reference substance .4
5.5 Trypan blue .4
5.6 Apparatus.4
6 Storage and preparation of samples .5
7 Procedure.5
7.1 Biological system .5
7.2 Preparation of the test mixture .6
7.3 Setting up of the test.7
7.4 Choice of the tested concentration .8
7.5 Culture condition.8
7.6 End of the test.8
8 Calculation and expression of results .9
8.1 Calculation .9
8.2 Expression of results.9
9 Validity criteria.9
10 Test report.9
Annex A (informative) Experimental device .11
Annex B (informative) Example of table of results.12
Annex C (informative) Example of results.13
Annex D (informative) Precision data .15
Bibliography.17

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
technical committee may decide to publish other types of document:
⎯ an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical experts in
an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 % of the members
of the parent committee casting a vote;
⎯ an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a technical
committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the committee casting
a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for a
further three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or ISO/TS is
confirmed, it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be transformed into an
International Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 10832 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological methods.
The corrected version of ISO/TS 10832:2009 incorporates the following corrections.
⎯ Clause 1, last line: “mix” was changed to “mixture and sludge”.
⎯ Subclause 3.12: the term “mass fraction” was changed to “inhibition concentration” and the symbol w
x
was changed to IC ; “mass fraction” was changed to “concentration” in the definition; a note was added.
x
⎯ In addition, “mass fraction” was changed to “concentration” or “inhibition concentration” in 4.1, Clause 6,
7.4, 8.1 and 8.2 as well as in Annexes B, C and D; the symbol w was changed to IC (or the symbol w
x x 50
was changed to IC ) in 4.1, 5.4 (modified), 8.1 and in Annex C.
⎯ Subclause 5.2.4: the last sentence was changed.
⎯ Subclause 5.3, first line: “the” was deleted.
⎯ Subclause 5.5, Figure 1 a): the figure was replaced.
iv © ISO 2009 – All rights reserved

⎯ Subclause 5.6.5: “fine” was changed to “thin”.
⎯ Subclause 7.1.2: the last line was changed.
⎯ Subclauses 7.2.2, 7.2.3, 7.2.4, 7.2.5: the last two sentences were changed.
⎯ Subclause 7.3: the first line was changed. In Figure 2, “Petri dish” was changed to “Petri plate”.
⎯ Subclause 7.3.4, 3rd and 4th lines: “assay” was changed to “test” and “retention” was changed to
“holding”.
⎯ Subclause 7.4.1, title and last line: “assay” was changed to “test”.
⎯ Subclause 7.4.2: the title was changed.
⎯ Subclause 7.6: the title and the last two sentences were changed.
⎯ Subclause 8.1: the first sentence was changed.
⎯ Subclause 8.2 was changed.
⎯ Clause 9: the 2nd and 4th lines were changed. The last sentence was transferred to 5.4.
⎯ Clause 10: Items b) and c) were changed.
⎯ Annex B: the title was changed. In Table B.1, “assay” was changed to “test” and “mg/kg” was changed to
−1
“mg·kg ”.
−1
⎯ Annex C: in Table C.1, “mg/kg” was changed to “mg·kg ”.

Introduction
Mycorrhizal fungi are important components of the soil microbial community and key organisms in plant/soil
systems. The root symbiosis they form represents a direct link between the soil and the large majority (80 %)
of vascular plant species, in natural and agricultural environments. Mycorrhizal fungi provide several benefits
to the host plant, including enhanced growth, improved mineral nutrition, greater drought resistance, and
protection against pathogens and heavy metal stress.
Several studies have shown that mycorrhizal fungi are sensitive to pollutants such as metallic trace elements
and polycyclic aromatic hydrocarbons, and to sewage sludges even when no phytotoxic effects on the host
plant are observed. As mycorrhizal fungi fulfil most of the criteria for bioindicator organisms (ubiquitous in soil,
sensitive to pollutants, ecologically relevant role in plant health and ecosystems), it appeared important to take
them into account in hazard and environmental risk assessments linked to pollutants, contaminated soils and
to the use of sewage sludge in agriculture.
Spore germination by an arbuscular mycorrhizal fungus, Glomus mosseae, makes up the basis of the
proposed test. The first step of the symbiosis is taken into account in this test, whereas another test based on
root colonization of the host plant is also under investigation.
This test can be directly performed with sludges or soils without any extraction step.

vi © ISO 2009 – All rights reserved

TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 10832:2009(E)

Soil quality — Effects of pollutants on mycorrhizal fungi —
Spore germination test
1 Scope
This Technical Specification specifies a method to evaluate the effects of pollutants on spore germination of a
mycorrhizal fungus, Glomus mosseae. This direct acute toxicity bioassay allows the evaluation of potential
effects of pollutants and contaminated soils on beneficial soil microorganisms important for plant growth within
the concept of sustainable agriculture.
This Technical Specification is applicable to
⎯ chemical substances, and
⎯ contaminated soils, waste and soil-waste mixture and sludge.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil
under aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the
laboratory
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 11263, Soil quality — Determination of phosphorus — Spectrometric determination of phosphorus soluble
in sodium hydrogen carbonate solution
ISO 11268-1, Soil quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) — Part 1: Determination of
acute toxicity using artificial soil substrate
ISO 11274, Soil quality — Determination of the water-retention characteristic — Laboratory methods
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method
3 Terms, definitions and abbreviated terms
For the purposes of this document, the following terms, definitions and abbreviated terms apply.
3.1
mycorrhizal fungus
ubiquitous microorganism forming symbiotic association with the roots of vascular plant species
3.2
BEG
The International Bank for the Glomeromycota
3.3
spore
asexual reproductive unit of a fungus
3.4
sporocarps
mycelium-surrounded spore group
3.5
mycelium
branched hyphae network
3.6
hyphae
filaments which compose fungus mycelium
3.7
control substrate
inert substrate, which does not affect spore germination, used as a control or dilutant
3.8
matrix
test soil, sludge or waste
3.9
sandwich
device composed of two nitrocellulose membrane filters containing the spores
NOTE The two membranes are held together with two slide frames.
3.10
trypan blue staining
non-vital staining with trypan blue used to make mycorrhizal fungus structures visible (coloured in blue)
3.11
test mixture
mixture of test substance or matrix with a control substrate
3.12
inhibition concentration
IC
x
concentration of test substance or matrix inducing x % spore-germination inhibition compared to the control
NOTE “Mass fraction” is often known in biological methods as “concentration”.
4 Test methods
4.1 Principle
Spores of Glomus mosseae are placed between two nitrocellulose membrane filters forming a sandwich (3.9),
which is placed in a Petri dish containing the test mixture (3.11) which contains the test substance or matrix
(3.8) with different concentrations, diluted or not with the control substrate (3.7).
The percentage of germinated spores is determined after 14 days.
2 © ISO 2009 – All rights reserved

The results are compared with a control substrate and used to estimate the 50 % spore-germination-inhibition
concentration (IC ).
Determination of another IC is also possible, but not required.
x
NOTE This method can be used to determine the effect of a single concentration.
4.2 Standard conditions
Use a growth chamber or room with a controlled temperature, (24 ± 2) °C.
Incubation is carried out in the dark (a darkroom or Petri dishes covered with aluminium foil).
5 Test materials
5.1 Distilled water
The pH of distilled water should be neutral and never less than 5,5.
5.2 Biological material
5.2.1 Fungus
Taxonomic group: Eumycota, Glomeromycota order.
Species: Glomus mosseae (Nicolson and Gerdeman) Gerdeman and Trappe (BEG 12).
5.2.2 Life status
Use mature spores.
5.2.3 Identification
Genbank identification number: U96139 (18s rDNA sub-unit); YO7656 (partial sequence of the 25s rDNA sub-
unit) (25, 26).
5.2.4 Material
1)
Use sporocarps (3.4) containing spores (3.3) (see Figure 1) purchased commercially . Use pot cultures that
are less than five months old to extract sporocarps.
The spore-germination percentage shall be higher than 75 %. Conserve the spores and sporocarps in distilled
water (5.1) at 4 °C.
The sporocarps shall be used within one week, and the spores within two days.
5.3 Control substrate
Use sand, or artificial soil in accordance with ISO 11268-1 as control substrate (3.7).

1) Sporocarps of the fungus Glomus mosseae, produced and distributed by BioRize, are an example of a suitable
product available commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not
constitute an endorsement by ISO of this product.
Use sand: > 99 % silica, pH 6,6 to 7,5, particle size 0,8 mm to 1,6 mm, washed three times with distilled water
(pH > 6) (5.1), then dried. The final pH shall be > 6 (see ISO 10390).
Check that spore germination in the control substrate before setting up the bioassay is > 75 %.
5.4 Reference substance
Use cadmium nitrate (CdNO ⋅4H O).
3 2
For information, in a ring test (n = 4) performed with cadmium nitrate, the value of IC in sand was between
−1 −1
0,15 mg⋅kg and 1,7 mg⋅kg .
5.5 Trypan blue
2)
Use Trypan blue , 0,5 g in 50 ml of HCl (1 %), 450 ml of H O, and 500 ml of glycerol.
a)  Sporocarps b)  Sporocarp opened

c)  Intact spore d)  Broken spore
Figure 1 — Sporocarps and spores of Glomus mosseae
5.6 Apparatus
5.6.1 Binocular microscope, 32 × magnifications.
5.6.2 Sterile plastic Petri dishes, of diameter 9 cm.
5.6.3 Slide frames, 24 mm × 36 mm.

2) Trypan blue referenced 93595, distributed by Sigma Aldrich, is an example of a suitable product available
commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an
endorsement by ISO of this product.
4 © ISO 2009 – All rights reserved

5.6.4 Nitrocellulose membrane filters, of diameter 47 mm, and porosity 0,45 µm, white, 3 mm gridlined.
3)
5.6.5 Ultra-thin nippers/tweezers .
5.6.6 Filter paper.
5.6.7 Plastic microtube, of capacity 1,5 ml.
5.6.8 Plastic film.
5.6.9 Micropipette and cut tips.
5.6.10 Balance, able to weigh from 0 g to 200 g, with an accuracy of 0,001 g.
5.6.11 Funnel.
6 Storage and preparation of samples
Soil samples shall be stored as specified in ISO 10381-6. Waste and sludge samples are stored at (4 ± 2) °C
in tight containers. Containers used for microbiologically active sludge and waste should not be filled
completely.
The following parameters should be determined for the soils, wastes and sludges to be tested:
⎯ pH (see ISO 10390); use soil with a pH not lower than 5.5 (see Reference [18] in the Bibliography);
⎯ water content (see ISO 11465);
⎯ water-holding capacity (see ISO 11274);
⎯ available phosphorus content (see ISO 11263);
−1
⎯ concentration of soluble phosphorus which shall be below 100 mg⋅kg (see References [1], [2], [7] and
[23]).
Use soils or wastes with a particle size below 4 mm in order to perform the bioassay. Otherwise, wastes
should be ground and sieved to 4 mm, and soils should be sieved to 4 mm before preparing the test mixture.
7 Procedure
7.1 Biological system
7.1.1 Spore control
Glomus mosseae spores (3.3) should be yellow and bright, and have an intact and clean envelope (empty and
crushed spores should be eliminated), see also Figure 1.
7.1.2 Preparation of the biological material
Number of individual spores for each concentration tested: 30 spores (3.3) per sandwich (3.9), six replicates
(sandwiches) per concentration; i.e. 180 spores per concentration.

3) Ultra-thin tweezers referenced T5130 No. 5, distributed by Oxford Instruments, are an example of a suitable product
available commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an
endorsement by ISO of this product.
Spores (3.3) are carefully collected under a binocular microscope (5.6.1) from the sporocarps (3.4), which are
placed on a filter paper (5.6.6) that has been slightly humidified so that the spores adhere to it. Sporocarps are
gently opened with ultra-fine tweezers (5.6.5) and spores can then be taken and transferred to a microtube
(5.6.7) containing distilled water (5.1).
A filtration membrane (5.6.4) humidified with distilled water (5.1) is placed on humidified filter paper (5.6.6)
under a binocular microscope (5.6.1). With a micropipette (5.6.9), G. mosseae spores (3.3), taken from the
microtube (5.6.7), are placed in the middle of this membrane, inside squares which are defined by the slide
frame (one spore per square defined by the gridline) (see Figure A.1). The spores are carefully covered with a
second filtration membrane previously humidified, in order that the gridlines of both membranes are
superposed. The two membranes are held together within two slide frames (5.6.3) to form a sandwich.
Spore sandwiches (3.9) should be quickly placed in the Petri dishes as described in 7.3.
7.2 Preparation of the test mixture
7.2.1 General
The test mixture (3.11) is composed of the control substrate (3.7) and the substance or matrix (3.8) to be
tested. Prepare enough test solution or mixture with the matrix.
7.2.2 Water-soluble or emulsifiable substances
For each concentration tested, dissolve or dilute the quantity of test substance required to obtain the desired
concentration in distilled water (5.1).
This solution is added to a Petri dish containing 80 g of control substrate (5.3) in order to obtain 90 % of the
water-holding capacity of the test mixture (3.11), see Figure 2.
Proceed in two steps as indicated in 7.3.1.
The control test is performed as described above with distilled water (5.1).
Proceed as specified in 7.3.
7.2.3 Water-insoluble and organic-solvent-soluble substances
For each concentration tested, dissolve or dilute the quantity of test substance required to obtain the desired
concentration in a volatile solvent (e.g. methanol).
This solution is mixed with 10 g of control substrate (5.3) (previously sampled from the quantity used to
prepare the test mixture). Organic solvent is evaporated under a vacuum hood for 24 h. Transfer the test
mixture (3.11) to a flask containing the rest of the test mixture and carefully homogenize.
80 g of this mixture is humidified to 90 % of the water-holding capacity with distilled water (5.1), see Figure 2.
Proceed in two steps as indicated in 7.3.2.
The control test is performed as described above without the addition of the test substance.
Proceed as specified in 7.3.
7.2.4 Non-water- or organic-solvent-soluble subst
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 10832
Première édition
2009-##-##
Qualité du sol — Effets des polluants vis-
à-vis des champignons
mycorhizogènes — Essai de germination
des spores
Soil quality — Effects of pollutants on mycorrhizal fungi — Spore
germination test
PROOF/ÉPREUVE
Numéro de référence
©
ISO 2009
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction.v
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives.1
3 Termes, définitions et termes abrégés.2
4 Méthodes d'essai.3
4.1 Principe.3
4.2 Conditions normales.3
5 Matériaux d'essai.3
5.1 Eau distillée.3
5.2 Matériel biologique.3
5.3 Substrat témoin .4
5.4 Substance de référence.4
5.5 Bleu trypan.4
5.6 Appareillage .5
6 Conservation et préparation des échantillons .5
7 Mode opératoire.6
7.1 Système biologique.6
7.2 Préparation du mélange d'essai .6
7.3 Mise en place de l'essai .7
7.4 Choix de la fraction massique à soumettre à essai.9
7.5 Conditions de culture.9
7.6 Arrêt de l'essai .9
8 Calculs et expression des résultats .10
8.1 Calculs.10
8.2 Expression des résultats.10
9 Critères de validité .10
10 Rapport d'essai.10
Annexe A (informative) Dispositif expérimental .12
Annexe B (informative) Exemple de tableau de résultats.13
Annexe C (informative) Exemple de résultats.14
Annexe D (informative) Données de fidélité.16
Bibliographie.18

Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
Dans d'autres circonstances, en particulier lorsqu'il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d'autres types de documents:
⎯ une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts dans
un groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 % des
membres votants du comité dont relève le groupe de travail;
⎯ une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d'un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l'objet d'un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour trois
nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu'une ISO/PAS ou
ISO/TS a été confirmée, elle fait l'objet d'un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa
transformation en Norme internationale soit de son annulation.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO/TS 10832 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
iv PROOF/ÉPREUVE © ISO 2009 – Tous droits réservés

Introduction
Les champignons mycorhizogènes sont d'importants composants de la communauté microbienne du sol et
sont des organismes clés dans les systèmes sol-plante. La symbiose racinaire qu'ils forment représente un
lien direct entre le sol et la grande majorité des espèces de plantes vasculaires (80 %) dans les
environnements naturels et agricoles. La plante hôte en tire plusieurs bénéfices, au nombre desquels on peut
citer une stimulation de la croissance, une amélioration de la nutrition minérale, une plus grande résistance à
la sécheresse et une protection contre les agents pathogènes et le stress lié aux métaux lourds.
Plusieurs études ont montré que les champignons mycorhizogènes sont sensibles aux polluants tels que les
éléments traces métalliques et les hydrocarbures aromatiques polycycliques, ainsi qu'aux boues d'épuration,
et ce même en l'absence d'effets phytotoxiques observés sur la plante hôte. Les champignons
mycorhizogènes remplissant la plupart des critères requis des organismes bio-indicateurs (ubiquité dans le
sol, sensibilité aux polluants, rôle écologique pertinent dans la santé des plantes et au sein des écosystèmes),
il est apparu important de les prendre en considération dans l'appréciation de la toxicité et des risques
environnementaux liés aux polluants, aux sols contaminés et à l'utilisation de boues d'épuration en agriculture.
La germination des spores chez un champignon mycorhizogène à arbuscules, Glomus mosseae, forme la
base de l'essai proposé. Cet essai concerne la première phase de la symbiose, tandis qu'un autre essai, basé
sur la colonisation racinaire de la plante hôte, est également en cours d'étude.
Cet essai peut être réalisé directement avec des boues ou des sols sans aucune étape d'extraction.

SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 10832:2009(F)

Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des
champignons mycorhizogènes — Essai de germination des
spores
1 Domaine d'application
La présente Spécification technique spécifie une méthode d'évaluation des effets de polluants sur la
germination des spores d'un champignon mycorhizogène, Glomus mosseae. Ce bio-essai de toxicité aiguë
directe permet d'évaluer les effets potentiels de polluants et de sols contaminés sur des micro-organismes
bénéfiques du sol qui sont importants pour la croissance des plantes dans le concept d'une agriculture
durable.
La présente Spécification technique est applicable:
⎯ aux substances chimiques, et
⎯ aux sols contaminés, aux déchets et aux mélanges sol et déchets.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l'évaluation en laboratoire des processus,
de la biomasse et de la diversité microbiens
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 11263, Qualité du sol — Dosage du phosphore — Dosage spectrométrique du phosphore soluble dans
une solution d'hydrogénocarbonate de sodium
ISO 11268-1, Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre (Eisenia fetida) — Partie 1:
Détermination de la toxicité aiguë en utilisant des substrats de sol artificiel
ISO 11274, Qualité du sol — Détermination de la caractéristique de la rétention en eau — Méthodes de
laboratoire
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
3 Termes, définitions et termes abrégés
Pour les besoins du présent document, les termes, définitions et termes abrégés suivants s'appliquent.
3.1
champignon mycorhizogène
micro-organisme ubiquiste formant une association symbiotique avec les racines d'espèces de plantes
vasculaires
3.2
BEG
IBG
Banque internationale des gloméromycètes
3.3
spore
unité reproductive asexuée d'un champignon
3.4
sporocarpe
groupe de spores entouré de mycélium
3.5
mycélium
réseau ramifié formé d'hyphes
3.6
hyphes
filaments qui composent le mycélium d'un champignon
3.7
substrat témoin
substrat inerte n'affectant pas la germination des spores, utilisé comme témoin ou diluant
3.8
matrice
sol, boues ou déchets soumis à essai
3.9
sandwich
dispositif formé de deux membranes filtrantes en nitrocellulose contenant les spores
NOTE Les deux membranes sont maintenues ensemble au moyen de deux cadres de diapositive.
3.10
coloration au bleu trypan
coloration non vitale au bleu trypan utilisée pour rendre visibles les structures des champignons
mycorhizogènes (colorées en bleu)
3.11
mélange d'essai
mélange d'une substance ou d'une matrice d'essai avec un substrat témoin
3.12
fraction massique
w
x
fraction massique de substance ou de matrice d'essai induisant une inhibition de x % de la germination des
spores par rapport au témoin
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4 Méthodes d'essai
4.1 Principe
Des spores de Glomus mosseae sont placées entre deux membranes filtrantes en nitrocellulose, formant un
sandwich (3.9) que l'on place dans une boîte de Petri contenant le mélange d'essai (3.11) qui contient la
substance ou la matrice d'essai (3.8) à différentes concentrations, diluée ou non avec le substrat témoin (3.7).
Le pourcentage de spores germées est estimé au bout de 14 jours.
Les résultats sont comparés à un substrat témoin et utilisés pour estimer la fraction massique d'inhibition à
50 % (w ) de la germination des spores.
La détermination d'une autre w est également possible, mais pas nécessaire.
x
NOTE La présente méthode peut être utilisée pour déterminer l'effet d'une fraction massique unique.
4.2 Conditions normales
Utiliser une chambre de culture ou une pièce climatisée à (24 ± 2)°C.
L'incubation est effectuée à l'obscurité (chambre obscure ou boîtes de Petri entourées de papier d'aluminium).
5 Matériaux d'essai
5.1 Eau distillée
Il convient que le pH de l'eau distillée soit neutre et jamais inférieur à 5,5.
5.2 Matériel biologique
5.2.1 Champignon
Groupe taxonomique: Eumycota, ordre des Gloméromycètes (Glomeromycota).
Espèce: Glomus mosseae (Nicolson & Gerdeman) Gerdeman & Trappe (BEG 12).
5.2.2 Stade de vie
Utiliser des spores matures.
5.2.3 Identification
Numéro d'identification Genbank: U96139 (sous-unité 18S de l'ADNr); YO7656 (séquence partielle de la
sous-unité 25S de l'ADNr) (25, 26).
5.2.4 Matériel
1)
Utiliser des sporocarpes (3.4) contenant des spores (3.3) (voir Figure 1) achetés dans le commerce . Utiliser
des cultures en pot de moins de cinq mois pour extraire les sporocarpes.

1) Les sporocarpes du champignon Glomus mosseae, produits et distribués par BIORIZE, sont un exemple de produit
approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs du présent document et ne
signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
Le pourcentage de germination des spores doit être supérieur à 75 %. Conserver les spores et les
sporocarpes dans de l'eau distillée (5.1) à 4 °C.
Utiliser dans un délai d'une semaine pour les sporocarpes et de deux jours pour les spores.
5.3 Substrat témoin
Utiliser du sable ou un sol artificiel conformément à l'ISO 11268-1 comme substrat témoin (3.7).
Utiliser un sable d'une teneur en silice supérieure à 99 %, un pH compris entre 6,6 à 7,5, une granulométrie
de 0,8 mm à 1,6 mm, lavé trois fois à l'eau distillée (pH > 6) (5.1) puis séché. Le pH final doit être supérieur
à 6 (voir l'ISO 10390).
Vérifier que la germination des spores dans le substrat témoin avant la mise en place du bio-essai est
supérieure à 75 %.
5.4 Substance de référence
Utiliser le nitrate de cadmium (CdNO , 4H O).
3 2
5.5 Bleu trypan
2)
Utiliser le bleu trypan , 0,5 g dans 50 ml de HCl 1 %, 450 ml d'eau et 500 ml de glycérol.

a)  Sporocarpes b)  Sporocarpe ouvert

c)  Spore intacte d)  Spore abîmée
Figure 1 — Sporocarpes et spores de Glomus mosseae

2) Le bleu trypan référencé 93595, distribué par Sigma Aldrich, est un exemple de produit approprié disponible sur le
marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO
approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
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5.6 Appareillage
5.6.1 Microscope binoculaire, grandissement × 32.
5.6.2 Boîtes de Petri stériles en plastique, diamètre 9 cm.
5.6.3 Cadres de diapositive, 24 mm × 36 mm.
5.6.4 Membranes filtrantes en nitrocellulose, diamètre 47 mm, porosité 0,45 µm, blanches, quadrillage
3 mm.
3)
5.6.5 Pinces ultra-fines .
5.6.6 Papier filtre.
5.6.7 Microtube en plastique, de contenance 1,5 ml.
5.6.8 Film plastique.
5.6.9 Micropipette et pointes coupées à l'extrémité.
5.6.10 Balance, capable de peser de 0 g à 200 g avec une précision de 0,001 g.
5.6.11 Entonnoir.
6 Conservation et préparation des échantillons
Les échantillons de sol doivent être conservés conformément à l'ISO 10381-6. Les échantillons de déchets et
de boues sont conservés à (4 ± 2) °C dans des récipients hermétiques. Il convient de ne pas remplir
complètement les récipients utilisés pour les boues et déchets microbiologiquement actifs.
Il convient de déterminer les paramètres suivants pour les sols, les déchets et les boues devant être soumis à
essai:
⎯ pH (voir l'ISO 10390); utiliser un sol dont le pH n'est pas inférieur à 5,5 (voir Référence [18]);
⎯ teneur en eau (voir l'ISO 11465);
⎯ capacité de rétention d'eau (voir l'ISO 11274);
⎯ teneur en phosphore disponible (voir l'ISO 11263);
−1
⎯ la fraction massique de phosphore soluble doit être inférieure à 100 mg·kg (voir Références [1], [2], [7]
et [23]).
Utiliser des sols ou des déchets de granulométrie inférieure à 4 mm pour réaliser le bio-essai; sinon, il
convient de broyer les déchets et de les passer au tamis de 4 mm et de passer les sols au tamis de 4 mm
avant de préparer le mélange d'essai.

3) Les pinces coupantes ultra-fines référencées T5130 n°5, distribuées par Oxford Instruments, sont un exemple de
produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs du présent document
et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
7 Mode opératoire
7.1 Système biologique
7.1.1 Contrôle des spores
Il convient que les spores de Glomus mosseae (3.3) soient jaunes et brillantes et que leur enveloppe soit
propre et intacte (il convient d'éliminer les spores vides et écrasées). Voir également Figure 1.
7.1.2 Préparation du matériel biologique
Nombre de spores individuelles pour chaque concentration testée: 30 spores (3.3) par sandwich (3.9), six
réplicats (sandwich) par concentration, soit 180 spores par concentration.
Les spores (3.3) sont collectées avec soin sous un microscope binoculaire (5.6.1) à partir des sporocarpes
(3.4) qui sont placés sur un papier filtre (5.6.6) légèrement humidifié pour que les spores y adhèrent. Les
sporocarpes sont ouverts avec précaution à l'aide de pinces ultra-fines (5.6.5) et les spores peuvent être
prélevées et transférées dans un microtube (5.6.7) contenant de l'eau distillée (5.1).
Une membrane de filtration (5.6.4) humidifiée avec de l'eau distillée (5.1) est placée sur un papier filtre (5.6.6)
humidifié sous un microscope binoculaire (5.6.1). À l'aide d'une micropipette (5.6.9), les spores de Glomus
mosseae (3.3), prélevées dans le microtube (5.6.7), sont placées au centre de cette membrane, à l'intérieur
des carrés qui sont définis par le cadre de diapositive (une spore par carré défini par le quadrillage) (voir
Figure A.1). Les spores sont soigneusement couvertes d'une seconde membrane de filtration préalablement
humidifiée en veillant à ce que les quadrillages des deux membranes soient superposés. Les deux
membranes sont maintenues ensemble à l'intérieur de deux cadres de diapositive (5.6.3) pour former un
sandwich.
Il convient de placer rapidement les sandwiches de spores (3.9) dans les boîtes de Petri (5.6.2).
7.2 Préparation du mélange d'essai
7.2.1 Généralités
Le mélange d'essai (3.11) est composé du substrat témoin (3.7) et de la substance ou de la matrice (3.8)
devant être soumise à essai. Préparer une quantité suffisante de solution ou de mélange d'essai avec la
matrice.
7.2.2 Substances solubles dans l'eau ou émulsifiables
Pour chaque concentration soumise à essai, dissoudre ou diluer la quantité de substance d'essai nécessaire
pour obtenir la concentration voulue dans l'eau distillée (5.1).
Cette solution est ajoutée à une boîte de Petri contenant 80 g de substrat témoin (5.3) pour obtenir 90 % de la
capacité de rétention d'eau du mélange d'essai (3.11). Voir Figure 2.
Procéder en deux étapes, comme indiqué en 7.3.1.
L'essai de contrôle est réalisé avec de l'eau distillée (5.1), de la manière décrite ci-dessus.
Poursuivre l'essai comme spécifié en 7.3.
7.2.3 Substances insolubles dans l'eau et solubles dans un solvant organique
Pour chaque concentration soumise à essai, dissoudre ou diluer la quantité de substance d'essai nécessaire
pour obtenir la concentration voulue dans un solvant volatil (par exemple du méthanol).
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Cette solution est mélangée à 10 g de substrat témoin (5.3) (échantillon préalablement prélevé sur la quantité
utilisée pour préparer le mélange d'essai). Faire évaporer le solvant organique sous une hotte d'aspiration
pendant 24 h. Transférer le mélange d'essai (3.11) dans un flacon contenant le reste du mélange d'essai et
homogénéiser avec soin.
Une quantité de 80 g de ce mélange est humidifiée à 90 % de la capacité de rétention d'eau avec de l'eau
distillée (5.1). Voir Figure 2.
Procéder en deux étapes, comme indiqué en 7.3.2.
L'essai de contrôle est réalisé de la manière décrite ci-dessus, sans substance soumise à essai.
Poursuivre l'essai comme spécifié en 7.3.
7.2.4 Substances non solubles dans l'eau ou dans un solvant organique
Pour chaque concentration soumise à essai, mélanger la quantité de substance d'essai nécessaire pour
obtenir la concentration voulue avec le substrat témoin (5.3).
Une quantité de 80 g de ce mélange est humidifiée à 90 % de la capacité de rétention d'eau avec de l'eau
distillée (5.1). Voir Figure 2.
L'essai de contrôle est réalisé de la manière décrite ci-dessus, sans substance soumise à essai.
Poursuivre l'essai comme spécifié en 7.3.
7.2.5 Matrices solides
Un mélange d'essai est préparé avec des dilutions croissantes de matrice soumise à essai dans le substrat
témoin (5.3). Ce mélange d'essai (3.11) est utilisé en deux fois. Procéder en deux étapes, comme indiqué en
7.3.4. Préparer un volume suffisant pour une boîte de Petri.
L'essai de contrôle est réalisé sans matrice.
Poursuivre l'essai comme indiqué en 7.3.
7.3 Mise en place de l'essai
Le sandwich (3.9) est transféré dans une
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 10832
Première édition
2009-10-15
Version corrigée
2010-01-15
Qualité du sol — Effets des polluants vis-
à-vis des champignons
mycorhizogènes — Essai de germination
des spores
Soil quality — Effects of pollutants on mycorrhizal fungi — Spore
germination test
Numéro de référence
©
ISO 2009
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Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction.vi
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives.1
3 Termes, définitions et termes abrégés.2
4 Méthodes d'essai.3
4.1 Principe.3
4.2 Conditions normales.3
5 Matériaux d'essai.3
5.1 Eau distillée.3
5.2 Matériel biologique.3
5.3 Substrat témoin .4
5.4 Substance de référence.4
5.5 Bleu trypan.4
5.6 Appareillage .5
6 Conservation et préparation des échantillons .5
7 Mode opératoire.6
7.1 Système biologique.6
7.2 Préparation du mélange d'essai .6
7.3 Mise en place de l'essai .7
7.4 Choix de la concentration soumise à essai.9
7.5 Conditions de culture.9
7.6 Arrêt de l'essai .9
8 Calculs et expression des résultats .10
8.1 Calculs.10
8.2 Expression des résultats.10
9 Critères de validité .10
10 Rapport d'essai.10
Annexe A (informative) Dispositif expérimental .12
Annexe B (informative) Exemple de tableau de résultats.13
Annexe C (informative) Exemple de résultats.14
Annexe D (informative) Données de fidélité.16
Bibliographie.18

Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
Dans d'autres circonstances, en particulier lorsqu'il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d'autres types de documents:
⎯ une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts dans
un groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 % des
membres votants du comité dont relève le groupe de travail;
⎯ une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d'un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l'objet d'un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour trois
nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu'une ISO/PAS ou
ISO/TS a été confirmée, elle fait l'objet d'un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa
transformation en Norme internationale soit de son annulation.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO/TS 10832 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
La présente version corrigée de l'ISO/TS 10832:2009 inclut les corrections suivantes:
⎯ À l'Article 1, à la fin de la dernière ligne, l'expression «aux déchets et aux mélanges sol et déchets» a été
remplacée par «aux déchets, aux mélanges sol-déchets et aux boues».
⎯ En 3.12, le terme «fraction massique» a été remplacé par le terme «concentration d'inhibition» et le
symbole w a été modifié en CI ; le terme «fraction massique» a été remplacé par le terme
x x
«concentration» dans la définition et une note a été ajoutée.
De plus, le terme «fraction massique» a été remplacé par le terme «concentration» en 4.1, à l'Article 6,
en 7.4, 8.1 et 8.2 ainsi que dans les Annexes B, C et D; le symbole w a été modifié en CI (ou le symbole
x x
w modifié en CI ) en 4.1, 5.4 (modifié), 8.1 et dans l'Annexe C.
50 50
⎯ En 5.2.4, la rédaction de la dernière phrase a été améliorée.
iv © ISO 2009 – Tous droits réservés

⎯ En 5.5, la Figure 1 a) a été remplacée.
⎯ En 7.1.2, à la dernière ligne, la référence croisée «(5.6.2)» a été remplacée par l'expression «comme
décrit en 7.3».
⎯ En 7.2.2, 7.2.3, 7.2.4 et 7.2.5, la dernière phrase a été modifiée pour remplacer l'expression «Poursuivre
l'essai» par «Procéder».
⎯ En 7.3, la référence croisée «(3.9)» a été remplacée par l'expression «préparé conformément à 7.1.2».
⎯ En 7.6, au début de l'avant-dernière phrase, le terme «sols» a été remplacé par l'expression «matrices
solides». De plus, à la fin de la dernière phrase, l'expression «des spores à compter» a été modifiée en
«de spore à considérer comme spore germée».
⎯ À l'Article 9, la dernière phrase a été déplacée en 5.4.
−1
⎯ Dans les Tableaux B.1 et C.1, «mg/kg» a été modifié en «mg·kg ».

Introduction
Les champignons mycorhizogènes sont d'importants composants de la communauté microbienne du sol et
sont des organismes clés dans les systèmes sol-plante. La symbiose racinaire qu'ils forment représente un
lien direct entre le sol et la grande majorité des espèces de plantes vasculaires (80 %) dans les
environnements naturels et agricoles. La plante hôte en tire plusieurs bénéfices, au nombre desquels on peut
citer une stimulation de la croissance, une amélioration de la nutrition minérale, une plus grande résistance à
la sécheresse et une protection contre les agents pathogènes et le stress lié aux métaux lourds.
Plusieurs études ont montré que les champignons mycorhizogènes sont sensibles aux polluants tels que les
éléments traces métalliques et les hydrocarbures aromatiques polycycliques, ainsi qu'aux boues d'épuration,
et ce même en l'absence d'effets phytotoxiques observés sur la plante hôte. Les champignons
mycorhizogènes remplissant la plupart des critères requis des organismes bio-indicateurs (ubiquité dans le
sol, sensibilité aux polluants, rôle écologique pertinent dans la santé des plantes et au sein des écosystèmes),
il est apparu important de les prendre en considération dans l'appréciation de la toxicité et des risques
environnementaux liés aux polluants, aux sols contaminés et à l'utilisation de boues d'épuration en agriculture.
La germination des spores chez un champignon mycorhizogène à arbuscules, Glomus mosseae, forme la
base de l'essai proposé. Cet essai concerne la première phase de la symbiose, tandis qu'un autre essai, basé
sur la colonisation racinaire de la plante hôte, est également en cours d'étude.
Cet essai peut être réalisé directement avec des boues ou des sols sans aucune étape d'extraction.

vi © ISO 2009 – Tous droits réservés

SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 10832:2009(F)

Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des
champignons mycorhizogènes — Essai de germination des
spores
1 Domaine d'application
La présente Spécification technique spécifie une méthode d'évaluation des effets de polluants sur la
germination des spores d'un champignon mycorhizogène, Glomus mosseae. Ce bio-essai de toxicité aiguë
directe permet d'évaluer les effets potentiels de polluants et de sols contaminés sur des micro-organismes
bénéfiques du sol qui sont importants pour la croissance des plantes dans le concept d'une agriculture
durable.
La présente Spécification technique est applicable:
⎯ aux substances chimiques, et
⎯ aux sols contaminés, aux déchets, aux mélanges sol-déchets et aux boues.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l'évaluation en laboratoire des processus,
de la biomasse et de la diversité microbiens
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 11263, Qualité du sol — Dosage du phosphore — Dosage spectrométrique du phosphore soluble dans
une solution d'hydrogénocarbonate de sodium
ISO 11268-1, Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre (Eisenia fetida) — Partie 1:
Détermination de la toxicité aiguë en utilisant des substrats de sol artificiel
ISO 11274, Qualité du sol — Détermination de la caractéristique de la rétention en eau — Méthodes de
laboratoire
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
3 Termes, définitions et termes abrégés
Pour les besoins du présent document, les termes, définitions et termes abrégés suivants s'appliquent.
3.1
champignon mycorhizogène
micro-organisme ubiquiste formant une association symbiotique avec les racines d'espèces de plantes
vasculaires
3.2
BEG
IBG
Banque internationale des gloméromycètes
3.3
spore
unité reproductive asexuée d'un champignon
3.4
sporocarpe
groupe de spores entouré de mycélium
3.5
mycélium
réseau ramifié formé d'hyphes
3.6
hyphes
filaments qui composent le mycélium d'un champignon
3.7
substrat témoin
substrat inerte n'affectant pas la germination des spores, utilisé comme témoin ou diluant
3.8
matrice
sol, boues ou déchets soumis à essai
3.9
sandwich
dispositif formé de deux membranes filtrantes en nitrocellulose contenant les spores
NOTE Les deux membranes sont maintenues ensemble au moyen de deux cadres de diapositive.
3.10
coloration au bleu trypan
coloration non vitale au bleu trypan utilisée pour rendre visibles les structures des champignons
mycorhizogènes (colorées en bleu)
3.11
mélange d'essai
mélange d'une substance ou d'une matrice d'essai avec un substrat témoin
3.12
concentration d'inhibition
CI
x
concentration de substance ou de matrice d'essai induisant une inhibition de x % de la germination des
spores par rapport au témoin
NOTE La «fraction massique» est généralement connue sous le terme «concentration» dans les méthodes
biologiques.
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4 Méthodes d'essai
4.1 Principe
Des spores de Glomus mosseae sont placées entre deux membranes filtrantes en nitrocellulose, formant un
sandwich (3.9) que l'on place dans une boîte de Petri contenant le mélange d'essai (3.11) qui contient la
substance ou la matrice d'essai (3.8) à différentes concentrations, diluée ou non avec le substrat témoin (3.7).
Le pourcentage de spores germées est déterminé au bout de 14 jours.
Les résultats sont comparés à un substrat témoin et utilisés pour estimer la concentration d'inhibition à 50 %
(CI ) de la germination des spores.
La détermination d'une autre CI est également possible, mais pas nécessaire.
x
NOTE La présente méthode peut être utilisée pour déterminer l'effet d'une concentration unique.
4.2 Conditions normales
Utiliser une chambre de culture ou une pièce climatisée à (24 ± 2)°C.
L'incubation est effectuée à l'obscurité (chambre obscure ou boîtes de Petri entourées de papier d'aluminium).
5 Matériaux d'essai
5.1 Eau distillée
Il convient que le pH de l'eau distillée soit neutre et jamais inférieur à 5,5.
5.2 Matériel biologique
5.2.1 Champignon
Groupe taxonomique: Eumycota, ordre des Gloméromycètes (Glomeromycota).
Espèce: Glomus mosseae (Nicolson & Gerdeman) Gerdeman & Trappe (BEG 12).
5.2.2 Stade de vie
Utiliser des spores matures.
5.2.3 Identification
Numéro d'identification Genbank: U96139 (sous-unité 18S de l'ADNr); YO7656 (séquence partielle de la
sous-unité 25S de l'ADNr) (25, 26).
5.2.4 Matériel
1)
Utiliser des sporocarpes (3.4) contenant des spores (3.3) (voir Figure 1) achetés dans le commerce . Utiliser
des cultures en pot de moins de cinq mois pour extraire les sporocarpes.
Le pourcentage de germination des spores doit être supérieur à 75 %. Conserver les spores et les
sporocarpes dans de l'eau distillée (5.1) à 4 °C.

1) Les sporocarpes du champignon Glomus mosseae, produits et distribués par BioRize, sont un exemple de produit
approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs du présent document et ne
signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
Les sporocarpes doivent être utilisés dans un délai d'une semaine et les spores dans un délai de deux jours.
5.3 Substrat témoin
Utiliser du sable ou un sol artificiel conformément à l'ISO 11268-1 comme substrat témoin (3.7).
Utiliser un sable d'une teneur en silice supérieure à 99 %, de pH compris entre 6,6 et 7,5, d'une granulométrie
de 0,8 mm à 1,6 mm, lavé trois fois à l'eau distillée (pH > 6) (5.1) puis séché. Le pH final doit être supérieur
à 6 (voir l'ISO 10390).
Vérifier que la germination des spores dans le substrat témoin avant la mise en place du bio-essai est
supérieure à 75 %.
5.4 Substance de référence
Utiliser le nitrate de cadmium (CdNO , 4H O).
3 2
À titre d'information, la valeur de CI dans le sable, mesurée au cours d'un essai comparatif (n = 4) réalisé
−1 −1
avec du nitrate de cadmium, était comprise entre 0,15 mg·kg et 1,7 mg·kg .
5.5 Bleu trypan
2)
Utiliser le bleu trypan , 0,5 g dans 50 ml de HCl 1 %, 450 ml d'eau et 500 ml de glycérol.

a)  Sporocarpes b)  Sporocarpe ouvert

c)  Spore intacte d)  Spore abîmée
Figure 1 — Sporocarpes et spores de Glomus mosseae

2) Le bleu trypan référencé 93595, distribué par Sigma Aldrich, est un exemple de produit approprié disponible sur le
marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO
approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
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5.6 Appareillage
5.6.1 Microscope binoculaire, grandissement × 32.
5.6.2 Boîtes de Petri stériles en plastique, diamètre 9 cm.
5.6.3 Cadres de diapositive, 24 mm × 36 mm.
5.6.4 Membranes filtrantes en nitrocellulose, diamètre 47 mm, porosité 0,45 µm, blanches, quadrillage
3 mm.
3)
5.6.5 Pinces ultra-fines .
5.6.6 Papier filtre.
5.6.7 Microtube en plastique, de contenance 1,5 ml.
5.6.8 Film plastique.
5.6.9 Micropipette et pointes coupées à l'extrémité.
5.6.10 Balance, capable de peser de 0 g à 200 g avec une précision de 0,001 g.
5.6.11 Entonnoir.
6 Conservation et préparation des échantillons
Les échantillons de sol doivent être conservés comme spécifié dans l'ISO 10381-6. Les échantillons de
déchets et de boues sont conservés à (4 ± 2) °C dans des récipients hermétiques. Il convient de ne pas
remplir complètement les récipients utilisés pour les boues et déchets microbiologiquement actifs.
Il convient de déterminer les paramètres suivants pour les sols, les déchets et les boues devant être soumis à
essai:
⎯ pH (voir l'ISO 10390); utiliser un sol dont le pH n'est pas inférieur à 5,5 (voir Référence [18]);
⎯ teneur en eau (voir l'ISO 11465);
⎯ capacité de rétention d'eau (voir l'ISO 11274);
⎯ teneur en phosphore disponible (voir l'ISO 11263);
−1
⎯ la concentration en phosphore soluble doit être inférieure à 100 mg·kg (voir Références [1], [2], [7]
et [23]).
Utiliser des sols ou des déchets de granulométrie inférieure à 4 mm pour réaliser le bio-essai; sinon, il
convient de broyer les déchets et de les passer au tamis de 4 mm et de passer les sols au tamis de 4 mm
avant de préparer le mélange d'essai.

3) Les pinces coupantes ultra-fines référencées T5130 n°5, distribuées par Oxford Instruments, sont un exemple de
produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs du présent document
et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
7 Mode opératoire
7.1 Système biologique
7.1.1 Contrôle des spores
Il convient que les spores de Glomus mosseae (3.3) soient jaunes et brillantes et que leur enveloppe soit
propre et intacte (il convient d'éliminer les spores vides et écrasées). Voir également Figure 1.
7.1.2 Préparation du matériel biologique
Nombre de spores individuelles pour chaque concentration testée: 30 spores (3.3) par sandwich (3.9), six
réplicats (sandwich) par concentration, soit 180 spores par concentration.
Les spores (3.3) sont collectées avec soin sous un microscope binoculaire (5.6.1) à partir des sporocarpes
(3.4) qui sont placés sur un papier filtre (5.6.6) légèrement humidifié pour que les spores y adhèrent. Les
sporocarpes sont ouverts avec précaution à l'aide de pinces ultra-fines (5.6.5) et les spores peuvent être
prélevées et transférées dans un microtube (5.6.7) contenant de l'eau distillée (5.1).
Une membrane de filtration (5.6.4) humidifiée avec de l'eau distillée (5.1) est placée sur un papier filtre (5.6.6)
humidifié sous un microscope binoculaire (5.6.1). À l'aide d'une micropipette (5.6.9), les spores de Glomus
mosseae (3.3), prélevées dans le microtube (5.6.7), sont placées au centre de cette membrane, à l'intérieur
des carrés qui sont définis par le cadre de diapositive (une spore par carré défini par le quadrillage) (voir
Figure A.1). Les spores sont soigneusement couvertes d'une seconde membrane de filtration préalablement
humidifiée en veillant à ce que les quadrillages des deux membranes soient superposés. Les deux
membranes sont maintenues ensemble à l'intérieur de deux cadres de diapositive (5.6.3) pour former un
sandwich.
Il convient de placer rapidement les sandwiches de spores (3.9) dans les boîtes de Petri comme décrit en 7.3.
7.2 Préparation du mélange d'essai
7.2.1 Généralités
Le mélange d'essai (3.11) est composé du substrat témoin (3.7) et de la substance ou de la matrice (3.8)
devant être soumise à essai. Préparer une quantité suffisante de solution ou de mélange d'essai avec la
matrice.
7.2.2 Substances solubles dans l'eau ou émulsifiables
Pour chaque concentration soumise à essai, dissoudre ou diluer la quantité de substance d'essai nécessaire
pour obtenir la concentration voulue dans l'eau distillée (5.1).
Cette solution est ajoutée à une boîte de Petri contenant 80 g de substrat témoin (5.3) pour obtenir 90 % de la
capacité de rétention d'eau du mélange d'essai (3.11). Voir Figure 2.
Procéder en deux étapes, comme indiqué en 7.3.1.
L'essai de contrôle est réalisé avec de l'eau distillée (5.1), de la manière décrite ci-dessus.
Procéder comme spécifié en 7.3.
7.2.3 Substances insolubles dans l'eau et solubles dans un solvant organique
Pour chaque concentration soumise à essai, dissoudre ou diluer la quantité de substance d'essai nécessaire
pour obtenir la concentration voulue dans un solvant volatil (par exemple du méthanol).
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Cette solution est mélangée à 10 g de substrat témoin (5.3) (échantillon préalablement prélevé sur la quantité
utilisée pour préparer le mélange d'essai). Faire évaporer le solvant organique sous une hotte à aspiration
pendant 24 h. Transférer le mélange d'essai (3.11) dans un flacon contenant le reste du mélange d'essai et
homogénéiser avec soin.
Une quantité de 80 g de ce mélange est humidifiée à 90 % de la capacité de rétention d'eau avec de l'eau
distillée
...