ISO 21285:2019
(Main)Soil quality — Inhibition of reproduction of the soil mite (Hypoaspis aculeifer) by soil contaminants
Soil quality — Inhibition of reproduction of the soil mite (Hypoaspis aculeifer) by soil contaminants
This document specifies a chronic test method for evaluating the habitat function of soils and determining effects of soil contaminants and substances on the reproduction of Hypoaspis aculeifer by ? mainly ? alimentary uptake. This method is applicable to soils and soil materials of unknown quality, e.g. from contaminated sites, amended soils, soils after remediation, industrial, agricultural or other sites under concern and waste materials (e.g. dredged material, municipal sludge from a wastewater treatment plant, composed material, or manure, especially those for possible land disposal). The reproduction (= number of juveniles) is the measured parameter of the test. The test reflects the bioavailability of a mixture of contaminants in natural soils (contaminated site soils) to a species which represents a trophic level which is not covered by other ISO standards. This test is not intended to replace the earthworm (see ISO 11268-2) or Collembola (see ISO 11267) reproduction tests since this species belongs not only to a different trophic group but also a different taxonomic group (= mites; i.e. arachnids) than those used usually. Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For contaminated soils, the effects are determined in the soil to be tested and in a control soil. Depending on the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) are either an uncontaminated soil comparable to the soil to be tested (reference soil) or a standard soil (e.g. artificial soil). This document provides information on how to use this method for testing samples (soils or substances) under temperate conditions. This document is not applicable to substances for which the air/soil partition coefficient is greater than one, or to substances with vapour pressure exceeding 300 Pa at 25 °C. NOTE The stability of the test substance cannot be ensured over the test period. No provision is made in the test method for monitoring the persistence of the substance under test.
Qualité du sol — Inhibition de la reproduction de l'acarien prédateur (Hypoaspis aculeifer) par des contaminants du sol
Le présent document décrit une méthode d'essai chronique pour évaluer la fonction d'habitat des sols et déterminer les effets des contaminants du sol et des substances sur la reproduction de l'espèce Hypoaspis aculeifer par — principalement — absorption par voie alimentaire. Cette méthode est applicable aux sols et matériaux du sol de qualité inconnue, par exemple, provenant de sites contaminés, de sols amendés, de sols ayant fait l'objet d'une remédiation, de sites industriels, agricoles et autres, et aux déchets (par exemple, matériau de dragage, boue résiduaire des stations d'épuration des eaux usées, engrais ou fumier, notamment ceux pour épandage éventuel). La reproduction (= nombre de juvéniles) est le paramètre mesuré au cours de l'essai. L'essai reflète la biodisponibilité d'un mélange de contaminants dans les sols naturels (sols de sites contaminés) vis-à-vis d'une espèce qui représente un niveau trophique qui n'est pas couvert par les autres normes ISO. Il n'est pas prévu d'utiliser cet essai pour remplacer les essais de reproduction vis-à-vis des vers de terre (voir ISO 11268-2) ou des collemboles (voir ISO 11267) car cette espèce appartient non seulement à un autre groupe trophique, mais également à un autre groupe taxonomique (= acariens; c'est-à-dire, arachnides) que les autres espèces utilisées habituellement. Les effets des substances sont évalués en utilisant un sol standard, de préférence un substrat défini de sol artificiel. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol à analyser et dans un sol témoin. Selon l'objectif de l'étude, le substrat témoin et le substrat de dilution (séries de dilutions du sol contaminé) sont soit un sol non contaminé comparable au sol à analyser (sol de référence), soit un sol standard (par exemple, sol artificiel). Le présent document fournit des informations sur la façon d'utiliser cette méthode pour analyser des échantillons (sols ou substances) dans des conditions tempérées. Il n'est pas applicable aux substances pour lesquelles le coefficient de partage air/sol est supérieur à 1, ou aux substances dont la tension de vapeur dépasse 300 Pa à 25 °C. NOTE La stabilité de la substance d'essai ne peut pas être assurée tout au long de la période d'essai. La méthode d'essai ne prévoit pas de contrôler la persistance de la substance soumise à essai.
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21285
First edition
2019-04
Soil quality — Inhibition of
reproduction of the soil mite
(Hypoaspis aculeifer) by soil
contaminants
Qualité du sol — Inhibition de la reproduction de l'acarien prédateur
(Hypoaspis aculeifer) par des contaminants du sol
Reference number
©
ISO 2019
© ISO 2019
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Published in Switzerland
ii © ISO 2019 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 3
5 Reagents and material . 4
5.1 Biological material . 4
5.2 Test mixtures . 4
5.3 Reference substance . 5
6 Apparatus . 6
7 Procedure. 6
7.1 Experimental design . 6
7.1.1 General. 6
7.1.2 Range-finding test (preliminary test) . 7
7.1.3 Definitive test . 7
7.1.4 Limit test . 7
7.2 Preparation of test mixtures . 8
7.2.1 Testing contaminated soil . 8
7.2.2 Testing substances added to the test substrate . 8
7.2.3 Preparation of control containers . 9
7.3 Addition of the biological material . 9
7.4 Test conditions and measurements . 9
7.5 Feeding of the mites. 9
7.6 Determination of surviving predatory mites .10
8 Calculation and expression of results .10
8.1 Calculation .10
8.2 Expression of results .10
9 Validity of the test .10
10 Statistical analysis .11
10.1 General .11
10.2 Single-concentration tests .11
10.3 Multi-concentration tests.11
10.3.1 Range-finding test .11
10.3.2 Definitive test .11
11 Test report .12
Annex A (informative) Techniques for rearing and breeding of predatory mites .14
Annex B (normative) Determination of water-holding capacity .16
Annex C (informative) Guidance on adjustment of pH of artificial soil .17
Annex D (informative) Extraction and counting of predatory mites .18
Annex E (informative) Basic information on the biology of Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer .19
Bibliography .20
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological characterization.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2019 – All rights reserved
Introduction
Ecotoxicological test systems are applied to obtain information about the effects of contaminants in
soil and are proposed to complement conventional chemical analysis (see ISO 15799 and ISO 17616).
ISO 15799 includes a list and short characterization of recommended and standardized test systems
and ISO 17616 gives guidance on the choice and evaluation of the bioassays. Aquatic test systems with
soil eluate are applied to obtain information about the fraction of contaminants potentially reaching
the groundwater by the water path (retention function of soils), whereas terrestrial test systems are
used to assess the habitat function of soils.
Mites (Acari) are a world-wide and diverse group of arthropods belonging to the class Arachnida with
over 40 000 species recorded, divided into two super-orders (Acariformes and Parasitiformes). Due to
their relative small size (a few µm to a few cm), they occupy specific ecological niches on plants as well
as in soils (see Reference [13]).
Among soil-inhabiting mites, the role of predation is ensured by, for example, Hypoaspis sp. (Laelapidae).
Because they are exposed to chemical contamination, mites are already considered in the environmental
risk assessment of pesticides, as non-target organisms (see Reference [10]). Indeed, among the data
required for active substances of pesticides, effects on predatory mites are assessed, i.e. for the plant-
inhabitant Typhlodromus pyri (Phytoseiidae) and the soil-inhabitant Hypoaspis aculeifer (Laelapidae)
(see Reference [6]).
[23][17]
The first authors introducing H. aculeifer as a test organism in ecotoxicological studies were later
proposed a two-species test system in the European project SECOFASE (Sublethal Effects of Chemicals
on Fauna in the Soil Ecosystem), including the collembolan Folsomia fimetaria as prey. In the context
of the development of an ecotoxicological test for the assessment of plant protection products on non-
target arthropods (see References [5][6]), a protocol on soil predatory mites using H. aculeifer was
further proposed. More recently, a standard test protocol for the assessment of chemicals was developed
for this species by OECD in 2008 and revised in 2016. The results of the associated international ring-
test were published in Reference [25].
Among mites, the predator Hypoaspis aculeifer is the most studied species in laboratory. The reproduction
end point was found in general to be more sensitive than mortality and avoidance. Compared to other
soil meso-fauna invertebrates, mites were found in general less sensitive than or as sensitive as other
test species, depending on the end points and chemicals studied. Considering semi-field studies,
H. aculeifer was used as a top predator whereas other soil invertebrates, mainly springtails, were
ranked in the grazer group. In these studies, mites showed to be quite tolerant towards anthropogenic
contamination. This statement was also corroborated by field surveys. However, the applicability of
laboratory test methods for the assessment of environmental samples (contaminated soils, wastes etc.)
with mites is emphasized, as to date a limited number of studies are available.
This document describes a method that is based on the determination of lethal and sublethal effects
of contaminated soils to adult predatory mites of the species Hypoaspis aculeifer. This species is
considered to be representative of predatory soil arthropods. Background information on the ecology
of these mites and their use in ecotoxicological testing is available in Reference [14].
INTERNATIONAL STANDARD ISO 21285:2019(E)
Soil quality — Inhibition of reproduction of the soil mite
(Hypoaspis aculeifer) by soil contaminants
1 Scope
This document specifies a chronic test method for evaluating the habitat function of soils and
determining effects of soil contaminants and substances on the reproduction of Hypoaspis aculeifer by
– mainly – alimentary uptake. This method is applicable to soils and soil materials of unknown quality,
e.g. from contaminated sites, amended soils, soils after remediation, industrial, agricultural or other
sites under concern and waste materials (e.g. dredged material, municipal sludge from a wastewater
treatment plant, composed material, or manure, especially those for possible land disposal). The
reproduction (= number of juveniles) is the measured parameter of the test. The test reflects the
bioavailability of a mixture of contaminants in natural soils (contaminated site soils) to a species which
represents a trophic level which is not covered by other ISO standards. This test is not intended to
replace the earthworm (see ISO 11268-2) or Collembola (see ISO 11267) reproduction tests since this
species belongs not only to a different trophic group but also a different taxonomic group (= mites; i.e.
arachnids) than those used usually.
Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For
contaminated soils, the effects are determined in the soil to be tested and in a control soil. Depending
on the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil)
are either an uncontaminated soil comparable to the soil to be tested (reference soil) or a standard soil
(e.g. artificial soil).
This document provides information on how to use this method for testing samples (soils or substances)
under temperate conditions.
This document is not applicable to substances for which the air/soil partition coefficient is greater than
one, or to substances with vapour pressure exceeding 300 Pa at 25 °C.
NOTE The stability of the test substance cannot be ensured over the test period. No provision is made in the
test method for monitoring the persistence of the substance under test.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis)
ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level
using barium chloride solution
ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis —
Gravimetric method
ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic
conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
3.2
effect concentration for x % effect
EC
x
concentration (mass fraction) of a test sample that causes x % of an effect on a given end point within a
given exposure period when compared with a control
EXAMPLE An EC is a concentration estimated to cause an effect on a test end point in 50 % of an exposed
population over a defined exposure period.
Note 1 to entry: The ECx is expressed as a percentage of soil to be tested (dry mass) per soil mixture (dry mass).
When substances are tested, the ECx is expressed as the mass of the test substance per dry mass of soil in
milligrams per kilogram.
3.3
effect rate
ER
x
rate of a soil to be tested that causes an x % of an effect on a given end point within a given exposure
period when compared with a control
3.4
limit test
single concentration test consisting of at least four replicates each, the soil to be tested without any
dilution or the highest concentration of test substance mixed into the control soil and the control
3.5
lowest observed effect concentration
LOEC
lowest test substance concentration that has a statistically significant effect (probability p < 0,05)
Note 1 to entry: In this test, the LOEC is expressed as a mass of test substance per dry mass of the soil to be
tested. All test concentrations above the LOEC should usually show an effect that is statistically different from
the control.
3.6
lowest observed effect rate
LOER
lowest rate of a soil to be tested in a control soil at which a statistically significant effect is observed
3.7
no observed effect concentration
NOEC
highest test substance concentration immediately below the LOEC (3.5) at which no effect is observed
Note 1 to entry: In this test, the concentration corresponding to the NOEC, has no statistically significant effect
(probability p < 0,05) within a given exposure period when compared with the control.
2 © ISO 2019 – All rights reserved
3.8
no observed effect rate
NOER
lowest rate of a soil to be tested immediately below the LOER (3.6) which when compared to the control
has no statistically significant effect (probability p < 0,05) within a given exposure period
3.9
reference soil
uncontaminated soil with comparable pedological properties (nutrient concentrations, pH, organic
carbon content and texture) to the soil being studied
3.10
standard soil
field-collected soil or artificial soil whose main properties (pH, texture, organic matter content) are
within a known range
EXAMPLE Euro soils, artificial soil, LUFA standard soil type 2.2.
Note 1 to entry: The properties of standard soils can differ from the soil to be tested.
3.11
control soil
reference or standard soil used as a control and as medium for preparing dilution series with soils to be
tested or a reference substance, which fulfils the validity criteria
Note 1 to entry: In the case of natural soil, it is advisable to demonstrate its suitability for a test and for achieving
the test validity criteria before using the soil in a definitive test.
3.12
test mixture
mixture of contaminated soil or the test substance (e.g. chemical, biosolid, waste) with control soil
3.13
test mixture ratio
ratio between the soil to be tested and the control soil in a test mixture
4 Principle
Adult females are exposed to the soil to be tested and the effects on reproduction measured are
compared to those observed for females exposed to a control soil. If appropriate, effects based on
exposure to a dilution range of contaminated soil and control soil or a range of concentrations of a test
substance mixed into control soil are determined. Test mixtures are prepared at the start of the test
and are not renewed within the test period. The test is started with 10 adult females per test vessel.
Males are not introduced in the test, because experience has shown that females mate immediately or
shortly after hatching from the deutonymph stage, if males are present. As the females are introduced
into the test about 7 d after they have reached the adult stage, the females can be considered as already
mated (Annex A and Annex E). The test runs until the first offspring have reached the deutonymph
stage. At 20 °C the exposure time ends at day 14 after introducing the females (day 0), followed by
two days of extraction. The number of surviving females and the number of juveniles per test vessel
are determined. The reproductive output of the mites exposed to the test mixtures is compared to
that of the controls in order to determine the concentrations which cause no effects on mortality and
reproduction (NOER/NOEC) and the concentration resulting in x % reduction of juveniles hatched from
eggs compared to the control (ER /EC ) respectively, depending on the experimental design (see 7.1.3).
x x
In case there is no prior knowledge of the dilution/concentration of the soil to be tested or the test
substance likely to have an effect, then it is useful to conduct the test in two steps:
— A range-finding test on reproduction is carried out, to give an indication of the effect dilution/
concentration, and the dilution/concentration giving no mortality (NOER/NOEC). Dilutions/
concentrations to be used in the definitive test can then be selected;
— the definitive test on reproduction to determine sublethal effects of (dilutions of) contaminated
soil or the concentration of a substance which, when evenly mixed into the standard soil, causes no
significant effects on numbers of offspring hatched from eggs compared with the control (NOER/
NOEC), and the lowest concentration causing effects (LOER/LOEC).
The use of a reference soil is an essential requirement to demonstrate the present status of the test
population, and to avoid misinterpretation of results.
5 Reagents and material
5.1 Biological material
In this test, Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer. adult female mites (7 d to 14 d after becoming adult; 28 d
to 35 d after the start of the egg laying in the synchronisation) are required to start the test. The mites
shall be selected from a synchronised cohort (see Annex E).
5.2 Test mixtures
5.2.1 Field-collected soil or waste. The field-collected soils used in the test shall be passed through
a sieve of 4 mm square mesh to remove coarse fragments and thoroughly mixed. If necessary, soil may
be air-dried without heating before sieving. Storage of soil to be tested should be as short as possible.
The soil shall be stored in accordance with ISO 18400-206 using containers that minimize losses of soil
contaminants sorption to the container walls. If soils or test mixtures have been stored, they should
be mixed a second time immediately before use. Soil pH should not be corrected as it can influence
bioavailability of soil contaminants.
For interpretation of test results, the following characteristics shall be determined for each soil sampled
from a field site:
a) pH in accordance with ISO 10390;
b) texture (sand, loam or silt, clay) in accordance with ISO 11277;
c) water content in accordance with ISO 11465;
d) water-holding capacity according to Annex B;
e) cationic exchange capacity in accordance with ISO 11260;
f) organic carbon in accordance with ISO 10694;
g) percentage of material removed by the 4 mm sieve.
It is important to determine the water holding capacity of all mixtures used in the test.
5.2.2 Control soil, either a) reference soil or b) standard soil that allows the presence of predatory
mites. Control soil and soil used for dilution shall not differ in one test [either a) or b)].
a) If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should
be treated and characterized like the soils to be tested. If a toxic contamination or unusual soil
properties cannot be ruled out, standard control soils should be preferred.
b) For testing the effects of substances mixed into soil, standard soils (e.g. artificial soil, LUFA standard
soil type 2.2.) shall be used as test substrate. The properties of the field-collected standard soil
shall be reported.
The substrate called artificial soil can be used as a standard soil and has the following composition:
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Percentage expressed on dry mass
basis
— Sphagnum peat finely ground [a particle size of (2 ± 1) mm is 5 %
acceptable] and with no visible plant remains
— Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite 20 %
— Industrial quartz sand (dominant fine sand with more than 50 % 74 %
of particle size 0,05 mm to 0,2 mm)
Approximately 0,3 % to 1,0 % calcium carbonate (CaCO , pulverised, analytical grade) are necessary to
get a pH of 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Taking the properties of highly non-polar (log K > 2) or ionizing substances into account, 5 % of
ow
peat have proven to be sufficient for maintaining the desired structure of the artificial soil.
NOTE 2 It has been demonstrated that Hypoaspis aculeifer can comply with the validity criteria even on
reproduction when tested in field soils with lower organic carbon content (e.g. 2,7 %), and there is experience
that this can be achieved in artificial soil with 5 % peat. Therefore, it is not necessary before using such a soil in a
definitive test to demonstrate the suitability of the artificial soil for allowing the test to comply with the validity
criteria unless the peat contents lowered more than specified above.
Prepare the artificial soil at least three days prior to start the test, by mixing the dry constituents listed
above thoroughly in a large-scale laboratory mixer. A portion of the deionized water required is added
while mixing is continued. Allowance should be made for any water that is used for introducing the test
substance into the soil. The amount of calcium carbonate required can vary, depending on properties
of the individual batch of sphagnum peat and should be determined by measuring sub-samples
immediately before the test (see Annex C). Store the mixed artificial soil at room temperature for at
least two days to equilibrate acidity. To determine pH and the maximum water holding capacity, the
dry artificial soil is pre-moistened one or two days before starting the test by adding deionised water
to obtain approximately half of the required final water content of 40 % to 60 % of the maximum water
holding capacity.
The total water-holding capacity shall be determined in accordance with Annex B, the pH shall be
determined according to ISO 10390.
5.3 Reference substance
5.3.1 General. To ensure the quality of the test system, tests should be performed regularly (once or
twice a year) with a reference substance.
The NOEC and/or the EC of a reference substance shall be determined to provide assurance that the
x
laboratory test conditions are adequate and to verify that the response of the test organisms did not
change over time. The reference substance can be tested in parallel to the determination of the toxicity
of each test sample at one concentration, which needs be demonstrated beforehand in a dose response
study to result in an effect of about 50 %. In this case, the number of replicates should be the same
as that in the controls. Alternatively, the reference substance is tested once or twice a year in a dose-
response test. Depending on the design chosen, the number of concentrations and replicates and the
spacing factor differ (see 7.1.3), but a response of 10 % to 90 % effect should be achieved (spacing factor
of 1,8). Dimethoate as well as boric acid are suitable reference substances that have shown to affect
[25]
reproduction .
The EC for dimethoate based on the number of juveniles should fall in the range between 3,0 mg a.s.
(active substance)/kg soil (dry mass) and 7,0 mg a.s. (active substance)/kg soil (dry mass). Based on
the results obtained with boric acid so far, the EC based on the number of juveniles should fall in the
range between 100 mg/kg (dry mass) soil and 300 mg/kg (dry mass) soil.
1)
5.3.2 Dimethoate (CAS 60-51-5), C H NO PS , to be tested as a formulation [e.g. Perfekthion (ca.
5 12 3 2
40 % dimethoate)].
5.3.3 Boric acid (CAS 10043-35-3), H BO (99 %).
3 3
WARNING — When handling these substances, appropriate precautions should be taken to avoid
ingestion or skin contact.
6 Apparatus
Use laboratory equipment and the following.
6.1 Test containers, made of glass or other chemically inert material of about 100 ml capacity and
with a diameter of about 5 cm, with lids (e.g. plastic, glass discs or parafilm, able to be closed tightly).
6.2 Apparatus to determine the dry mass of the substrate, in accordance with ISO 11465.
6.3 Large scale laboratory mixer, for the preparation of the test mixture (5.2).
6.4 Suitable accurate balances.
6.5 Apparatus, capable of measuring pH and water content of the substrate.
6.6 Exhauster, for transfer of mites (see ISO 11267:2014, A.2).
6.7 Test environment.
6.7.1 Enclosure, capable of being controlled to a temperature of (20 ± 2) °C.
6.7.2 Light source, capable of delivering a constant light intensity of 400 lx to 800 lx at the substrate
surface at a controlled light:dar k cycle of between 12 h:12 h and 16 h:8 h.
6.8 Extraction apparatus, Tullgren funnel or comparable methods like e.g. McFadyen (see Annex D).
7 Procedure
7.1 Experimental design
7.1.1 General
A sample of field-collected soil can be tested at a single concentration (typically 100 %) or evaluated
for toxicity in a multi-concentration test whereby a series of concentrations (dilutions) is prepared
by mixing measured quantities with a control soil (5.2.2). When testing substances, a series of
concentrations is prepared by mixing quantities of the test substance with a standard soil (e.g. artificial
soil). The concentrations being expressed in milligrams of test substance per kilogram of dried control
soil (5.2.2). Depending on the knowledge of relevant response levels a range-finding test may precede
the definitive test. Each definitive test consists of a series of soil mixtures (treatments).
1) Perfekthion is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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7.1.2 Range-finding test (preliminary test)
A preliminary test to find the range of mixture ratio affecting predatory mites is optional, e.g. 0 %,
1 %, 5 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 % soil, or of the test substance, e.g. 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg,
100 mg/kg and 1 000 mg/kg [the concentrations being expressed in milligrams of test substance per
kilogram of dried control soil (see 5.2.2) and a control using 10 mites per container]. The preliminary
test is conducted without replication. The duration of the range finding test is 14 d (exposure time),
followed by an extraction time of two days. After a total 16 d, mortality of the adult mites and the
number of juveniles is determined. Based on the results of the range finding test, the ER /EC is
50 50
roughly determined by calculating the geometric mean of those two concentrations showing 0 % and
100 % mortality. The concentration/dilution range in the final test should preferably be chosen so
that it includes concentrations at which juvenile numbers are affected while survival of the maternal
generation is not. This, however, may not be possible for substances that cause lethal and sub-lethal
effects at similar concentrations.
When no effects are observed, even at 100 % contaminated soil or at concentrations of 1 000 mg test
substance/kg standard soil (dry mass), the definitive test can be designed as a limit test.
7.1.3 Definitive test
The design of the definitive test depends on the test objectives. Typically, the habitat properties of
samples of a field-collected soil are characterized by comparison of the biological effects found in the
soil to be tested with those found in a reference soil, or if not available or not appropriate due to toxicity
or atypical physicochemical characteristics, in a standard soil. Results for the standard soil assist in
distinguishing contaminant effects from non-contaminant effects caused by soil physicochemical
properties. Regardless of whether a reference soil or standard soil is used for the statistical comparisons,
[27]
the results from standard soil shall be used to judge the validity and acceptability of the test . The
duration of the definitive test is 14 d (exposure time), followed by an extraction time of two days. After
a total 16 d, mortality of the adult mites and the number of juveniles is determined.
If for characterization purposes a test design including dilution series is required, three designs are
possible (the concentrations shall be spaced by a factor not exceeding 2):
— For the NOER/NOEC approach, at least five concentrations or test mixtures in a geometric series
should be used. Four replicates for each treatment plus eight controls are recommended.
— For the ER /EC approach, 12 concentrations or test mixtures should be used. Two replicates for
x x
each concentration plus six controls are recommended. The spacing factor can be variable; smaller
at low concentrations, larger at high concentrations.
— For the mixed approach, 6 to 8 concentrations or test mixtures in a geometric series should be
used. Four replicates for each treatment plus eight controls are recommended. This mixed approach
allows a NOER/NOEC as well as an ER /EC evaluation.
x x
To facilitate checking of the pH and humidity of the test sample, use of additional containers for each
concentration and for the control is recommended.
Each test container (replicate) is filled with 20 g dry mass of the test sample. To ensure easy migration
of mites the substrate in the test container should not be compressed.
7.1.4 Limit test
If no effects are observed at the highest concentration in the range-finding test (i.e. 1 000 mg/kg or
100 %), the reproduction test can be performed as a limit test, using a test concentration of 1 000 mg/
kg or undiluted soil. A limit test will provide the opportunity to demonstrate that the NOEC/NOER or
the EC ER for reproduction is greater than the limit concentration while minimising the number of
10/ 10
mites used in the test. Eight replicates should be used for both the treated soil and the control.
7.2 Preparation of test mixtures
7.2.1 Testing contaminated soil
According to the selected dilution range the soil to be tested is mixed with the reference soil or the
standard soil thoroughly (either manually or by using a hand mixer). The homogeneity of the mixture is
checked visually. The total mass of the soil to be tested and the reference soil or the standard soil shall
be 20 g (dry mass) in each test container (6.1). The test mixture shall be wetted with deionised water
to reach 40 % to 60 % of the total water holding capacity determined in accordance with Annex B. In
some cases, e.g. when testing waste materials, higher percentages are required. A rough check of the
soil moisture content can be obtained by gently squeezing the soil in the hand, if the moisture content is
correct small drops of water should appear between the fingers.
Determine the pH for each test mixture (one container per concentration) in accordance with ISO 10390
at the beginning and end of the test (when acid or basic samples are tested, do not adjust the pH).
Prepare the appropriate number of replicates per concentration/test mixture and the control(s)
according to the selected approach (see 7.1.3).
WARNING — Contaminated soils can contain unknown mixtures of toxic, mutagenic, or
otherwise harmful substances or infectious microorganisms. Occupational health risks can
arise from dust or evaporated substances as well as via dermal contact during handling and
incubation.
7.2.2 Testing substances added to the test substrate
Standard soil (5.2.2) is used to prepare the test sample. For each test container (6.1), the mass of
the substrate used shall be 20 g (dry mass). Substances are added to the test substrate and mixed
thoroughly.
For the introduction of test substances, use either method a), b) or c), as appropriate.
a) Water-soluble substance
— Immediately before starting the test, dissolve the quantity of the test substance in the water or
a portion of it required to wet the soil samples for the replicates of one concentration in order
to reach a final water content of 40 % to 60 % of the maximum water holding capacity, and mix
it thoroughly with the soil before introducing it into the test containers.
b) Substances insoluble in water but soluble in organic solvents
— Dissolve the quantity of test substance required to obtain the desired concentration in a volatile
solvent (such as acetone or hexane) mix it with a portion of the quartz sand required. After
evaporating the solvent by placing the container under a fume hood, add the remainder of the
soil and the water and mix it thoroughly before introducing it into the test containers.
NOTE Ultrasonic dispersion, organic solvents, emulsifiers or dispersants can be used to disperse
substances with low aqueous solubility. When such auxiliary substances are used, all test concentrations
and an additional control are intended to contain the same minimum amount of auxiliary substance.
WARNING — Take appropriate precautions when dealing with solvent vapour to avoid danger
from inhalation or explosion, and to avoid damage to extraction equipment, pumps etc.
c) Substances insoluble in water or organic solvents
— For a substance insoluble in a volatile solvent, prepare a mixture of 10 g of finely ground
industrial quartz sand (see 5.2.2) and the quantity of the test substance required to obtain the
desired concentration. Add that mixture to the remainder of the soil and the water and mix
thoroughly before introducing it into a test container.
8 © ISO 2019 – All rights reserved
Base the concentrations selected to provide the LOEC/NOEC on the results of the range-finding test.
Space the concentrations by a factor not exceeding 2.
Substances mixed into the substrate do not need to be tested at concentrations higher than 1 000 mg/
kg mass of test sample.
Proceed simultaneously with all replicates per concentration and the control(s) required according to
the selected approach.
Determine the pH for each test mixture (one container per concentration) in accordance with ISO 10390
at the beginning and end of the test.
7.2.3 Preparation of control containers
The control container contains the control soil (5.2.2) wetted with deionised water to reach 40 % to
60 % of the total water holding capacity (determined in accordance with Annex B).
Perform one control container for the range-finding test and at least six control containers for the
definitive test.
Prepare the control containers in the same way as the test containers. If the preparation of the test
requires the use of a solvent (see 7.2.2), use at least six additional control containers prepared with
solvent but without the test substance. Cover the containers as indicated in 6.1.
7.3 Addition of the biological material
Ten adult females in 20 g dry mass of artificial soil are recommended for each control and treatment
vessel. Test organisms should be added within 2 h after preparation of the final test substrate (i.e. after
application of the test item). In specific cases (e.g. when ageing is considered to be a determining factor),
the time between preparation of the final test substrate and the addition of the mites can be prolonged
(for details of such ageing, see Reference [11]). However, in such cases a scientific justification shall be
provided.
Mites are tapped or sucked from the breeding containers to transfer them to the test containers. This
can easily be done using an exhauster as described in ISO 11267:2014, A.2. Before they are transferred
to the test containers, organisms are counted and checked for damage both to reduce control mortality
and to avoid systematic trial errors.
7.4 Test conditions and measurements
The test temperature should be (20 ± 2) °C. Temperature should be recorded at least daily and adjusted,
if necessary. The test is carried out under a constant light intensity of 400 lx to 800 lx at the substrate
surface at a controlled light: dark cycle of between 12 h:12 h and 16 h:8 h. For reasons of comparability,
[19]
these conditions are the same as in other soil ecotoxicological tests .
Gaseous exchange should be ensured by aerating the test vessels at least twice a week in case screw
lids are used. If gauze covers are used, special attention should be paid to the maintenance of the soil
moisture content.
The water content of the soil substrate in the test vessels is maintained throughout the test by weighing
and if needed re-watering the test vessels periodically (e.g. once per week). Losses are replenished as
necessary with deionised water. The moisture content during the test should not differ by more than
10 % from the start value. When acidic or basic substances are tested, d
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21285
Première édition
2019-04
Qualité du sol — Inhibition de la
reproduction de l'acarien prédateur
(Hypoaspis aculeifer) par des
contaminants du sol
Soil quality — Inhibition of reproduction of the soil mite (Hypoaspis
aculeifer) by soil contaminants
Numéro de référence
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Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Réactifs et matériel . 4
5.1 Matériel biologique . 4
5.2 Mélanges d’essai . 4
5.3 Substance de référence . 6
6 Appareillage . 6
7 Mode opératoire. 7
7.1 Plan d’expérience . 7
7.1.1 Généralités . 7
7.1.2 Essai préliminaire . 7
7.1.3 Essai définitif . 7
7.1.4 Essai limite . 8
7.2 Préparation des mélanges d’essai . 8
7.2.1 Essai sur sol contaminé . . 8
7.2.2 Essai sur substances ajoutées au substrat d’essai . 9
7.2.3 Préparation des récipients témoins . 9
7.3 Ajout du matériel biologique .10
7.4 Conditions d’essai et mesurages .10
7.5 Alimentation des acariens .10
7.6 Détermination du nombre d’acariens prédateurs survivants .11
8 Calcul et expression des résultats .11
8.1 Calcul .11
8.2 Expression des résultats .11
9 Validité de l’essai .11
10 Analyse statistique .11
10.1 Généralités .11
10.2 Essais à une seule concentration .12
10.3 Essais à plusieurs concentrations.12
10.3.1 Essai préliminaire .12
10.3.2 Essai définitif .12
11 Rapport d'essai .13
Annexe A (informative) Techniques d’élevage des acariens prédateurs .15
Annexe B (normative) Détermination de la capacité de rétention d’eau .17
Annexe C (informative) Recommandations relatives à l’ajustement du pH d’un sol artificiel .19
Annexe D (informative) Extraction et comptage des acariens prédateurs .20
Annexe E (informative) Informations générales sur la biologie de Hypoaspis (Geolaelaps)
aculeifer .21
Bibliographie .22
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
iv © ISO 2019 – Tous droits réservés
Introduction
Les systèmes d’essais écotoxicologiques sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur les
effets des contaminants présents dans les sols et sont proposés pour compléter l’analyse chimique
conventionnelle (voir ISO 15799 et ISO 17616). L’ISO 15799 contient une liste et une brève caractérisation
des systèmes d’essai recommandés et normalisés et l’ISO 17616 donne des recommandations sur le
choix et l’évaluation des essais biologiques. Les systèmes d’essai aquatiques avec un éluat de sol sont mis
en œuvre pour obtenir des informations sur la fraction des contaminants susceptibles d’être entraînés
jusque dans les eaux souterraines par le cheminement de l’eau (fonction de rétention des sols), alors que
les systèmes d’essai terrestres sont utilisés pour évaluer la fonction d’habitat des sols.
Les acariens représentent un groupe divers d’arthropodes, présent dans le monde entier, appartenant
à la classe des Arachnides, avec plus de 40 000 espèces comptabilisées, divisé en deux super-ordres
(Acariformes et Parasitiformes). En raison de leur taille relativement petite (de quelques micromètres à
quelques centimètres), ils occupent des niches écologiques spécifiques sur les végétaux et dans les sols
(voir Référence [13]).
Chez les acariens terricoles, le rôle de prédation est assuré, par exemple, par Hypoaspis sp. (Laelapidae).
Étant donné qu’ils sont exposés à une contamination chimique, les acariens sont déjà pris en compte
dans l’évaluation des risques environnementaux des pesticides, au titre d’organismes non cibles (voir
Référence [10]). En effet, parmi les données requises pour les substances actives pesticides, les effets sur
les acariens prédateurs sont évalués, à savoir pour l’espèce planticole Typhlodromus pyri (Phytoseiidae)
et l’espèce terricole Hypoaspis aculeifer (Laelapidae) (voir Référence [6]).
Les premiers auteurs à avoir introduit l’espèce H. aculeifer comme organisme d’essai lors d’études
[23][17]
écotoxicologiques ont ensuite proposé un système d’essai à deux espèces dans le cadre du projet
européen SECOFASE (Sublethal Effects of Chemicals on Fauna in the Soil Ecosystem), avec le collembole
Folsomia fimetaria comme proie. Lors de l’élaboration d’un essai écotoxicologique pour l’évaluation
de produits phytopharmaceutiques sur des arthropodes non cibles (voir Références [5], [6]), un autre
protocole relatif aux acariens prédateurs du sol utilisant H. aculeifer a été proposé. Plus récemment, un
protocole d’essai standardisé pour l’évaluation des produits chimiques a été mis au point pour cette
espèce par l’OCDE en 2008 et a été révisé en 2016. Les résultats de l’essai interlaboratoires international
associé ont été publiés dans la Référence [25].
Chez les acariens, le prédateur Hypoaspis aculeifer est l’espèce la plus étudiée en laboratoire. En général,
le critère d’effet lié à la reproduction s’est révélé plus sensible que la mortalité et l’évitement. Comparés
à d’autres invertébrés de la mésofaune du sol, les acariens se sont généralement avérés moins ou aussi
sensibles que d’autres espèces d’essai, selon les critères d’effet et les produits chimiques étudiés.
D’après les études réalisées dans des conditions semi-naturelles, H. aculeifer a été utilisé comme
prédateur supérieur alors que les invertébrés du sol, notamment les collemboles, ont été classés dans
le groupe des herbivores. Dans ces études, les acariens se sont montrés relativement résistants à la
contamination anthropogénique. Cette observation a été corroborée par des études sur le terrain.
Cependant, l’applicabilité des méthodes d’essai de laboratoire relatives à l’évaluation d’échantillons
environnementaux (sols contaminés, déchets, etc.) avec des acariens est soulignée bien que, jusqu’à
présent, un faible nombre d’études soit disponible.
Le présent document décrit une méthode reposant sur la détermination des effets létaux et sublétaux
de sols contaminés sur des acariens prédateurs adultes de l’espèce Hypoaspis aculeifer. Cette espèce est
considérée comme étant représentative des arthropodes prédateurs du sol. Des informations générales
sur l’écologie de ces acariens et leur utilisation dans les essais écotoxicologiques sont disponibles dans
la Référence [14].
NORME INTERNATIONALE ISO 21285:2019(F)
Qualité du sol — Inhibition de la reproduction de
l'acarien prédateur (Hypoaspis aculeifer) par des
contaminants du sol
1 Domaine d'application
Le présent document décrit une méthode d’essai chronique pour évaluer la fonction d’habitat des sols
et déterminer les effets des contaminants du sol et des substances sur la reproduction de l’espèce
Hypoaspis aculeifer par — principalement — absorption par voie alimentaire. Cette méthode est
applicable aux sols et matériaux du sol de qualité inconnue, par exemple, provenant de sites contaminés,
de sols amendés, de sols ayant fait l’objet d’une remédiation, de sites industriels, agricoles et autres,
et aux déchets (par exemple, matériau de dragage, boue résiduaire des stations d’épuration des eaux
usées, engrais ou fumier, notamment ceux pour épandage éventuel). La reproduction (= nombre de
juvéniles) est le paramètre mesuré au cours de l’essai. L’essai reflète la biodisponibilité d’un mélange
de contaminants dans les sols naturels (sols de sites contaminés) vis-à-vis d’une espèce qui représente
un niveau trophique qui n’est pas couvert par les autres normes ISO. Il n’est pas prévu d’utiliser cet
essai pour remplacer les essais de reproduction vis-à-vis des vers de terre (voir ISO 11268-2) ou des
collemboles (voir ISO 11267) car cette espèce appartient non seulement à un autre groupe trophique,
mais également à un autre groupe taxonomique (= acariens; c’est-à-dire, arachnides) que les autres
espèces utilisées habituellement.
Les effets des substances sont évalués en utilisant un sol standard, de préférence un substrat défini de
sol artificiel. Pour les sols contaminés, les effets sont déterminés dans le sol à analyser et dans un sol
témoin. Selon l’objectif de l’étude, le substrat témoin et le substrat de dilution (séries de dilutions du sol
contaminé) sont soit un sol non contaminé comparable au sol à analyser (sol de référence), soit un sol
standard (par exemple, sol artificiel).
Le présent document fournit des informations sur la façon d’utiliser cette méthode pour analyser des
échantillons (sols ou substances) dans des conditions tempérées.
Il n’est pas applicable aux substances pour lesquelles le coefficient de partage air/sol est supérieur à 1,
ou aux substances dont la tension de vapeur dépasse 300 Pa à 25 °C.
NOTE La stabilité de la substance d’essai ne peut pas être assurée tout au long de la période d’essai. La
méthode d’essai ne prévoit pas de contrôler la persistance de la substance soumise à essai.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d'échange cationique et du taux de saturation en
bases échangeables à l'aide d'une solution de chlorure de baryum
ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des
sols — Méthode par tamisage et sédimentation
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
ISO 18400-206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206: Collecte, manipulation et conservation de
sols destinés à l'évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et structurels en laboratoire
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
3.1
contaminant
substance ou agent présent(e) dans le sol du fait de l’activité humaine
3.2
concentration efficace à x %
CE
x
concentration (fraction massique) d’un échantillon pour essai qui engendre un effet de x % sur un
critère d’effet donné durant une période d’exposition déterminée, par rapport au témoin
EXEMPLE Une CE est une concentration estimée produire un effet de 50 % d’une population exposée sur
un critère d’effet donné durant une période d’exposition déterminée.
Note 1 à l'article: La CEx est exprimée en pourcentage de sol soumis à essai (masse sèche) par mélange de sols
(masse sèche). Lorsque des substances sont soumises à essai, la CEx est exprimée en masse de substance d’essai
par masse sèche de sol en milligrammes par kilogramme.
3.3
taux efficace
RE
x
taux d’un sol soumis à essai qui engendre un effet de x % sur un critère d’effet donné durant une période
d’exposition déterminée, par rapport au témoin
3.4
essai limite
essai à une seule concentration comprenant au moins quatre réplicats chacun, le sol soumis à essai sans
dilution ou la concentration maximale de substance d’essai mélangée dans le sol témoin et le témoin
3.5
concentration minimale avec effet observé
CMEO
concentration minimale en substance d’essai ayant un effet statistiquement significatif (probabilité
p < 0,05)
Note 1 à l'article: Dans cet essai, la CMEO est exprimée en masse de substance d’essai par masse sèche de sol
soumis à essai. Il convient que toutes les concentrations d’essai supérieures à la CMEO présentent généralement
un effet statistiquement différent du témoin.
3.6
taux minimal avec effet observé
RMEO
taux minimal d’un sol soumis à essai dans un sol témoin pour lequel un effet statistiquement significatif
est observé
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés
3.7
concentration sans effet observé
CSEO
concentration maximale en substance d’essai, immédiatement inférieure à la CMEO (3.5), à laquelle
aucun effet n’est observé
Note 1 à l'article: Dans cet essai, la concentration correspondant à la CSEO ne présente aucun effet statistiquement
significatif (probabilité p < 0,05) durant une période d’exposition déterminée, en comparaison avec le témoin.
3.8
taux sans effet observé
RSEO
taux minimal d’un sol soumis à essai, immédiatement inférieur au RMEO (3.6), qui, en comparaison avec
le témoin, ne présente aucun effet statistiquement significatif (probabilité p < 0,05) durant une période
d’exposition déterminée
3.9
sol de référence
sol non contaminé avec des propriétés pédologiques (concentrations en éléments nutritifs, pH, teneur
en carbone organique et texture) comparables à celles du sol étudié
3.10
sol standard
sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les principales propriétés (pH, texture, teneur en matières
organiques) se situent dans une gamme connue
EXEMPLE Euro-sols, sol artificiel, sol LUFA standard de type 2.2.
Note 1 à l'article: Les propriétés des sols standards peuvent différer de celles du sol d’essai.
3.11
sol témoin
sol de référence ou sol standard utilisé comme témoin et comme milieu pour préparer une gamme de
dilution des sols soumis à essai ou d’une substance de référence, qui satisfait aux critères de validité
Note 1 à l'article: Dans le cas d’un sol naturel, il est recommandé de démontrer sa capacité à être utilisé pour un
essai et à remplir les critères de validité de l’essai avant de l’utiliser dans un essai définitif.
3.12
mélange d’essai
mélange d’un sol contaminé ou d’une substance d’essai (par exemple, substance chimique, biosolide,
déchet) avec un sol témoin
3.13
ratio de mélange d’essai
ratio entre le sol soumis à essai et le sol témoin dans un mélange d’essai
4 Principe
Des femelles adultes sont exposées au sol soumis à essai et les effets mesurés sur la reproduction sont
comparés à ceux observés pour des femelles exposées à un sol témoin. Si cela est approprié, les effets
observés sont déterminés sur la base de l’exposition à une gamme de dilutions de sol contaminé et de
sol témoin ou à une gamme de concentrations d’une substance d’essai mélangée dans le sol témoin.
Les mélanges d’essai sont préparés au début de l’essai et ne sont pas renouvelés au cours de la période
d’essai. L’essai commence avec 10 femelles adultes par récipient d’essai. Les mâles ne sont pas inclus
dans l’essai car l’expérience a montré que les femelles s’accouplent dès l’éclosion du stade deutonymphe
ou peu après, dès lors que des mâles sont présents. Étant donné que les femelles sont introduites
dans l’essai environ 7 jours après avoir atteint le stade adulte, on peut considérer qu’elles se sont déjà
accouplées (Annexe A et Annexe E). L’essai se déroule jusqu’à ce que la première larve ait atteint le
ème
stade deutonymphe. À 20 °C, la période d’exposition se termine le 14 jour, après avoir introduit
les femelles (jour 0), et est suivie de deux jours d’extraction. Le nombre de femelles survivantes et le
nombre de juvéniles par récipient d’essai sont déterminés. Le taux de reproduction des acariens exposés
aux mélanges d’essai est comparé à celui des témoins, afin de déterminer les concentrations sans effet
observé sur la mortalité et la reproduction (RSEO/CSEO) et la concentration entraînant x % de réduction
des juvéniles éclos à partir des œufs en comparaison avec le témoin (RE /CE ), respectivement, selon le
x x
plan d’expérience (voir 7.1.3).
Dans le cas où il n'y a aucune connaissance préalable de la dilution/concentration du sol soumis à essai
ou de la substance d’essai susceptible d’avoir un effet, il est utile d’effectuer cet essai en deux étapes:
— un essai préliminaire sur la reproduction est réalisé pour obtenir une indication de la dilution/
concentration produisant un effet, et de la dilution/concentration ne provoquant pas de mortalité
(RSEO/CSEO). Les dilutions/concentrations à utiliser au cours de l’essai définitif peuvent ensuite
être choisies;
— l’essai définitif sur la reproduction pour déterminer les effets sublétaux de (dilutions de) sols
contaminés ou de la concentration d’une substance qui, lorsqu’elle est uniformément répartie dans
le sol standard, n’a pas d’effet significatif sur le nombre de larves écloses des œufs comparativement
au témoin (RSEO/CSEO), et la concentration minimale produisant un effet (RMEO/CMEO).
L’utilisation d’un sol de référence est une exigence essentielle pour démontrer l’état actuel de la
population d’essai et éviter une mauvaise interprétation des résultats.
5 Réactifs et matériel
5.1 Matériel biologique
Dans cet essai, des acariens femelles Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer adultes (7 jours à 14 jours après
avoir atteint le stade adulte; 28 jours à 35 jours après le début de la ponte lors de la synchronisation)
sont requis pour commencer l’essai. Les acariens doivent être choisis parmi une cohorte synchronisée
(voir Annexe E).
5.2 Mélanges d’essai
5.2.1 Sol ou déchets prélevé(s) sur le terrain Les sols prélevés sur le terrain et utilisés au cours de
l’essai doivent être tamisés à 4 mm (tamis à mailles carrées), pour éliminer les gros fragments, et être
soigneusement mélangés. Si nécessaire, le sol peut être séché à l’air, sans chauffage, avant le tamisage. Il
convient que la conservation du sol soumis à essai soit aussi courte que possible. Le sol doit être conservé
conformément à l’ISO 18400-206 en utilisant des récipients qui réduisent au minimum les pertes de
contaminants du sol par sorption sur les parois des récipients. Si des sols ou des mélanges d’essai ont été
conservés, il convient de les mélanger une nouvelle fois avant de les utiliser. Il convient de ne pas rectifier
le pH du sol car il peut avoir une incidence sur la biodisponibilité des contaminants du sol.
Pour l’interprétation des résultats d’essai, les caractéristiques suivantes doivent être déterminées pour
chaque échantillon de sol prélevé sur site:
a) pH conformément à l’ISO 10390;
b) texture (sable, limon ou loam, argile) conformément à l’ISO 11277;
c) teneur en eau conformément à l’ISO 11465;
d) capacité de rétention d’eau conformément à l’Annexe B;
e) capacité d'échange cationique conformément à l’ISO 11260;
f) carbone organique conformément à l’ISO 10694;
g) pourcentage de matériel éliminé par le tamis de 4 mm.
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Il est important de déterminer la capacité de rétention d’eau de tous les mélanges utilisés dans l’essai.
5.2.2 Sol témoin, soit a) un sol de référence soit b) un sol standard permettant la présence d’acariens
prédateurs. Le sol témoin et le sol utilisé pour la dilution ne doivent pas différer l’un de l’autre au cours
d’un essai [soit a) soit b)].
a) Si des sols de référence provenant de zones non contaminées voisines d’un site contaminé sont
disponibles, il convient de les traiter et de les caractériser de la même manière que les sols soumis à
essai. S’il est impossible d’exclure une contamination toxique ou des propriétés inhabituelles du sol,
il convient de préférer des sols témoins standards.
b) Pour évaluer les effets de substances mélangées au sol, des sols standards (par exemple, sol artificiel,
sol standard LUFA de type 2.2) doivent être utilisés comme substrat d’essai. Les propriétés du sol
standard prélevé sur le terrain doivent être consignées dans le rapport.
Le substrat dénommé «sol artificiel» peut être utilisé comme un sol standard et a la composition
suivante:
Pourcentage exprimé en masse sèche
— Tourbe de sphaignes, finement moulue [une granulométrie 5 %
de (2 ± 1) mm est acceptable], exempte de tout résidu
végétal visible
— Argile kaolinique contenant au moins 30 % de kaolinite 20 %
— Sable de quartz industriel (contenant en majorité du sable 74 %
fin constitué à plus de 50 % de grains d’une granulométrie
de 0,05 mm à 0,2 mm)
Environ 0,3 % à 1,0 % de carbonate de calcium (CaCO , pulvérisé, de qualité analytique) sont nécessaires
pour obtenir un pH de 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Afin de prendre en compte les propriétés des substances fortement non polaires (log K > 2) ou
ow
ionisantes, 5 % de tourbe se sont avérés suffisants pour maintenir la structure souhaitée du sol artificiel.
NOTE 2 Il a été démontré que Hypoaspis aculeifer peut remplir les critères de validité, même en ce qui concerne
la reproduction, lorsqu’il est soumis à essai dans des sols ayant une plus faible teneur en carbone organique (par
exemple 2,7 %), et des expériences prouvent que cette teneur peut être obtenue dans un sol artificiel avec 5 %
de tourbe. Par conséquent, avant d’utiliser un tel sol dans un essai définitif, il n’est pas nécessaire de démontrer
que le sol artificiel permet de réaliser l’essai conformément aux critères de validité, sauf si la teneur en tourbe est
inférieure à la valeur spécifiée ci-dessus.
Préparer le sol artificiel au moins trois jours avant le début de l’essai, en mélangeant soigneusement
les constituants secs indiqués ci-dessus dans un mélangeur de laboratoire de grandes dimensions. Une
partie de l’eau déionisée nécessaire est ajoutée pendant le mélange. Il convient de tenir compte de l’eau
qui est utilisée pour introduire la substance d’essai dans le sol. La quantité de carbonate de calcium
nécessaire peut varier selon les propriétés de chaque lot de tourbe de sphaignes et il convient qu’elle
soit déterminée par des mesurages effectués sur des sous-échantillons immédiatement avant l’essai
(voir Annexe C). Conserver le sol artificiel mélangé à température ambiante pendant au moins deux
jours pour équilibrer l’acidité. Pour déterminer le pH et la capacité maximale de rétention d’eau, le sol
artificiel sec est pré-humidifié un ou deux jours avant le début de l’essai en ajoutant de l’eau déionisée
de manière à atteindre environ la moitié de la teneur finale en eau requise, comprise entre 40 % et 60 %
de la capacité maximale de rétention d’eau.
La capacité totale de rétention d’eau doit être déterminée conformément à l’Annexe B, le pH doit être
déterminé conformément à l’ISO 10390.
5.3 Substance de référence
5.3.1 Généralités. Pour assurer la qualité du système d’essai, il convient d’effectuer des essais à
intervalles réguliers (une ou deux fois par an) en utilisant une substance de référence.
La CSEO et/ou la CE d’une substance de référence doivent être déterminées pour garantir que les
x
conditions d’essai en laboratoire sont adéquates et pour vérifier que la réponse des organismes d’essai
n’a pas évolué dans le temps. La substance de référence peut être soumise à essai parallèlement à
la détermination de la toxicité de chaque échantillon pour essai à une concentration qui doit être
démontrée au préalable lors d’une étude dose-réponse comme produisant un effet d’environ 50 %.
Dans ce cas, il convient que le nombre de réplicats soit identique à celui des témoins. Autrement, la
substance de référence est soumise à essai une à deux fois par an lors d’un essai dose-réponse. Selon le
dispositif choisi, le nombre de concentrations et de réplicats et le facteur de séparation diffèrent (voir
7.1.3), mais il convient d’obtenir une réponse de 10 % à 90 % d’effet (facteur de séparation de 1,8). Le
diméthoate et l’acide borique sont des substances de référence appropriées ayant montré un effet sur la
[25]
reproduction .
Il convient que la CE du diméthoate basée sur le nombre de juvéniles se situe entre 3,0 mg s.a.
(substance active)/kg de sol (masse sèche) et 7,0 mg s.a. (substance active)/kg de sol (masse sèche).
D’après les résultats obtenus jusqu’ici avec l’acide borique, il convient que la CE basée sur le nombre
de juvéniles se situe entre 100 mg/kg (masse sèche) de sol et 300 mg/kg (masse sèche) de sol.
5.3.2 Diméthoate (CAS 60-51-5), C H NO PS , soumis à essai sous forme de formulation [par
5 12 3 2
1)
exemple, Perfekthion (env. 40 % de diméthoate)].
5.3.3 Acide borique (CAS 10043-35-3), H BO (99 %).
3 3
AVERTISSEMENT — Lors de la manipulation de ces substances, il convient de prendre toutes les
précautions nécessaires pour éviter toute ingestion ou tout contact avec la peau.
6 Appareillage
Utiliser du matériel de laboratoire et l’appareillage suivant.
6.1 Récipients d’essai, en verre ou autre matériau chimiquement inerte, d’une capacité d’environ
100 ml et d’un diamètre d’environ 5 cm, munis de couvercles (par exemple, couvercle en plastique,
disques en verre ou film plastique pouvant être fermés hermétiquement).
6.2 Appareillage permettant de déterminer la masse sèche du substrat, conformément à
l’ISO 11465.
6.3 Mélangeur de laboratoire de grandes dimensions, pour la préparation des mélanges d’essai (5.2).
6.4 Balances de précision adaptée.
6.5 Appareillage, permettant de mesurer le pH et la teneur en eau du substrat.
6.6 Système d’aspiration, pour le transfert des acariens (voir ISO 11267:2014, A.2).
1) Perfekthion est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à
l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve l’emploi du produit
ainsi désigné.
6 © ISO 2019 – Tous droits réservés
6.7 Environnement d’essai
6.7.1 Enceinte, thermostatée à (20 ± 2) °C.
6.7.2 Source lumineuse, permettant de fournir aux récipients une intensité lumineuse constante
de 400 lx à 800 lx à la surface du substrat, selon un cycle contrôlé lumière/obscurité compris
entre 12 h:12 h et 16 h:8 h.
6.8 Appareil d’extraction, entonnoir de Tullgren ou méthode équivalente, par exemple, méthode
McFadyen (voir Annexe D).
7 Mode opératoire
7.1 Plan d’expérience
7.1.1 Généralités
Un échantillon de sol prélevé sur le terrain peut être soumis à essai à une seule concentration
(généralement 100 %) ou faire l’objet d’une évaluation de sa toxicité lors d’un essai à plusieurs
concentrations pour lequel une gamme de concentrations (dilutions) est préparée en mélangeant
des quantités calculées avec un sol témoin (5.2.2). Lorsque des substances sont soumises à essai,
une gamme de concentrations est préparée en mélangeant des quantités de la substance d’essai avec
un sol standard (par exemple un sol artificiel). Les concentrations sont exprimées en milligrammes
de substance d’essai par kilogramme de sol témoin équivalent sec (5.2.2). Selon la connaissance des
niveaux de réponse pertinents, un essai préliminaire peut précéder l’essai définitif. Chaque essai
définitif comprend une gamme de mélanges de sols (traitements).
7.1.2 Essai préliminaire
L’essai préliminaire permettant de déterminer la gamme de mélanges affectant les acariens prédateurs
est facultatif, par exemple: 0 %, 1 %, 5 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 % de sol, ou en concentrations de
substance d’essai: 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg et 1 000 mg/kg [les concentrations étant
exprimées en milligrammes de substance d’essai par kilogramme de sol témoin sec (voir 5.2.2) et un
témoin en utilisant 10 acariens par récipient]. L’essai préliminaire est effectué sans répétition. La durée
de l’essai préliminaire est de 14 jours (temps d’exposition) suivis d’une période d’extraction de deux
jours. Au bout de 16 jours, la mortalité des acariens adultes et le nombre de juvéniles sont déterminés.
D’après les résultats de l’essai préliminaire, le RE /la CE sont déterminés sommairement en calculant
50 50
la moyenne géométrique de ces deux concentrations présentant une mortalité de 0 % et 100 %. Lors de
l’essai définitif, il convient de choisir la gamme de concentrations/dilutions de façon qu’elle inclue les
concentrations auxquelles le nombre de juvéniles est affecté alors que la survie des femelles ne l’est
pas. Toutefois, ceci n’est pas forcément possible pour les substances engendrant des effets létaux et
sublétaux à des concentrations similaires.
Lorsqu’aucun effet n’est observé, même avec un sol contaminé à 100 % ou à une concentration en
substance d’essai de 1 000 mg/kg de sol standard (masse sèche), l’essai définitif peut être conçu comme
un essai limite.
7.1.3 Essai définitif
La conception de l’essai définitif dépend des objectifs de l’essai. Les propriétés d’habitat des échantillons
de sol prélevé sur site sont généralement caractérisées en comparant les effets biologiques observés
dans le sol soumis à essai avec ceux observés dans un sol de référence, ou si celui-ci n’est pas disponible
ou n’est pas approprié en raison de sa toxicité ou de caractéristiques physico-chimiques atypiques, dans
un sol standard. Les résultats pour le sol standard aident à faire la distinction entre les effets liés aux
contaminants et les effets non liés aux contaminants, provoqués par des propriétés physico-chimiques.
Indépendamment du fait qu’un sol de référence ou un sol standard soit utilisé pour les comparaisons
statistiques, les résultats obtenus à partir du sol standard doivent être utilisés pour évaluer la validité
[27]
et l’acceptabilité de l’essai . La durée de l’essai définitif est de 14 jours (temps d’exposition) suivis
d’une période d’extraction de deux jours. Au bout de 16 jours, la mortalité des acariens adultes et le
nombre de juvéniles sont déterminés.
Si, à des fins de caractérisation, un plan d’expérience incluant une gamme de dilutions est nécessaire,
trois conceptions sont possibles (les concentrations doivent être espacées par un facteur inférieur ou
égal à 2):
— Pour l’approche RSEO/CSEO, il convient d’utiliser une série géométrique d’au moins cinq
concentrations ou mélanges d’essai. Quatre réplicats pour chaque traitement et huit témoins sont
recommandés.
— Pour l’approche RE /CE , il convient d’utiliser 12 concentrations ou mélanges d’essai. Deux réplicats
x x
pour chaque concentration et six témoins sont recommandés. Le facteur de séparation peut être
variable: plus petit pour les concentrations faibles, plus important pour les concentrations élevées.
— Pour l’approche mixte, il convient d’utiliser une série géométrique de 6 à 8 concentrations ou
mélanges d’essai. Quatre réplicats pour chaque traitement et huit témoins sont recommandés. Cette
méthode mixte permet d’évaluer le RSEO/la CSEO ainsi que le RE /la CE .
x x
Pour faciliter la vérification du pH et de l’humidité de l’échantillon pour essai, il est recommandé
d’utiliser des récipients supplémentaires pour chaque concentration et pour le témoin.
Chaque récipient d’essai (réplicat) est rempli de 20 g de masse sèche de l’échantillon pour essai. Pour
assurer une migration aisée des acariens, il convient que le substrat dans le récipient d’essai ne soit
pas tassé.
7.1.4 Essai limite
Si aucun effet n’est observé à la concentration maximale lors de l’essai préliminaire (c’est-à-
dire, 1 000 mg/kg ou 100 %), l’essai de reproduction peut être effectué sous forme d’essai limite, en
utilisant une concentration d’essai de 1 000 mg/kg ou le sol non dilué. Un essai limite permettra de
prouver que le RSEO/la CSEO ou la CE /le RE pour la reproduction sont supérieurs à la concentration
10 10
limite tout en réduisant au minimum le nombre d’acariens utilisés dans l’essai. Il convient d’utiliser huit
réplicats pour le sol traité et le témoin.
7.2 Préparation des mélanges d’essai
7.2.1 Essai sur sol contaminé
Conformément à la gamme de dilutions choisie, le sol soumis à essai est soigneusement mélangé au sol
de référence ou au sol standard (manuellement ou à l’aide d’un mélangeur à main). L’homogénéité du
mélange est contrôlée visuellement. La masse totale du sol soumis à essai et du sol de référence ou du
sol standard doit être de 20 g (masse sèche) dans chaque récipient d’essai (6.1). Le mélange d’essai doit
être humidifié avec de l’eau déionisée pour atteindre 40 % à 60 % de la capacité totale de rétention
d’eau déterminée conformément à l’Annexe B. Dans certains cas, par exemple lorsque l’essai est réalisé
sur des déchets, des pourcentages plus élevés sont nécessaires. Une vérification sommaire de la teneur
en eau du sol peut être obtenue en comprimant légèrement le sol dans la main; si la teneur en eau est
correcte, il convient que de petites gouttes d’eau apparaissent entre les doigts.
Déterminer le pH pour chaque mélange d’essai (un récipient par concentration) conformément à
l’ISO 10390 au début et à la fin de l’essai (lorsque des échantillons acides ou basiques sont soumis à
essai, ne pas ajuster le pH).
Préparer le nombre approprié de réplicats par concentration/mélange d’essai et le(s) témoin(s)
conformément à l’approche sélectionnée (voir 7.1.3).
AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de substances
toxiques, mutagènes ou nocives ou des micro-organismes infectieux. Des risques pour la santé
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au travail peuvent survenir en raison de la poussière ou de l’évaporation de substances ainsi que
par contact cutané pendant la manipulation et l’incubation.
7.2.2 Essai sur substances ajoutées au substrat d’essai
Un sol standard (5.2.2) est utilisé pour préparer l’échantillon pour essai. Pour chaque récipient
d’essai (6.1), la masse du substrat utilisé doit être de 20 g (masse sèche). Les substances sont ajoutées au
substrat d’essai, puis le tout est soigneusement mélangé.
Pour l’introduction des substances d’essai, utiliser la méthode a), b) ou c), selon le cas:
a) Substance soluble dans l’eau
— Immédiatement avant le début de l’essai, dissoudre la quantité de substance d’essai dans
l’eau ou dans une partie de celle-ci pour humidifier les échantillons de sol pour les réplicats
d’une concentration afin d’atteindre une teneur finale en eau de
...
Questions, Comments and Discussion
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