ISO 846:2019
(Main)Plastics — Evaluation of the action of microorganisms
Plastics — Evaluation of the action of microorganisms
This document specifies methods for determining the deterioration of plastics due to the action of fungi and bacteria and soil microorganisms. The aim is not to determine the biodegradability of plastics or the deterioration of natural fibre composites. The type and extent of deterioration can be determined by a) visual examination and/or b) changes in mass and/or c) changes in other physical properties. The tests are applicable to all plastics that have an even surface and that can thus be easily cleaned. The exceptions are porous materials, such as plastic foams. This document uses the same test fungi as IEC 60068-2-10. The IEC method, which uses so-called "assembled specimens", calls for inoculation of the specimens with a spore suspension, incubation of the inoculated specimens and assessment of the fungal growth as well as any physical attack on the specimens. The volume of testing and the test strains used depend on the application envisaged for the plastic.
Plastiques — Évaluation de l'action des micro-organismes
Le présent document spécifie des méthodes pour la détermination de la détérioration des plastiques lorsqu'ils sont exposés à l'action des champignons et des bactéries, et à celle des micro-organismes vivant dans le sol. Il n'a pas pour but de déterminer la biodégradabilité des plastiques ou la détérioration des composites en fibres naturelles. Le type et l'ampleur de la détérioration engendrée peuvent être déterminés: a) par un examen visuel; et/ou b) à partir des variations de masse; et/ou c) à partir des variations d'autres propriétés physiques. Les essais sont applicables à tous les plastiques ayant une surface plane et qui peuvent, de ce fait, être aisément nettoyés, exception faite des matériaux poreux, tels que les mousses en plastique. Le présent document utilise les mêmes champignons pour essai que l'IEC 60068‑2‑10. La méthode IEC, qui utilise ce qu'on appelle des «spécimens assemblés», nécessite l'inoculation des éprouvettes avec une suspension de spores, l'incubation des éprouvettes ensemencées et l'évaluation de la croissance fongique ainsi que de l'attaque physique des éprouvettes. Le volume des essais et les souches d'essai à utiliser dépendront de l'application prévue pour le plastique.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 846
Third edition
2019-03
Plastics — Evaluation of the action of
microorganisms
Plastiques — Évaluation de l'action des micro-organismes
Reference number
©
ISO 2019
© ISO 2019
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Published in Switzerland
ii © ISO 2019 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vii
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
4.1 General . 2
4.2 Resistance to fungi . 2
4.2.1 Method A: Fungal-growth test . 2
4.2.2 Method B: Determination of fungistatic effects . 2
4.3 Method C: Resistance to bacteria . 3
4.4 Method D: Resistance to microbially active soil (soil-burial test) . 3
4.5 Choice of properties for assessment of biodeterioration . 3
5 Apparatus and materials. 3
5.1 For all tests . 3
5.2 For tests with fungi . . 4
5.3 For tests with bacteria . 6
5.4 For soil-burial tests . 6
6 Test specimens. 7
6.1 Shape and dimensions . 7
6.2 Specimen test series and numbers in each test series. 7
6.2.1 Specimen test series . 7
6.2.2 Numbers in each test series . 8
7 Preparation of specimens . 8
7.1 Cleaning . 8
7.2 Labelling and storage . 8
7.3 Conditioning and weighing . 8
8 Procedures . 9
8.1 Test temperature . 9
8.2 Test methods . 9
8.2.1 General. 9
8.2.2 Fungal-growth test (method A) . 9
8.2.3 Determination of fungistatic effect (method B) .11
8.2.4 Procedure with bacteria (method C) .12
8.2.5 Soil-burial test (method D) .13
9 Assessment .14
9.1 Assessment of fungal growth on the specimens by visual examination (methods A,
B and D) .14
9.2 Evaluation of the test specimens for the determination of changes in mass and/or
in other physical properties .15
9.2.1 Cleaning .15
9.2.2 Change in mass .15
9.2.3 Determination of changes in other physical properties .16
10 Expression of results .16
10.1 General .16
10.2 Visual assessment .16
10.3 Change in mass .16
10.4 Changes in other physical properties .16
11 Accuracy of the measurements .17
12 Test report .17
Annex A (normative) Determination of the water content and water holding capacity of a soil .19
Annex B (normative) Negative control for Test A .21
Annex C (normative) Grid for evaluation of fungal surface growth (Test A) .22
Annex D (informative) Information on test fungi .24
Bibliography .26
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: www .iso .org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 61, Plastics, Subcommittee SC 6, Ageing,
chemical and environmental resistance.
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 846:1997), which has been technically
revised. The main changes compared to the previous edition are as follows.
— The size of the test specimens has been defined as (50 mm ± 1 mm) × (50 mm ± 1 mm). A fixed size
allows the determination of any edge effects associated with the area 5 mm from the outer edge (see
new Annex C). In this way, the evaluation of growth on the test specimens is harmonized.
— New Annexes B and C have been added and the old annexes have been renumbered.
— The former Annex C has been updated and renumbered as Annex D.
— Test A only:
Stainless steel coupons acting as negative control specimens have been introduced to provide a
reference for where fungal growth occurs in the Petri dish, even though no nutrients have been
added to the test design.
The test design does not use an agar-medium any more to provide the source of moisture to allow
95 % ± 5 % relative humidity to be achieved. Instead the test specimens are stored in closed
containers that include a water reservoir to provide a relative humidity 95 % ± 5 % around the test
specimens during incubation;
A grid has been introduced for use during the evaluation of the area of growth observed on the
surface of the test specimens. The use of the grid provides and objective mechanisms for assessing
growth and is explained in the new Annex C.
— Test B has been deleted.
— Positive control specimens (test specimens that allow fungal growth) have been introduced to allow
the determination of basic fungistatic effects of samples that contain biocides.
— The fungal inoculum has been revised to be consistent with other referenced test standards and
changes to the names of fungal strains have been incorporated.
— The media used in the test have been revised based on the experience of various laboratories.
— A staining method has been proposed to aim assessment.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
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Introduction
Under certain climatic and environmental conditions, microorganisms can settle on and colonize the
surface of plastics or plastics products. Their presence and/or their metabolic products might not
only damage the plastic itself, but can also affect the serviceability of building materials and systems
containing plastic parts.
The tests and test conditions specified in this document are empirical and cover most but not all
potential applications.
For specific applications and for long-term tests, procedures which reflect performance under actual
conditions are agreed upon.
The actions of microorganisms on plastics are influenced by two different processes.
a) Direct action: the deterioration of plastics which serve as a nutritive substance for the growth of
the microorganisms.
b) Indirect action: the influence of metabolic products of the microorganisms, e.g. discolouration or
further deterioration.
This document deals with both processes as well as their combined action.
Changes to the method are based on discussions among laboratories that have performed the test for
at least 5 years. On an international level, discussions have taken place within the Plastic Group of the
International Biodeterioration Research Group (IBRG) between scientists with extensive experience
with this document as well as the testing of the interaction between microorganisms and plastics.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 846:2019(E)
Plastics — Evaluation of the action of microorganisms
WARNING — Handling and manipulation of microorganisms which are potentially hazardous
requires a high degree of technical competence. Only personnel trained in microbiological
techniques should carry out such tests. Codes of practice for disinfection, sterilization and
personal hygiene shall be strictly observed. It is recommended that workers consult IEC 60068-
2-10 and ISO 7218.
1 Scope
This document specifies methods for determining the deterioration of plastics due to the action of fungi
and bacteria and soil microorganisms. The aim is not to determine the biodegradability of plastics or
the deterioration of natural fibre composites.
The type and extent of deterioration can be determined by
a) visual examination and/or
b) changes in mass and/or
c) changes in other physical properties.
The tests are applicable to all plastics that have an even surface and that can thus be easily cleaned. The
exceptions are porous materials, such as plastic foams.
This document uses the same test fungi as IEC 60068-2-10. The IEC method, which uses so-called
“assembled specimens”, calls for inoculation of the specimens with a spore suspension, incubation of
the inoculated specimens and assessment of the fungal growth as well as any physical attack on the
specimens.
The volume of testing and the test strains used depend on the application envisaged for the plastic.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 13934-1:2013, Textiles — Tensile properties of fabrics — Part 1: Determination of maximum force and
elongation at maximum force using the strip method
EN 10088-1, Stainless steels — Part 1: List of stainless steels
EN 10088-2, Stainless steels — Part 2: Technical delivery conditions for sheet/plate and strip corrosion
resisting steels for general purposes
EN 13697:2015, Chemical disinfectants and antiseptics — Quantitative non-porous surface test for the
evaluation of bactericidal and/or fungicidal activity of chemical disinfectants used in food, industrial, domestic
and institutional areas — Test method and requirements without mechanical action (phase 2, step 2)
IEC 60068-2-10, Environmental testing — Part 2-10: Tests — Test J and guidance: Mould growth
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
biodeterioration
undesired change in the properties, such as colour, strength, mass, of a material due to the action of a
microorganism
3.2
fungistatic effect
antimycotic effect of an antimicrobial treatment which prevents a given material from being overgrown
by fungi under moist conditions
4 Principle
4.1 General
The test involves exposing test specimens of plastic to the action of selected test strains of fungi and
bacteria (or, in the case of the soil-burial test, to microbially active soil) for specified or agreed periods
of time under specified conditions of temperature and humidity.
At the end of the exposure, the test specimens are assessed before and/or after cleaning by visual
examination and/or any change in mass or other physical properties is determined.
The results obtained with the specimens exposed to microorganisms (test series I) are compared with
those obtained from retained reference specimens (test series 0) or sterile specimens (test series S)
kept under the same conditions.
In the case of testing fungistatic properties, a visual assessment is made between test specimens free of
biocides and with those containing biocides to demonstrate the effect of a biocide in a qualitative manner.
Short descriptions of the test methods used to determine the resistance of plastics to fungi (method A)
or the fungistatic effects (method B), resistance to bacteria (method C) and resistance to soil
microorganisms (method D) are given in 4.2 to 4.4.
4.2 Resistance to fungi
4.2.1 Method A: Fungal-growth test
Test specimens are exposed to a mixed suspension of fungal spores in the presence of a humidity ≥95 %
relative humidity. After the limited nutrients from the spore itself are depleted through formation of
a germination tube, the fungi can only grow at the expense of the material of the test specimens. If
the specimens contain no nutritive component, the fungi cannot develop mycelia and there will be no
deterioration of the plastic.
Method A is suitable for the assessment of the inherent resistance of plastics to fungal attack in the
absence of other organic matter.
4.2.2 Method B: Determination of fungistatic effects
Test specimens are exposed to a mixed suspension of fungus spores in the presence of a complete
nutrient medium, i.e. with a carbon source. Even if the plastic does not contain any nutritive elements,
the fungi can grow over the specimens and their metabolic products can attack the material by
metabolizing the nutrient-agar medium.
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Any inhibition of growth either on the plastic or in the nutrient-agar medium (zone of inhibition) shows
fungistatic activity of the plastic or the presence of a fungicidal treatment.
In order to show a basic qualitative effect of a biocide in a plastic material, specimens free from biocide
shall be included in the test. Only if these biocide-free specimens show more growth than the specimens
containing biocides can a qualitative indication of fungistatic or fungicidal efficacy be determined.
4.3 Method C: Resistance to bacteria
The action of bacteria on test specimens is assessed using an incomplete medium without a carbon
1)
source . If there is no growth in the agar surrounding the specimen, then the specimen does not contain
any nutritive components.
If a material to be tested claims added functionality, such as a product with hygienic effects, the plastic
material should be tested according to ISO 22196 which provides guidance for measuring the basic
antibacterial performance of non-porous (plastic) materials that have been treated with a biocide with
the intention of introducing antibacterial/hygienic properties into that material.
4.4 Method D: Resistance to microbially active soil (soil-burial test)
Test specimens are completely buried in natural soil with a known water-holding capacity and a
specified moisture content (see Annex A).
The soil-burial test has been included in this document because many plastics are used in permanent
contact with soil and exposed to high humidities.
4.5 Choice of properties for assessment of biodeterioration
The choice of the properties to be determined depends on the aim of the test. A visual assessment of
biological attack shall always be made as the first stage in assessing the resistance of the plastic.
It is recommended that determinations be made of those properties which clearly indicate surface
changes, such as surface gloss, flexural properties, impact resistance and hardness.
5 Apparatus and materials
5.1 For all tests
5.1.1 Incubators, capable of controlling the temperature to ±1 °C at 29 °C at a relative humidity
of ≥ 95 %.
5.1.2 Oven, capable of controlling the temperature at 45 °C ± 1 °C for drying test specimens and at
between 103 °C and 105 °C for determining the water-holding capacity of soil.
5.1.3 Climatic chamber, capable of maintaining standard temperature and humidity conditions (23 °C
and 50 % R.H.) for the conditioning of test and control specimens.
5.1.4 Autoclave, capable of maintaining a temperature and pressure of 120 °C and 2 bar, respectively,
for sterilizing glass containers or glass Petri dishes and soil.
5.1.5 Analytical balance, accurate to 0,1 mg.
5.1.6 Laboratory centrifuge.
1) Agar-agar used in media needs to be very low in carbon.
5.1.7 Stereoscopic microscope, magnification × 50.
5.1.8 Glass or plastic disposable Petri dishes with vented lids, of suitable size for exposing test
specimens.
5.1.9 Glass containers with lid, with a volume of at least 1 l (height approximately. 16 cm; diameter
approximately 11 cm), with sufficient space to allow a reservoir of water to be set-up below the Petri dishes.
5.1.10 Distilled or deionized water.
The water used for the preparation of all solutions and nutritive media and for all determinations shall
be distilled or deionized and have a conductivity of < 1 µS/cm.
5.1.11 Microbicidal solution, is Ethanol-water mixture, in the proportions, by mass, of 70:30.
5.1.12 Stainless steel coupons (method A).
These shall be 1.4301 (in accordance with EN 10088-1) stainless steel discs (about 2 cm in diameter)
with Grade 2 B (in accordance with the requirements of EN 10088-2) finish on both sides. The surface
shall be as flat as possible and the stainless steel should have a gauge of 1,2 mm or 1,5 mm.
NOTE Suitable stainless steel discs can usually be purchased from local engineering companies.
5.1.13 Buchner funnel, with a sintered filter.
5.1.14 Grid (5 mm × 5 mm), inscribed on clear carrier (e.g. glass or plastic) to be used to evaluate the
colonisation of the surface of test specimens by fungi.
5.1.15 o-phenylphenol solution.
Dissolve 1 g of o-phenylphenol in 50 ml of 90 % ethanol, make up to 1 000 ml with water and adjust the
pH to 3,5 by adding lactic acid drop by drop.
5.2 For tests with fungi
5.2.1 Test fungi
The test fungi shall be obtained from national culture collections. The strains to be used are listed in
Table 1, and shall be stated in the test report. Alternative culture collections and strain numbers of the
same fungal strains are listed in Annex C.
Table 1 — Fungal strains to be used when testing plastics without electronic application
Name Strain
Aspergillus niger ATCC 6275
Penicillium pinophilum ATCC 36839
Paecilomyces variotii ATCC 18502
Trichoderma virens ATCC 9645
Chaetomium globosum ATCC 6205
If there are technical reasons, and by agreement between the interested parties, other species may be
used. In this case, too, the strains used shall be stated in the test report.
4 © ISO 2019 – All rights reserved
When performing tests on plastics intended for use in electronic components and electronic equipment,
using the method specified in IEC 60068-2-10 use Aspergillus niger, Penicillium pinophilum, Paecilomyces
variotii and Trichoderma virens from Table 1 and the three strains given in Table 2.
Table 2 — Fungal strains to be used when testing electronics
Name Strain
Aspergillus niger ATCC 6275
Penicillium pinophilum ATCC 36839
Paecilomyces variotii ATCC 18502
Trichoderma virens ATCC 9645
Chaetomium globosum ATCC 6205
Aspergillus terreus ATCC 10690
Hormoconis resinae DSM 1203
Scopulariopsis brevicaulis ATCC 36840
5.2.2 Stock strains
Culture the test fungi (5.2.1) in tubes on agar slants or in Petri dishes containing malt-extract agar of
the following composition:
Malt extract 30 g
Agar 20 g
Water 1 000 ml
Sterilize at 120 °C ± 1 °C for 20 min in an autoclave in an atmosphere saturated with water vapour.
After incubation at 29 °C ± 1 °C, well sporulating cultures may then be used. They shall not be stored for
more than 4 weeks at this temperature.
Because of the possibility of genetic and physiological changes in the test fungi during culturing on
artificial media, the intervals between sub-culturing shall be reduced to a minimum by suitable
measures (e.g. lyophilization of cultures, storage at +4 °C or in liquid nitrogen or on cryo-beads at
−70 °C).
5.2.3 Solutions and nutritive media
5.2.3.1 Stock mineral-salt solution, of the following composition (use only chemicals of analytical
grade or equivalent purity):
NaNO 2,0 g
KH PO 0,7 g
2 4
K HPO 0,3 g
2 4
KCI 0,5 g
MgSO ⋅ 7H O 0,5 g
4 2
FeSO ⋅ 7H O 0,01 g
4 2
H O 1 000 ml
Adjust the pH to 6,0 to 6,5 with sterile 0,01 mol/l NaOH solution.
5.2.3.2 Mineral-salt/wetting-agent solution, prepared by adding to 1 l of stock mineral-salt solution
(5.2.3.1) 0,1 g of a non-toxic wetting agent such as N-methyltaurine or polyglycol ether and sterilizing in
an autoclave at 120 °C ± 1 °C for 20 min.
5.2.3.3 Mineral-salt/glucose solution, prepared by adding to stock mineral-salt solution (5.2.3.1)
sufficient glucose to give a concentration of 30 g/l ± 1 g/l and sterilizing in an autoclave at 115 °C ± 1 °C
for 30 min.
5.2.3.4 Incomplete agar medium, prepared by adding to stock mineral-salt solution (5.2.3.1)
sufficient agar to give a concentration of 20 g/I. Dissolve the agar by boiling the solution while stirring.
Sterilize in an autoclave at 120 °C ± 1 °C for 20 min. Adjust the pH to 6,0 to 6,5 with sterile 0,01 mol/l
NaOH solution.
5.2.3.5 Complete agar medium, prepared by adding to the incomplete agar medium (5.2.3.4)
sufficient glucose to give a concentration of 30 g/l ± 1 g/l. Sterilize in an autoclave at 115 °C ± 1 °C for
30 min. After sterilization, adjust the pH to between 6,0 and 6,5 at 20 °C with sterile 0,01 mol/l NaOH
solution.
5.3 For tests with bacteria
5.3.1 Test bacterium, Pseudomonas aeruginosa, strain NCTC 8060 or ATCC 13388.
A well-defined strain of the test bacterium shall be obtained from a national culture collection. If, by
agreement, additional test bacteria are used, they shall be mentioned in the test report.
5.3.2 Nutritive media, and solutions.
5.3.2.1 Casein soybean peptone agar, prepared in accordance with the manufacturer’s instructions.
The medium may be obtained from commercial suppliers.
5.3.2.2 Sterile buffer solution, pH 7,0 at 20 °C.
Prepare the following two solutions separately:
KH PO 9,1 g/l (solution A)
2 4
Na HPO 11,9 g/l (solution B)
2 4
Mix 600 ml of solution A with 400 ml of solution B. Sterilize in an autoclave at 120 °C ± 1 °C for 20 min.
Adjust the pH to 7,0 at 20 °C by adding 0,01 mol/l NaOH solution.
5.4 For soil-burial tests
Use an activated soil with a moisture content of (60 ± 5) % of the water-holding capacity of the soil (see
Annex A).
The water-holding capacity is the water content of a soil when it is saturated with water.
The pH of an aqueous soil extract (1 g of soil in 20 g of water) shall be between 4,0 and 7,0.
Determine the moisture content and water-holding capacity of the soil in accordance with Annex A. If
the moisture content of the soil exceeds the above figure, spread it out in a thin layer under ambient
laboratory conditions. Do not heat the soil or allow it to dry out as this may affect the soil microflora. If
the moisture content needs to be raised, use an aqueous solution of 1 g of ammonium nitrate and 0,2 g
of di-potassium phosphate in 1 l of water.
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6 Test specimens
6.1 Shape and dimensions
The shape and dimensions of the specimens will depend on any tests to be performed following
exposure to the fungi, bacteria or soil.
If it is necessary to measure changes in the thickness of the specimens, use specimens taken from the
original material. If the material is to be moulded before use, use specimens with a maximum thickness
of 0,5 mm.
If changes in mass are to be measured, use square specimens of size of (50 mm ± 1 mm) × (50 mm ± 1 mm)
with a maximum thickness of 2 mm. A thickness of 0,5 mm to 2 mm is recommended.
Since the microorganisms may attack the surface of the plastic tested, only results using specimens of
the same dimensions may be compared.
6.2 Specimen test series and numbers in each test series
6.2.1 Specimen test series
6.2.1.1 For each sample and each test method, prepare three test series of specimens:
— test series 0: climate control specimens, stored under standard temperature and standard moisture
conditions;
— minimum 2 specimens
— test series S: sterile specimens, stored under the same conditions as test series I.
— minimum 2 specimens
— test series I: test specimens inoculated with microorganisms and incubated;
— minimum 5 test specimens of each sub-test series a and/or b (see Table 3) according to the
purpose of the test.
6.2.1.2 Sub-test series a (without biocide) and sub-test series b (with biocide).
If the test specimens contain biocides and the test is intended to show the biocidal efficacy of an active
substance intended to protect the material from biodeterioration, then for test series I two sets of
test specimens have to be tested: one without a biocide (sub-test series a) and one test series with the
biocide (sub-test series b). Therefore, 10 test specimens in total need to be inoculated. Ideally, these
test specimens should be identical except for their biocide content. This test set-up would allow the
demonstration of the basic preservative efficacy for an active substance.
6.2.1.3 Sub-test series c (for Test A only): stainless steel coupons as negative controls (minimum
3 specimens).
These control specimens are comprised of non-corrodible stainless steel, which contains no nutrient
source for fungi. They are inoculated, incubated and assessed (see Table 4) in the same way as the test
specimens in test series I. Should growth occur on these inert surfaces this indicates that nutrients
have been unintentionally transported onto the surface of the control specimen with the inoculum. Any
growth on these negative control specimens shall be reported according to Table 4 as well as whether
growth is more or less than on the other inoculated specimens in test series I.
6.2.2 Numbers in each test series
For visual examination, prepare a total of at least 11 specimens per plastic sample and per test method.
Additionally, prepare 3 negative control specimens (stainless steel coupons), if testing according to
Method A of this document. Prepare 5 specimens without biocide as positive controls, if testing for
biocidal effects according to Method B. These coupons shall be cleaned according to EN 13697.
NOTE The cleaning process described in EN 13697 ensures that no fatty residues from production are left
on the coupons.
For determination of mass changes, prepare at least six specimens for each test series, i.e. a total of at
least 18 specimens per sample and per test method.
For other assessment procedures, use the number of specimens specified in the referring standard.
The test procedure for each assessment shall be carried out separately. However, specimens for
determining changes in mass or other physical properties may also be used for visual examination.
7 Preparation of specimens
7.1 Cleaning
Dip specimens for methods A and C into the microbicidal solution (5.1.11) for 1 min and either dry at
45 °C for 4 h or, alternatively, for 72 hours at room temperature under sterile conditions, unless they
are adversely affected by ethanol. In the latter case, store the specimens in a sterile container, handling
them with sterile forceps. Carry out all subsequent handling of the specimens using forceps to avoid
contamination by extraneous organic matter.
The metal coupons that serve as negative control specimens for method A need to be cleaned according
to EN 13697:2015, 5.2.3 (see Annex B)
Do not clean specimens for methods B or D.
7.2 Labelling and storage
Store the cleaned and labelled (or marked) specimens in Petri dishes (5.1.8) at ambient temperature.
Labelling or marking may result in surface reactions by the plastic during the test. In such cases, store
the specimens separately in suitable containers (e.g. Petri dishes) and mark the Petri dishes, not the
specimens, to avoid surface reactions. In all other cases, the specimens may be labelled directly using a
suitable marker.
7.3 Conditioning and weighing
Store each series of test specimens used for determining change in mass in a desiccator at ambient
temperature until the mass of each specimen (m , m , m , etc.) is constant to the nearest 0,1 mg
1 2 3
(usually after 48 h). Record the mass of each specimen. Unless otherwise agreed, specimens for visual
examination and/or for determination of changes in physical properties other than mass do not need
conditioning at this stage.
It may be agreed between the interested parties to store the specimens in a desiccator at 45 °C. In this
case, cool over silica gel to room temperature before use and store until constant mass is reached at
20 °C ± 1 °C and (65 ± 3) % R.H. If this procedure is followed, it shall be mentioned in the test report.
8 © ISO 2019 – All rights reserved
8 Procedures
8.1 Test temperature
Prepare and assess specimens at room temperature and incubate them at 29 °C ± 1 °C.
8.2 Test methods
8.2.1 General
A general scheme of the test methods described is shown in Table 3. The choice of method and of the
properties to be measured depends on the material under test and the conditions of use envisaged to it.
Table 3 — Summary of test methods
Tests with fungi Tests with bacteria Tests with soil
Method A B C D
Subclause 8.2.2 8.2.3 8.2.4 8.2.5
Medium used none Complete agar medium Incomplete agar Soil
medium
(5.2.3.5) (see 5.4)
(5.2.3.4) inoculated
as specified in 8.2.4.5
Test series I S I S I S I S
a b a c
Sub-test series a , c a , b
Solution Sp-S Ms-S Sp-S Ms-S None Ms-S None Ms-S
sprayed on
c
specimens
Incubation 29 °C ± 1 °C
conditions
d
4 weeks or more; ≥95 % relative humidity
Sp-S = spore suspension;
Ms-S = microbicidal solution.
NOTE “I” indicates inoculated test specimens, “S” indicates sterile test specimens in this table.
a
Test specimens (with or without biocide).
b
Negative control specimens (here: stainless steel coupon).
c
Test specimens without biocide (ideally, these test specimens should be identical to a1, but without biocide).
d
This humidity is achieved via a humid chamber in method A and via the agar medium in methods B and C. For method D
this RH is achieved when soil moisture and temperature are according to the standard and the glass container has a lid. To
confirm the RH use a calibrated data logger in the test set-up.
8.2.2 Fungal-growth test (method A)
8.2.2.1 Arrangement of test specimens in humid chamber
8.2.2.1.1 Preparation of humid chamber
A humid chamber needs to be prepared where the test specimens can be incubated at a relative
humidity of 95 % ± 5 %.
NOTE This level of humidity can be generated when the Petri-dishes, holding the test specimens, are kept
above a reservoir of water surface, for example, by placing them on a stainless steel mesh above the water in a
closed container.
8.2.2.1.2 Placing of test specimens in humid chamber
Place the specimens separately into Petri dishes, as flat as possible onto the bottom of the Petri dish,
avoiding any contact between specimens and with the walls of the Petri dishes. Close the Petri dish
with a vented lid to allow the humid air into the Petri dish.
Divide the prepared Petri dishes randomly into test series as required for the test to be performed.
If it is anticipated that the specimens may lift away from the bottom of the Petri dish ballast the area of
the edge (outer 5 mm) of the test specimens with inert weights (e.g. made from glass or stainless steel)
to keep them as flat as possible.
8.2.2.2 Preparation of spore suspension
8.2.2.2.1 General
Produce a spore suspension from well sporulated cultures, using mineral-salt/wetting-agent solution
(5.2.3.2).
8.2.2.2.2 Harvesting the spores
Introduce into each culture tube or Petri dish (see 5.2.2) 5 ml of mineral-salt/wetting agent solution.
Gently scrape the surface of the sporulating culture with a sterile tool, e.g. inoculation needle, to obtain
an aqueous suspension of the spores. Gently shake the culture vessel to disperse the spores in the liquid.
Repeat this procedure with the same culture vessel three times. Then shake the spore suspension of
each fungal culture with sterile glass beads and filter through a thin layer of sterile cotton or glass wool
or a Buchner funnel with a sintered glass filter to remove mycelial fragments.
8.2.2.2.3 Washing the spores by centrifugation, and preparation of working suspensions
Aseptically centrifuge the filtered spore suspension and discard the supernatant liquid. Re-suspend
the residue in 25 ml of mineral-salt solution (5.2.3.1) and centrifuge again. Suspend the washed residue
in 50 ml of stock mineral-salt solution. This repeated washing of the spore suspensions is intended to
guarantee that all surface-active substances are removed which might cause stress cracking in some
plastics.
Adjust the number concentration of spores to about 10 /ml (determined using a counting chamber or
by turbimetry).
Repeat these operations with each test fungus. Blend equal volumes of five suspensions containing the
same number of spores to obtain the final mixed spore suspension ready for inoculation. Use the spore
suspension within 6 h of preparation.
NOTE When new plastics formulations are tested, the investigator can carry out preliminary tests using
individual fungi or selected combinations of fungi.
8.2.2.3 Spore viability check
Fill two sterile Petri dishes with complete agar medium (5.2.3.5), following the procedure given
in 8.2.2.1 and inoculate with one drop of each of the spore suspensions (before blending the spore
suspension). Incubate at 29 °C ± 1 °C for 3 to 4 d (carry out the viability check at the same temperature
as the actual test). In the absence of copious growth, prepare a new spore suspension from other culture
tubes and repeat the test.
8.2.2.4 Inoculation or disinfection of specimens
For each specimen in test series I, spray or pipette evenly on to the surface of the specimen and of the
agar 0,1 ml of the spore suspension prepared in 8.2.2.2. in a manner to achieve in average a minimum
10 © ISO 2019 – All rights reserved
number of 1 000 spores per cm , taking care that the spore suspension does not settle or separate
during delivery.
For each specimen in test series S, pipette 3 ml of microbicidal solution (5.1.11) on to the surface.
8.2.2.5 Incubation
Incubate both the inoculated specimens and the sterile controls either at 29 °C ± 1 °C for 4 weeks, or
longer by agreement between the interested parties. Take precautions to prevent condensed water
dropping onto the surface of the specimens. If the test lasts more than 4 weeks, re-inoculate the
specimens every 4 weeks in accordance with 8.2.2.2, using washed
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 846
Troisième édition
2019-03
Plastiques — Évaluation de l'action
des micro-organismes
Plastics — Evaluation of the action of microorganisms
Numéro de référence
©
ISO 2019
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Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vii
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Résistance aux champignons . 2
4.2.1 Méthode A: Essai de croissance fongique . 2
4.2.2 Méthode B: Détermination des effets fongistatiques . 3
4.3 Méthode C: Résistance aux bactéries . 3
4.4 Méthode D: Résistance à un sol microbiologiquement actif (essai par
enfouissement dans le sol) . 3
4.5 Choix des propriétés pour l’évaluation de la biodétérioration . 3
5 Appareillage et matériaux . 3
5.1 Pour tous les essais . 3
5.2 Pour les essais avec champignons . 4
5.2.1 Champignons pour essai . 4
5.2.2 Souches mères . 5
5.2.3 Solutions et milieux nutritifs . 6
5.3 Pour les essais avec bactéries. 6
5.4 Pour les essais par enfouissement dans le sol . 7
6 Éprouvettes . 7
6.1 Forme et dimensions . 7
6.2 Séries d’essais d’éprouvettes et nombre dans chaque série d’essais . 8
6.2.1 Séries d’essais d’éprouvettes. 8
6.2.2 Nombre dans chaque série d’essais . . 8
7 Préparation des éprouvettes . 9
7.1 Nettoyage . 9
7.2 Étiquetage et stockage . 9
7.3 Conditionnement et pesée . 9
8 Modes opératoires . 9
8.1 Température d’essai . 9
8.2 Méthodes d’essai . 9
8.2.1 Généralités . 9
8.2.2 Essai de croissance des champignons (méthode A) .10
8.2.3 Détermination de l’effet fongistatique (méthode B) .12
8.2.4 Mode opératoire avec bactéries (méthode C) .13
8.2.5 Essai par enfouissement dans le sol (méthode D) .14
9 Évaluation .15
9.1 Évaluation par examen visuel de la croissance fongique sur les éprouvettes
(méthodes A, В et D) .15
9.2 Évaluation des éprouvettes en vue de la détermination des variations de masse et/
ou d’autres propriétés physiques .16
9.2.1 Nettoyage.16
9.2.2 Variation de masse .17
9.2.3 Détermination des variations d’autres propriétés physiques .17
10 Expression des résultats.17
10.1 Évaluation visuelle .17
10.2 Variation de masse .17
10.3 Variations d’autres propriétés physiques .18
11 Exactitude des mesurages .18
12 Rapport d’essai .18
Annexe A (normative) Détermination de la teneur en eau et de la capacité de rétention
d’eau d’un sol.20
Annexe B (normative) Témoin négatif pour l’essai A .22
Annexe C (normative) Quadrillage pour l’évaluation de la croissance fongique en surface
(essai A) .23
Annexe D (informative) Informations relatives aux champignons pour essai .25
Bibliographie .27
iv © ISO 2019 – Tous droits réservés
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 61, Plastiques, sous-comité SC 6,
Vieillissement et résistance aux agents chimiques et environnants.
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 846:1997), qui a fait l’objet d’une
révision technique. Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes:
— La taille des éprouvettes a été définie comme étant égale à (50 mm ± 1 mm) × (50 mm ± 1 mm).
Une taille fixe permet de déterminer les effets de bord associés à la zone de 5 mm à partir du
bord extérieur (voir la nouvelle Annexe C). De cette manière, l’évaluation de la croissance sur les
éprouvettes est harmonisée.
— De nouvelles Annexes B et C ont été ajoutées et les anciennes annexes ont été renumérotées.
— L’ancienne Annexe C a été mise à jour et est devenue l’Annexe D.
— Essai A uniquement:
Des coupons en acier inoxydable servant d’éprouvettes témoins négatives ont été introduits. Leur
but est de fournir une référence pour les cas où il se produit une croissance fongique dans la boîte
de Petri bien qu’aucun nutriment n’ait été ajouté lors de l’essai.
L’essai n’utilise plus de milieu gélosé pour fournir une source d’humidité permettant d’obtenir une
humidité relative de 95 % ± 5 %. À la place, les éprouvettes sont conservées dans des récipients
fermés qui comportent un réservoir d’eau pour assurer une humidité relative de 95 % ± 5 % autour
des éprouvettes lors de l’incubation.
Un quadrillage, utilisé lors de l’évaluation de la zone de croissance observée à la surface des
éprouvettes, a été introduit. L’utilisation de ce quadrillage fournit des mécanismes objectifs pour
évaluer la croissance et est expliquée dans une nouvelle Annexe C.
— L’essai B a été supprimé.
— Des éprouvettes témoins positives (éprouvettes permettant la croissance fongique) ont été
introduites pour permettre la détermination des effets fongistatiques de base des échantillons
contenant des biocides.
— L’inoculum fongique a été révisé pour être en cohérence avec d’autres normes d’essai référencées et
certains noms de souches fongiques ont été modifiés.
— Les milieux utilisés lors de l’essai ont été révisés en fonction de l’expérience acquise par divers
laboratoires.
— Une méthode de coloration a été proposée pour faciliter l’évaluation.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
vi © ISO 2019 – Tous droits réservés
Introduction
Dans certaines conditions climatiques et environnementales, les micro-organismes peuvent se fixer sur
la surface des plastiques ou des produits en matériaux plastiques et la coloniser. Non seulement leur
présence et/ou les produits de leur métabolisme peuvent endommager le plastique lui-même, mais il
arrive qu’ils altèrent également l’aptitude à l’emploi des matériaux de construction et des systèmes qui
comprennent des parties en matériaux plastiques.
Les essais et les conditions d’essai spécifiés dans le présent document sont empiriques et couvrent la
plupart des applications possibles, mais pas toutes.
Pour certaines applications spécifiques et pour les essais de longue durée, il convient de se mettre
d’accord sur des modes opératoires qui reflètent les performances dans les conditions réelles.
L’action des micro-organismes sur les plastiques est influencée par deux types de processus:
a) action directe: détérioration du plastique qui sert de substance nutritive pour la croissance des
micro-organismes;
b) action indirecte: influence des produits du métabolisme des micro-organismes, par exemple
décoloration ou aggravation de la détérioration.
Le présent document traite de ces deux processus et de leur action combinée.
Les changements apportés à la méthode font suite aux discussions entre les laboratoires qui réalisent
l’essai depuis au moins 5 ans. Sur le plan international, des discussions ont eu lieu au sein du Groupe
d’étude des plastiques de l’International Biodeterioration Research Group (IBRG), entre des scientifiques
ayant une grande expérience à la fois de l’ISO 846 et des essais d’interaction entre les micro-organismes
et les plastiques.
NORME INTERNATIONALE ISO 846:2019(F)
Plastiques — Évaluation de l'action des micro-organismes
AVERTISSEMENT — La manutention et la manipulation de micro-organismes potentiellement
dangereux requièrent un niveau élevé de compétences techniques. Il convient que ces essais ne
soient effectués que par un personnel spécialement formé aux techniques microbiologiques.
Les codes de bonnes pratiques de désinfection, de stérilisation et d’hygiène doivent être
rigoureusement respectés. Il est recommandé aux opérateurs de consulter l’IEC 60068-2-10 et
l’ISO 7218.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie des méthodes pour la détermination de la détérioration des plastiques
lorsqu’ils sont exposés à l’action des champignons et des bactéries, et à celle des micro-organismes
vivant dans le sol. Il n’a pas pour but de déterminer la biodégradabilité des plastiques ou la détérioration
des composites en fibres naturelles.
Le type et l’ampleur de la détérioration engendrée peuvent être déterminés:
a) par un examen visuel; et/ou
b) à partir des variations de masse; et/ou
c) à partir des variations d’autres propriétés physiques.
Les essais sont applicables à tous les plastiques ayant une surface plane et qui peuvent, de ce fait, être
aisément nettoyés, exception faite des matériaux poreux, tels que les mousses en plastique.
Le présent document utilise les mêmes champignons pour essai que l’IEC 60068-2-10. La méthode IEC,
qui utilise ce qu’on appelle des «spécimens assemblés», nécessite l’inoculation des éprouvettes avec
une suspension de spores, l’incubation des éprouvettes ensemencées et l’évaluation de la croissance
fongique ainsi que de l’attaque physique des éprouvettes.
Le volume des essais et les souches d’essai à utiliser dépendront de l’application prévue pour le plastique.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 13934-1:2013, Textiles — Propriétés des étoffes en traction — Partie 1: Détermination de la force
maximale et de l'allongement à la force maximale par la méthode sur bande
ISO 22196, Mesurage de l'action antibactérienne sur les surfaces en plastique et autres surfaces non
poreuses
EN 10088-1, Aciers inoxydables — Partie 1: Liste des aciers inoxydables
EN 10088-2, Aciers inoxydables — Partie 2: Conditions techniques de livraison des tôles et bandes en acier
de résistance à la corrosion pour usage général
EN 13697:2015, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Essai quantitatif de surface non-poreuse pour
l’évaluation de l’activité bactéricide et/ou fongicide des désinfectants chimiques utilisés dans le domaine
de l’agro-alimentaire, dans l’industrie, dans les domaines domestiques et en collectivité — Méthode d’essai
sans action mécanique et prescriptions (phase 2/étape 2)
IEC 60068-2-10, Essais d’environnement — Partie 2-10: Essais — Essai J et guide: Moisissures
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
3.1
biodétérioration
variation indésirable des propriétés d’un matériau, telles que la couleur, la résistance ou la masse,
provoquée par l’action d’un micro-organisme
3.2
effet fongistatique
effet antimycotique d’un traitement antimicrobien qui empêche un matériau donné de se recouvrir de
champignons dans des conditions d’humidité
4 Principe
4.1 Généralités
L’essai consiste à exposer des éprouvettes de plastique à l’action de souches déterminées de
champignons et de bactéries (ou, dans le cadre de l’essai par enfouissement dans le sol, à l’action d’un
sol microbiologiquement actif) pendant des durées spécifiées ou ayant fait l’objet d’un accord entre les
parties intéressées, et dans des conditions déterminées de température et d’humidité.
À la fin de l’exposition, les éprouvettes font l’objet d’une évaluation avant et/ou après nettoyage, par
examen visuel et/ou en déterminant les variations de masse ou d’autres propriétés physiques.
Les résultats obtenus avec les éprouvettes exposées aux micro-organismes (série d’essais I) sont
comparés à ceux obtenus avec des éprouvettes de référence (série d’essais 0) ou avec des éprouvettes
stériles (série d’essais S) conservées dans des conditions identiques.
Dans le cas de l’essai des propriétés fongistatiques, une évaluation visuelle est effectuée entre les
éprouvettes exemptes de biocides et celles qui en contiennent afin de démontrer l’effet d’un biocide de
manière qualitative.
Une description succincte des méthodes d’essai utilisées pour déterminer la résistance des plastiques
aux champignons (méthode A) ou les effets fongistatiques (méthode В), la résistance aux bactéries
(méthode C) et la résistance aux micro-organismes contenus dans le sol (méthode D) est donnée dans
les paragraphes 4.2 à 4.4.
4.2 Résistance aux champignons
4.2.1 Méthode A: Essai de croissance fongique
Les éprouvettes sont exposées à une suspension de plusieurs spores de champignons en présence
d’une humidité relative ≥ 95 %. Une fois que la quantité limitée de nutriments des spores elles-mêmes
est épuisée par la formation d’un tube de germination, les champignons ne peuvent croître qu’au
détriment du matériau des éprouvettes. Si les éprouvettes ne contiennent aucune substance nutritive,
les champignons ne peuvent développer le mycélium et il n’y a pas de détérioration du plastique.
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés
La méthode A est appropriée pour l’évaluation de la résistance inhérente des plastiques à toute attaque
fongique en l’absence de toute autre matière organique.
4.2.2 Méthode B: Détermination des effets fongistatiques
Les éprouvettes sont exposées à une suspension de plusieurs spores de champignons en présence d’un
milieu nutritif complet, c’est-à-dire avec une source de carbone. Même si le plastique ne contient aucune
substance nutritive, les champignons peuvent se développer sur les éprouvettes et les produits de leur
métabolisme peuvent attaquer le matériau en métabolisant le milieu nutritif gélosé.
Toute inhibition de la croissance sur le plastique ou dans le milieu nutritif gélosé (zone d’inhibition) met
en évidence l’activité fongistatique du plastique ou la présence d’un traitement fongicide.
Pour démontrer un effet qualitatif de base d’un biocide dans un matériau plastique, des éprouvettes
exemptes de biocide doivent être incluses dans l’essai. Si ces éprouvettes exemptes de biocide ont une
croissance supérieure à celle des éprouvettes contenant des biocides, une indication qualitative de
l’efficacité fongistatique ou fongicide peut être déterminée.
4.3 Méthode C: Résistance aux bactéries
L’évaluation de l’action des bactéries sur les éprouvettes s’effectue en utilisant un milieu incomplet
1)
(sans source de carbone . Si l’on ne constate aucune croissance dans l’agar-agar autour de l’éprouvette,
cette dernière ne contient pas de substances nutritives.
Si une fonctionnalité supplémentaire est déclarée pour le matériau soumis à l’essai, par exemple un
produit présentant des effets hygiéniques, il convient que le matériau plastique soit soumis à l’essai
conformément à l’ISO 22196, qui fournit un guide pour mesurer les performances antibactériennes de
base de matériaux (plastiques) non poreux ayant été traités avec un biocide dans le but d’introduire des
propriétés antibactériennes/hygiéniques dans ce matériau.
4.4 Méthode D: Résistance à un sol microbiologiquement actif (essai par enfouissement
dans le sol)
Les éprouvettes sont complètement enfouies dans un sol naturel caractérisé par une capacité de
rétention d’eau connue et par une teneur en eau spécifiée (voir l’Annexe A).
L’essai par enfouissement dans le sol a été inclus dans le présent document, car un grand nombre de
plastiques sont utilisés en contact permanent avec le sol et exposés à des niveaux élevés d’humidité.
4.5 Choix des propriétés pour l’évaluation de la biodétérioration
Le choix des propriétés à déterminer dépend du but de l’essai. Toujours procéder à une évaluation
visuelle de l’attaque biologique; celle-ci tiendra lieu de première étape dans l’évaluation de la résistance
du plastique.
Il est recommandé de déterminer les propriétés qui indiquent de manière nette les variations de l’état
de surface, telles que le brillant de surface, les propriétés en flexion, la résistance au choc et la dureté.
5 Appareillage et matériaux
5.1 Pour tous les essais
5.1.1 Incubateurs, permettant de réguler la température à 29 °C, à ± 1 °C près, avec une humidité
relative ≥ 95 %.
1) Il est nécessaire que l’agar-agar utilisé dans les milieux ait une très faible teneur en carbone.
5.1.2 Étuve, permettant de réguler la température à 45 °C ± 1 °C pour sécher les éprouvettes et entre
103 °C et 105 °C pour déterminer la capacité de rétention d’eau du sol.
5.1.3 Enceinte climatique, permettant de maintenir les conditions normales de température et
d’humidité (23 °C et 50 % HR), pour conditionner les éprouvettes et les témoins.
5.1.4 Autoclave, permettant de maintenir une température de 120 °C et une pression de 2 bar, pour
stériliser les récipients en verre ou les boîtes de Petri et le sol.
5.1.5 Balance analytique, avec une résolution de 0,1 mg.
5.1.6 Centrifugeuse de laboratoire.
5.1.7 Microscope stéréoscopique, permettant d’obtenir un grossissement de × 50.
5.1.8 Boîtes de Petri jetables, en verre ou en plastique, avec des couvercles ventilés, de
dimensions appropriées pour exposer les éprouvettes.
5.1.9 Récipients en verre avec couvercle, d’une capacité d’environ 1 l (environ 16 cm de hauteur
et 11 cm de diamètre), avec un espace suffisant pour permettre de monter un réservoir d’eau sous les
boîtes de Petri.
5.1.10 Eau distillée ou déionisée.
L’eau utilisée pour préparer les solutions et les milieux nutritifs et celle utilisée pour les déterminations
doit être de l’eau distillée ou déionisée et avoir une conductivité < 1 µS/cm.
5.1.11 Solution microbicide, mélange éthanol-eau, en proportions en masse de 70:30.
5.1.12 Coupons en acier inoxydable (méthode A).
Il doit s’agir de disques en acier inoxydable 1.4301 (EN 10088-1) (d’environ 2 cm de diamètre), de nuance
2 B (conformément aux exigences de l’EN 10088-2), avec une finition sur les deux faces. La surface doit
être aussi plane que possible et il convient que l’acier inoxydable ait un calibre de 1,2 mm ou 1,5 mm.
NOTE Des disques en acier inoxydable adaptés peuvent généralement être achetés auprès de sociétés
d’ingénierie locales.
5.1.13 Entonnoir Büchner, avec un filtre en verre fritté.
5.1.14 Quadrillage (5 mm × 5 mm), inscrit sur un support transparent (par exemple en verre ou en
plastique), à utiliser pour évaluer la colonisation de la surface des éprouvettes par les champignons.
5.1.15 Solution d’o-phénylphénol
Dissoudre 1 g d’o-phénylphénol dans 50 ml d’éthanol à 90 %, compléter à 1 000 ml avec de l’eau et
ajuster le pH à 3,5 en ajoutant de l’acide lactique goutte à goutte.
5.2 Pour les essais avec champignons
5.2.1 Champignons pour essai
Les champignons pour essai doivent être obtenus auprès des collections nationales de cultures. Les
souches à utiliser sont énumérées dans le Tableau 1 et doivent être consignées dans le rapport d’essai.
4 © ISO 2019 – Tous droits réservés
D’autres collections de cultures et numéros de souches des mêmes souches fongiques sont énumérés
dans l’Annexe C.
Tableau 1 — Souches fongiques à utiliser pour l’essai de plastiques sans application
électronique
Nom Souche
Aspergillus niger ATCC 6275
Penicillium pinophilum ATCC 36839
Paecilomyces variotii ATCC 18502
Trichoderma virens ATCC 9645
Chaetomium globosum ATCC 6205
Pour certaines raisons techniques et conformément à tout accord éventuellement conclu entre les
parties intéressées, il est possible d’utiliser d’autres espèces. En tout état de cause, les espèces utilisées
doivent être consignées dans le rapport d’essai.
Si les essais doivent être conduits sur des plastiques destinés à être utilisés dans la fabrication
d’appareils et de composants électroniques conformément à la méthode spécifiée dans l’IEC 60068-2-10,
utiliser les champignons Aspergillus niger, Penicillium pinophilum, Paecilomyces variotii et Trichoderma
virens pris dans le Tableau 1 conjointement aux trois souches mentionnées dans le Tableau 2.
Tableau 2 — Souches fongiques à utiliser en cas d’application électronique
Nom Souche
Aspergillus niger ATCC 6275
Penicillium pinophilum ATCC 36839
Paecilomyces variotii ATCC 18502
Trichoderma virens ATCC 9645
Chaetomium globosum ATCC 6205
Aspergillus terreus ATCC 10690
Hormoconis resinae DSM 1203
Scopulariopsis brevicaulis ATCC 36840
5.2.2 Souches mères
Cultiver les champignons pour essai (5.2.1) dans des tubes à essai sur de la gélose oblique ou dans des
boîtes de Petri contenant un milieu de gélose à l’extrait de malt ayant la composition suivante:
Extrait de malt 30 g
Agar-agar 20 g
Eau 1 000 ml
Stériliser à 120 °C ± 1 °C pendant 20 min dans un autoclave en atmosphère saturée de vapeur d’eau.
Après incubation à 29 °C ± 1 °C, les cultures abondamment sporulées peuvent alors être utilisées. Elles
ne doivent pas être conservées plus de 4 semaines à cette température.
Étant donné que les champignons pour essai peuvent subir des modifications génétiques et
physiologiques pendant la mise en culture sur les milieux artificiels, il faut réduire au minimum les
intervalles entre chaque préparation de sous-cultures par des mesures appropriées (par exemple
lyophilisation des cultures, conservation à +4 °C ou dans de l’azote liquide ou sur des cryoperles à
−70 °C).
5.2.3 Solutions et milieux nutritifs
5.2.3.1 Solution mère de sels minéraux, ayant la composition suivante (utiliser uniquement des
produits chimiques de qualité analytique reconnue ou de pureté équivalente):
NaNO 2,0 g
KH PO 0,7 g
2 4
K HPO 0,3 g
2 4
KCI 0,5 g
MgSO ⋅ 7H O 0,5 g
4 2
FeSO ⋅ 7H O 0,01 g
4 2
H O 1 000 ml
Ajuster le pH entre 6,0 et 6,5 avec une solution de NaOH stérile à 0,01 mol/l.
5.2.3.2 Solution de sels minéraux/agent mouillant, préparée en ajoutant à 1 l de solution mère de
sels minéraux (5.2.3.1) 0,1 g d’agent mouillant non toxique tel que la N-méthyltaurine ou le polyglycol
éther, et en stérilisant en autoclave à 120 °C ± 1 °C pendant 20 min.
5.2.3.3 Solution de sels minéraux/glucose, préparée en ajoutant à la solution mère de sels minéraux
(5.2.3.1) suffisamment de glucose pour obtenir une concentration de 30 g/l ± 1 g/l et en stérilisant en
autoclave à 115 °C ± 1 °C pendant 30 min.
5.2.3.4 Milieu gélosé incomplet, préparé en ajoutant à la solution mère de sels minéraux (5.2.3.1)
suffisamment d’agar-agar pour obtenir une concentration de 20 g/l. Mettre l’agar-agar en solution en
portant la solution à ébullition sous agitation. Stériliser en autoclave à 120 °C ± 1 °C pendant 20 min.
Après stérilisation, ajuster le pH entre 6,0 et 6,5 avec une solution de NaOH stérile à 0,01 mol/l.
5.2.3.5 Milieu gélosé complet, préparé en ajoutant au milieu gélosé incomplet (5.2.3.4) suffisamment
de glucose pour obtenir une concentration de 30 g/l ± 1 g/l. Stériliser en autoclave à 115 °C ± 1 °C
pendant 30 min. Après stérilisation, ajuster le pH entre 6,0 et 6,5 à 20 °C avec une solution de NaOH
stérile à 0,01 mol/l.
5.3 Pour les essais avec bactéries
5.3.1 Bactérie pour essai, constituée d’une souche de Pseudomonas aeruginosa NCTC 8060 ou
ATCC 13388.
On doit se procurer une souche bien définie de bactérie pour essai auprès d’une collection nationale de
cultures. Si l’on s’accorde pour utiliser d’autres bactéries, on doit les consigner dans le rapport d’essai.
5.3.2 Milieux nutritifs et solutions.
5.3.2.1 Agar-agar à base de caséine de soja peptone, préparée conformément aux instructions du
fabricant.
Le milieu peut être obtenu auprès de fournisseurs commerciaux.
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5.3.2.2 Solution tampon stérile, pH 7,0 à 20 °C.
Préparer séparément les deux solutions suivantes:
KH PO 9,1 g/l (solution A)
2 4
Na HPO 11,9 g/l (solution B)
2 4
Mélanger 600 ml de solution A avec 400 ml de solution B. Stériliser en autoclave à 120 °C ± 1 °C pendant
20 min. Ajuster le pH à 7,0 à 20 °C avec une solution de NaOH stérile à 0,01 mol/l.
5.4 Pour les essais par enfouissement dans le sol
Utiliser un sol activé ayant une teneur en eau de (60 ± 5) % de la capacité de rétention d’eau du sol (voir
l’Annexe A).
La capacité de rétention d’eau est la teneur en eau d’un sol lorsqu’il est saturé d’eau.
Le pH d’un extrait aqueux de sol (1 g de sol dans 20 g d’eau) doit être compris entre 4,0 et 7,0.
Déterminer la teneur en eau et la capacité de rétention d’eau du sol conformément à l’Annexe A. Si la
teneur en eau du sol dépasse la valeur susmentionnée, étaler le sol en mince couche dans les conditions
ambiantes de laboratoire. Ne pas chauffer ni laisser sécher le sol, car cette opération est susceptible
d’altérer la microflore qu’il contient. Si la teneur en eau doit être augmentée, utiliser une solution
aqueuse composée de 1 g de nitrate d’ammonium et de 0,2 g de phosphate dipotassique par litre d’eau.
6 Éprouvettes
6.1 Forme et dimensions
La forme et les dimensions des éprouvettes dépendront des essais devant être effectués après
l’exposition aux champignons ou bactéries, ou après enfouissement dans le sol.
S’il est nécessaire de déterminer les variations de l’épaisseur des éprouvettes, utiliser des éprouvettes
provenant du matériau original. Si le matériau doit être moulé avant utilisation, utiliser des éprouvettes
de 0,5 mm d’épaisseur maximale.
S’il est nécessaire de déterminer les variations de masse, utiliser des éprouvettes carrées de
(50 mm ± 1 mm) × (50 mm ± 1 mm) et 2 mm d’épaisseur maximale. Une épaisseur de 0,5 mm à 2 mm est
recommandée.
Les micro-organismes pouvant attaquer la surface du plastique soumis à l’essai, seuls les résultats
ayant été obtenus à partir d’éprouvettes de dimensions identiques peuvent être comparés.
6.2 Séries d’essais d’éprouvettes et nombre dans chaque série d’essais
6.2.1 Séries d’essais d’éprouvettes
6.2.1.1 Préparer trois séries d’essais d’éprouvettes par échantillon et par méthode d’essai:
— série d’essais 0: éprouvettes témoins, conservées dans les conditions normales de température et
d’humidité;
— minimum 2 éprouvettes
— série d’essais S: éprouvettes stériles, conservées dans les mêmes conditions que celles de la série
d’essais I.
— minimum 2 éprouvettes
— série d’essais I: éprouvettes ensemencées avec des micro-organismes et incubées;
— minimum 5 éprouvettes de chaque sous-série d’essais a et/ou b (voir le Tableau 3) en fonction
de l’objet de l’essai.
6.2.1.2 Sous-série d’essais a (sans biocide) et sous-série d’essais b (avec biocide).
Si les éprouvettes contiennent des biocides et que l’essai est destiné à démontrer l’efficacité biocide d’une
substance active destinée à protéger le matériau de la biodétérioration, alors pour la série d’essais I
deux jeux d’éprouvettes doivent être soumis à l’essai: l’un sans biocide (sous-série d’essais a) et l’autre
avec biocide (sous-série d’essais b). Par conséquent, 10 éprouvettes au total doivent être ensemencées.
Idéalement, il convient que celles-ci soient identiques, excepté leur teneur en biocide. Cette configuration
d’essai permet de démontrer l’efficacité de préservation de base d’une substance active.
6.2.1.3 Sous-série d’essais c (pour l’essai A uniquement): coupons en acier inoxydable comme témoins
négatifs (minimum 3 éprouvettes).
Ces éprouvettes témoins sont en acier inoxydable non corrodable et ne contiennent aucune source de
nutriment pour les champignons. Elles sont ensemencées, incubées et évaluées (Tableau 4) de la même
manière que pour la série d’essais I. Si une croissance se produit sur ces surfaces inertes, cela indique
que des nutriments ont été transportés accidentellement sur la surface de l’éprouvette avec l’inoculum.
Toute croissance sur ces éprouvettes témoins négatives doit être consignée selon le Tableau 4 en
indiquant également si la croissance est plus ou moins importante que sur les autres éprouvettes
ensemencées de la série d’essais I.
6.2.2 Nombre dans chaque série d’essais
Pour l’examen visuel, préparer un total d’au moins 11 éprouvettes par échantillon de plastique et par
méthode d’essai. En outre, préparer 3 éprouvettes témoins négatives (coupons en acier inoxydable)
en cas d’essai selon la méthode A de la présente norme. Préparer 5 éprouvettes sans biocide comme
témoins positifs en cas d’essai portant sur les effets biocides selon la méthode B. Ces coupons doivent
être nettoyés conformément à l’EN 13697.
NOTE Le procédé de nettoyage décrit dans l’EN 13697 garantit qu’il ne reste plus aucun résidu gras issu de
la production sur les coupons.
Pour la détermination des variations de masse, préparer au moins six éprouvettes de chaque série
d’essais, c’est-à-dire un total d’au moins 18 éprouvettes par échantillon et par méthode d’essai.
Pour les autres méthodes d’évaluation, utiliser le nombre d’éprouvettes spécifié dans la norme
appropriée.
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Effectuer séparément les différentes évaluations. Néanmoins, les éprouvettes utilisées pour déterminer
les variations de masse ou d’autres propriétés physiques peuvent également être utilisées pour effectuer
l’examen visuel.
7 Préparation des éprouvettes
7.1 Nettoyage
Pour les méthodes A et C, plonger les éprouvettes pendant 1 min dans la solution microbicide (5.1.11) et
les sécher à 45 °C pendant 4 h ou pendant 72 h à la température ambiante dans des conditions stériles, à
moins qu’elles ne soient endommagées par l’éthanol. Dans ce dernier cas, conserver les éprouvettes dans
un récipient stérile, en les manipulant avec des brucelles stériles. Effectuer toutes les manipulations
auxquelles les éprouvettes seront ultérieurement soumises en utilisant des brucelles pour éviter toute
contamination organique extérieure.
Les coupons de métal qui servent d’éprouvettes témoins négatives pour la méthode A doivent être
nettoyés conformément à l’EN 13697:2015, 5.2.3 (voir l’Annex B).
Ne pas nettoyer les éprouvettes pour les méthodes B ou D.
7.2 Étiquetage et stockage
Une fois nettoyées et étiquetées (ou munies d’un marquage), conserver les éprouvettes dans des boîtes
de Petri (5.1.8) à la température ambiante.
L’étiquetage et le marquage peuvent provoquer des réactions superficielles par le plastique pendant
l’essai. Si c’est le cas, conserver les éprouvettes séparément dans des récipients appropriés (par exemple
boîtes de Petri) et marquer les récipients, non les éprouvettes, afin d’éviter toute réaction superficielle.
Dans tous les autres cas, les éprouvettes peuvent être étiquetées directement à condition d’utiliser un
marqueur approprié.
7.3 Conditionnement et pesée
Conserver chaque série d’éprouvettes utilisées pour déterminer les variations de masse dans un
dessiccateur à la température ambiante jusqu’à ce que la masse de chaque éprouvette (m , m , m , etc.) soit
1 2 3
constante à 0,1 mg près (c’est généralement le cas au bout de 48 h). Noter la masse de chaque éprouvette.
Sauf accord contraire, les éprouvettes utilisées pour l’examen visuel et/ou pour déterminer les variations
de propriétés physiques autres que la masse ne nécessitent aucun conditionnement à ce stade.
Les parties intéressées peuvent convenir de conserver les éprouvettes dans un dessiccateur à 45 °C.
Dans ce cas, les refroidir au-dessus d’un gel de silice jusqu’à la température ambiante avant emploi et
les conserver jusqu’à l’obtention d’une masse constante à 20 °C ± 1 °C et (65 ± 3) % HR. Si ce mode
opératoire est suivi, cela doit être consigné dans le rapport d’essai.
8 Modes opératoires
8.1 Température d’essai
Préparer et évaluer les éprouvettes à la température ambiante et les incuber à 29 °C ± 1 °C.
8.2 Méthodes d’essai
8.2.1 Généralités
Le Tableau 3 donne une présentation générale des méthodes d’essai décrites. Le choix de la méthode
et des propriétés à mesurer dépend du matériau soumis à l’essai et des conditions pour l’emploi prévu.
Tableau 3 — Récapitulatif des méthodes d’essai
Essais par
Essais avec
Essais avec champignons enfouissement
bactéries
dans le sol
Méthode A B C D
Paragraphe 8.2.2 8.2.3 8.2.4 8.2.5
Milieu utilisé Aucun Milieu gélosé Milieu gélosé Sol
complet incomplet (5.2.3.4)
(voir 5.4)
ensemencé
(5.2.3.5)
conformément
à 8.2.4.5
Série d’essais I S I S I S I S
a b a c
Sous-séries a , c a , b
d’essais
Solution Sp-S Ms-S Sp-S Ms-S Aucune Ms-S Aucune Ms-S
pulvérisée
sur les
c
éprouvettes
Conditions 29 °C ± 1 °C
d’incubation
d
Au moins 4 semaines ≥ 95 % d’humidité relative
Sp-S = suspension de spores;
Ms-S = solution microbicide.
NOTE Dans ce tableau, «I» indique
...
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