ISO 21479:2019

NORME ISO
INTERNATIONALE 21479
Première édition
2019-06
Qualité du sol — Détermination des
effets des polluants sur la flore du sol
— Composition en acides gras foliaires
des plantes utilisées pour évaluer la
qualité du sol
Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora
— Leaf fatty acid composition of plants used to assess soil quality
Numéro de référence
©
ISO 2019
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2019
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
Fax: +41 22 749 09 47
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes, définitions et abréviations . 1
3.1 Termes et définitions . 1
3.2 Abréviations . 2
4 Principe . 2
5 Appareillage et réactifs . 2
5.1 Appareillage. 2
5.2 Réactifs . 3
6 Stratégies d’échantillonnage . 3
7 Échantillonnage des tissus foliaires . 3
8 Obtention, extraction et analyses des FAME . 4
8.1 Contrôle de la contamination . 4
8.2 Obtention et extraction des FAME des feuilles de végétaux . 4
8.3 Analyse des FAME . 5
9 Rapport d'essai . 6
9.1 Référence au présent document, c’est-à-dire l'ISO 21479 . 6
9.2 Description du site et des zones analysées . 6
9.3 Échantillonnage des feuilles . 6
9.4 Composition en acides gras . 6
9.5 Conclusion . 6
Annexe A (informative) Résultats de l’essai interlaboratoires . 7
Annexe B (informative) Évaluation de la qualité du sol par détermination de l’indice
Oméga-3 de plantules de Lactuca sativa cultivées ex situ dans des conditions contrôlées .14
Annexe C (informative) Espèces végétales utilisées précédemment avec succès pour
évaluer les sols de sites contaminés (par des composés organiques et/ou des métaux) .16
Annexe D (informative) Variation de l’indice Oméga-3 en fonction de l’heure de récolte, de
la taille des végétaux et du développement foliaire .17
Annexe E (informative) Effet de la quantité de tissus foliaires sur la composition en FAME.19
Annexe F (informative) Exemple de chromatogramme obtenu après l'analyse FAME de
tissus foliaires .20
Annexe G (informative) Méthode mathématique recommandée pour noter les sols de zones
lorsque certaines espèces végétales échantillonnées ne sont pas trouvées dans
toutes les zones .21
Bibliographie .24
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, de la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute autre information au sujet de
l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les
obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
iv © ISO 2019 – Tous droits réservés

Introduction
Sur plus de 150 normes ISO élaborées relatives à la qualité du sol, moins de 40 concernent les organismes
vivants, et parmi celles-ci, seules cinq traitent des végétaux supérieurs, et ce malgré l’importance de la
surveillance des effets indésirables de la qualité du sol sur les organismes vivants.
[1]
L’une de ces cinq normes concerne la génotoxicité , et quatre d’entre elles, l’inhibition de l’émergence
[2-5]
et/ou de la croissance . Il semble donc que ces Normes internationales ciblent un effet très spécifique
(génotoxicité) ou des effets suffisamment importants pour induire des phénotypes développementaux
(et donc visibles): inhibition de l’émergence ou de la croissance de jeunes plantules poussant sur des
sols prélevés sur site. Dès lors, des biomarqueurs plus sensibles/précoces des effets indésirables des
polluants sur les végétaux, tels que «l’indice Oméga-3», sont nécessaires.
L'évaluation des effets d’une contamination du sol par l’indice Oméga-3 repose sur la composition en
acides gras foliaires d’angiospermes poussant sur les sites étudiés. L’utilisation de l’indice Oméga-3 s’est
révélée appropriée pour mettre en évidence la présence de contaminants métalliques et organiques
(herbicides, etc.) dans les sols. Dans cette perspective, il convient également de déterminer les
propriétés physiques et chimiques (pH, teneur en N/P/K) des sols car la composition en acides gras
[12]
foliaires peut varier en fonction de la teneur en nutriments , et le pH peut influencer la biodisponibilité
des composés chimiques. Il est à noter que ce biomarqueur s’est souvent avéré plus sensible (c’est-à-dire
répondant à de plus faibles doses de contaminants) que les paramètres biométriques que sont le taux
[6][14]
de germination et la biomasse . Il permet donc de mettre en évidence des effets indésirables des
sols sur les végétaux qui ne pourraient pas être démontrés par le taux de germination ou la biomasse.
De plus, pour l’évaluation in situ, il peut être difficile d’observer des effets visibles sur le taux de
germination et/ou la biomasse des plantes.
Il convient de noter que, d'un point de vue pratique, notamment avec les espèces végétales récoltées sur
site, et en comparaison d’autres biomarqueurs, l’indice Oméga-3 présente plusieurs avantages.
— Pour l’analyse des acides gras, seuls 20 mg à 50 mg de tissus foliaires frais par échantillon sont
nécessaires. Par conséquent, ceci n’est pas destructif pour les végétaux et il n’est pas difficile
d’obtenir suffisamment de tissus d’une espèce sur une zone donnée.
— Les tissus végétaux prélevés peuvent être conservés dans du méthanol pendant plusieurs jours à
température ambiante avant les analyses.
— Il n’est pas nécessaire de trouver des espèces particulières sur un site et, a priori, n’importe quelle
espèce (souvent choisie parmi les plus représentatives) peut être prélevée (Article 6).
Les résultats d’un essai interlaboratoires effectué par six laboratoires afin d’évaluer la reproductibilité
et la répétabilité de la méthode sont indiqués à l’Annexe A. Les résultats obtenus par le même
investigateur avec le même échantillon et le même instrument de mesure sur une courte période de
temps sont donnés à l’Annexe B
NORME INTERNATIONALE ISO 21479:2019(F)
Qualité du sol — Détermination des effets des polluants
sur la flore du sol — Composition en acides gras foliaires
des plantes utilisées pour évaluer la qualité du sol
AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de substances
chimiques toxiques, mutagènes ou autrement dangereuses ou des micro-organismes infectieux.
La poussière ou les produits chimiques évaporés peuvent entraîner des risques pour la santé
au travail. De plus, les végétaux peuvent absorber des substances chimiques présentes dans le
sol. Il convient donc de prendre les mesures de sécurité appropriées lors de la manipulation des
végétaux soumis à essai.
1 Domaine d’application
Le présent document décrit une méthode visant à comparer la qualité des sols en déterminant la
composition en acides gras des feuilles d’espèces végétales poussant sur ces sols.
Cette méthode ne permet pas de déterminer une valeur optimale de l’indice Oméga-3 et ne peut donc pas
être utilisée pour déterminer la qualité intrinsèque d’un sol d'une zone spécifique (considérée homogène).
La méthode peut être utilisée uniquement pour comparer la qualité des sols entre plusieurs zones.
Cette méthode est applicable à:
— des sols provenant de sites contaminés;
— des sols amendés;
— des sols après remédiation;
— des sols contenant des produits résiduaires (par exemple lisier, fumier, boues ou composts).
La qualité des sols peut aussi être évaluée en déterminant l’indice Oméga-3 de plantules de Lactuca
sativa poussant dans ces sols dans des conditions contrôlées (c’est-à-dire, enceinte phytotronique) et en
comparant ces valeurs avec celles obtenues à partir de sols témoins (voir l’Annexe B).
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes, définitions et abréviations
3.1 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
3.1.1
indice Oméga-3
rapport % C18:3/(% C18:0 + % C18:1 + % C18:2)
Note 1 à l'article: à l’Article L’indice Oméga-3 n’a pas d’unité.
3.2 Abréviations
Pour les besoins du présent document, l’abréviation suivante s’applique.
FAME Esters méthyliques d’acides gras; C16:0: ester méthylique d’acide palmitique; C16:1: ester
méthylique palmitoléique; C18:0: ester méthylique d’acide stéarique; C18:1: ester méthy-
lique d’acide oléique; C18:2: ester méthylique d’acide linoléique; C18:3: ester méthylique
d’acide linolénique.
4 Principe
La méthode est utilisée pour évaluer la qualité des sols en déterminant la composition en acides gras
des feuilles d’angiospermes (voir Annexe C et [9-14][18]) poussant sur ces sols. Après échantillonnage
des tissus foliaires, leur composition en acides gras est déterminée. Pour cela, une transestérification
est réalisée sur les tissus foliaires et les esters méthyliques d’acides gras obtenus sont analysés par
chromatographie en phase gazeuse. Après analyse, le rapport % C18:3 / (% C18:0 + % C18:1 + % C18:2)
est calculé. Plus ce rapport est faible, plus les effets indésirables induits par les sols sur les plantes sont
importants [6][9-14][18].
5 Appareillage et réactifs
5.1 Appareillage
En plus de l’équipement de laboratoire courant, l’appareillage suivant est nécessaire.
5.1.1 Ciseaux pour couper les feuilles.
5.1.2 Pipette graduée en verre, pour ajouter l’acide sulfurique (H SO ) au méthanol, pipettes pour
2 4
introduire le mélange dans des tubes de culture en verre (1 ml/tube) et pipettes Pasteur pour récupérer
l’hexane après l’extraction des FAME.
5.1.3 Tubes de culture en verre (par exemple 1,3 × 10 cm) avec bouchons à vis avec joint en
polytétrafluoroéthylène. Ces tubes de culture ont été numérotés sur ruban adhésif (et non pas directement
sur le verre, pour éviter tout risque d’effacement). Vérifier que les tubes n’ont pas été ébréchés (afin d’en
assurer l’étanchéité).
5.1.4 Système (par exemple bloc chauffant) permettant de chauffer les tubes à 80 °C.
5.1.5 Centrifugeuse de paillasse permettant de centrifuger les tubes entre 200 g et 300 g et de
séparer la phase aqueuse de l’hexane.
5.1.6 Fioles de chromatographe en phase gazeuse avec inserts CG et bouchons à vis munis d’un
septum en polytétrafluoroéthylène.
5.1.7 Chromatographe en phase gazeuse équipé d’un détecteur à ionisation de flamme (FID) et
d’une colonne capillaire permettant la séparation et la quantification des esters méthyliques d’acides
gras de 12 atomes de carbone à 22 atomes de carbone, et pour chaque longueur de chaîne aliphatique,
permettant de séparer les esters saturés, mono, di et tri-insaturés.
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés

NOTE 1 La plupart du temps, les études qui ont conduit à l’élaboration du présent document ont été effectuées
à l’aide d’un chromatographe en phase gazeuse (Hewlett Packard 5890 série II ou Hewlett Packard 7890A) sur
une colonne capillaire Carbowax de 1,2 micron, 0,53 mm de diamètre et 15 m de longueur (Altech, Deerfield,
IL., États-Unis) ou sur une colonne capillaire DB-WAX de 1 micron, 0,53 mm de diamètre et 15 m de longueur
1)
(Agilent, Santa Clara, CA., États-Unis), l’hélium étant le gaz vecteur .
5.2 Réactifs
5.2.1 Méthanol (99 %) et acide sulfurique (H SO ), composants de la solution de transestérification.
2 4
5.2.2 Eau distillée et hexane (99 %) pour extraire les FAME.
6 Stratégies d’échantillonnage
Étant donné que la composition en acides gras des végétaux peut varier en fonction des conditions
climatiques, il convient que les zones comparées partagent les mêmes conditions climatiques (humidité,
température, ensoleillement). De plus, étant donné que l’indice Oméga-3 est un indicateur précoce, sa
valeur n’est pas pertinente lorsqu’un fort phénotype visuel (biomasse hautement réduite, chlorose
foliaire élevée, etc.) est détecté dans les végétaux ayant poussé dans une zone, et n’est pas détecté dans
une autre zone.
Selon l’objectif de l’étude, une ou plusieurs angiospermes peuvent être échantillonnées sur chaque
zone d’intérêt. Pour la plupart des études, même si une seule espèce peut être utilisée pour l’évaluation
d’un site donné (le sol d’une décharge métallurgique par exemple), il est recommandé d’utiliser
plusieurs espèces (si possible, de trois à huit). En effet, en utilisant une seule espèce, il est possible
d’échantillonner fortuitement une espèce hautement résistante (ou sensible). De plus, plus le nombre
d’espèces échantillonnées est élevé, plus les résultats seront représentatifs de la «qualité du sol» pour
la phytocénose en général. Par conséquent, dans ce cas, les différentes zones du site sont d’abord
prospectées, et les espèces à échantillonner sont choisies parmi les exemples les plus représentatifs
et, dans la mesure du possible, communs à toutes les zones. Il convient d’échantillonner, par zone, une
feuille (ou un morceau de feuille lorsque les feuilles entières sont trop grandes pour être complètement
immergées dans 1 ml de méthanol/H SO , voir 8.2) de quatre à huit individus par espèce. L’Annexe C
2 4
répertorie certaines espèces végétales précédemment utilisées avec succès pour évaluer les sols de
sites contaminés (par des composés organiques et/ou des métaux).
Lorsqu’il est impossible d’échantillonner les mêmes espèces dans toutes les zones, il demeure possible
de déterminer l’indice Oméga-3, mais dans ce cas: (i) il convient que toutes les espèces échantillonnées
dans une zone donnée soient présentes et échantillonnées dans au moins une autre zone, et (ii) il
convient que toutes les paires de zones partagent au moins une espèce à échantillonner.
Noter que pour l’évaluation des pratiques agricoles, la seule espèce végétale à échantillonner est
généralement l’espèce d’intérêt, à savoir la plante cultivée. Lorsqu’une seule espèce est échantillonnée,
une feuille (ou un morceau de feuille) de 6 à 12 individus par zone est récoltée.
7 Échantillonnage des tissus foliaires
Il convient de respecter les recommandations suivantes pour échantillonner des tissus foliaires adaptés
à l’analyse ultérieure:
— la réaction de transestérification consistant à obtenir des esters méthyliques d’acides gras à partir
d’échantillons biologiques, et la présence d’eau entraînant l’hydrolyse des esters formés, la présence
d’eau externe sur les échantillons biologiques doit être évitée. Par conséquent, si des feuilles
sont mouillées, avant l’échantillonnage, il est nécessaire d’enlever l’eau de leur surface à l’aide d’un
papier absorbant;
1) Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs de la présente norme et ne
saurait constituer un engagement de l'ISO à l’égard de ce produit.
— ne pas échantillonner les feuilles souffrant de stress hydrique (sécheresse) ou biotique (pathogènes).
Il convient de récolter uniquement les feuilles vertes;
— récolter les feuilles sur des individus de taille similaire. Par conséquent, il convient de ne pas récolter
les feuilles de petits individus dans une zone et les feuilles de grands individus dans une autre zone
pour mesurer l’indice Oméga-3 (voir Annexe D et [12]);
— à titre de précaution, nous recommandons de ne récolter que les feuilles matures et de laisser celles
en développement (voir Annexe D);
— lorsque seule une partie des feuilles est échantillonnée à partir d’une espèce donnée, récolter la
même partie des feuilles (la partie distale par exemple) pour tous les individus;
— à titre de précaution, il est recommandé de récolter tous les végétaux dans un délai de 2 h à 3 h (voir
Annexe D).
8 Obtention, extraction et analyses des FAME
8.1 Contrôle de la contamination
Pour empêcher toute contamination, il est nécessaire d’éviter tout contact entre les solutions et
plastique, parafilm, colle, etc. Pour s’assurer de l’absence de contaminations (par exemple, erreurs de
protocole, solutions contaminées, etc.), il convient d’effectuer un essai avant chaque série d’analyses en
suivant le même protocole que celui décrit en 8.2 et 8.3, mais sans tissus biologiques dans les tubes de
culture. Après les analyses CG, à l’exception du pic correspondant à l’hexane, il convient que le profil du
chromatogramme en phase gazeuse ne présente pas de pics.
Éviter tout contact des solutions avec le plastique: cette recommandation ne s’applique pas aux pointes
de pipette utilisées pour prélever la solution de méthanol/H SO (40/1) ou l’hexane.
2 4
8.2 Obtention et extraction des FAME des feuilles de végétaux
Introduire les tissus foliaires (environ 1 cm × 1 cm) dans les tubes de culture (voir 5.1.3) contenant
1 ml d’une solution de méthanol/H SO (40/1). Fermer les tubes hermétiquement avec un bouchon à
2 4
vis muni d’un joint en polytétrafluoroéthylène. Les chauffer pendant 1 h à 80 °C. Sous la pression de
1 atmosphère, le méthanol bouillant à 72 °C, il est obligatoire d’éviter toute évaporation et d’engendrer
une pression de vapeur saturante dans les tubes. Il est donc important que ceux-ci soient parfaitement
bouchés. Il est aussi nécessaire de contrôler visuellement (toute les 5 min pendant 20 min, puis toutes
les 10 min) que la solution de méthanol/H SO ne bout pas pendant la durée du chauffage. Si, pendant
2 4
le chauffage, le contenu du tube bout, plonger le tube dans la glace pour le refroidir puis dévisser et
revisser complètement le bouchon. Réajuster le volume, si besoin, à 1 ml en ajoutant du méthanol. Si le
contenu bout encore après avoir remis le tube à chauffer, prendre un autre tube et un autre bouchon, y
transvaser le contenu du tube défectueux. Il convient de ne pas analyser la composition en acides gras
des tissus présents dans des tubes dont la solution de méthanol/H SO s’est (quasiment) totalement
2 4
évaporée lors du chauffage.
Après 1 h de chauffage à 80 °C, refroidir les tubes (les disposer sur de la glace par exemple). Ajouter
d’abord 750 μl d’hexane 99 % puis 1,5 ml d’H O. Agiter vigoureusement manuellement pendant 20 s.
Il convient d’éviter l’utilisation d’un vortex. Centrifuger les tubes entre 200 g et 300 g pendant 5 min
à 10 min pour obtenir deux phases. A l’aide d’une pipette Pasteur, transvaser entre 200 µl et 400 µl
d’hexane (phase supérieure) dans une fiole CG munie d’un insert. Fermer la fiole avec un bouchon à vis
muni d’un septum en silicone. Il convient d’absolument éviter de prélever de la phase inférieure car l’eau
détériore irréversiblement la colonne utilisée pour la chromatographie en phase gazeuse.
Noter qu’en respectant ce protocole, la composition en acides gras foliaires ne dépend pas de la quantité
de tissus foliaires placés dans le tube (voir Annexe E).
4 © ISO 2019 – Tous droits réservés

8.3 Analyse des FAME
Réaliser l’analyse par chromatographie en phase gazeuse avec une colonne capillaire permettant de
séparer et de quantifier les esters méthyliques d’acides gras de 14 atomes de carbone à 22 atomes de
carbone, et pour chaque longueur de chaîne aliphatique, de séparer les esters saturés, mono, di et tri-
insaturés. Les FAME sont identifiés par comparaison des temps de rétention avec des étalons d’esters
méthyliques de C16:0; C16:1; C16:3; C18:0; C18:1; C18:2 et C18:3.
Après l’analyse par chromatographie en phase gazeuse (voir Annexe F), prendre en compte la surface
des pics du chromatogramme correspondant aux C16:0; C16:1; C16:3 (si présent); C18:0; C18:1; C18:2 et
C18:3. Exprimer les résultats en pourcentage de chaque FAME, F . Le pourcentage est calculé en divisant
i
la surface S du pic du FAME F par la somme des surfaces des pics correspondant aux C16:0, C16:1, C16:3
i i
(si présent), C18:0, C18:1, C18:2 et C18:3, c’est-à-dire:
% F = 100 × S /(S + S + S + S + S + S + S) (1)
i i C16:0 C16:1 C16:3 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3
Il convient d'éliminer les résultats des analyses pour lesquelles on suspecte une contamination. Par
exemple, lorsque la composition en acides gras s’éloigne trop de la composition en acides gras standard
pour les tissus des feuilles vertes d’angiospermes (voir Annexes B, E, F et [6][9-14][18]).
— il convient que % C18:0, % C16:1 et % C18:1 soient chacun inférieurs à 10 %;
— il convient que C16:0 et C18:2 soient chacun compris entre 5 % et 30 %;
— il convient que C16:3 soit compris entre 0 % et 30 %; et
— il convient que C18:3 soit supérieur à 40 % de la somme (% C16:0 + % C16:1 + % C16:3 + % C18:0 +
% C18:1 + % C18:2 + % C18:3).
De la même façon, ne pas tenir compte des résultats lorsqu’un ou plusieurs pic(s) supplémentaire(s) ne
correspondant pas aux C16:0, C16:3, C18:0, C16:1, C18:1, C18:2 ou C18:3 apparaît/apparaissent dans
des proportions significatives, par exemple un ou des pic(s) présentant une surface, S, supérieure à
0,15 × (S + S + S + S + S + S + S ).
C16:0 C16:1 C16:3 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3
Une ou plusieurs espèces végétales peuvent être échantillonnées par zone. Lorsqu’une seule espèce
végétale est analysée ou lorsque toutes les espèces végétales sont trouvées dans toutes les zones
d’échantillonnage, les modes opératoires statistiques standards sont suffisants pour effectuer l’analyse
des résultats. Les analyses paramétriques (par exemple test t) pour de telles données supposent que
les données sont normalement distribuées, que les traitements sont indépendants et que la variance
est homogène entre les différents traitements. Il convient de vérifier ces hypothèses. Si les données
satisfont à ces hypothèses, l’analyse des résultats peut se poursuivre. Sinon, il convient d’utiliser des
essais non paramétriques. Uniquement en cas de différences statistiques significatives entre les zones,
une notation est attribuée au sol de chaque zone.
Lorsqu’une seule espèce est analysée, et si des différences significatives entre les moyennes de l’indice
Oméga-3 par zone sont observées, il convient de définir la notation d’une zone sous forme de moyenne
de l’indice Oméga-3 sur cette zone, divisée par la moyenne maximale de l’indice Oméga-3 mesuré sur
l’ensemble du site, toutes zones confondues.
Les valeurs de l’indice Oméga-3 peuvent dépendre de l’espèce végétale analysée. Par conséquent,
lorsque plusieurs espèces végétales sont analysées en même temps, il convient d’utiliser des valeurs
normalisées de l’indice Oméga-3. Le rapport X /X est donc calculé, où X représente l’indice Oméga-3
p max p
mesuré pour l’individu p, et X représente l’indice Oméga-3 maximal obtenu pour les individus de la
max
même espèce sur un site donné, toutes zones confondues.
Lorsque plusieurs espèces végétales sont analysées et que toutes les espèces végétales ont été trouvées
dans toutes les zones d’échantillonnage, et si des différences significatives sont observées entre les
moyennes du rapport X /X par zone (tous les individus de toutes les espèces incluses), la notation
p max
d’une zone est définie sous forme de moyenne du rapport X /X sur cette zone (tous les individus de
p max
toutes les espèces incluses) divisée par la moyenne maximale du rapport X /X mesuré sur un site
p max
donné, toutes zones confondues.
Noter qu’il demeure possible de noter et de classer les zones quand toutes les espèces végétales
étudiées n’ont pas été trouvées dans toutes les zones d’échantillonnage lorsque (i) toutes les espèces
échantillonnées sur une zone donnée étaient présentes et ont été échantillonnées sur au moins une
autre zone, et (ii) toutes les paires de zones partageaient au moins une même espèce échantillonnée.
Dans ce cas, la méthode de calcul des notations des zones est décrite en détail en [10] et expliquée à
l’Annexe G.
Il convient de noter que les notations sont relatives: pour un site donné, la zone ayant la «meilleure
qualité du sol» se voit attribuer la notation de 1, les autres zones reçoivent une notation inférieure. Au vu
[6][9-14][18]
de notre expérience passée , nous distinguons généralement les différents effets indésirables
du sol sur les végétaux de la manière suivante: peu ou pas d’effet indésirable (notation ≥ 0,93), effet
indésirable moyen (0,93 > notation ≥ 0,85), effet indésirable élevé (0,85 > notation ≥ 0,7) et effet
indésirable très élevé (0,7 > notation), par rapport au sol de la zone avec une notation de référence de 1.
9 Rapport d'essai
Il convient que le rapport d’essai contienne les informations suivantes:
9.1 Référence au présent document, c’est-à-dire l'ISO 21479
9.2 Description du site et des zones analysées
Lorsqu’elle est disponible, une carte détaillée du site est jointe au rapport d’essai. Mentionner zone par
zone si peu ou beaucoup d’espèces végétales étaient présentes, et quelles étaient les plus abondantes.
Noter que des informations détaillées sur les propriétés physiques et chimiques sont utiles pour
interpréter les résultats (voir Introduction).
9.3 Échantillonnage des feuilles
— Zone par zone, l’espèce végétale échantillonnée (si possible: classification linnéenne, variété, origine),
le nombre d’individus provenant de chacune de ces espèces et, le cas échéant, le(s) individu(s)
manquant(s);
— la partie des feuilles échantillonnées (distale, proximale) et les feuilles échantillonnées (feuille
mature, feuille la plus âgée, etc.); et
— toute particularité spécifique concernant l’état de l’individu échantillonné (stade de développement,
âge, taille, etc.) et, le cas échéant, une description appropriée des dommages visuels (les photographies
sont recommandées).
9.4 Composition en acides gras
— Le cas échéant, données manquantes (tubes cassés, échantillon contaminé, etc.);
— la composition en acides gras de chaque échantillon et la valeur du rapport
% C18:3 / (% C18:0 + % C18:1 + % C18:2), sa moyenne et son écart-type; et
— lorsque plusieurs espèces sont analysées, le rapport % C18:3 / (% C18:0 + % C18:1 + % C18:2)
normalisé, sa moyenne et son écart-type, espèce par espèce.
9.5 Conclusion
Les conclusions sur la qualité relative du sol des différentes zones découlent de l’analyse des résultats
décrite en 8.2 et 8.3.
6 © ISO 2019 – Tous droits réservés

Annexe A
(informative)
Résultats de l’essai interlaboratoires
A.1 Généralités
Six laboratoires (désignés par les lettres A, B, C, D, E et F) de trois pays d’Europe (France, Portugal et
Royaume-Uni) ont participé à l’essai interlaboratoires.
La campagne d’échantillonnage a été effectuée le 31 mai 2017 pour tous les participants. Le site d’étude
(27 m × 19 m) se trouvait à Léognan, près de Bordeaux (France). Il était divisé en plusieurs zones
(de 3 m × 6 m), chaque zone étant séparée d’1 m. Les tissus foliaires ont été récoltés sur des plantes
poussant dans trois zones différentes: zone 2, zone 7 et zone 20. Ces zones présentaient diverses teneurs
en métal (voir Tableau A.1) car les zones 2 et 7 avaient reçu des boues d’épuration urbaines digérées et
déshydratées entre 1974 et 1993 (10 t par hectare chaque année pour la zone 2 et 100 t par hectare tous
les 2 ans pour la zone 7), tandis que la zone 20 n’en avait reçu aucune.
Tableau A.1 — Teneur totale en éléments traces métalliques (mg/kg)
Teneur totale en métal (mg/kg)
Zone
Cd Cr Cu Ni Pb Zn
2 6,01 21,9 85,8 23,6 179 977
7 10,3 33,8 135 39 307 1790
20 (témoin) 0,62 10,9 34,2 4,03 48,6 55,5
Chaque laboratoire, A, B, C, D, E et F, a synthétisé, extrait et analysé les FAME au sein du Laboratoire
de Biogenèse Membranaire (LBM, Bordeaux). Les résultats obtenus par les différents investigateurs à
Bordeaux sont indiqués par les lettres A1, B1, C1, D1, E1 et F1, respectivement.
De plus, les laboratoires A, B, C et D ont également synthétisé, extrait et analysé les FAME dans leur
propre laboratoire; les résultats correspondants sont indiqués par A2, B2, C2 et D2, respectivement.
Seules trois espèces végétales ont été trouvées dans toutes les zones, et ont été analysées: Plantago
lanceolata, Hypochaeris radicata et Medicago sativa. Pour chaque série (A1 à F1 et A2 à D2), les
laboratoires ont indépendamment récolté cinq morceaux de feuille de cinq individus pour chaque
espèce (Figures A.1 et A.2).
Après les analyses des acides gras, la moyenne des valeurs normalisées de l’indice Oméga-3 a été
calculée zone par zone, toutes espèces confondues.
a)  Avec Plantago lanceolata
b)  Avec Hypochaeris radicata
c)  Avec Medicago sativa
Légende
P représente les parties de la feuille échantillonnée par les investigateurs effectuant les analyses uniquement au
laboratoire LBM
Figure A.1 — Espèces végétales récoltées et protocole d’échantillonnage des feuilles pour les
analyses uniquement effectuées au LBM (un échantillon)
8 © ISO 2019 – Tous droits réservés

a)  Avec Plantago lanceolata
b)  Avec Hypochaeris radicata
c)  Avec Medicago sativa
Légende
P1 et P2 représentent les parties de la feuille échantillonnée par les investigateurs ayant effectué les analyses au
laboratoire LBM (avec les parties P1) et dans leur propre laboratoire (avec les parties P2)
Figure A.2 — Espèces végétales récoltées et protocole d’échantillonnage des feuilles pour les
analyses effectuées au LBM et dans les autres laboratoires (deux échantillons)
A.2 Résultats obtenus à Bordeaux par six laboratoires
La Figure A.3 montre que, dans les zones 20 et 7, tous les laboratoires ont trouvé une moyenne similaire
des valeurs normalisées de l’indice Oméga-3 de: 0,781 ± 0,016 (test de Kruskal-Wallis: p = 0,883) dans la
zone 20, et 0,786 ± 0,037 (test de Kruskal-Wallis: p = 0,269) dans la zone 7. Les points verts représentent
les valeurs aberrantes.
Zone 20
Zone 7
Légende
X laboratoire impliqué dans l'essai
Y Index Oméga-3 normalisé
Figure A.3 — Indice Oméga-3 normalisé obtenu pour les zones 20 et 7 pour tous les
laboratoires au LBM
En revanche, dans la zone 2, le laboratoire B a trouvé un indice Oméga-3 légèrement mais
significativement supérieur aux autres (voir Figure A.4).
10 © ISO 2019 – Tous droits réservés

Légende
X laboratoire impliqué dans l'essai
Y Index Oméga-3 normalisé
test de Kruskal-Wallis:
a
p < 0,02
b
p < 0,01
c
p < 0,002
Figure A.4 — Indice Oméga-3 normalisé obtenu pour la zone 2 pour tous les laboratoires au LBM
Pour résumer, à l’exception d’un investigateur dans une zone (valeurs de l’indice Oméga-3 légèrement
supérieures aux autres), sur chaque zone, tous les laboratoires ont obtenu les mêmes valeurs normalisées
de l’indice Oméga-3. Les valeurs étant très proches, il se peut que, sur les 18 zones analysées (trois
zones x six laboratoires), les valeurs maximales et minimales de l’indice Oméga-3 normalisé étaient
uniformément réparties sur 17 zones, alors qu’une zone présentait aléatoirement une valeur maximale
légèrement plus élevée.
A.3 Résultats obtenus par le même investigateur dans différents laboratoires
Comme mentionné plus haut, les laboratoires A, B, C et D ont synthétisé, extrait et analysé les FAME de
ces échantillons dans leur propre laboratoire. Malheureusement, le laboratoire D n’ayant pas utilisé une
colonne CG appropriée, il n’a pas été possible de tenir compte de ces résultats. De plus, le laboratoire C
a analysé la composition en acides gras par CG-SM et non par CG-FID dans son laboratoire. Nous
présentons ci-dessous les résultats obtenus par CG-SM par le laboratoire C. Ils ne peuvent toutefois pas
être comparés aux résultats obtenus à Bordeaux par CG-FID.
Le Tableau A.2 montre que, à l’exception d’une valeur (case bleue), dans chaque zone, chaque laboratoire
a trouvé les valeurs minimales (cases orange) et maximales (cases vertes) associées au même individu
(toutes espèces confondues) à Bordeaux et dans leur laboratoire. De plus, deux des laboratoires, A et
B, ont trouvé des valeurs normalisées similaires de l’indice Oméga-3 à Bordeaux (LBM) et dans leur
propre laboratoire: toutes espèces et toutes zones confondues, les rapports A1/A2 et B1/B2 étaient de
1,008 ± 0,088 (n = 45) et 1,025 ± 0,079 (n = 45) pour les échantillons analysés par les laboratoires A et
B, respectivement. Cela met en évidence la faible variabilité des résultats lorsque le même échantillon
(c’est-à-dire la même feuille) est analysé dans deux lieux différents (par le même investigateur).
Tableau A.2 — Comparaisons des valeurs normalisées de l’indice Oméga-3 mesurées sur la
même feuille au LBM et dans les autres laboratoires, et de la valeur p des tests de Kruskal-Wallis
Zone 20 7 2
Laboratoire A B A B A B
Échantillon n° A1 A2 B1 B2 A1 A2 B1 B2 A1 A2 B1 B2
1 0,58 0,51 0,88 0,82 0,84 0,82 0,99 0,800 0,78 0,71 0,99 1,00
Tableau A.2 (suite)
Zone 20 7 2
Laboratoire A B A B A B
Échantillon n° A1 A2 B1 B2 A1 A2 B1 B2 A1 A2 B1 B2
2 0,73 0,62 0,92 0,88 1,00 1,00 0,82 0,77 0,83 0,89 0,97 0,89
3 0,79 0,73 0,79 0,73 0,92 0,89 0,87 0,91 0,82 0,78 0,96 0,94
4 0,91 0,81 0,69 0,69 0,81 0,80 1,00 1,00 0,88 0,92 0,86 0,74
5 0,70 0,64 0,93 0,94 0,86 0,90 0,82 0,72 0,75 0,79 0,96 0,93
6 1,00 1,00 0,73 0,78 0,85 0,92 0,85 0,87 0,67 0,80 0,68 0,62
7 0,87 0,91 0,70 0,86 0,85 0,98 0,77 0,82 0,58 0,56 0,84 0,84
8 0,76 0,81 0,82 0,77 0,61 0,61 0,98 0,95 0,73 0,76 0,98 1,00
9 0,74 0,78 0,82 0,91 0,59 0,60 0,96 0,92 0,77 0,79 0,88 0,92
10 0,80 0,82 0,76 0,80 0,63 0,66 1,00 1,00 0,67 0,72 0,97 0,98
11 0,83 0,74 0,89 0,74 0,73 0,70 0,78 0,77 1,00 1,00 1,00 0,92
12 0,79 0,77 0,82 0,81 0,81 0,83 0,65 0,69 0,89 0,91 0,86 0,81
13 0,70 0,81 0,82 0,73 0,74 0,73 0,69 0,70 0,85 0,80 0,97 0,96
14 0,74 0,71 0,71 0,85 0,90 0,58 0,57 0,89 0,93 0,78 0,67
15 0,78 0,86 0,68 0,67 0,88 0,82 0,73 0,79 0,64 0,67 0,99 1,00
Moyenne 0,780 0,773 0,798 0,789 0,798 0,811 0,832 0,819 0,783 0,802 0,913 0,882
écart-type 0,099 0,123 0,083 0,081 0,116 0,124 0,131 0,124 0,113 0,115 0,094 0,121
C 0,126 0,159 0,104 0,103 0,146 0,152 0,157 0,151 0,144 0,143 0,103 0,137
V
valeur p 0,884 0,724 0,836 0,724 0,561 0,494
A.4 Résultat
Dans l’ensemble, les résultats obtenus après les analyses par CG-FID montrent que les laboratoires n’ont
décelé aucune différence entre les zones, quel que soit le lieu de réalisation des analyses (à l’exception
du laboratoire B qui a trouvé une différence faible, mais toutefois significative, entre la zone 2 et la
zone 20 pour les analyses effectuées à Bordeaux, mais pas pour celles menées dans son laboratoire).
Les résultats obtenus par CG-FID et CG-SM ne peuvent pas être directement comparés. Toutefois, il
convient de noter que les analyses par CG-SM (C2) n’ont pas non plus mis en évidence de différences
significatives entre les zones (Tableau A.3).
Si l’on examine la teneur totale en métal du sol des différentes zones, il peut paraître surprenant
qu’aucune différence parmi les valeurs de l’indice Oméga-3 n’ait été observée. Néanmoins, il convient de
noter que les métaux dans ces zones sont faiblement extractibles, par exemple 0,062 mg/kg, 0,187 mg/
kg et 0,209 mg/kg pour le Cd dans les zones 20, 2 et 7 respectivement, c’est-à-dire des valeurs proches
[17]
des valeurs observées dans les sites non contaminés . Ainsi, les zones 2 et 7 peuvent être considérées
comme faiblement contaminées, alors que les espèces végétales récoltées sont connues pour être peu
[7][8][16]
sensibles aux métaux .
De plus, pour une quelconque zone donnée, l’écart-type des valeurs normalisées de l’indice Oméga-3,
toutes espèces confondues, obtenues après les analyses par CG-FID par tous les investigateurs et dans
tous les laboratoires, était très faible. Cela illustre une reproductibilité et une répétabilité élevées des
résultats (Tableau A.3).
Tableau A.3 — Comparaisons des valeurs normalisées de l’indice Oméga-3 obtenues pour
chaque zone et pour chaque laboratoire, et de la valeur p des tests de Kruskal-Wallis
Valeur p
Série Zone 20 Zone 7 Zone 2
(Kruskal-Wallis)
A1 0,78 ± 0,1 0,80 ± 0,12 0,78 ± 0,11 0,735
12 © ISO 2019 – Tous droits réservés

Tableau A.3 (sui
...