ISO 6579-1:2017
(Main)Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 1: Detection of Salmonella spp.
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 1: Detection of Salmonella spp.
ISO 6579-1:2017 specifies a horizontal method for the detection of Salmonella. It is applicable to the following: - products intended for human consumption and the feeding of animals; - environmental samples in the area of food production and food handling; - samples from the primary production stage such as animal faeces, dust, and swabs. With this horizontal method, most of the Salmonella serovars are intended to be detected. For the detection of some specific serovars, additional culture steps may be needed. For Salmonella Typhi and Salmonella Paratyphi, the procedure is described in Annex D. The selective enrichment medium modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis (MSRV) agar is intended for the detection of motile Salmonella and is not appropriate for the detection of non-motile Salmonella strains.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche, le dénombrement et le sérotypage des Salmonella — Partie 1: Recherche des Salmonella spp.
ISO 6759-1:2017 spécifie une méthode horizontale de recherche des Salmonella. Il s'applique aux: - produits destinés à la consommation humaine et à l'alimentation animale. - échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manutention de denrées alimentaires. - échantillons au stade de la production primaire, tels que des matières fécales, de la poussière ou des prélèvements de surface. Cette méthode horizontale vise à rechercher la plupart des sérovars de Salmonella. Des étapes de culture supplémentaires peuvent être nécessaires pour la recherche de certains sérovars spécifiques. Pour Salmonella Typhi et Salmonella Paratyphi, le mode opératoire est décrit en Annexe D. Le milieu d'enrichissement sélectif MSRV, gélose de Rappaport‐Vassiliadis semi‐solide modifiée, est conçu pour la recherche des Salmonella mobiles et n'est pas adapté à la détection des Salmonella immobiles.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 6579-1
First edition
2017-02
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the detection,
enumeration and serotyping of
Salmonella —
Part 1:
Detection of Salmonella spp.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche, le dénombrement et le sérotypage des
Salmonella —
Partie 1: Recherche des Salmonella spp.
Reference number
©
ISO 2017
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ii © ISO 2017 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vii
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
4.1 General . 2
4.2 Pre-enrichment in non-selective liquid medium . 2
4.3 Enrichment in/on selective media . 2
4.4 Plating out on selective solid media . 2
4.5 Confirmation . 3
5 Culture media, reagents, and antisera . 3
6 Equipment and consumables . 3
7 Sampling . 4
8 Preparation of test sample . 4
9 Procedure (see diagrams in Annex A) . 4
9.1 Test portion and initial suspension . 4
9.2 Non-selective pre-enrichment . 4
9.3 Selective enrichment. 5
9.3.1 General. 5
9.3.2 Procedure for food, animal feed samples, and environmental samples
from the food production area . 5
9.3.3 Procedure for samples from the primary production stage . 5
9.4 Plating out . 6
9.4.1 General. 6
9.4.2 Procedure for food, animal feed samples, and environmental samples
from the food production area . 6
9.4.3 Procedure for samples from the primary production stage . 6
9.5 Confirmation . 7
9.5.1 General. 7
9.5.2 Selection of colonies for confirmation . 7
9.5.3 Biochemical testing . 8
9.5.4 Serological testing . . .11
9.5.5 Interpretation of biochemical and serological reactions .11
9.5.6 Serotyping.12
10 Expression of results .12
11 Performance characteristics of the method .12
11.1 Interlaboratory studies .12
11.2 Sensitivity .12
11.3 Specificity .12
11.4 LOD .
50 12
12 Test report .13
Annex A (normative) Diagrams of the procedures .14
Annex B (normative) Culture media and reagents .17
Annex C (informative) Method validation studies and performance characteristics .32
Annex D (normative) Detection of Salmonella enterica subspecies enterica serovars Typhi
and Paratyphi .38
Annex E (informative) Examples of selective plating-out media .43
Bibliography .48
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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,
as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the
Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www . i so .org/ iso/ foreword .html
This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN), Technical
Committee CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical
Committee TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the agreement
on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This first edition of ISO 6579-1 cancels and replaces ISO 6579:2002 and ISO 6785:2001, which have been
technically revised. It also incorporates ISO 6579:2002/Amd 1:2007 and ISO 6579:2002/Cor 1:2004.
The main changes, compared to ISO 6579:2002, are the following.
— ISO 6785 has been incorporated in this document.
— Samples from the primary production stage have been added to the scope.
— Detection of Salmonella Typhi and Salmonella Paratyphi is described in Annex D.
— Descriptions of preparations of initial suspensions have been removed and references made to
relevant parts of ISO 6887, whenever possible.
— The temperature range for incubation of non-selective media has been extended from 37 °C ± 1 °C
to 34 °C to 38 °C without further tolerance.
— For selective enrichment, there is a choice between using the broth or the semi-solid agar of
Rappaport Vassiliadis medium (RVS or MSRV) for food, animal feed samples, and for environmental
samples from the food production area.
— The inoculation of the isolation medium has become less prescriptive; the objective is to obtain
well-isolated colonies after incubation.
— For confirmation, it is acceptable to perform the tests on only one suspect colony (instead of one
suspect colony of each medium combination). If this isolate tests negative for Salmonella, four more
suspect isolates from different media combinations shall be tested.
— It is permitted to perform the biochemical confirmation directly on a suspect, well-isolated colony
from the selective plating medium. The purity check on the non-selective agar medium can then be
performed in parallel.
— Two confirmation tests have become optional ( ß-galactosidase test and indole reaction) and one
confirmation test has been deleted (Voges-Proskauer reaction).
— In this document, serological confirmation (to serogroup level) is described. For guidance on
serotyping (to serovar level), reference is made to ISO/TR 6579-3.
— Table 1 has been improved.
— Performance testing for the quality assurance of the culture media has been added to Annex B.
— Performance characteristics of MSRV have been added to Annex C.
A list of all parts in the ISO 6579 series can be found on the ISO website.
vi © ISO 2017 – All rights reserved
Introduction
This document describes a horizontal method for the detection of Salmonella spp. in food (including
milk and milk products, originally described in ISO 6785), in animal feed, in animal faeces, and in
environmental samples from the primary production stage (the latter two were originally described in
ISO 6579:2002/Amd 1:2007).
The main changes, listed in the foreword, introduced in this document compared to ISO 6579:2002, are
[37]
considered as minor (see ISO 17468 ).
[3]
A procedure for the enumeration of Salmonella spp. is described in ISO/TS 6579-2.
[24]
Guidance for serotyping of Salmonella spp. is described in ISO/TR 6579-3.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 6579-1:2017(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method
for the detection, enumeration and serotyping of
Salmonella —
Part 1:
Detection of Salmonella spp.
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests
for detecting Salmonella are only undertaken in properly equipped laboratories under the
control of a skilled microbiologist and that great care is taken in the disposal of all incubated
materials. Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety aspects, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
1 Scope
This document specifies a horizontal method for the detection of Salmonella. It is applicable to the
following:
— products intended for human consumption and the feeding of animals;
— environmental samples in the area of food production and food handling;
— samples from the primary production stage such as animal faeces, dust, and swabs.
With this horizontal method, most of the Salmonella serovars are intended to be detected. For the
detection of some specific serovars, additional culture steps may be needed. For Salmonella Typhi and
Salmonella Paratyphi, the procedure is described in Annex D.
The selective enrichment medium modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis (MSRV) agar is intended
for the detection of motile Salmonella and is not appropriate for the detection of non-motile Salmonella
strains.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of food and animal feed — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133:2014, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
3.1
Salmonella
microorganism which forms typical or less typical colonies on solid selective media and which displays
the characteristics described when confirmation tests are carried out in accordance with this document
3.2
detection of Salmonella
determination of Salmonella (3.1), in a particular mass or volume of product or surface area or object
(e.g. boot socks), when tests are carried out in accordance with this document
4 Principle
4.1 General
The detection of Salmonella requires four successive stages as specified in Annex A.
NOTE Salmonella can be present in small numbers and is often accompanied by considerably larger numbers
of other Enterobacteriaceae or bacteria of other families. Pre-enrichment is used to permit the detection of low
numbers of Salmonella or injured Salmonella.
4.2 Pre-enrichment in non-selective liquid medium
Buffered peptone water at ambient temperature is inoculated with the test portion, then incubated
between 34 °C and 38 °C for 18 h.
For large quantities (e.g. 1 l or more), it is recommended to pre-warm the BPW to 34 °C to 38 °C before
mixing it with the test portion.
4.3 Enrichment in/on selective media
Rappaport-Vassiliadis medium with soya (RVS broth) or Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis
(MSRV) agar and Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin broth (MKTTn broth) are inoculated
with the culture obtained in 4.2.
The RVS broth or the MSRV agar is incubated at 41,5 °C for 24 h and the MKTTn broth at 37 °C for 24 h.
For some products, it may be necessary to incubate the selective enrichment medium/media for an
additional 24 h.
NOTE MSRV agar is intended for the detection of motile Salmonella strains and is not appropriate for the
detection of non-motile Salmonella strains.
4.4 Plating out on selective solid media
From the cultures obtained in 4.3, the following two selective solid media are inoculated:
— Xylose Lysine Deoxycholate agar (XLD agar);
— any other solid selective medium complementary to XLD agar (for examples, see Annex E).
The XLD agar is incubated at 37 °C and examined after 24 h. The second selective agar is incubated
according to the manufacturer’s instructions.
2 © ISO 2017 – All rights reserved
4.5 Confirmation
Colonies of presumptive Salmonella are subcultured and their identity is confirmed by means of
appropriate biochemical and serological tests.
5 Culture media, reagents, and antisera
For current laboratory practice, see ISO 7218 and ISO 11133.
Composition of culture media and reagents and their preparation are described in Annex B.
6 Equipment and consumables
Disposable equipment is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications.
Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave).
As specified in ISO 7218.
6.2 Drying cabinet or oven, capable of operating between 25 °C and 50 °C.
6.3 Incubator(s), capable of operating in the range 34 °C to 38 °C and at 37 °C ± 1 °C.
6.4 Incubator, capable of operating at 41,5 °C ± 1 °C or water bath capable of operating at
41,5 °C ± 1 °C.
6.5 Water bath, capable of operating at 47 °C to 50 °C.
6.6 Water bath, capable of operating at 37 °C ± 1 °C.
6.7 Water bath, capable of operating at 45 °C ± 1 °C.
It is recommended to use a water bath (6.4 to 6.7) containing an antibacterial agent because of the low
infective dose of Salmonella.
6.8 Refrigerator, capable of operating at 5 °C ± 3 °C.
6.9 Freezer, capable of operating at -20 °C ± 5 °C.
6.10 Sterile loops, of approximate diameter, 3 mm (10 μl volume), and of 1 µl volume and inoculation
needle or wire.
6.11 pH-meter, having an accuracy of calibration of ±0,1 pH unit at 20 °C to 25 °C.
6.12 Sterile tubes, bottles, or flasks with caps of appropriate capacity.
6.13 Sterile graduated pipettes or automatic pipettes, of nominal capacities of 25 ml, 10 ml, 1 ml,
and 0,1 ml.
6.14 Sterile Petri dishes, with a diameter of approximately 90 mm and (optional) large size (diameter
approximately 140 mm).
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document (see the specific International Standard
dealing with the product concerned). If there is no specific International Standard, it is recommended
that the parties concerned come to an agreement on this subject.
[26] [27
A recommended sampling method is given in ISO/TS 17728 for food and animal feed, in ISO 707 ]
[28]
for milk and milk products, in ISO 13307 for sampling at the primary production stage, in
[29] [25]
ISO 17604 for sampling of carcasses, and in ISO 18593 for sampling of surfaces.
It is important that the laboratory receives a sample which is representative and has not been damaged
or changed during transport or storage.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample from the laboratory sample in accordance with the specific International
Standard dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard, it is
recommended that the parties concerned come to an agreement on this subject.
9 Procedure (see diagrams in Annex A)
9.1 Test portion and initial suspension
For preparation of the initial suspension, in the general case, use as diluent the pre-enrichment medium
specified in B.2 (buffered peptone water). Pre-warm the BPW to room temperature before use.
In general, an amount of test portion (mass or volume) is added to a quantity of BPW (mass or volume)
to yield a tenfold dilution. For this, a 25 g test portion is mixed with 225 ml of BPW. However, for some
type of samples (e.g. boot socks, dust), it may be necessary to use another ratio.
For specific products, follow the procedures specified in ISO 6887 (all parts).
This document has been validated for test portions of 25 g. A smaller test portion may be used without
the need for additional validation/verification provided that the same ratio between (pre-)enrichment
broth and test portion is maintained. A larger test portion than that initially validated may be used
if a validation/verification study has shown that there are no negative effects on the detection of
Salmonella spp.
NOTE 1 Validation can be conducted according to the appropriate parts of ISO 16140. Verification for pooling
[38]
samples can be conducted according to the protocol described in ISO 6887-1:2017, Annex D .
For large quantities (e.g. 1 l or more), it is recommended to pre-warm the BPW to 34 °C to 38 °C before
mixing it with the test portion.
NOTE 2 When more than one 25 g test portion from a specified lot of product is to be examined and when
evidence is available that combining test portions does not affect the result for that particular food, the test
portions can be pooled. More information on pooling of samples as well as a procedure to test the influence of
[38]
pooling on the sensitivity of the method can be found in ISO 6887-1 .
9.2 Non-selective pre-enrichment
Incubate the initial suspension (9.1) between 34 °C and 38 °C (6.3) for 18 h ± 2 h.
It is permissible to store the pre-enriched sample after incubation at 5 °C (6.8) for a maximum of 72 h
(see References [30] to [34]).
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9.3 Selective enrichment
9.3.1 General
Allow the selective enrichment media, RVS broth or MSRV agar (B.3 or B.4), and MKTTn broth (B.5) to
equilibrate at room temperature if they were stored at a lower temperature.
Minimize the transfer of particulate material from the pre-enrichment into the selective enrichment
media.
After incubation, it is permissible to store the selective enrichment at 5 °C (6.8) for a maximum of 72 h
(see References [30] to [34]).
NOTE MSRV agar is intended for the detection of motile Salmonella strains and is not appropriate for the
detection of non-motile Salmonella strains.
9.3.2 Procedure for food, animal feed samples, and environmental samples from the food
production area
Transfer 0,1 ml of the culture obtained in 9.2 to a tube containing 10 ml of the RVS broth (B.3) or to the
surface of a MSRV agar plate (B.4). Inoculate the MSRV agar with one to three equally spaced spots on
the surface of the medium.
Transfer 1 ml of the culture obtained in 9.2 to a tube containing 10 ml of MKTTn broth (B.5).
Incubate the inoculated RVS broth at 41,5 °C (6.4) for 24 h ± 3 h.
Incubate the inoculated MSRV agar plates at 41,5 °C (6.4) for 24 h ± 3 h. Do not invert the plates.
Incubate the inoculated MKTTn broth at 37 °C (6.3) for 24 h ± 3 h.
Suspect MSRV plates will show a grey-white, turbid zone extending out from the inoculated drop.
In dried milk products and cheese, Salmonella may be sublethally injured. Incubate the selective
enrichment media from these products for an additional 24 h ± 3 h (see Reference [35]).
For some other products, e.g. when investigating outbreak samples, this additional incubation time may
also be beneficial.
9.3.3 Procedure for samples from the primary production stage
Inoculate the MSRV agar (B.4) with 0,1 ml of the pre-enriched culture (9.2) as one to three equally
spaced spots on the surface of the medium.
Incubate the inoculated MSRV plates at 41,5 °C (6.4) for 24 h ± 3 h.
Do not invert the plates.
Suspect MSRV plates will show a grey-white, turbid zone extending out from the inoculated drop.
If the plates are negative after 24 h, re-incubate for a further 24 h ± 3 h.
NOTE Sensitivity can be improved by using a second selective enrichment procedure, e.g. MKTTn broth
[36]
incubated at 41,5 °C for 24 h.
9.4 Plating out
9.4.1 General
From the selective enriched cultures (9.3), inoculate two selective isolation agar media. The first
isolation medium is Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) agar. The second isolation medium is chosen by
the testing laboratory.
Choose a second selective plating medium which is complementary to XLD agar and is based on different
diagnostic characteristics to those of XLD agar to facilitate detection of, for instance, lactose positive or
H2S-negative Salmonella. For examples of isolation media, see Annex E.
Allow the XLD agar (B.6) plates and the second selective plating medium to equilibrate at room
temperature if they were stored at a lower temperature. If necessary, dry the surface of the plates
before use (see ISO 11133).
9.4.2 Procedure for food, animal feed samples, and environmental samples from the food
production area
From the culture obtained in the RVS broth (9.3.2), inoculate by means of a 10 µl loop (6.10) the surface
of an XLD plate (B.6) so that well-isolated colonies will be obtained. Proceed in the same way with the
second selective plating-out medium.
From the positive growth obtained on the MSRV agar (9.3.2), determine the furthest point of opaque
growth from the inoculation points and dip a 1 µl loop (6.10) just inside the border of the opaque
growth. Withdraw the loop ensuring that no large lumps of MSRV agar are extracted. Inoculate the
surface of an XLD plate (B.6) so that well-isolated colonies will be obtained. Proceed in the same way
with the second selective plating-out medium.
From the culture obtained in the MKTTn broth (9.3.2), inoculate by means of a 10 µl loop (6.10) the
surface of an XLD plate (B.6) so that well-isolated colonies are obtained. Proceed in the same way with
the second selective plating-out medium.
NOTE 1 To obtain well-isolated colonies, large size Petri dishes with plating-out media (diameter
approximately 140 mm) or two normal size plates (diameter approximately 90 mm) can be used.
Incubate the XLD plates inverted at 37 °C (6.3) for 24 h ± 3 h.
Incubate the second selective plating-out medium in accordance with the manufacturer’s instructions.
If the selective enrichment media have been incubated for an additional 24 h, follow the same plating-
out procedure as described above.
Typical colonies of Salmonella on XLD agar have a black centre and a lightly transparent zone of reddish
colour due to the colour change of the indicator.
NOTE 2 Salmonella H2S-negative variants grown on XLD agar are pink with a darker pink centre. Lactose-
positive Salmonella grown on XLD agar are yellow with or without blackening. The occurrence of these
phenotypes is summarized in Table 1.
Check the second selective plating medium after the appropriate incubation time for the presence of
colonies which, from their characteristics, are considered to be presumptive Salmonella.
9.4.3 Procedure for samples from the primary production stage
From the positive growth obtained on the MSRV agar (9.3.3), determine the furthest point of opaque
growth from the inoculation points and dip a 1 μl loop (6.10) just inside the border of the opaque
growth. Withdraw the loop ensuring that no large lumps of MSRV agar are extracted. Inoculate the
surface of an XLD plate so that well-isolated colonies will be obtained. Proceed in the same way with
the second selective plating medium.
6 © ISO 2017 – All rights reserved
Incubate the XLD plates inverted at 37 °C (6.3) for 24 h ± 3 h.
Incubate the second selective plating medium in accordance with the manufacturer’s instructions.
Return negative MSRV plates to the 41,5 °C incubator and incubate for a further 24 h ± 3 h. Perform the
selective plating procedure if, after 48 h of incubation, these MSRV plates become positive.
Typical colonies of Salmonella on XLD agar have a black centre and a lightly transparent zone of reddish
colour due to the colour change of the indicator.
NOTE Salmonella H2S-negative variants grown on XLD agar are pink with a darker pink centre. Lactose-
positive Salmonella grown on XLD agar are yellow with or without blackening. The occurrence of these
phenotypes is summarized in Table 1.
Check the second selective plating medium after the appropriate incubation time for the presence of
colonies which, from their characteristics, are considered to be presumptive Salmonella.
9.5 Confirmation
9.5.1 General
The combination of biochemical and serological test results indicate whether an isolate belongs to the
genus Salmonella. For characterization of Salmonella strains, full serotyping is needed. Guidance for
[24]
serotyping is described in ISO/TR 6579-3 .
For some of the confirmation media as specified in 9.5.3 and in B.8 to B.12, alternative (commercial)
formulations exist which may also be applicable for biochemical confirmation of Salmonella. These
alternative formulations are allowed, provided that the performance for the biochemical confirmation
of Salmonella is verified before use.
For a clear distinction between positive and negative biochemical reactions, it is helpful to verify the
reactions of the media of each biochemical test with well-characterized positive and negative control
strains.
NOTE 1 The recognition of colonies of Salmonella is, to a large extent, a matter of experience and their
appearance can vary somewhat, not only from serovar to serovar, but also from batch to batch of the selective
culture medium used.
If shown to be reliable, miniaturized galleries for the biochemical identification of Salmonella may be
used (see ISO 7218).
NOTE 2 Alternative procedures can be used to confirm the isolate as Salmonella spp. providing the suitability
of the alternative procedure is verified (see ISO 7218).
9.5.2 Selection of colonies for confirmation
Mark suspect colonies on each plate (9.4). Select at least one typical or suspect colony for subculture
and confirmation. If this is negative, select up to four more suspect colonies ensuring that these
colonies are subcultured from different selective enrichment/isolation medium combinations showing
suspect growth.
Streak the selected colonies onto the surface of a pre-dried non-selective agar medium (B.7) in a manner
which will allow well-isolated colonies to develop. Incubate the inoculated plates between 34 °C and
38 °C (6.3) for 24 h ± 3 h.
Alternatively, if well-isolated colonies (of a pure culture) are available on the selective plating media
(9.4), the biochemical confirmation can be performed directly on a suspect, well-isolated colony
from the selective plating medium. The culture step on the non-selective agar medium can then be
performed in parallel with the biochemical tests for purity check of the colony taken from the selective
agar medium.
Use pure cultures for biochemical and serological confirmation.
NOTE For epidemiological purposes or during outbreak investigations, confirmation of additional colonies,
e.g. five typical or suspect colonies from each selective enrichment/isolation medium combination, can be
beneficial.
9.5.3 Biochemical testing
9.5.3.1 General
Inoculate the biochemical confirmation media with each of the cultures obtained from the colonies
selected in 9.4 or 9.5.2. For confirmation of Salmonella spp., at least the tests specified in 9.5.3.2 to
9.5.3.4 shall be performed. The tests specified in 9.5.3.5 and 9.5.3.6 can also be performed when the
results of the other confirmation tests do not give a clear identification.
9.5.3.2 TSI agar (B.8)
Streak the agar slant surface and stab the butt. Incubate at 37 °C (6.3) for 24 h ± 3 h.
Interpret the changes in the medium as follows:
a) butt
— yellow: glucose positive (glucose fermentation);
— red or unchanged: glucose negative (no fermentation of glucose);
— black: formation of hydrogen sulphide;
— bubbles or cracks: gas formation from glucose;
b) slant surface
— yellow: lactose and/or sucrose positive (lactose and/or sucrose fermentation);
— red or unchanged: lactose and sucrose negative (no fermentation of lactose or sucrose).
The majority of the typical Salmonella cultures show alkaline (red) slants and acid (yellow) butts with
gas formation (bubbles) and (in about 90 % of the cases) formation of hydrogen sulfide (blackening of
the agar) (see Table 1).
When a lactose-positive Salmonella is isolated, the TSI slant is yellow. Thus, preliminary confirmation of
Salmonella cultures shall not be based on the results of the TSI agar test only (see 9.5.3.1).
NOTE Kligler-Hajna medium gives similar results as TSI agar.
9.5.3.3 Urea agar (B.9)
Streak the agar slant surface. Incubate at 37 °C (6.3) for up to 24 h.
If the reaction is positive, urea is hydrolyzed, liberating ammonia. This changes the colour of phenol red
to rose-pink and later to deep cerise. The reaction is often apparent after 2 h to 4 h.
Typical Salmonella cultures do not hydrolyze urea so that the colour of the urea agar will remain
unchanged (see Table 1).
9.5.3.4 L-Lysine decarboxylation medium (LDC, B.10)
Inoculate just below the surface of the liquid medium. Incubate at 37 °C (6.3) for 24 h ± 3 h.
Turbidity and a purple colour after incubation indicate a positive reaction. A yellow colour indicates a
negative reaction.
8 © ISO 2017 – All rights reserved
The majority of the typical Salmonella cultures show a positive reaction in LDC (see Table 1).
9.5.3.5 Detection of β -galactosidase (B.11) (optional)
The β-galactosidase test can be used to distinguish Salmonella enterica subspecies arizonae and
diarizonae and other members of the Enterobacteriaceae (all give a positive reaction) from other
subspecies of Salmonella enterica (in general these give a negative reaction, see Table 1).
Several procedures to perform the β-galactosidase test exist. An example is given below.
Suspend a loopful of the suspected colony in a tube containing 0,25 ml of the saline solution (B.13).
Add one drop of toluene and shake the tube. Place the tube in a water bath set at 37 °C (6.6) and leave
for several minutes (approximately 5 min). Add 0,25 ml of the reagent for detection of β-galactosidase
(B.11) and mix.
Replace the tube in the water bath set at 37 °C (6.6) and leave for up to 24 h.
A yellow colour indicates a positive reaction. The reaction is often apparent after 20 min.
If prepared paper discs are used for the detection of β-galactosidase, follow the manufacturer’s
instructions.
9.5.3.6 Medium for indole reaction (B.12) (optional)
The indole test can be used when there is a need to differentiate Salmonella (generally indole negative,
see Table 1) from Escherichia coli and Citrobacter (both indole positive) as these organisms can give
typical reactions on some of the Salmonella isolation media.
Inoculate a tube containing 5 ml of the tryptone/tryptophan medium (B.12.1) with the suspected colony.
Incubate at 37 °C (6.3) for 24 h ± 3 h. After incubation, add 1 ml of the Kovacs reagent (B.12.2).
The formation of a red ring (surface layer) indicates a positive reaction. A yellow-brown ring (surface
layer) indicates a negative reaction.
10 © ISO 2017 – All rights reserved
Table 1 — Interpretation of biochemical tests
a
Test Salmonella strain
(9.5.3.2 to 9.5.3.6)
g
S. Typhi S. Paratyphi A S. Paratyphi B S. Paratyphi C S. Gallinarum biovar S. Gallinarum biovar Other strains
b b
gallinarum pullorum
c c d d c c c
Reaction %+ Reaction %+ Reaction %+ Reaction %+ Reaction %+ Reaction %+ Reaction %+
TSI acid from glucose + 100 + 100 + 100 + 100 + 100 + 100 + 100
e
TSI gas from glucose − 0 + 96,1 + 96,1 + 96,1 - 0 + 95,1 + 92
h
TSI acid from lactose − 2 − 0 − 0 − 0 − 0 − 0 − 1
TSI acid from sucrose − 0 − 0,6 − 0,6 − 0,6 − 0,6 − 0,6 − 1
TSI hydrogen sulfide
f f
+ 97 − 10 + 100 + 100 V V + 92
produced
Urea hydrolysis − 0 − 0 − 0 − 0 − 0 − 0 − 1
Lysine
+ 98 − 0 + 95 + 100 + 95 + 95 + 95
decarboxylation
β-Galactosidase
h
− 0 − 0 − − − <10 − <10 − 2
reaction
Production of indole − 0 − 1,2 − 1,2 − 1,2 − 1,2 − 1,2 − 1
a
From References [13] and [14].
b
From References [11],[13] and [14].
c
Percentages indicate that not all isolates of Salmonella serovars show the reactions marked + or −. Reactions may also vary between and within serovars.
d
Empty cells: Percentages are not known from available literature.
e
Salmonella Typhi is anaerogenic.
f
V = Variable results.
g [24]
For further distinction between Salmonella species and subspecies, see ISO/TR 6579-3.
h
Salmonella enterica subspecies arizonae and diarizonae always give a positive β-galactosidase reaction. Some strains of subspecies arizonae and diarizonae can ferment lactose.
9.5.4 Serological testing
9.5.4.1 General
The pure colonies (9.5.2) showing typical biochemical reactions for Salmonella (9.5.3) are also tested
for the presence of Salmonella O- and H-antigens (and, in areas where Salmonella Typhi is expected in
the food supply, also for Vi-antigen) by slide agglutination using polyvalent antisera (B.14). The pure
colonies are cultured on a non-selective agar medium (B.7) and tested for auto-agglutination. Strains
that are auto-agglutinable cannot be tested for the presence of Salmonella antigens. Use the antisera
according to the manufacturer’s instructions if different from the method described below to detect the
presence of Salmonella O- and H-antigens (and if necessary, also for Vi-antigen).
The following tests (9.5.4.2 to 9.5.4.5) are the minimum required for serological testing of Salmonella spp.
[24]
Further guidance on serological confirmation and on serotyping is given in ISO/TR 6579-3 .
9.5.4.2 Elimination of auto-agglutinable strains
Place one drop of saline solution (B.13) on a clean glass slide. Using a loop, disperse part of the colony to
be tested in the saline to obtain a homogeneous and turbid suspension.
Rock the slide gently for 5 s to 60 s (depending on the manufacturer’s instructions). Observe the
suspension, preferably against a dark background. If the bacteria have formed granules in the suspension,
this indicates auto-agglutination and serological confirmation will become complicated. Additional
[24]
information on the treatment of auto-agglutinating strains can be found in ISO/TR 6579-3 ).
9.5.4.3 Examination for O-antigens
Using one non-auto-agglutinating pure colony, proceed according to 9.5.4.2 using one drop of polyvalent
anti-O sera (B.14) in place of the saline solution.
If agglutination occurs, this is considered a positive reaction.
9.5.4.4 Examination for Vi-antigens (optional)
Using one non-auto-agglutinating pure colony, proceed according to 9.5.4.2 using one drop of anti-Vi
sera (B.14) in place of the saline solution.
If agglutination occurs, this is considered a positive reaction.
9.5.4.5 Examination for H-antigens
Using one non-auto-agglutinating pure colony, proceed according to 9.5.4.2 using one drop of polyvalent
anti-H sera (B.14) in place of the saline solution.
If agglutination occurs, this is considered a positive reaction.
9.5.5 Interpretation of biochemical and serological reactions
Table 2 gives the interpretation of the confirmatory tests (9.5.3 and 9.5.4) carried out on the colonies
used (9.5.2).
Table 2 — Interpretation of confirmatory tests
Biochemical reactions Auto-agglutination Serological reactions Interpretation
Typical No O- and H-antigens Strains considered to be
positive Salmonella
(and Vi positive if tested)
Typical No O- and/or H-antigens Presumptive Salmonella
negative
Typical Yes Not tested because of
auto-agglutination
(see 9.5.4.2)
No typical reactions — — Not considered to be
Salmonella
9.5.6 Serotyping
Strains that are confirmed as Salmonella spp. (Table 2) can be further typed to serovar level. Guidance
[24]
fo
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 6579-1
Première édition
2017-02
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche, le
dénombrement et le sérotypage des
Salmonella —
Partie 1:
Recherche des Salmonella spp.
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
detection, enumeration and serotyping of Salmonella —
Part 1: Detection of Salmonella spp.
Numéro de référence
©
ISO 2017
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ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vii
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Préenrichissement en milieu non sélectif liquide . 2
4.3 Enrichissement en milieux sélectifs . 2
4.4 Isolement sur des milieux solides sélectifs . 3
4.5 Confirmation . 3
5 Milieux de culture, réactifs et sérums . 3
6 Matériels et consommables . 3
7 Échantillonnage . 4
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
9 Mode opératoire (voir les schémas en Annexe A) . 4
9.1 Prise d’essai et suspension mère. 4
9.2 Préenrichissement non sélectif . 5
9.3 Enrichissement sélectif . 5
9.3.1 Généralités . 5
9.3.2 Mode opératoire pour les échantillons d’aliments, d’aliments pour
animaux et les échantillons environnementaux au stade de la
production d’aliments . 5
9.3.3 Mode opératoire pour les échantillons au stade de la production primaire . 6
9.4 Isolement . 6
9.4.1 Généralités . 6
9.4.2 Mode opératoire pour les échantillons d’aliments, d’aliments pour
animaux et les échantillons environnementaux au stade de la de
production d’aliments . 6
9.4.3 Mode opératoire pour les échantillons au stade de la production primaire . 7
9.5 Confirmation . 7
9.5.1 Généralités . 7
9.5.2 Choix des colonies pour la confirmation . 8
9.5.3 Essais biochimiques . 8
9.5.4 Essais de sérotypage . .12
9.5.5 Interprétation des réactions biochimiques et sérologiques .12
9.5.6 Sérotypage .13
10 Expression des résultats.13
11 Caractéristiques de performance de la méthode .13
11.1 Études interlaboratoires .13
11.2 Sensibilité .13
11.3 Spécificité .13
11.4 LOD .
50 14
12 Rapport d’essai .14
Annexe A (normative) Schémas des modes opératoires .15
Annexe B (normative) Milieux de culture et réactifs .18
Annexe C (informative) Études de validation des méthodes et caractéristiques de performance .32
Annexe D (normative) Recherche des sérovars Typhi et Paratyphi de Salmonella enterica
sous-espèce enterica .38
Annexe E (informative) Exemples de milieux d’isolement sélectifs .43
Bibliographie .48
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation
de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation
mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien
suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html
Le présent document a été élaborée par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits
alimentaires - Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec
le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à
l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette première édition de l’ISO 6579-1 annule et remplace l’ISO 6579:2002 et l’ISO 6785:2001, qui
ont fait l’objet d’une révision technique. Elle intègre également l’ISO 6579-1:2002/Amd 1:2007 et
l’ISO 6579-1:2002/Cor 1:2004.
Par rapport à l’ISO 6579:2002, les principales modifications sont les suivantes.
— L’ISO 6785 a été intégrée dans le présent document;
— Les échantillons au stade de la production primaire ont été ajoutés dans le domaine d’application.
— La recherche de Salmonella Typhi et de Salmonella Paratyphi est décrite en Annexe D.
— Les descriptions des préparations des suspensions mères ont été supprimées et remplacées, dans la
mesure du possible, par des renvois aux parties appropriées de l’ISO 6887.
— La plage de températures pour l’incubation de milieux non sélectifs a été étendue de (37 ± 1) °C à la
plage comprise entre 34 °C et 38 °C, sans tolérance supplémentaire.
— En ce qui concerne l’enrichissement sélectif, la norme offre le choix entre l’utilisation du bouillon
ou de la gélose semi-solide du milieu de Rappaport Vassiliadis (RVS ou MSRV) pour les échantillons
d’aliments, les échantillons d’aliments pour animaux et les échantillons environnementaux prélevés
dans les secteurs de la production et de la manutention des aliments.
— L’ensemencement du milieu d’isolement est devenu moins prescriptif; l’objectif est d’obtenir des
colonies bien isolées après l’incubation.
— Pour la confirmation, il est acceptable d’effectuer les essais uniquement sur une colonie
caractéristique (au lieu d’une colonie caractéristique de chaque combinaison de milieux). Si les
essais de cet isolat sont négatifs pour Salmonella, quatre autres isolats caractéristiques issus des
différentes combinaisons de milieux doivent être soumis à essai.
— Il est permis d’effectuer la confirmation biochimique directement sur une colonie caractéristique
bien isolée, sur le milieu d’isolement sélectif. Le contrôle de la pureté sur le milieu gélosé non sélectif
peut être effectué en parallèle.
— Deux essais de confirmation sont devenus facultatifs (essai de la ß-galactosidase et réaction de
l’indole) et un essai de confirmation a été supprimé (réaction de Voges-Proskauer).
— Le présent document décrit la confirmation sérologique (au niveau du sérogroupe). Pour les lignes
directrices relatives au sérotypage (au niveau du sérovar), se référer à l’ISO/TR 6579-3.
— Le Tableau 1 a été amélioré.
— Des essais de performance pour l’assurance de la qualité des milieux de culture ont été ajoutés à
l’Annexe B.
— Les caractéristiques de performance du milieu MSRV ont été ajoutées à l’Annexe C.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 6579 peut être consultée sur le site web de l’ISO.
vi © ISO 2017 – Tous droits réservés
Introduction
Le présent document décrit une méthode horizontale de recherche des Salmonella spp. dans les
produits alimentaires (y compris le lait et les produits laitiers, initialement décrits dans l’ISO 6785),
les aliments pour animaux, les matières fécales des animaux et des échantillons environnementaux au
stade de la production primaire (ces deux derniers types d’échantillon étaient initialement décrits dans
l’ISO 6579-1:2002/Amd 1:2007).
Les principales modifications énumérées dans l’avant-propos, introduites dans le présent document
[37]
par rapport à l’ISO 6579:2002, sont considérées comme étant mineures (voir ISO 17468) .
[3]
Un mode opératoire pour le dénombrement des Salmonella spp. est décrit dans l’ISO/TS 6579-2.
[24]
Des lignes directrices pour le sérotypage des Salmonella spp. sont décrites dans l’ISO/TR 6579-3.
NORME INTERNATIONALE ISO 6579-1:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche, le dénombrement et le
sérotypage des Salmonella —
Partie 1:
Recherche des Salmonella spp.
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que
les essais de détection des Salmonella ne soient réalisés que dans des laboratoires équipés à cet
effet, sous le contrôle d’un microbiologiste expérimenté, et qu’un grand soin soit pris lors de
l’élimination de tous les éléments incubés. Il convient que les personnes qui utilisent le présent
document soient familières avec les pratiques courantes de laboratoire. Le présent document
n’a pas pour but de traiter tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son
utilisation. Il est de la responsabilité de l’utilisateur d’établir les pratiques de sécurité et de
santé appropriées et d’assurer la conformité aux réglementations nationales.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode horizontale de recherche des Salmonella. Il s’applique aux:
— produits destinés à la consommation humaine et à l’alimentation animale.
— échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manutention de denrées
alimentaires.
— échantillons au stade de la production primaire, tels que des matières fécales, de la poussière ou des
prélèvements de surface.
Cette méthode horizontale vise à rechercher la plupart des sérovars de Salmonella. Des étapes de
culture supplémentaires peuvent être nécessaires pour la recherche de certains sérovars spécifiques.
Pour Salmonella Typhi et Salmonella Paratyphi, le mode opératoire est décrit en Annexe D.
Le milieu d’enrichissement sélectif MSRV, gélose de Rappaport-Vassiliadis semi-solide modifiée,
est conçu pour la recherche des Salmonella mobiles et n’est pas adapté à la détection des Salmonella
immobiles.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentairePréparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133:2014, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation,
production, stockage et essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp
3.1
Salmonella
microorganisme formant des colonies caractéristique ou moins caractéristiques sur des milieux
sélectifs solides et possédant les caractéristiques biochimiques et sérologiques décrites lorsque des
essais de confirmation sont réalisés conformément au présent document
3.2
recherche des Salmonella
détermination des Salmonella (3.1), dans une quantité déterminée de produit ou de surface ou d’objet
(par exemple, pédi-chiffonnettes), lorsque les essais sont réalisés conformément au présent document
4 Principe
4.1 Généralités
La recherche de Salmonella nécessite quatre phases successives, comme indiqué dans l’Annexe A.
NOTE Les Salmonella peuvent être présentes en petit nombre et sont souvent accompagnées d’un nombre
beaucoup plus grand d’autres microorganismes appartenant à la famille des Enterobacteriaceæ ou à des bactéries
d’autres familles. Un préenrichissement est nécessaire pour permettre la détection des Salmonella en nombre
restreint ou des Salmonella stressées.
4.2 Préenrichissement en milieu non sélectif liquide
Ensemencement de la prise d’essai dans de l’eau peptonée tamponnée à température ambiante, puis
incubation entre 34 °C et 38 °C pendant 18 h.
En cas de grandes quantités (par exemple, 1 l ou plus), il est recommandé de chauffer l’eau peptonée
tamponnée entre 34 °C et 38 °C avant son mélange avec la prise d’essai.
4.3 Enrichissement en milieux sélectifs
Ensemencement du bouillon Rappaport-Vassiliadis avec soja (bouillon RVS) ou de la gélose Rappaport-
Vassiliadis semi-solide modifiée (MSRV) et d’un bouillon Müller-Kauffmann tétrathionate-novobiocine
(MKTTn) avec la culture obtenue en 4.2.
Incubation du bouillon RVS ou de la gélose MSRV à 41,5 °C pendant 24 h, et du bouillon MKTTn à 37 °C
pendant 24 h.
Pour certains produits, il peut être nécessaire d’incuber le ou les milieux d’enrichissement sélectifs
pendant 24 h supplémentaires.
NOTE La gélose MSRV est conçu pour la recherche des Salmonella mobiles et n’est pas adapté à la détection
des Salmonella immobiles.
2 © ISO 2017 – Tous droits réservés
4.4 Isolement sur des milieux solides sélectifs
À partir des cultures obtenues en 4.3, ensemencement des deux milieux sélectifs solides suivants:
— gélose xylose-lysine-désoxycholate (gélose XLD);
— un autre milieu sélectif solide complémentaire de la gélose XLD (voir les exemples donnés dans
l’Annexe E).
Incubation de la gélose XLD à 37 °C puis examen après 24 h. Incubation du second milieu sélectif selon
les recommandations du fabricant.
4.5 Confirmation
Repiquage des colonies présumées de Salmonella et confirmation au moyen des essais biochimiques et
sérologiques appropriés.
5 Milieux de culture, réactifs et sérums
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l’ISO 7218 et l’ISO 11133.
La composition des milieux de culture et des réactifs, ainsi que leur préparation, sont décrites en
Annexe B.
6 Matériels et consommables
Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, si les spécifications
sont similaires.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave)
Comme spécifié dans l’ISO 7218.
6.2 Enceinte de séchage, ou étuve, ventilée par convection, réglable entre 25 °C et 50 °C.
6.3 Incubateur(s), réglables entre 34 °C et 38 °C et à (37 ± 1) °C.
6.4 Incubateur, réglable à (41,5 ± 1) °C, ou bain d’eau, réglable à (41,5 ± 1) °C.
6.5 Bain d’eau, réglable de 47 °C à 50 °C.
6.6 Bain d’eau, réglable à (37 ± 1) °C.
6.7 Bain d’eau, réglable à (45 ± 1) °C.
La dose infectante de Salmonella étant faible, il est recommandé d’utiliser un bain d’eau (6.4 à 6.7)
contenant un agent antibactérien.
6.8 Réfrigérateur, réglable à (5 ± 3) °C
6.9 Congélateur, réglable à (−20 ± 5) °C
6.10 Anses bouclées stériles, d’environ 3 mm de diamètre (volume de 10 µl) et d’un volume de 1 µl, et
fil droit (ose).
6.11 pH-mètre, ayant une exactitude d’étalonnage de ± 0,1 unité de pH de 20 °C à 25 °C.
6.12 Tubes ou flacons stériles munis de bouchons et de capacité appropriée.
6.13 Pipettes graduées ou pipettes automatiques stériles, de capacités nominales 25 ml, 10 ml, 1 ml
et 0,1 ml.
6.14 Boîtes de Petri stériles, de diamètre d’environ 90 mm et (facultatif) de grandes dimensions
(environ 140 mm de diamètre).
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document (voir la Norme
internationale spécifique au produit concerné). S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique, il
est recommandé que les parties concernées se mettent d’accord à ce sujet.
[26]
Une méthode d’échantillonnage recommandée est donnée dans l’ISO/TS 17728 pour les denrées
[27]
alimentaires et les aliments pour animaux, dans l’ISO 707 pour le lait et les produits laitiers, dans
[28] [29]
l’ISO 13307 pour l’échantillonnage au stade de la production primaire, dans l’ISO 17604 pour
[25]
l’échantillonnage des carcasses et dans l’ISO 18593 pour l’échantillonnage des surfaces.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif, non endommagé ou modifié lors
du transport et du stockage.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai à partir de l’échantillon de laboratoire conformément à la Norme
internationale spécifique du produit concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique, il
est recommandé que les parties concernées se mettent d’accord à ce sujet.
9 Mode opératoire (voir les schémas en Annexe A)
9.1 Prise d’essai et suspension mère
Pour la préparation de la suspension mère, dans le cas général utiliser comme diluant le milieu de
préenrichissement spécifié en B.2 (eau peptonée tamponnée). Préchauffer l’eau peptonée tamponnée à
température ambiante avant utilisation.
En règle générale, une quantité de prise d’essai (masse ou volume) est ajoutée à une quantité d’eau
ème
peptonée tamponnée de manière à obtenir une dilution au 1/10 . Il s’agit généralement de l’ajout
d’une quantité de 25 g de prise d’essai à 225 ml d’eau peptonée tamponnée. Néanmoins, pour certains
types échantillons (par exemple, pour les pédi-chiffonnettes ou la poussière), il peut être nécessaire
d’utiliser un rapport de dilution différent.
Pour la préparation de produits spécifiques, suivre les modes opératoires spécifiés dans l’ISO 6887
(toutes les parties).
Le présent document a été validé pour des prises d’essai de 25 g. L’utilisation d’une prise d’essai plus
petite est autorisée sans validation ou vérification supplémentaire, dans la mesure où le rapport entre
le bouillon de préenrichissement et la prise d’essai demeure le même. Il est admis d’utiliser une prise
d’essai plus importante que celle validée à l’origine si une étude de validation/vérification a démontré
l’absence d’effets négatifs sur la détection de Salmonella spp.
NOTE 1 Une validation peut être effectuée conformément aux parties appropriées de l’ISO 16140. La
vérification du regroupement d’échantillons peut être effectuée conformément au protocole décrit dans
[38]
l’ISO 6887-1:2017, Annexe D.
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En cas de grandes quantités (par exemple, 1 l ou plus), il est recommandé de chauffer l’eau peptonée
tamponnée entre 34 °C et 38 °C avant son mélange avec la prise d’essai.
NOTE 2 Lorsqu’il faut examiner plusieurs prises d’essai de 25 g provenant d’un lot déterminé de produit
alimentaire, et lorsqu’on dispose de preuves indiquant que la combinaison de prises d’essai ne modifie pas les
résultats en ce qui concerne ce produit alimentaire en particulier, les prises d’essai peuvent être regroupées.
Des informations supplémentaires sur le regroupement d’échantillons, ainsi qu’un mode opératoire permettant
[38]
d’analyser l’influence du regroupement sur la sensibilité de la méthode figurent dans l’ISO 6887-1.
9.2 Préenrichissement non sélectif
Incuber la suspension mère (9.1) entre 34 °C et 38 °C (6.3) pendant 18 ± 2 h.
Après incubation, il est permis de conserver la culture de préenrichissement à 5 °C (6.8) pendant 72 h
au maximum (voir les Références [30] à [34]).
9.3 Enrichissement sélectif
9.3.1 Généralités
Laisser les milieux d’enrichissement sélectifs, le bouillon RVS ou la gélose MSRV (B.3 ou B.4), et de
bouillon MKTTn (B.5), se réchauffer à température ambiante s’ils étaient conservés à une température
inférieure.
Minimiser le transfert de particules entre le milieu de préenrichissement et les milieux d’enrichissement
sélectifs.
Après l’incubation, il est permis de conserver l’enrichissement sélectif à 5 °C (6.8) pendant 72 h au
maximum (voir les Références [30] à [34]).
NOTE La gélose MSRV est conçu pour la recherche des Salmonella mobiles et n’est pas adapté à la détection
des Salmonella immobiles.
9.3.2 Mode opératoire pour les échantillons d’aliments, d’aliments pour animaux et les
échantillons environnementaux au stade de la production d’aliments
Transférer 0,1 ml de la culture obtenue en 9.2 dans un tube contenant 10 ml du bouillon RVS (B.3) ou
sur la surface d’une boîte de gélose MSRV (B.4). Ensemencer la gélose MSRV par dépôt de 1 à 3 gouttes
réparties de manière équidistante sur la surface du milieu.
Transférer 1 ml de la culture obtenue en 9.2 dans un tube contenant 10 ml de bouillon MKTTn (B.5).
Incuber le bouillon RVS ensemencé à 41,5 °C (6.4) pendant 24 h ± 3 h.
Incuber les boîtes de gélose MRVS ensemencées à 41,5 °C (6.4) pendant 24 h ± 3 h. Ne pas retourner
les boîtes.
Incuber le bouillon MKTTn ensemencé à 37 °C (6.3) pendant 24 h ± 3 h.
Les boîtes MSRV caractéristiques présentent une zone trouble blanche grisâtre s’étendant à partir de la
goutte ensemencée.
Dans les produits laitiers secs et le fromage, les Salmonella peuvent être stressées avec des dommages
sublétaux. Incuber les milieux d’enrichissement sélectifs de ces produits pendant 24 h ± 3 h
supplémentaires (voir la Référence [35]).
Cette durée d’incubation supplémentaire peut s’avérer bénéfique pour certains autres produits, par
exemple lors de l’étude d’échantillons liés à une toxi-infection.
9.3.3 Mode opératoire pour les échantillons au stade de la production primaire
Ensemencer les boîtes de gélose MSRV (B.4) avec 0,1 ml de la culture du préenrichissement (9.2) par
dépôt de 1 à 3 gouttes réparties de manière équidistante sur la surface du milieu.
Incuber les boîtes de MRVS ensemencées à 41,5 °C (6.4) pendant 24 h ± 3 h.
Ne pas retourner les boîtes.
Les boîtes MSRV caractéristiques présentent une zone trouble blanche grisâtre s’étendant à partir de la
goutte ensemencée.
Si les boîtes s’avèrent négatives après 24 h, incuber pendant 24 h ± 3 h supplémentaires.
NOTE Il est possible d’augmenter la sensibilité en appliquant un second mode opératoire d’enrichissement
[36]
sélectif, par exemple le bouillon MKTTn incubé à 41,5 °C pendant 24 h .
9.4 Isolement
9.4.1 Généralités
À partir des cultures obtenues dans les milieux d’enrichissement sélectifs (9.3), ensemencer deux
milieux gélosés d’isolement sélectifs. Le premier milieu d’isolement est une gélose xylose-lysine-
désoxycholate (XLD). Le second milieu d’isolement est choisi par le laboratoire d’essais.
Choisir un second milieu d’isolement sélectif complémentaire à la gélose XLD, et basé sur des
caractéristiques diagnostiques différentes de celles de la gélose XLD, de façon à faciliter la détection,
par exemple, des Salmonella lactose positives ou H S négatives. Des exemples de milieux d’isolement
sont donnés en Annexe E.
Laisser les boîtes de gélose XLD (B.6) et le second milieu d’isolement sélectif revenir à température
ambiante, si elles étaient stockées à une température inférieure. Si nécessaire, sécher la surface des
boîtes avant utilisation (voir l’ISO 11133).
9.4.2 Mode opératoire pour les échantillons d’aliments, d’aliments pour animaux et les
échantillons environnementaux au stade de la de production d’aliments
À partir de la culture obtenue dans le bouillon RVS (9.3.2), ensemencer à l’aide d’une anse de 10 µl
(6.10) la surface d’une boîte de gélose XLD (B.6) de façon à permettre le développement de colonies bien
isolées. Procéder de la même manière pour le second milieu d’isolement sélectif.
À partir de la culture positive obtenue sur la gélose MSRV (9.3.2), localiser le front de migration de la
culture opaque le plus éloigné des points d’ensemencement et piquer une anse de 1 µl (6.10) juste en
bordure interne de la zone opaque. Retirer l’anse en veillant à ne pas entraîner de gros fragments de
la gélose MSRV. Ensemencer la surface d’une boîte de gélose XLD (B.6) afin d’obtenir des colonies bien
isolées. Procéder de la même manière pour le second milieu d’isolement sélectif.
À partir de la culture obtenue dans le bouillon MKTTn (9.3.2), ensemencer à l’aide d’une anse de 10 µl
(6.10) la surface d’une boîte de gélose XLD (B.6) de façon à permettre le développement de colonies bien
isolées. Procéder de la même manière pour le second milieu d’isolement sélectif.
NOTE 1 Pour obtenir des colonies bien isolées, il peut être nécessaire d’utiliser des boîtes de Petri de grandes
dimensions (diamètre d’environ 140 mm) contenant les milieux d’isolement ou deux boîtes de taille normale
(diamètre d’environ 90 mm).
Incuber les boîtes de géloses XLD surface de la gélose vers le bas à 37 °C (6.3) pendant 24 h ± 3 h.
Incuber le second milieu d’isolement sélectif selon les instructions du fabricant.
Si les milieux d’enrichissement sélectif ont été incubés pendant 24 h supplémentaires, suivre le même
mode opératoire d’isolement que celui décrit ci-dessus.
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Les colonies caractéristiques de Salmonella cultivées sur gélose XLD ont un centre noir et sont entourées
d’un halo clair rouge légèrement transparent dû à un changement de l’indicateur du milieu.
NOTE 2 Les Salmonella variant H S négatif cultivées sur gélose XLD sont roses avec un centre rose foncé.
Les Salmonella lactose positives cultivées sur gélose XLD sont jaunes sans noircissement. La fréquence de ces
phénotypes est résumée dans le Tableau 1.
Après la durée d’incubation appropriée du second milieu d’isolement sélectif, examiner la boîte afin de
rechercher la présence de colonies présumées être des Salmonella en raison de leurs caractéristiques.
9.4.3 Mode opératoire pour les échantillons au stade de la production primaire
À partir de la culture positive obtenue sur la gélose MSRV (9.3.3), localiser le front de migration de la
culture opaque le plus éloigné des points d’ensemencement et piquer une anse de 1 µl (6.10) juste en
bordure interne de la zone opaque. Retirer l’anse en veillant à ne pas entraîner de gros fragments de la
gélose MSRV. Ensemencer la surface d’une boîte de gélose XLD afin d’obtenir des colonies bien isolées.
Procéder de la même manière pour le second milieu d’isolement sélectif.
Incuber les boîtes de géloses XLD surface de la gélose vers le bas à 37 °C (6.3) pendant 24 h ± 3 h.
Incuber le second milieu d’isolement sélectif selon les instructions du fabricant.
Réincuber les boîtes de MSRV négatif dans l’incubateur à 41,5 °C pendant 24 h ± 3 h supplémentaires.
Appliquer le mode opératoire d’isolement en milieux sélectifs si, après 48 h d’incubation, ces MSRV en
boîtes deviennent positifs.
Sur gélose XLD, les colonies caractéristiques de Salmonella ont un centre noir entouré d’une zone
légèrement transparente de couleur rougeâtre, due à un changement de couleur de l’indicateur.
NOTE Les Salmonella variant H S négatif cultivées sur gélose XLD sont roses avec un centre rose foncé.
Les Salmonella lactose positives cultivées sur gélose XLD sont jaunes sans noircissement. La fréquence de ces
phénotypes est résumée dans le Tableau 1.
Après la durée d’incubation appropriée du second milieu d’isolement sélectif, examiner la boîte afin de
rechercher la présence de colonies présumées être des Salmonella en raison de leurs caractéristiques.
9.5 Confirmation
9.5.1 Généralités
La combinaison des résultats des essais biochimiques et sérologiques indique si un isolat appartient au
genre Salmonella. Un sérotypage complet est nécessaire pour caractériser les souches de Salmonella.
[24]
Des lignes directrices pour le sérotypage sont données dans l’ISO/TR 6579-3 .
Pour certains milieux de confirmation tel que décrit en 9.5.3 ainsi qu’en B.8 à B.12, des compositions
alternatives existantes (commerciales) peuvent également être utilisées pour la confirmation
biochimique des Salmonella. Ces compositions alternatives sont autorisées dans la mesure où leurs
performances pour la confirmation biochimique des Salmonella ont été vérifiées avant utilisation.
Pour établir une distinction nette entre les réactions biochimiques positives et négatives, il est utile de
vérifier pour chaque essai biochimique les réactions des milieux avec des souches de contrôle positives
et négatives bien caractérisées.
NOTE 1 La détection des colonies de Salmonella est en grande partie une question d’expérience, et leurs
aspects peuvent quelquefois varier, non seulement d’un sérovar à un autre, mais également d’un lot de milieu de
culture à un autre.
Il est possible d’utiliser des galeries d’identification miniaturisées pour l’examen biochimique des
Salmonella, si leur fiabilité est démontrée (voir l’ISO 7218).
NOTE 2 D’autres modes opératoires peuvent être utilisés pour confirmer un isolat en tant que Salmonella spp.
sous réserve de vérifier que le mode opératoire alternatif est approprié (voir l’ISO 7218).
9.5.2 Choix des colonies pour la confirmation
Marquer les colonies caractéristiques sur chaque boîte (9.4). Choisir au moins une colonie caractéristique
ou typique pour le repiquage et la confirmation. Si cette colonie est négative, repiquer jusqu’à quatre
autres colonies caractéristiques, en veillant à choisir des colonies caractéristiques provenant des
cultures issues des différentes combinaisons des milieux d’enrichissement sélectifs/ d’isolement.
Isoler les colonies sélectionnées sur la surface de la gélose non sélective coulée en boîte (B.7)
préalablement séchées, de façon à permettre le développement de colonies bien isolées. Incuber les
boîtes ensemencées entre 34 °C et 38 °C (6.3) pendant 24 h ± 3 h.
En variante, si des colonies (d’une culture pure) bien isolées sont disponibles sur les milieux
d’isolement sélectifs (9.4), la confirmation biochimique peut être réalisée directement sur une colonie
caractéristique, bien isolée, du milieu d’isolement sélectif. Dans ce cas, la vérification de la pureté de la
colonie prélevée sur la gélose sélective, par isolement de la culture sur le milieu gélosé non sélectif, est
réalisée en parallèle aux essais biochimiques.
Utiliser des cultures pures pour les confirmations biochimiques et sérologiques.
NOTE À des fins épidémiologiques ou pour les analyses lors de toxi-infections, il peut être bénéfique de
confirmer un nombre additionnel de colonies, par exemple cinq colonies typiques ou caractéristiques de chaque
combinaison de milieux d’enrichissement sélectifs/ d’isolement.
9.5.3 Essais biochimiques
9.5.3.1 Généralités
Ensemencer les milieux de confirmation biochimiques avec chacune des cultures obtenues à partir des
colonies sélectionnées en 9.4 ou 9.5.2. Pour la confirmation de Salmonella spp., les essais décrits dans les
paragraphes 9.5.3.2 à 9.5.3.4 doivent au minimum être effectués. Les essais décrits en 9.5.3.5 et 9.5.3.6
peuvent également être effectués lorsque les résultats des autres essais de confirmation ne donnent
pas lieu à une confirmation nette.
9.5.3.2 Gélose TSI (B.8)
Ensemencer en stries la pente du milieu et le culot par piqûre. Incuber à 37 °C (6.3) pendant 24 h ± 3 h.
Interpréter les changements dans le milieu de la façon suivante:
a) culot
— jaune: glucose positif (fermentation du glucose);
— rouge ou inchangé: glucose négatif (pas de fermentation du glucose);
— noir: formation de sulfure d’hydrogène;
— bulles ou fissures: formation de gaz à partir du glucose;
b) pente
— jaune: lactose et/ou saccharose positifs (fermentation du lactose et/ou du saccharose);
— rouge ou inchangé: lactose et/ou saccharose négatifs (pas de fermentation du lactose et/ou du
saccharose).
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La majorité des cultures caractéristiques de Salmonella correspondent à une pente alcaline (rouge)
et un culot acide (jaune) avec formation de gaz (bulles), et (dans environ 90 % des cas) formation de
sulfure d’hydrogène (noircissement de la gélose) (voir le Tableau 1).
Lorsqu’une Salmonella lactose positive est isolée, la pente de la gélose TSI est jaune. En conséquence,
une première étape de confirmation de cultures de Salmonella ne doit pas être fondée uniquement sur
les résultats obtenus à partir de la gélose TSI (voir 9.5.3.1).
NOTE Le milieu Kligler-Hajna donne des résultats similaires à la gélose TSI.
9.5.3.3 Gélose à l’urée (B.9)
Ensemencer en stries la pente de la gélose. Incuber à 37 °C (6.3) pendant une durée pouvant aller
jusqu’à 24 h.
En cas de réaction positive, l’urée est hydrolysée et produit un dégagement d’ammoniac, faisant virer le
rouge de phénol au rose, puis au rouge foncé. La réaction est souvent visible au bout de 2 h à 4 h.
Les cultures caractéristiques de Salmonella n’hydrolysent pas l’urée, de sorte que la couleur de la gélose
à l’urée reste inchangée (voir le Tableau 1).
9.5.3.4 Milieu pour décarboxylation de la L-Lysine (LDC, B.10)
Ensemencer le milieu liquide juste au-dessous de la surface. Incuber à 37 °C (6.3) pendant 24 h ± 3 h.
Une turbidité et une couleur violette après incubation indiquent une réaction positive. Une couleur
jaune indique une réaction négative.
La majorité des cultures caractéristiques de Salmonella montrent une réaction LDC positive (voir le
Tableau 1).
9.5.3.5 Recherche de la β -galactosidase (B.11) (facultative)
L’essai de la β-galactosidase peut être utilisé pour faire la distinction entre les sous-espèces arizonae
et diarizonae de Salmonella enterica et les autres membres des Enterobacteriaceae (qui donnent tous
une réaction positive) et les autres sous-espèces de Salmonella enterica (qui donnent généralement une
réaction négative; voir le Tableau 1).
Il existe plusieurs modes opératoires pour effectuer l’essai de la β-galactosidase, dont un exemple est
indiqué ci-dessous.
Mettre en suspension une anse de la colonie caractéristique dans un tube contenant 0,25 ml de la
solution saline (B.13).
Ajouter une goutte de toluène et agiter le tube. Placer le tube dans le bain d’eau réglé à 37 °C (6.6) et l’y
laisser séjourner quelques minutes (environ 5 min). Ajouter 0,25 ml du réactif pour la recherche de la
β-galactosidase (B.11) et mélanger.
Replacer le tube dans le bain d’eau réglé à 37 °C (6.6) et l’y laisser séjourner jusqu’à 24 h.
Une couleur jaune indique une réaction positive. La réaction est souvent visible au bout de 20 min.
Dans le cas d’utilisation de disques en papier prêts à l’emploi pour la recherche de la β-galactosidase,
suivre les instructions du fabricant.
9.5.3.6 Milieu pour la recherche de l’indole (B.12) (facultatif)
La réaction de l’indole peut être utilisée lorsqu’il est nécessaire de différencier les Salmonella
(généralement indole négatives, voir le Tableau 1). d’Escherichia coli et de Citrobacter (toutes deux indole
positives). Ces deux derniers organismes peuvent en effet donner des réactions typiques des Salmonella
sur certains milieux d’isolement spécifiques.
Ensemencer un tube contenant 5 ml du milieu tryptone/tryptophane (B.12.1) avec la colonie
caractéristique.
Incuber à 37 °C (6.3) pendant 24 h ± 3 h. Après incubation, ajouter 1 ml du réactif de Kovacs (B.12.2).
La formation d’un anneau rouge en surface indique une réaction positive. Un anneau jaune-brun en
surface indique une réaction négative.
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Tablea
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