ISO 21286:2019
(Main)Soil quality — Identification of ecotoxicological test species by DNA barcoding
Soil quality — Identification of ecotoxicological test species by DNA barcoding
This document specifies a protocol to identify ecotoxicological test specimens (mainly invertebrates and plants) to the species level, based on the DNA barcoding technique. This protocol can be used by laboratories performing DNA barcoding in order to standardize both the wet-lab and data analysis workflows as much as possible, and make them compliant with community standards and guidelines. This document does not intend to specify one particular strain for each test method, but to accurately document the species/strain which was used. NOTE 1 This does not imply that DNA barcoding is performed in parallel to each test run, but rather regularly (e.g. once a year, such as reference substance testing) and each time a new culture is started or new individuals are added to an ongoing culture. This document does not aim at duplicating or replacing morphological-based species identifications. On the contrary, DNA barcoding is proposed as a complementary identification tool where morphology is inconclusive, or to diagnose cryptic species, in order to ensure that the results obtained from different ecotoxicological laboratories are referring to the same species or strain. This document is applicable to identifications of immature forms which lack morphological diagnostic characters (eggs, larvae, juveniles), as well as the streamline identification of specimens collected in field monitoring studies, where large numbers of organisms from diverse taxa are classified. NOTE 2 In principle, all species regularly used in ecotoxicological testing can be analysed by DNA barcoding. Besides the earthwoms Eisenia fetida and E. andrei, further examples for terrestrial species are Lumbricus terrestris, L. rubellus, Allolobophora chlorotica, Aporrectodea rosea, and A. caliginosa, Dendrodrilus rubidus, Enchytraeus albidus, and E. crypticus (Haplotaxida); Folsomia candida, F. fimetaria, Proisotoma minuta, and Sinella curviseta (Collembola); Hypoaspis aculeifer and Oppia nitens (Acari); Aleochara bilineata and Poecilus cupreus (Coleoptera); Scathophaga stercoraria, Musca autumnalis (Diptera) or Pardosa sp. (Arachnida). Nematodes or snails and even plants can also be added to this list.
Qualité du sol — Identification des espèces par codes-barres ADN dans les essais d'écotoxicologie
Le présent document spécifie un protocole d'identification de spécimens d'essais écotoxicologiques (principalement des invertébrés et des végétaux) au niveau de l'espèce, reposant sur la technique du code-barres ADN. Ce protocole peut être utilisé par les laboratoires effectuant le code-barres ADN afin de normaliser le plus possible les travaux de laboratoire et les flux d'analyse de données, et de les mettre en conformité avec les normes et les lignes directrices communautaires. Le présent document ne prévoit pas de spécifier une souche particulière pour chaque méthode d'essai, mais de documenter avec exactitude l'espèce/la souche qui a été utilisée. NOTE 1 Cela ne veut pas dire que le code-barres ADN est effectué parallèlement à chaque cycle d'essai, mais qu'il est effectué régulièrement (par exemple, une fois par an, notamment pour l'essai mené avec la substance de référence) et à chaque fois qu'une nouvelle culture est démarrée ou que de nouveaux individus sont ajoutés à une culture existante. Le présent document ne vise pas à reproduire ou remplacer les identifications d'espèces reposant sur des caractéristiques morphologiques. En revanche, le code-barres ADN est proposé comme outil d'identification complémentaire lorsque l'identification morphologique est incertaine, ou pour diagnostiquer les espèces cryptiques, afin d'assurer que les résultats obtenus auprès de différents laboratoires d'écotoxicologie font référence à la même espèce ou souche. Le présent document est applicable à l'identification de formes immatures n'ayant pas de caractéristiques morphologiques de diagnostic (œufs, larves, juvéniles) ainsi qu'à l'identification rationalisée des spécimens prélevés lors d'études de surveillance sur le terrain, où un grand nombre d'organismes de taxons divers sont classés. NOTE 2 En principe, toutes les espèces régulièrement utilisées lors des essais écotoxicologiques peuvent être analysées par code-barres ADN. Outre les vers de terre Eisenia fetida et E. andrei, d'autres exemples d'espèces terrestres sont Lumbricus terrestris, L. rubellus, Allolobophora chlorotica, Aporrectodea rosea, A. caliginosa, Dendrodrilus rubidus, Enchytraeus albidus et E. crypticus (Haplotaxida) ; Folsomia candida, F. fimetaria, Proisotoma minuta et Sinella curviseta (Collembola) ; Hypoaspis aculeifer et Oppia nitens (Acari) ; Aleochara bilineata et Poecilus cupreus (Coleoptera) ; Scathophaga stercoraria, Musca autumnalis (Diptera) ou Pardosa sp. (Arachnida). De plus, les nématodes ou les escargots et même les plantes peuvent être ajoutés à cette liste non exhaustive.
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21286
First edition
2019-03
Soil quality — Identification of
ecotoxicological test species by DNA
barcoding
Qualité du sol — Identification des espèces par code-bare ADN dans
les essais d'écotoxicologie
Reference number
©
ISO 2019
© ISO 2019
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Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents and material . 3
5.1 Biological material . 3
5.2 Enzyme . 3
5.3 Oligonucleotide PCR primers . 3
5.4 Reagents. 3
6 Apparatus . 4
7 General requirements . 5
7.1 Experimental precaution and contamination avoidance . 5
7.2 Safety precautions . 5
7.2.1 Chemical hazards. 5
7.2.2 Physical hazards . 6
8 Procedure. 6
8.1 DNA isolation . 6
8.2 Quantification . 7
8.3 PCR . 7
8.3.1 Target genomic region . 7
8.3.2 Primer design . 7
8.3.3 Primer synthesis . 7
8.3.4 PCR . 8
8.4 Checking the amplicon size . 9
8.5 Purification . 9
8.6 Sequencing . 9
8.7 Bioinformatics . 9
8.7.1 General. 9
8.7.2 Electropherogram or raw sequence quality checking .10
8.7.3 Trimming of low-quality regions and primers sequences .10
8.7.4 Sequence overlapping .10
8.7.5 Sequence verification . .11
8.7.6 Reviewing the edited sequence .11
8.7.7 Species assignment .11
8.7.8 Quality of the reference databases .12
9 Calculation and expression of results .13
10 Validity of the test .13
11 Test report .14
Annex A (informative) Eisenia Barcoding Initiative: A ring test to evaluate the applicability
of DNA barcoding for the identification of Eisenia species .15
Bibliography .18
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: www .iso .org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological characterization.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2019 – All rights reserved
Introduction
Currently, test species identification is usually based on morphological characters. However, this does
not always give clear results because
a) few taxonomic experts are available,
b) closely related species can differ by a few, easily overlooked characters, and
c) even more importantly, several test species are in fact complexes of cryptic species.
A good example is the compost worm Eisenia fetida/andrei (used in ISO 11268-1, ISO 11268-2 and
ISO 17512-1), in which morphological traits alone may not be sufficient to discriminate between both
[5][36] [50]
species . Another well-known case is the predatory mite, Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer ,
[31]
which might get confused with H. miles, widely used in biological pest control .
Species misidentifications, the use of a morphospecies which is actually a complex of cryptic species, or
even species mixing in lab cultures, can be a serious problem for the reliability of the ecotoxicological
tests. Sibling species in a morphospecies complex can exhibit ecological, behavioural, and physiological
differences, and can differ also in their response to toxicants (e.g. References [2], [17], [35], [40]). This
also seems to be the case of the springtail Folsomia candida (used in ISO 11267 and ISO 17512-2), in
which considerable levels of genetic differentiation have been found among natural populations of F.
[9][19][41]
candida and among laboratory strains . Although different laboratory strains have been found
[12][9]
to exhibit only minor differences in the sensitivity towards some chemicals , other studies have
detected significant variation in phenmedipham avoidance behaviour and divergent fitness responses
[14][30]
to cadmium exposure among genetically differentiated strains . Moreover, even if two species
have similar responses to toxicants, the presence of two species within the same laboratory culture can
[36]
result in the production of sterile hybrids, which will bias the outcome of reproduction tests .
Implementing species identification via DNA barcoding can help to overcome these obstacles, ensuring
that the species or strain used for testing is well characterized. As a result, quality assurance can be
improved, making the results obtained by different ecotoxicological laboratories far more reliable and
comparable. For Eisenia fetida/E. andrei this work, including an international ringtest, has already been
[36]
performed , see Annex A. The conclusions of this ringtest can be summarized as follows.
— DNA barcoding is a reliable and practical method for identifying Eisenia species.
— Only 17 out of 28 ecotoxicological laboratories were correct in their taxonomic assignment. Most
laboratories with wrong or unknown assignments actually have E. andrei in stock.
— The existence of a cryptic species pair within E. fetida is a plausible hypothesis.
— It is important that earthworms used for ecotoxicological tests are regularly (re-)identified by DNA
barcoding.
Very probably, similar experiences and recommendations can be drawn for other invertebrates
species used in terrestrial ecotoxicology, as well as plants. Indeed, DNA barcoding has proven to be
useful for specimen identification and species delimitation in many organism groups, including other
[13][37] [16] [15] [32] [42] [28]
earthworms , enchytraeids , mites , collembolans , molluscs , nematodes and
[8]
terrestrial plants .
INTERNATIONAL STANDARD ISO 21286:2019(E)
Soil quality — Identification of ecotoxicological test species
by DNA barcoding
1 Scope
This document specifies a protocol to identify ecotoxicological test specimens (mainly invertebrates
and plants) to the species level, based on the DNA barcoding technique. This protocol can be used by
laboratories performing DNA barcoding in order to standardize both the wet-lab and data analysis
workflows as much as possible, and make them compliant with community standards and guidelines.
This document does not intend to specify one particular strain for each test method, but to accurately
document the species/strain which was used.
NOTE 1 This does not imply that DNA barcoding is performed in parallel to each test run, but rather regularly
(e.g. once a year, such as reference substance testing) and each time a new culture is started or new individuals
are added to an ongoing culture.
This document does not aim at duplicating or replacing morphological-based species identifications. On
the contrary, DNA barcoding is proposed as a complementary identification tool where morphology is
inconclusive, or to diagnose cryptic species, in order to ensure that the results obtained from different
ecotoxicological laboratories are referring to the same species or strain.
This document is applicable to identifications of immature forms which lack morphological diagnostic
characters (eggs, larvae, juveniles), as well as the streamline identification of specimens collected in
field monitoring studies, where large numbers of organisms from diverse taxa are classified.
NOTE 2 In principle, all species regularly used in ecotoxicological testing can be analysed by DNA barcoding.
Besides the earthwoms Eisenia fetida and E. andrei, further examples for terrestrial species are Lumbricus
terrestris, L. rubellus, Allolobophora chlorotica, Aporrectodea rosea, and A. caliginosa, Dendrodrilus rubidus,
Enchytraeus albidus, and E. crypticus (Haplotaxida); Folsomia candida, F. fimetaria, Proisotoma minuta, and Sinella
curviseta (Collembola); Hypoaspis aculeifer and Oppia nitens (Acari); Aleochara bilineata and Poecilus cupreus
(Coleoptera); Scathophaga stercoraria, Musca autumnalis (Diptera) or Pardosa sp. (Arachnida). Nematodes or
snails and even plants can also be added to this list.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
amplicon
specific DNA product generated by PCR (3.5) using one pair of PCR primers (3.6)
3.2
DNA barcode
unique pattern of DNA sequence that identifies each species
3.3
electropherogram
trace file
combination of a graphical representation of a Sanger DNA sequence composed of colour-coded peaks
with each colour corresponding to one nucleotide
Note 1 to entry: They are automatically supplied by DNA sequencing programs.
3.4
Phred quality score
Q score
quality measure used to assess the accuracy of a sequencing reaction
Note 1 to entry: This quality measure indicates the probability that a given base is called incorrectly by the
sequencer. Phred scores are on a logarithmic scale. Therefore, if Phred assigns a Q score of 30 (Q30) to a base, this
is equivalent to the probability of an incorrect base call 1 in 1 000 times. A lower base call accuracy of 99 % (Q20)
will have an incorrect base call probability of 1 in 100, meaning that every 100 base pairs sequencing read will
likely contain an error.
3.5
polymerase chain reaction
PCR
molecular biology technique for rapidly synthesising multiple copies of a given DNA segment by using a
DNA polymerase and an oligonucleotide primer pair
3.6
PCR primer
short oligonucleotides (usually 15 to 30 nucleotides in length) that allow PCR amplification of DNA
between specific sites
Note 1 to entry: The two primers (a forward and a reverse) are base-paired to the top and bottom strand of the
template DNA, and their 3’-OH ends are in convergent direction.
4 Principle
DNA barcoding is a molecular method that uses a short and standardized DNA region (the DNA barcode)
[22]
as a genetic tag for species-level identification .
Since its inception in 2003 and the launch of the Barcode of Life project, DNA barcoding has
systematically been applied not only to biological research, but also to several industrial fields where
a correct identification of biological materials is essential, such as the food industry. For example, it
[29]
is helping to detect fraud in herbal medicinal products , and it has been adopted by the Food and
[21][44]
Drug Administration (FDA) for seafood and fish identification . In fact, DNA barcoding is likely to
[20]
become a routine test in many fields, in particular in food quality control and traceability .
Briefly, the goal of DNA barcoding is:
a) to obtain the nucleotide sequence of a standardised DNA region from an unidentified sample (a test
specimen),
b) to compare that sequence with known sequences in a reference database by using bioinformatic
methods, and
c) based on such comparison, to identify the sample to the species level.
Therefore, DNA barcoding cannot be a useful identification tool without a reliable and comprehensive
reference database, which includes enough samples of each species from across its geographic range to
account for intraspecific variability. Also, DNA barcoding relies on the premise that sequences in this
barcode region are more similar between members of a species than to sequences of any other species
(the so called barcode gap). Therefore, before applying DNA barcoding, a species delimitation study
2 © ISO 2019 – All rights reserved
of the target organismal group should have been carried out to assess its efficacy for discriminating
species.
It is essential that the DNA barcoding method is carried out by trained staff. On the one hand, trained
laboratory technicians are needed to optimize the wet-lab protocols for each organismal group.
On the other hand, the wet-lab pipeline needs to be supervised by scientists trained in genomics
and systematics. These scientists should also be in charge of the electropherogram and/or raw DNA
sequence file analysis and species assignment.
5 Reagents and material
5.1 Biological material
Adequate specimen preservation is a critical factor to obtain good-quality DNA from samples. Whenever
possible, specimen samples for DNA barcoding should be taken from freshly harvested or fresh-frozen
tissue. Exposure to preservation agents such as ethyl acetate or formaldehyde should be avoided, as
they destroy DNA.
Freezing at –80 °C or in liquid nitrogen (−196 °C) is the preferred method for long-term storage of
tissue samples. DNA in dried specimens generally remains stable for at least one year, but degradation
[23]
becomes increasingly problematic over time .
Ethanol-preserved material is easily analysed when fresh, but DNA will slowly become acidified and
degraded unless ethanol is regularly refreshed or buffered. For proper tissue preservation, use an
ethanol concentration of 95 % to 99 %, and ensure that the volume of ethanol is at least three times
greater than the volume of tissue. In order to maintain the ethanol concentration to at least 95 %, it is
necessary to replace the ethanol solution within the first days (at least three days) after sampling, and
[23]
tightly seal the vial to avoid evaporation . A combination of low temperatures (–20 °C) and ethanol
will help preserve the samples for long-term storage and helps prevent degradation during thawing and
re-freezing cycles.
As a general rule, DNA barcoding analysis should follow tissue collection as soon as possible, but specimens
[21][23]
adequately preserved and stored for several months will perform well in DNA extraction .
5.2 Enzyme
Taq Polymerase from Thermus aquaticus is standard for PCR. Hot start Taq polymerases and/or high
fidelity DNA polymerases have been shown to offer a high performance in DNA barcoding, allowing
for greater amplification sensitivity and increased ease of reaction setup than standard polymerases
(http: //ccdb .ca/resources/).
Alternatively, pre-optimised commercial master mixes may be used. These consist of a premixed,
ready-to-use solution containing Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl and reaction buffers at optimal
concentrations for efficient amplification of DNA templates in routine PCR.
5.3 Oligonucleotide PCR primers
For Oligonucleotide PCR primers, see 8.3.2 and 8.3.3.
5.4 Reagents
5.4.1 Nuclease-free water molecular grade water (dd H O).
5.4.2 TE buffer (Tris-EDTA buffer), 1-fold, pH 8,0.
Dissolve 1 ml of 1 mol/l Tris base (pH 8,0), 0,2 ml EDTA (0,5 mol/l) in 98,8 ml of molecular grade water.
Adjust the pH to 8,0 with concentrated HCl.
5.4.3 Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs).
5.4.4 PCR buffer, without Mg (500 mmol/l KCl, 100 mmol/l Tris-HCl, pH 8,3 at 25 °C).
Buffer is usually supplied with each enzyme as a 10-fold or fivefold concentrate. Use only the buffer
supplied with each particular enzyme.
5.4.5 Magnesium chloride, MgCl .
5.4.6 PCR additives (optional): trehalose dihydrate, bovine serum albumin (BSA), formamide,
dimethyl sulfoxide (DMSO).
5.4.7 Agarose (analytical grade, standard melting temperature).
5.4.8 TAE (gel-running buffer), 50-fold stock solution, pH 8,3.
Dissolve 242 g of Tris base [tris(hydroxymethyl)aminomethane], 57,1 ml of glacial acetic acid
(17,4 mol/l), 100 ml of 500 mmol/l EDTA solution (pH 8,0) in 842,9 ml of molecular grade water.
5.4.9 Size standard 100 base pair (bp) DNA ladder, a commercially available molecular-weight
marker suitable for sizing double-stranded DNA from 100 to 1 000 base pairs during gel electrophoresis.
5.4.10 6-fold Loading buffer, 3 ml of 100 % glycerol, 0,025 g of bromophenol blue, 0,025 g of xylene
cyanol FF in 7 ml of molecular grade water.
5.4.11 Ethidium bromide solution (0,5 μg/ml) or any safer alternative nucleic acid stain.
5.4.12 PCR purification kit, either using enzymatic reactions, magnetic beads or silica-membrane-
based cleanup.
5.4.13 5-fold Sequencing buffer (400 nm Tris-HCl, pH 9,0, 10 mmol/l MgCl ).
1)
5.4.14 BigDye® Terminator v3.1 cycle sequencing kit .
1)
5.4.15 Pop-7 Polymer for 3730 DNA analyzers .
1)
5.4.16 3730 DNA analyser capillary array, 50 cm .
1)
5.4.17 GeneScanTM 500 LIZTM DYE Size Standard .
5.4.18 Highly deionized formamide.
6 Apparatus
The usual laboratory equipment, including micropipettes, centrifuge, and the following specific
equipment.
6.1 Spectrophotometer, to measure the concentration and purity of double-stranded DNA at 260 nm.
1) This protocol has been validated using the 3730 DNA Analyzer capillary electrophoresis system and the
BigDye terminator chemistry. They are registered trademarks of Applied Biosystems. This information is given for
the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named.
Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
4 © ISO 2019 – All rights reserved
6.2 Laminar flow hood.
6.3 PCR thermal cycler.
6.4 Horizontal electrophoresis system.
6.5 Electrophoresis power supply.
6.6 Gel documentation system.
6.7 Automated DNA sequencing system, for DNA sequencing (e.g. 3730 DNA analyser, Applied
2)
Biosystems) .
7 General requirements
7.1 Experimental precaution and contamination avoidance
Good laboratory practice and specific anti-contamination strategies are necessary to minimize
the chance of contamination during the DNA isolation and PCR steps, either from DNA previously
handled in the laboratory, amplicon carry-over from previous PCR assays, or sample-to-sample cross-
contamination.
There are some basic steps to be followed to prevent exogenous contamination and sample carry-over:
work on a clean surface, wear gloves, and use disposable or sterilised instruments. If possible, laboratories
should use separate rooms – or, at least, different benchtops and work spaces of the laboratory – for
template extraction, PCR reagent preparation, and amplification. Work shall always flow from the
cleanest to the dirtiest area. Each work area should have dedicated supplies and reagents, as well as lab
coats and gloves. It is recommended that the setting up of PCR reactions is performed in a laminar flow
hood. It is also necessary to use sterile plastic-ware and aerosol-resistant filtered pipette tips.
When handling multiple specimens, care shall be taken to avoid cross-contamination between samples.
Anything (gloves, surfaces) that comes in contact with one sample shall be discarded or cleaned before
proceeding with the next one by wiping it with 1 % bleach solution and then thoroughly rinsing it with
water. Tools used to collect a fragment of tissue (tweezers, scissors, scalpels, etc.) shall be sterilized
before and after handling each sample. To do so, soak the instruments into ethanol (70 % to 96 %) and
then hold them briefly over the flame of a Bunsen burner or a lighter to burn off the alcohol.
7.2 Safety precautions
7.2.1 Chemical hazards
WARNING 1 — Ethidium bromide (EtBr) staining is commonly used to visualize DNA in agarose
gels. EtBr is a potential mutagen and is a skin, eye, and respiratory irritant. Avoid direct skin
contact, wear nitrile gloves, and use adequate eye protection. All staining of gels should be
done in a designated area in the laboratory, and all EtBr waste should be disposed of in labelled
containers.
2) This protocol has been validated using the 3730 DNA Analyzer capillary electrophoresis system and the
BigDye terminator chemistry. They are registered trademarks of Applied Biosystems. This information is given for
the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named.
Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
WARNING 2 — In the past few years, diverse alternatives to EtBr (e.g. GreenSafe®, Sybr® Safe,
3)
GelRed™) have become commercially available. These products are generally considered to be
less hazardous than EtBr. They are, however, still mutagenic and should also be handled and
disposed of with care.
WARNING 3 — Formamide used in sequencing reactions causes eye, skin, and respiratory tract
irritation. It is a possible developmental and birth defect hazard. When handling formamide,
wear appropriate protective eyewear, clothing, and gloves.
7.2.2 Physical hazards
Electrophoresis experiments present a potential electrical hazard if used incorrectly. Electrophoresis
units and their power supplies shall be routinely inspected to ensure that they are working properly,
that wires, leads, and connectors are undamaged and properly insulated, and that buffer tanks
have no cracks or leaks. During electrophoresis, since any wet surface can become conductive, it is
recommended not to touch any part of the equipment (tank, wires) while the power supply is on.
Ultraviolet (UV) transilluminators are often used to visualize fluorescent dyes used in gel
electrophoresis and pose potential exposures to UV radiation. Laboratory coats, gloves and appropriate
glasses and face visor shall be worn if there is any risk of exposure, especially when using unshielded
transilluminators.
8 Procedure
8.1 DNA isolation
This process can either be carried out by using a commercial DNA isolation kit or by following a
standard DNA isolation protocol. The DNA isolation kit or protocol can be selected depending on the
specific features of the sample. For instance, for fresh or recently collected tissue a Chelex-based DNA
release method usually provides enough DNA for DNA barcoding. However, for archival samples or
very small specimens, more sensitive approaches should be used (e.g. silica membrane-based DNA
[23]
extraction methods) . Using commercial kits can be helpful, as the pre-prepared reagents facilitate
the standardization of the technique.
In the case of minute organisms (i.e. length < 0,5 cm) — such as collembolans, mites, or small insects
— the entire specimen may be processed. For larger organisms, various body parts can be selected,
including muscle biopsies, abdomen, legs, antennae, or eggs. When possible, external body surfaces, the
digestive tract and body parts containing hairs, bristles, or hardened exoskeletons, should be avoided.
For earthworms, potworms, and other annelids, it is recommended to keep the specimens for about
24 h on moist filter-paper before tissue sampling, so their gut contents are evacuated.
DNA isolation from plant tissue can be challenging due to their high content in complex
polysaccharides, polyphenols, and other secondary metabolites that can affect DNA quality and inhibit
downstream reactions. Compounds such as CTAB (cetyl trimethylammonium bromide) and PVP
(polyvinylpyrrolidone) can aid in removing polysaccharides and polyphenols, respectively, and are
therefore widely used in plant DNA isolation buffers.
Detailed protocols for DNA isolation from either animal or plant tissues can be found in Reference [43]
and at the DNA barcoding website of the DNA Learning Center (http: //www .dnabarcoding101 .org/).
A negative control (with no tissue) shall be run in parallel with all batches of sample extraction, in
order to detect DNA contamination of the analytical reagents or sample-to-sample contamination. This
3) GreenSafe®, Sybr® Safe, GelRed™ are registered trademarks of NZYTech, Thermo Fisher Scientific, and Biotium,
respectively. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an
endorsement by ISO of the product named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the
same results.
6 © ISO 2019 – All rights reserved
negative control shall be processed through the DNA isolation and PCR steps, in parallel with the test
samples.
8.2 Quantification
After DNA isolation, the yield and purity of the DNA sample should be determined by either
a) using a spectrophotometer equipped with a UV lamp, to measure sample absorbance at 260 nm, or
b) using a fluorometer that employs fluorescent DNA-binding dyes to specifically quantify double-
stranded DNA.
Typically, the DNA sample is diluted to 10 ng/µl using molecular grade water and should be stored at
−20 °C for extended periods, or at 4 °C until use.
8.3 PCR
8.3.1 Target genomic region
The target genomic region (or DNA barcode) varies across taxa. The standard DNA barcode for almost
all animal groups is a 658-base pairs region of the mitochondrial cytochrome c oxidase 1 gene (COI).
For land plants, a combination of the chloroplastic genes matK and rbcL has been recommended as the
[8]
plant DNA barcode , although the success of species discrimination using this combination can be
limited in certain plant groups.
Please note that the usual DNA barcode may not be sufficient in particular cases. In these cases,
additional genomic regions may be analysed.
8.3.2 Primer design
A critical factor in the PCR stage is the selection of appropriate primer pairs. Therefore, care shall be
taken when choosing or designing optimal primers.
The first step is to check the literature and databases (e.g. the BOLD Primer Database, available at http:
//www .boldsystems .org/index .php/Public _Primer _PrimerSearch) for existing primers that have been
successfully used to amplify the DNA barcode in the target organism group.
If there are no public primers available, or the selected primer pairs do not work on the target species,
then new primer pairs may be designed. Sequences of the same genomic region belonging to the same
or related taxa, publicly available in the BOLD database (http: //www .boldsystems .org/) and the
National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank database (https: //www .ncbi .nlm .nih
[45]
.gov/genbank), can be used for primer design. Free online resources such as Primer-BLAST are
a useful tool to find primers specific to the target genomic region. This program also checks primer
specificity against a user-selected database, to confirm that the designed primers do not amplify
genomic regions other than the specific target region.
8.3.3 Primer synthesis
Primers may be ordered from a primer supplier who specializes in the synthesis of oligonucleotides. A
standard desalting purification is sufficient for the primers used in DNA barcoding.
The primers are usually shipped and delivered in a lyophilized state in nanomoles quantity. Before
PCR, they should be centrifuged and resuspended in TE buffer or molecular grade water to make a
100 µmol/l stock. Alternatively, primers can be ordered already resuspended at a given concentration
(typically between 10 µmol/l to 100 µmol/l) from several manufacturers. In either case, resuspended
primers shall be dispensed into single-use aliquots and stored at −20 °C.
8.3.4 PCR
For standard PCR, reactions are set up in sterile, thin-walled 0,2 ml tubes or an equivalent PCR plate
format. The final concentrations of reagents for a typical PCR reaction, with a final volume of 25 µl, are
as follows (see Table 1).
Table 1 — Final concentrations of reagents for a typical PCR reaction, with a final volume of 25 µl
Volume
Reagent Initial concentration Final concentration
µl
PCR buffer 10-fold 2,5 1-fold
MgCl 50 mmol/l 0,75 1,5 mmol/l
dNTPs 2,5 mmol/l 2,0 0,2 mmol/l
Forward primer 0,1 mmol/l 0,125 0,5 µmol/l
Reverse primer 0,1 mmol/l 0,125 0,5 µmol/l
Taq polymerase 5 units/µl 0,125 0,025 units/µl
Template DNA 10 ng/µl 2,5 1 ng/µl
Nuclease-free sterile water 16,875
Always add water and buffer first and Taq polymerase last.
When multiple PCR reactions are set up simultaneously, it is useful to prepare a master mix that
contains all the reagents except for DNA template. This reduces preparation time and the potential for
pipetting errors. Make up enough master mix for the number of reactions to be amplified, and an extra
volume to allow for pipetting errors (as a rule of thumb, count one extra reaction every 10 samples).
Addition of PCR-enhancing agents in the PCR mix can increase the yield of the specific PCR product and
overcome the effect on PCR inhibitors present in the reaction. Some of these enhancers are trehalose,
bovine serum albumin (BSA), betaine, formamide or DMSO (e.g. References [18] and [39]). Alternatively,
pre-optimised commercial master mixes may be used.
The high sensitivity of PCR makes it especially vulnerable to trace contamination. Therefore, it is
necessary to use sterile tips (and preferably filter tips) for pipetting the PCR reagents. DNA templates
(and other PCR products) shall also be kept away from the PCR reagents while setting up the PCR
reaction mix. In addition, and besides the DNA isolation negative control, every set of reactions shall
include a PCR negative control, which contains all reagents except for the DNA template. This PCR
negative control is used to detect DNA contamination in the PCR reagents.
PCR is performed in a thermocycler (PCR block), according to the following program:
— one cycle of 4 min at 94 °C;
— 35 cycles of: 30 s at 94 °C, 40 s at specific annealing temperature (Ta) for the PCR primers, 1 min
at 72 °C;
— a final extension step at 72 °C for 5 min.
NOTE Primers T is usually set at 2 °C to 6 °C lower than their melting temperature, usually specified by the
a
primer supplier. Alternatively, T can be estimated using an online calculator (http: //tmcalculator .neb .com). Not
a
only the T , but also other PCR cycling parameters can be modified depending on the nature of the template DNA
a
or the DNA polymerases (see manufacturers’ recommendations).
Once completed the PCR reactions can be stored in the fridge at 4 °C. For long-term storage (i.e. more
than a week), freezing at −20 °C is recommended.
8 © ISO 2019 – All rights reserved
8.4 Checking the amplicon size
PCR success can be checked by agarose gel electrophoresis.
— Prepare a 0,5 % to 2 % agarose gel in TAE buffer and add 1 µl of nucleic acid stain per each 10 ml
of gel solution. A 0,7 % gel will show good separation (resolution) of large DNA fragments (5 kb to
10 kb), while a 2 % gel will show good resolution for small fragments (0,2 kb to 1 kb).
— Pipette 4 µl of each PCR product to a new tube, and add 1 µl of DNA loading buffer to each 4 µl
aliquot.
— Load 5 µl of each sample into the pre-cast gel wells.
— Include the appropriate size standard in one well.
— Run the electrophoresis and visualize the results under UV light in a gel documentation system.
A successful PCR reaction should yield a single sharp amplicon (of approximately 700 base pairs, in the
case of COI). Both the DNA isolation and the PCR negative controls should contain no bands.
Photograph and keep a picture of the gel (electronic and/or hard copy) for records.
8.5 Purification
The PCR products can require a purification step, in order to prepare good quality DNA templates for
sequencing. This step is intended to eliminate unspecific bands which may have been observed in the
gel. Unincorporated nucleotides and residual primers are also eliminated in this step.
Besides traditional ethanol precipitation, there are varied commercial kits for PCR product purification,
which can be based on an enzymatic reaction, magnetic beads or silica-membrane columns.
8.6 Sequencing
The PCR products or the purified PCR products may be sequenced with the same primers used for PCR.
Depending on the sequencing platform and reagents used, this step may need some optimization.
Assuming that most laboratories do not have access to Sanger sequencing equipment in-house, it is
recommended to send the purified PCR products to an external company, where the sequencing service
will be performed by professionally trained staff. The requirements of the sequencing services in
terms of volume and concentration of PCR products and sequencing primers should be checked with
the service provider. Typically, an automated capillary electrophoresis system will produce a sequence
read of circa 750 base pairs.
Whenever possible, PCR products should be sequenced bidirectionally. Bidirectional sequencing enables
the generation of full length barcode sequences by avoiding low-quality base calls which generally
occur towards the end of the reads. Based on a bi-directional sequencing, two electropherograms or
trace files (generally .ab1 files) are obtained per DNA barcode.
The electropherogram files or other applicable raw file format shall be saved and stored, since they
serve as quality control for the original DNA barcode sequences.
8.7 Bioinformatics
8.7.1 General
The electropherogram files or other applicable raw file can be opened, quality-checked, and edited
[25]
using DNA analysis software packages. For an example, see http: //www .geneious .com .
8.7.2 Electropherogram or raw sequence quality checking
The bidirectional sequencing strategy enables automatic sequence assembly using the DNA analysis
software package.
Nonetheless, visual inspection and manual editing of the electropherograms is still necessary to
verify sequence quality. Discrimination of closely related species using DNA barcodes often relies on
differences in one or a very few base-pair sites. Therefore, electropherograms quality checking is a
[7]
critical factor to ensure the accuracy and reliability of the resulting DNA barcode sequences .
If sequencing quality is high, the majority of the electropherogram should consist of a series of clear
peaks, corresponding to the signal from each of the nucleotides in the DNA sequence. If sequencing
has failed, or contamination is present, the peaks will look weak and/or it will be impossible to clearly
resolve a single peak at each nucleotide position. If this is the case, the results are not high quality
enough for use.
The Geneious software implements a “Base Calling” tool which detects peaks in the electropherograms
and assigns the most probable base at each position. It may also assign a quality measure for such a call,
in terms of the expected probability of making an erroneous call (Phred quality scores or Q scores).
According to the Database Working Group (DBWG) of the Consortium for the Barcode of Life (CBOL),
Q scores > 20 are generally considered to be high quality base calls, and scores
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21286
Première édition
2019-03
Version corrigée
2019-12
Qualité du sol — Identification des
espèces par codes-barres ADN dans
les essais d'écotoxicologie
Soil quality — Identification of ecotoxicological test species by DNA
barcoding
Numéro de référence
©
ISO 2019
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Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs et matériel . 3
5.1 Matériel biologique . 3
5.2 Enzyme . 3
5.3 Amorces oligonucléotidiques de PCR . 4
5.4 Réactifs . 4
6 Appareillage . 5
7 Exigences générales . 5
7.1 Précautions expérimentales et prévention de la contamination . 5
7.2 Précautions de sécurité . 6
7.2.1 Dangers chimiques . . 6
7.2.2 Dangers physiques . 6
8 Mode opératoire. 6
8.1 Isolement de l’ADN . 6
8.2 Quantification . 7
8.3 PCR . 7
8.3.1 Région génomique cible . 7
8.3.2 Désignation d’amorces . 7
8.3.3 Synthèse d’amorces . 8
8.3.4 PCR . 8
8.4 Contrôle de la taille des amplicons . 9
8.5 Purification . 9
8.6 Séquençage .10
8.7 Bioinformatique .10
8.7.1 Généralités .10
8.7.2 Contrôle qualité des électrophorégrammes ou des séquences brutes .10
8.7.3 Rognage des séquences de faible qualité et des amorces .11
8.7.4 Assemblage des séquences .11
8.7.5 Vérification des séquences .11
8.7.6 Contrôle de la séquence éditée .11
8.7.7 Assignation des espèces .12
8.7.8 Qualité des bases de données de référence .13
9 Calcul et expression des résultats .14
10 Validité de l’essai .14
11 Rapport d'essai .15
Annexe A (informative) Initiative du code-barres ADN d’Eisenia: essai interlaboratoires
visant à évaluer l’applicabilité du code-barres ADN dans le cadre de l’identification
de l’espèce Eisenia . .16
Bibliographie .19
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, de la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute autre information au sujet de
l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les
obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
La présente version corrigée de l’ISO 21286:2019 inclut la correction suivante: le titre du document a
été corrigé en remplaçant «code-bare» par «codes-barres».
iv © ISO 2019 – Tous droits réservés
Introduction
Actuellement, l’identification des espèces utilisées pour des essais standardisés repose généralement
sur des caractéristiques morphologiques. Toutefois, ceci ne permet pas toujours d’obtenir des résultats
clairs car:
a) peu de taxonomistes sont disponibles,
b) des espèces très ressemblantes peuvent différer au niveau de quelques caractéristiques facilement
ignorées, et
c) surtout, plusieurs espèces d’essai sont en réalité des complexes d’espèces cryptiques.
Un bon exemple est le ver de compost Eisenia fetida/andrei (utilisé dans l’ISO 11268-1, l’ISO 11268-2 et
l’ISO 17512-1), pour lequel les caractéristiques morphologiques seules peuvent ne pas être suffisantes
[5][36]
pour distinguer les deux espèces . Un autre cas connu est l’acarien prédateur, Hypoaspis (Geolaelaps)
[50]
aculeifer , qu’il est possible de confondre avec H. miles, couramment utilisé dans la lutte biologique
[31]
contre les parasites .
Les erreurs d’identification des espèces, l’utilisation d’une morpho-espèce qui est en réalité un complexe
d’espèces cryptiques, ou encore le mélange d’espèces dans des cultures de laboratoire, peuvent être très
problématiques pour la fiabilité des essais écotoxicologiques. Dans un complexe de morpho-espèces, les
espèces jumelles peuvent présenter des différences écologiques, comportementales et physiologiques
et peuvent également réagir différemment aux substances toxiques (par exemple, Références [2], [17],
[35], [40]). Il semblerait que cela soit également le cas du collembole Folsomia candida (utilisé dans
l’ISO 11267 et l’ISO 17512-2), dans lequel des niveaux de différenciation génétique ont été observés
[9],[19],[41]
parmi les populations naturelles de F. candida et parmi les souches de laboratoire . Même si
différentes souches de laboratoire se sont avérées présenter uniquement des différences mineures en
[12],[9]
termes de sensibilité à certains produits chimiques , d’autres études ont détecté une variation
importante du comportement d’évitement du phenmedipham et des réactions d’adaptation divergentes
[14][30]
à l’exposition au cadmium parmi les souches génétiquement différenciées . De plus, même si deux
espèces présentent des réponses similaires aux substances toxiques, la présence de deux espèces dans
la même culture de laboratoire peut entraîner la production d’hybrides stériles, ce qui faussera le
[36]
résultat des essais de reproduction .
L’identification des espèces par code-barres ADN peut contribuer à pallier ces problèmes, en assurant
que l’espèce ou la souche utilisée pour l’essai est correctement caractérisée. Par conséquent, l’assurance
de la qualité des essais peut être améliorée, et ce faisant, les résultats obtenus par différents laboratoires
d’écotoxicologie sont donc nettement plus fiables et comparables. Pour Eisenia fetida/E. andrei, ce
[36]
travail, y compris un essai interlaboratoires international, a déjà été effectué , voir Annexe A. Les
conclusions de cet essai interlaboratoires peuvent être résumées de la manière suivante:
— Le code-barres ADN est une méthode fiable et pratique pour identifier l’espèce Eisenia.
— Seuls 17 des 28 laboratoires d’écotoxicologie ont réalisé une assignation taxonomique correcte.
La majorité des laboratoires ayant effectué une assignation erronée ou inconnue avaient E. andrei
en stock.
— L’existence d’une paire d’espèces cryptiques au sein d’E. fetida est une hypothèse plausible.
— Il est important que les vers de terre utilisés pour les essais écotoxicologiques soient régulièrement
(ré-)identifiés par code-barres ADN.
Très probablement, des expériences et recommandations similaires peuvent être tirées pour d’autres
espèces d’invertébrés utilisées dans l’écotoxicologie terrestre, ainsi que pour des végétaux. En effet, le
code-barres ADN s’est révélé utile pour l’identification de spécimens et la délimitation d’espèces dans de
[13],[37] [16] [15]
nombreux groupes d’organismes, y compris les vers de terre , les enchytréïdes , les acariens ,
[32] [42] [28] [8]
les collemboles , les mollusques , les nématodes et les plantes terrestres .
NORME INTERNATIONALE ISO 21286:2019(F)
Qualité du sol — Identification des espèces par codes-
barres ADN dans les essais d'écotoxicologie
1 Domaine d'application
Le présent document spécifie un protocole d’identification de spécimens d’essais écotoxicologiques
(principalement des invertébrés et des végétaux) au niveau de l’espèce, reposant sur la technique du
code-barres ADN. Ce protocole peut être utilisé par les laboratoires effectuant le code-barres ADN
afin de normaliser le plus possible les travaux de laboratoire et les flux d’analyse de données, et de les
mettre en conformité avec les normes et les lignes directrices communautaires.
Le présent document ne prévoit pas de spécifier une souche particulière pour chaque méthode d’essai,
mais de documenter avec exactitude l’espèce/la souche qui a été utilisée.
NOTE 1 Cela ne veut pas dire que le code-barres ADN est effectué parallèlement à chaque cycle d’essai, mais
qu’il est effectué régulièrement (par exemple, une fois par an, notamment pour l’essai mené avec la substance de
référence) et à chaque fois qu’une nouvelle culture est démarrée ou que de nouveaux individus sont ajoutés à une
culture existante.
Le présent document ne vise pas à reproduire ou remplacer les identifications d’espèces reposant
sur des caractéristiques morphologiques. En revanche, le code-barres ADN est proposé comme
outil d’identification complémentaire lorsque l’identification morphologique est incertaine, ou pour
diagnostiquer les espèces cryptiques, afin d’assurer que les résultats obtenus auprès de différents
laboratoires d’écotoxicologie font référence à la même espèce ou souche.
Le présent document est applicable à l’identification de formes immatures n’ayant pas de caractéristiques
morphologiques de diagnostic (œufs, larves, juvéniles) ainsi qu’à l’identification rationalisée des
spécimens prélevés lors d’études de surveillance sur le terrain, où un grand nombre d’organismes de
taxons divers sont classés.
NOTE 2 En principe, toutes les espèces régulièrement utilisées lors des essais écotoxicologiques peuvent être
analysées par code-barres ADN. Outre les vers de terre Eisenia fetida et E. andrei, d’autres exemples d’espèces
terrestres sont Lumbricus terrestris, L. rubellus, Allolobophora chlorotica, Aporrectodea rosea, A. caliginosa,
Dendrodrilus rubidus, Enchytraeus albidus et E. crypticus (Haplotaxida); Folsomia candida, F. fimetaria, Proisotoma
minuta et Sinella curviseta (Collembola); Hypoaspis aculeifer et Oppia nitens (Acari); Aleochara bilineata et Poecilus
cupreus (Coleoptera); Scathophaga stercoraria, Musca autumnalis (Diptera) ou Pardosa sp. (Arachnida). De plus,
les nématodes ou les escargots et même les plantes peuvent être ajoutés à cette liste non exhaustive.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online Browsing Platform (OBP): disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
3.1
amplicon
fragment d’ADN spécifique généré par PCR (3.5) à l’aide d’une paire d’amorces PCR (3.6)
3.2
code-barres ADN
motif unique de séquence ADN qui identifie chaque espèce
3.3
électrophérogramme
électrophoregramme d’ADN
ensemble constitué d’une représentation graphique de la séquence ADN composée de pics de couleur,
chaque couleur correspondant à un nucléotide
Note 1 à l'article: Il est automatiquement fourni par les programmes de séquençage d’ADN.
3.4
score de qualité Phred
score Q
mesure de qualité utilisée pour évaluer l’exactitude d’une réaction de séquençage
Note 1 à l'article: Cette mesure de qualité indique la probabilité pour qu’une base donnée soit dénommée à tort
par le séquenceur. Les scores Phred utilisent une échelle logarithmique. Par conséquent, si le programme Phred
assigne un score Q de 30 (Q30) à une base, cela correspond à une probabilité de dénomination de base incorrecte
de 1 sur 1 000. Une exactitude de dénomination de base moins élevée de 99 % (Q20) donnera une probabilité de
dénomination de base incorrecte de 1 sur 100, soit un risque d’erreur de séquençage toutes les 100 paires de base.
3.5
réaction de polymérisation en chaînes
PCR
technique de biologie moléculaire permettant de synthétiser rapidement plusieurs copies d’un segment
d’ADN donné en utilisant l’enzyme ADN polymérase et une paire d’amorces oligonucléotidiques
3.6
amorce PCR
oligonucléotides courts (généralement d’une longueur de 15 à 30 nucléotides) permettant l’amplification
PCR de l’ADN entre des sites spécifiques
Note 1 à l'article: Les deux amorces (une amorce sens et une amorce antisens) sont appariées au brin supérieur et
au brin inférieur de la matrice d’ADN, et leurs extrémités 3’-OH sont dans une direction convergente.
4 Principe
Le code-barres ADN est une méthode moléculaire qui utilise une région d’ADN courte et normalisée (le
[22)
code-barres ADN) comme marqueur génétique pour l’identification au niveau de l’espèce .
Depuis sa création en 2003 et le lancement du projet Barcode of Life, le code-barres ADN a été
systématiquement appliqué non seulement à la recherche biologique, mais également dans plusieurs
domaines industriels dans lesquels il est essentiel d’identifier correctement le matériel biologique,
notamment dans l’industrie agroalimentaire. Par exemple, il est utile pour détecter les fraudes dans les
[29]
médicaments à base de plantes , et il a été adopté par la Food and Drug Administration (FDA) pour
[21][44]
l’identification des poissons et produits de la mer . En fait, le code-barres ADN devrait devenir
un essai de routine dans de nombreux domaines, en particulier dans le contrôle de la qualité et la
[20]
traçabilité des aliments .
Pour résumer, les objectifs du code-barres ADN sont:
a) d’obtenir la séquence nucléotidique de la région d’ADN ciblée à partir d’un échantillon non identifié
(un spécimen d’essai);
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés
b) de comparer cette séquence avec les séquences connues dans une base de données de référence en
utilisant des méthodes bioinformatiques, et
c) d’identifier, d’après cette comparaison, l’échantillon au niveau de l’espèce.
Par conséquent, le code-barres ADN ne peut pas être un outil d’identification utile si l’on ne dispose pas
d’une base de données de référence fiable et exhaustive. Il faut donc avoir suffisamment d’échantillons
de chaque espèce de toute sa zone géographique pour tenir compte de la variabilité intraspécifique.
De plus, le code-barres ADN repose sur l’hypothèse selon laquelle que les séquences du code-barres
sont davantage similaires entre les membres d’une espèce qu’à celles d’autres espèces (appelé barcode
gap). Ainsi, avant d’appliquer le code-barres ADN, il convient d’effectuer une étude de délimitation des
espèces du groupe d’organismes cible pour évaluer son efficacité de différenciation des espèces.
Il est essentiel que la méthode de code-barres ADN soit effectuée par un personnel qualifié. De plus, il
est nécessaire que les techniciens de laboratoire soient formés pour appliquer de manière optimale les
protocoles de travaux de laboratoire pour chaque groupe d’organismes. Par ailleurs, le déroulement des
travaux de laboratoire doit être supervisé par des scientifiques ayant une formation en génomique et en
systématique. Il convient également que ces scientifiques effectuent l’analyse des électrophorégrammes
et/ou du fichier de séquences ADN brutes ainsi que l’assignation des espèces.
5 Réactifs et matériel
5.1 Matériel biologique
Il est essentiel de conserver correctement les spécimens pour obtenir des échantillons d’ADN de bonne
qualité. Si cela est possible, il convient de prélever des échantillons de spécimens pour le code-barres
ADN sur un tissu fraîchement recueilli ou un tissu frais congelé. Il convient d’éviter toute exposition à
des agents conservateurs tels que l’acétate d’éthyle ou le formaldéhyde, car ils détruisent l’ADN.
Privilégier la congélation à –80 °C ou dans l’azote liquide (–196 °C) pour le stockage à long terme des
échantillons de tissu. L’ADN des spécimens séchés reste généralement stable pendant au moins un an,
[23]
mais la dégradation devient de plus en plus problématique au fil du temps .
Le matériel conservé dans l’éthanol est facilement analysé quand il est frais, mais l’ADN va lentement
s’acidifier et se dégrader, sauf si l’éthanol est régulièrement changé ou tamponné. Pour conserver
correctement le tissu, utiliser une concentration en éthanol de 95 % à 99 % et vérifier que le volume
d’éthanol est au moins trois fois plus élevé que le volume de tissu. Pour maintenir la concentration en
éthanol à 95 % minimum, il est nécessaire de remplacer la solution d’éthanol pendant les premiers jours
(au moins trois jours) suivant l’échantillonnage, et de fermer hermétiquement le flacon pour éviter toute
[23]
évaporation . La combinaison de faibles températures (–20 °C) et d’éthanol permettra de conserver
les échantillons pendant longtemps et d’éviter toute dégradation pendant les cycles de décongélation et
recongélation.
En règle générale, il convient d’effectuer l’analyse par code-barres ADN dès que possible après le
prélèvement du tissu. Toutefois, des spécimens correctement conservés et stockés pendant plusieurs
[21][23]
mois seront parfaitement exploitables pour l’extraction d’ADN .
5.2 Enzyme
La Taq Polymérase de Thermus aquaticus est l’enzyme de référence pour la PCR. Les Taq Polymérases
« hot start » et/ou les ADN polymérases haute-fidélité offrent une haute performance pour le code-
barres ADN, permettant d’obtenir une meilleure sensibilité d’amplification et une plus grande facilité
de préparation de la réaction PCR que les polymérases classiques (http:// ccdb .ca/ resources/ ).
Les mélanges prêts à l’emploi disponibles dans le commerce peuvent également être utilisés. Ils
comprennent une solution pré-mélangée contenant de la Taq ADN polymérase, des dNTP, du MgCl et
des tampons de réaction à des concentrations optimales pour amplifier efficacement les matrices d’ADN
lors de la PCR de routine.
5.3 Amorces oligonucléotidiques de PCR
Pour les amorces oligonucléotidiques de PCR, voir 8.3.2 et 8.3.3.
5.4 Réactifs
5.4.1 Eau de qualité biologie moléculaire exempte de nucléase (dd H O).
5.4.2 Tampon TE (tampon Tris-EDTA), 1x, pH 8,0.
Dissoudre 1 ml de base Tris 1 mol/l (pH 8,0) et 0,2 ml d’EDTA (0,5 mol/l) dans 98,8 ml d’eau de qualité
biologie moléculaire. Ajuster le pH à 8,0 avec du HCl concentré.
5.4.3 Désoxynucléoside triphosphates (dNTP).
5.4.4 Tampon de PCR, sans Mg (KCl 500 mmol/l, Tris-HCl 100 mmol/l, pH 8,3 à 25 °C).
Le tampon est généralement fourni avec chaque enzyme sous la forme d’un concentré 10x ou 5x. Utiliser
uniquement le tampon fourni avec chaque enzyme spécifique.
5.4.5 Chlorure de magnésium, MgCl .
5.4.6 Additifs de PCR (en option): tréhalose dihydraté, sérumalbumine bovine (BSA), formamide,
diméthylsulfoxyde (DMSO).
5.4.7 Agarose (de qualité analytique, température de fusion standard).
5.4.8 TAE (tampon d’électrophorèse), solution mère concentrée 50x, pH 8,3.
Dissoudre 242 g de base Tris [tris(hydroxyméthyl)aminométhane], 57,1 ml d’acide acétique glacial
(17,4 mol/l), 100 ml de solution d’EDTA 500 mmol/l (pH 8,0) dans 842,9 ml d’eau de qualité biologie
moléculaire.
5.4.9 Échelle d’ADN de 100 paires de base (pb) de taille standard, un marqueur de poids
moléculaire disponible dans le commerce pour déterminer la taille des fragments d’ADN double brin de
100 à 1 000 paires de base pendant l’électrophorèse sur gel.
5.4.10 Tampon de charge 6x, 3 ml de glycérol 100 %, 0,025 g de base bromophénol, 0,025 g de xylène
cyanol FF dans 7 ml d’eau de qualité biologie moléculaire.
5.4.11 Solution de bromure d’éthidium (0,5 μg/ml) ou tout autre colorant d’acide nucléique plus sûr.
5.4.12 Kit de purification pour PCR, en utilisant des réactions enzymatiques et des billes magnétiques
ou la purification sur membrane de silice.
5.4.13 Tampon de séquençage 5x (400 nm de Tris-HCl, pH 9,0, MgCl 10 mmol/l).
1)
5.4.14 Kit de séquençage de cycle BigDye® Terminator v3.1 .
1) Ce protocole a été validé en utilisant le système d’électrophorèse capillaire de l’analyseur d’ADN 3730 et la
chimie du BigDye Terminator. Ils sont des marques déposées d’Applied Biosystems. Cette information est donnée
par souci de commodité à l'intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement
de l'ISO à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux
mêmes résultats.
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5.4.15 Polymère Pop-7 pour analyseur d’ADN 3730 .
5.4.16 Barrette de capillaires pour analyseur d’ADN 3730, 50 cm .
5.4.17 GeneScanTM 500 LIZTM DYE taille standard .
5.4.18 Formamide hautement déionisé.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire, y compris micropipettes, centrifugeuse et le matériel spécifique
suivant.
6.1 Spectrophotomètre, pour mesurer la concentration et la pureté de l’ADN double brin à 260 nm.
6.2 Hotte à flux laminaire.
6.3 Thermocycleur PCR.
6.4 Système d’électrophorèse horizontale.
6.5 Alimentation pour électrophorèse.
6.6 Système de documentation de gels.
6.7 Système de séquençage de l’ADN automatisé, pour le séquençage de l’ADN (par exemple,
2)
analyseur d’ADN 3730, Applied Biosystems) .
7 Exigences générales
7.1 Précautions expérimentales et prévention de la contamination
De bonnes pratiques de laboratoire et des stratégies d’anticontamination spécifiques sont nécessaires
pour réduire le plus possible le risque de contamination pendant l’isolement de l’ADN et les étapes de
PCR, avec de l’ADN précédemment manipulé dans le laboratoire, des amplicons de précédents essais
PCR ou des contaminations croisées entre les échantillons.
Il faut respecter certaines précautions de base pour empêcher toute contamination exogène et
contamination entre les échantillons: travailler sur une surface propre, porter des gants et utiliser
des instruments jetables ou stérilisés. Si possible, il convient que les laboratoires utilisent des pièces
séparées – ou, au moins, différentes paillasses et différents espaces de travail au sein du laboratoire –
pour l’extraction de la matrice, la préparation du réactif de PCR et l’amplification. Toujours travailler du
plus propre au plus sale. Il convient que chaque espace de travail ait ses propres fournitures et réactifs,
ses propres blouses et ses propres gants. Il est recommandé de préparer les réactions PCR sous une
hotte à flux laminaire. Il est également nécessaire d’utiliser un matériel plastique stérile et des embouts
de pipette équipés de filtres anti-aérosols.
Lors de la manipulation de plusieurs spécimens, veiller à éviter toute contamination croisée entre
les échantillons. Tout élément (gants, surface) entrant en contact avec un échantillon doit être jeté
2) Ce protocole a été validé en utilisant le système d’électrophorèse capillaire de l’analyseur d’ADN 3730 et la
chimie du BigDye Terminator. Ils sont des marques déposées d’Applied Biosystems. Cette information est donnée
par souci de commodité à l'intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement
de l'ISO à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux
mêmes résultats.
ou nettoyé avant de passer au suivant en le nettoyant avec une solution javellisée à 1 % puis en le
rinçant soigneusement à l’eau. Les outils utilisés pour prélever un fragment de tissu (pinces, ciseaux,
scalpels, etc.) doivent être stérilisés avant et après avoir manipulé chaque échantillon. Pour cela,
tremper les instruments dans de l’éthanol à 70 % à 96 % puis les placer brièvement au-dessus de la
flamme d’un bec Bunsen ou d’un briquet pour brûler l’alcool.
7.2 Précautions de sécurité
7.2.1 Dangers chimiques
AVERTISSEMENT 1 Le bromure d’éthidium (EtBr) est un colorant couramment utilisé pour visualiser l’ADN
dans les gels d’agarose. L’EtBr est un puissant mutagène irritant pour la peau, les yeux et les voies respiratoires.
Éviter tout contact direct avec la peau et porter des gants en nitrile et des lunettes appropriées. Il convient
d’effectuer la coloration des gels dans une zone désignée du laboratoire et de jeter tous les déchets contaminés
par l’EtBr dans des récipients étiquetés.
3)
AVERTISSEMENT 2 Plusieurs alternatives à l’EtBr (par exemple, GreenSafe®, Sybr® Safe, GelRed™) sont
commercialisées depuis quelques années. En général, ces produits sont considérés comme étant moins dangereux
que l’EtBr. Toutefois, ils demeurent mutagènes et il convient de les manipuler également et de les jeter avec soin.
AVERTISSEMENT 3 Le formamide utilisé dans les réactions de séquençage est irritant pour les yeux, la peau
et les voies respiratoires. Il peut provoquer des anomalies congénitales et des anomalies du développement. Lors
de la manipulation du formamide, porter des lunettes, des vêtements et des gants appropriés.
7.2.2 Dangers physiques
Les expériences d’électrophorèse présentent un risque d’électrocution si elles sont mal utilisées.
Les appareils d’électrophorèse et leurs alimentations doivent être régulièrement contrôlés pour
s’assurer qu’ils fonctionnent correctement, que les fils, les câbles et les connecteurs sont intacts et
adéquatement isolés, et que les cuves contenant les tampons ne présentent ni fissures ni fuites. Pendant
l’électrophorèse, étant donné que toute surface humide peut devenir conductrice, il est recommandé de
ne toucher aucune partie du matériel (cuve, fils) tant qu’il est alimenté.
Les transilluminateurs UV sont souvent utilisés pour visualiser les colorants fluorescents employés
lors de l’électrophorèse sur gel et présentent des risques d’exposition aux rayonnements UV. En cas
de risque d’exposition, notamment lors de l’utilisation de transilluminateurs non blindés, porter des
blouses de laboratoire, des gants, des lunettes appropriées et une visière.
8 Mode opératoire
8.1 Isolement de l’ADN
Cette opération peut être effectuée soit en utilisant un kit d’isolement de l’ADN du commerce soit en
suivant un protocole d’isolement de l’ADN standard. Le kit ou le protocole d’isolement de l’ADN peut
être choisi en fonction des caractéristiques spécifiques de l’échantillon. Par exemple, pour un tissu frais
ou prélevé récemment, une méthode d’extraction de l’ADN à la résine Chelex permet habituellement
d’obtenir suffisamment d’ADN pour le code-barres ADN. Toutefois, pour les échantillons anciens ou
les très petits spécimens, il convient d’utiliser des techniques plus sensibles (par exemple, méthodes
[23]
d’extraction de l’ADN sur membrane de silice) . Il peut être utile d’employer les kits du commerce car
les réactifs préparés facilitent la normalisation de la technique.
Dans le cas d’organismes de petite taille (c’est-à-dire, d’une longueur inférieure à 0,5 cm) — notamment
les collemboles, les acariens ou les petits insectes — la totalité du spécimen peut être traitée. Pour les
organismes de plus grande taille, différentes parties du corps peuvent être sélectionnées, notamment
3) GreenSafe®, Sybr® Safe, GelRed™ sont des marques déposées de NZYTech, Thermo Fisher Scientific, et Biotium,
respectivement. Cette information est donnée par souci de commodité à l'intention des utilisateurs du présent
document et ne saurait constituer un engagement de l'ISO à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent
être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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les biopsies musculaires, l’abdomen, les pattes, les antennes ou les œufs. Il convient, si possible, d’éviter
les surfaces extérieures du corps, le tube digestif et les parties du corps contenant des poils, des soies
ou des exosquelettes durcis.
Pour les vers de terre, les enchytréïdes et autres annélides, il est recommandé de conserver les
spécimens pendant environ 24 h sur un papier filtre humide avant de prélever le tissu, afin que leur
contenu gastrique soit évacué.
Il peut être problématique d’isoler l’ADN du tissu végétal en raison de leur concentration élevée en
polysaccharides complexes, polyphénols et autres métabolites secondaires susceptibles d’affecter
la qualité de l’ADN et d’inhiber les réactions en aval. Les composés tels que le CTAB (bromure de
cétyltriméthylammonium) et la PVP (polyvinylpyrrolidone) peuvent faciliter l’élimination des
polysaccharides et des polyphénols, respectivement, et sont donc largement utilisés dans les tampons
d’isolement de l’ADN végétal.
Des protocoles détaillés sur l’isolement de l’ADN de tissus animaux ou végétaux sont donnés dans la
Référence [43] et sur le site Internet du DNA Learning Center (http:// www .dnabarcoding101 .org/ ).
Un témoin négatif (sans tissu) doit être préparé parallèlement à tous les lots d’extraction d’échantillon,
afin de détecter toute contamination de l’ADN des réactifs analytiques ou toute contamination entre
les échantillons. Ce témoin négatif doit être soumis à l’isolement de l’ADN et aux étapes de PCR,
parallèlement aux échantillons pour essai.
8.2 Quantification
Après isolement de l’ADN, il convient de déterminer le rendement et la pureté de l’échantillon d’ADN soit:
a) en utilisant un spectrophotomètre équipé d’une lampe UV, pour mesurer l’absorbance de
l’échantillon à 260 nm; soit
b) en utilisant un fluorimètre employant des colorants fluorescents se liant à l’ADN pour quantifier
spécifiquement l’ADN double brin.
En général, l’échantillon d’ADN est dilué à 10 ng/µl en utilisant de l’eau de qualité biologie moléculaire
et il convient de le conserver à −20 °C pendant de longues périodes, ou à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé.
8.3 PCR
8.3.1 Région génomique cible
La région génomique cible (ou code-barres ADN) varie selon les taxons. Le code-barres ADN standard
pour pratiquement tous les groupes d’animaux est une région de 658 paires de base du gène
mitochondrial cytochrome c oxydase 1 (COI). Pour les plantes terrestres, il est recommandé d’utiliser
[8]
une combinaison des gènes chloroplastiques matK et rbcL comme code-barres ADN de la plante
même si l’efficacité de différenciation de l’espèce avec cette combinaison peut être limitée dans certains
groupes de plantes.
Noter que, dans certains cas, le code-barres ADN habituel peut ne pas suffire. Dans ce cas, d’autres
régions génomiques peuvent être analysées.
8.3.2 Désignation d’amorces
Lors de la PCR, il est crucial de désigner des paires d’amorces appropriées. Il faut donc choisir ou
désigner avec soin des amorces optimales.
La première étape consiste à consulter la littérature et les bases de données (par exemple, la base
de données d’amorces BOLD, disponible à l’adresse http:// www .boldsystems .org/ index .php/ Public
_Primer _PrimerSearch) pour rechercher les amorces existantes qui ont permis d’amplifier le code-
barres ADN dans le groupe d’organismes cible.
Si aucune amorce publique n’est disponible ou si les paires d’amorces choisies ne fonctionnent pas
sur l’espèce cible, de nouvelles paires d’amorces peuvent être désignées. Des séquences de la même
région génomique appartenant à des taxons identiques ou apparentés, accessibles au public dans la
base de données BOLD (http:// www .boldsystems .org/ ) et la base de données GenBank du National
Center for Biotechnology Information (NCBI) (https:// www .ncbi .nlm .nih .gov/ genbank), peuvent être
[45]
utilisées pour désigner des amorces. Des ressources en ligne gratuites telles que Primer-BLAST
sont un outil utile pour trouver des amorces spécifiques à la région génomique cible. Ce programme
permet également de contrôler la spécificité des amorces en fonction d’une base de données choisie par
l’utilisateur, pour confirmer que les amorces désignées n’amplifient pas d’autres régions génomiques
que la région cible spécifique.
8.3.3 Synthèse d’amorces
Les amorces peuvent être commandées auprès d’un fournisseur d’amorces spécialisé dans la synthèse
des oligonucléotides. Une purification par dessalement standard est suffisante pour les amorces
utilisées dans le code-barres ADN.
Les amorces sont généralement transportées et livrées à l’état lyophilisé dans des quantités
nanomolaires. Avant la PCR, il convient de les centrifuger et de les remettre en suspension dans le
tampon TE ou dans de l’eau de qualité biologie moléculaire pour atteindre une concentration stock de
100 µmol/l. Sinon, les amorces peuvent être commandées déjà solubilisées à une concentration donnée
(généralement entre 10 µmol/l et 100 µmol/l) auprès de plusieurs producteurs. Dans un cas comme
dans l’autre, les amorces remises en suspension doivent être réparties en aliquotes à usage unique et
conservées à −20 °C.
8.3.4 PCR
Les réactions de PCR standard sont effectuées dans des tubes stériles à paroi mince de 0,2 ml ou dans
un format plaque PCR équivalent. Les concentrations finales en réactifs pour une réaction PCR type,
avec un volume final de 25 µl, sont les suivantes (voir Tableau 1).
Tableau 1 — Concentrations finales en réactifs pour une réaction PCR type, avec un volume
final de 25 µl
Volume
Réactif Concentration initiale Concentration finale
µl
Tampon PCR 10x 2,5 1x
MgCl 50 mmol/l 0,75 1,5 mmol/l
dNTP 2,5 mmol/l 2,0 0,2 mmol/l
Amorce sens 0,1 mmol/l 0,125 0,5 µmol/l
Amorce antisens 0,1 mmol/l 0,125 0,5 µmol/l
Taq polymérase 5 unités/µl 0,125 0,025 unités/µl
Matrice d’ADN 10 ng/µl 2,5 1 ng/µl
Eau stérile exempte de nucléase 16,875
Toujours ajouter l’eau et le tampon en premier, et la Taq polymérase en dernier.
Lorsque plusieurs réactions PCR sont effectuées simultanément, il est utile de préparer un mélange
contenant tous les réactifs sauf la matrice d’ADN. Ceci réduit le temps de préparation et le risque
d’erreurs de pipetage. Préparer une quantité de mélange suffisante pour le nombre de réactions à
amplifier et un volume supplémentaire pour compenser les erreurs de pipetage (en règle générale,
compter une réaction supplémentaire pour dix échantillons).
L’ajout d’agents stimulant la PCR dans le mélange PCR peut accroître le rendement du produit PCR
spécifique et contrecarrer l’effet des inhibiteurs de PCR présents dans la réaction. Certains de ces agents
stimulants sont le tréhalose, la sérumalbumine bovine (BSA), la bétaïne, le formamide ou le DMSO (par
8 © ISO 2019 – Tous droits réservés
exemple, Références [18] et [39]. Les mélanges prêts à l’emploi disponibles dans le commerce peuvent
également être utilisés.
La haute sensibilité de la PCR la rend particulièrement vulnérable aux traces de contamination. Il est
donc nécessaire d’utiliser des embouts stériles (et de préférence des embouts à filtres) pour pipeter les
réactifs de PCR. Les matrices d’ADN (et d’autres produits PCR) doivent également être tenues éloignées
des réactifs de PCR pendant la préparation du mélange réactionnel de PCR. Par ailleurs, et en plus
du témoin négatif d’isolement de l’ADN, chaque série de réactions doit comprendre un témoin négatif
de PCR contenant tous
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
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