ISO 16140-2:2016/Amd 1:2024
(Amendment)Microbiology of the food chain — Method validation — Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods against a reference method — Amendment 1: Revision of qualitative method comparison study data evaluation, relative level of detection calculations in the interlaboratory study, calculation and interpretation of the relative trueness study, and inclusion of a commercial sterility testing protocol for specific products
Microbiology of the food chain — Method validation — Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods against a reference method — Amendment 1: Revision of qualitative method comparison study data evaluation, relative level of detection calculations in the interlaboratory study, calculation and interpretation of the relative trueness study, and inclusion of a commercial sterility testing protocol for specific products
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 2: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) par rapport à une méthode de référence — Amendement 1: Révision de l’évaluation des données des études de comparaison de méthodes qualitatives, des calculs du niveau de détection de l'étude interlaboratoires et de l’interprétation de l’étude de justesse relative, et ajout d’un protocole pour la détermination de la stérilité commerciale pour des produits spécifiques
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 16140-2
First edition
Microbiology of the food chain —
2016-06-15
Method validation —
AMENDMENT 1
Part 2:
2024-09
Protocol for the validation of
alternative (proprietary) methods
against a reference method
AMENDMENT 1: Revision of
qualitative method comparison
study data evaluation, relative level
of detection calculations in the
interlaboratory study, calculation and
interpretation of the relative trueness
study, and inclusion of a commercial
sterility testing protocol for specific
products
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des
méthodes —
Partie 2: Protocole pour la validation de méthodes alternatives
(commerciales) par rapport à une méthode de référence
AMENDEMENT 1: Révision de l’évaluation des données des études
de comparaison de méthodes qualitatives, des calculs du niveau
de détection de l'étude interlaboratoires et de l’interprétation
de l’étude de justesse relative, et ajout d’un protocole pour la
détermination de la stérilité commerciale pour des produits
spécifiques
Reference number
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(en) © ISO 2024
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(en)
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Published in Switzerland
ii
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(en)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
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The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
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of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
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constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee
CEN/TC 463, Microbiology of the food chain, in accordance with the Agreement on technical cooperation
between ISO and CEN (Vienna Agreement).
A list of all parts in the ISO 16140 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iii
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(en)
Microbiology of the food chain — Method validation —
Part 2:
Protocol for the validation of alternative (proprietary)
methods against a reference method
AMENDMENT 1: Revision of qualitative method comparison study
data evaluation, relative level of detection calculations in the
interlaboratory study, calculation and interpretation of the relative
trueness study, and inclusion of a commercial sterility testing
protocol for specific products
Introduction
Replace the text with the following:
Introduction
0.1 The ISO 16140 series
The ISO 16140 series has been expanded in response to the need for various ways to validate or verify test
methods. It is the successor to ISO 16140:2003. The ISO 16140 series consists of six parts with the general
title, Microbiology of the food chain — Method validation:
— Part 1: Vocabulary;
— Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods against a reference method;
— Part 3: Protocol for the verification of reference methods and validated alternative methods in a single
laboratory;
— Part 4: Protocol for method validation in a single laboratory;
— Part 5: Protocol for factorial interlaboratory validation for non-proprietary methods;
— Part 6: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods for microbiological confirmation and
typing procedures.
ISO 17468 is a closely linked International Standard, which establishes technical rules for the development
and validation of standardized methods.
In general, two stages are needed before a method can be used in a laboratory:
— The first stage is the validation of the method. Validation is conducted using a study in a single laboratory
followed by an interlaboratory study (see this document, ISO 16140-5 and ISO 16140-6). In the case when
a method is validated within one laboratory (see ISO 16140-4), no interlaboratory study is conducted.
— The second stage is method verification, where a laboratory demonstrates that it can satisfactorily
perform a validated method. This is described in ISO 16140-3. Verification is only applicable to methods
that have been validated using an interlaboratory study.
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(en)
In general, two types of methods are distinguished: reference methods and alternative methods.
A reference method is defined in ISO 16140-1:2016, 2.59, as an “internationally recognized and widely
accepted method”. The note to entry clarifies that “these are ISO standards and standards jointly published
by ISO and CEN or other regional/national standards of equivalent standing”.
In the ISO 16140 series, reference methods include standardized reference (ISO and CEN) methods as
defined in ISO 17468:2023, 3.7, as a “reference method described in a standard”.
An alternative method (method submitted for validation) is defined in ISO 16140-1:2016, 2.4, as a “method
of analysis that detects or quantifies, for a given category of products, the same analyte as is detected or
quantified using the corresponding reference method”. The note to entry clarifies that: “The method can be
proprietary. The term ‘alternative’ is used to refer to the entire ‘test procedure and reaction system’. This
term includes all ingredients, whether material or otherwise, required for implementing the method.”
ISO 16140-4 addresses validation within a single laboratory. The results are therefore only valid for the
laboratory that conducted the study. In this case, verification (as described in ISO 16140-3) is not applicable.
ISO 16140-5 describes protocols for non-proprietary methods where a more rapid validation is required or
when the method to be validated is highly specialized and the number of participating laboratories required
by this document cannot be reached. ISO 16140-4 and ISO 16140-5 can be used for validation against a
reference method. ISO 16140-4 (regarding qualitative and quantitative methods) and ISO 16140-5 (regarding
quantitative methods only) can also be used for validation without a reference method.
The flow chart in Figure 0.1 gives an overview of the links between the different parts mentioned above. It
also guides the user in selecting the right part of the ISO 16140 series, taking into account the purpose of the
study and the remarks given above.
Figure 0.1 — Flow chart for application of the ISO 16140 series
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NOTE In this document, the words “category”, “type” and/or “item” are sometimes combined with “(food)” to
improve readability. However, the word “(food)” is interchangeable with “(feed)” and other areas of the food chain as
mentioned in Clause 1.
ISO 16140-6 is somewhat different from the other parts in the ISO 16140 series in that it relates to a very
specific situation where only the confirmation procedure of a method is to be validated [e.g. the biochemical
confirmation of Enterobacteriaceae (see ISO 21528-2)]. The confirmation procedure advances a suspected
(presumptive) result to a confirmed positive result. The validation of alternative typing techniques (e.g.
serotyping of Salmonella) is also covered by ISO 16140-6. The validation study in ISO 16140-6 clearly defines
the selective agar(s) from which strains can be confirmed using the alternative confirmation method. If
successfully validated, the alternative confirmation method can only be used if strains are recovered on an
agar that was used and shown to be acceptable within the validation study. Figure 0.2 shows the possibilities
where an alternative confirmation method validated in accordance with ISO 16140-6 can be applied (see
text in the boxes).
Figure 0.2 — Use of validated alternative confirmation methods (see ISO 16140-6)
EXAMPLE An example application of a validated alternative confirmation method is as follows.
An alternative confirmation method based on ELISA has been validated (in accordance with ISO 16140-6) to replace
the biochemical confirmation for Salmonella as described in ISO 6579-1. In the validation study, XLD (mandatory agar
in accordance with ISO 6579-1) plus BGA and a specified chromogenic agar (two optional agars for second plating in
accordance with ISO 6579-1) were used as the agars to start the confirmation. The validated confirmation method can
be used to replace the biochemical confirmation under the following conditions:
— by laboratories using ISO 6579-1; or
— by laboratories using an ISO 16140-2 validated alternative method that refers to ISO 6579-1 for confirmation; or
— by laboratories using an ISO 16140-2 validated alternative method that starts the confirmation from XLD and/or
BGA agar and/or the specified chromogenic agar.
The validated confirmation method cannot be used under the following conditions:
— by laboratories using an ISO 16140-2 validated alternative method that refers only to agars other than those
included in the validation to start the confirmation (e.g. Hektoen agar and SS agar only); or
— by laboratories using an ISO 16140-2 validated alternative method that refers only to a confirmation procedure
that does not require isolation on agar.
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0.2 Validation protocols in the ISO 16140 series
This document describes the general approach to method validation in the field of microbiology of the food
chain and serves as a fundamental basis to the other parts of the ISO 16140 series, which cross-reference to
it. An understanding of the performance characteristics, the (food) categories, the technical protocol and
data analysis as outlined in this document provides support in the application of the ISO 16140 series in
general.
Clause 4
Add the following text at the end of the clause:
For the validation of an alternative qualitative method, a corresponding qualitative reference method
is selected for carrying out the validation study. This is commonly done using test portions of 10 gram,
25 gram or higher. In some cases, it can be of interest to validate a qualitative alternative method against a
quantitative reference method, using smaller test portion sizes.
EXAMPLE 1 Enterobacteriaceae criterion for pasteurized milk and other liquid pasteurized products in Regulation
(EC) No 2073/2005 is < 10 cfu/ml and refers to the quantitative method ISO 21528-2.
In such situations, it is of interest to validate the performance of qualitative alternative methods against the
specified (quantitative) reference method. To that end, the technical protocol for the validation of qualitative
methods (see Clause 5) is to be used. For such a validation study, the quantitative results of the reference
method have to be converted into qualitative results prior to interpretation according to Clause 5.
−2
EXAMPLE 2 When one or more colonies are observed on a plate using 1 ml of a 10 dilution, this result corresponds
to a positive detection in 0,01 gram.
NOTE Annex J provides the special case of validation of a method for commercial sterility testing for specific
products [sterilized or ultra high temperature (UHT) dairy and plant-based liquid products].
If a technical change in a validated alternative (proprietary) method is evaluated as being major, a re-
validation of this alternative method in accordance with this document is needed.
When the re-validation of the alternative method is conducted, the impact on the performance
characteristics shall be evaluated to determine if the changes are to be regarded as major (performance
characteristics have substantially changed) or minor (no or minor impact on performance characteristics
observed). In certain cases, a major technical change in the method can be considered to be minor, if the re-
validation study shows that it has no significant impact on the performance characteristics or test results.
A major (technical) change that, after re-validation, has a major impact on the performance characteristics
of the alternative method, requires re-verification of the method by the user laboratory in accordance with
ISO 16140-3.
5.1.1
Add the following text at the end of the subclause:
The organizing laboratory shall be competent to perform both the reference method as well as the
alternative method.
NOTE Competence can be demonstrated in different ways (e.g. for the reference method, a documented proof of
meeting the requirements of ISO/IEC 17025, and for the alternative method, a documented training).
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5.1.2
Add the following text at the end of the subclause:
When the reference and alternative methods are based on two different principles and are performed
with the same test portion, but do not share a common enrichment procedure, an unpaired data study is
performed. For example, when a qualitative alternative method is validated against a quantitative reference
method at a limit of 100 cfu/g. In this case, a suspension of the (food) item can be used to inoculate both
culture media for the reference method and the alternative method before any enrichment/multiplication of
the microorganism.
5.1.3.3
Add the following text at the end of the subclause:
The alternative method shall be evaluated for a defined test portion size (e.g. 25 g, 200 g, 375 g) during the
validation study. The method is considered to be validated for any test portion size up to the validated test
portion size if the testing protocol (dilution ratio, incubation time and incubation temperature) is the same
as that used during the validation study.
EXAMPLE A reference method used in a validation study of this document was validated for a “broad range of
foods” using a 25 g test portion and a 1:10 dilution ratio. The alternative method was validated for a “broad range of
foods” using a 375 g test portion and a 1:5 dilution ratio at a determined incubation time. In practice, a user laboratory
can use the alternative method for all food items (broad range of foods) using a test portion size up to 375 g test
portion and a 1:5 dilution ratio at the validated incubation time (unless stated differently by the organization involved
in the method validation).
5.1.3.4
Add the following text before the last sentence of the second paragraph:
The interpretation of the results (positive agreement, negative agreement, etc.) is based on a comparison of
the reference method result (column 1 in Tables 1 and 2) and the alternative method result, including any
confirmations as described in the alternative method protocol (column 2 in Tables 1 and 2). When positive or
negative deviations are obtained, a footnote should be included at the end of each table to provide additional
explanations for the interpretation of the deviations. The footnotes indicate if the result is due to a false
positive or false negative result of the alternative method. The footnote is a comparison of the results of the
alternative method (including any confirmations as described in the alternative-method protocol) (column 2
in Tables 1 and 2) and the confirmed alternative method (by any means) (column 3 in Tables 1 and 2).
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5.1.3.4, after the second paragraph
Replace the text with the following:
Table 1 — Comparison and interpretation of sample results between the reference and alternative
methods for a paired study
Result of the (reference or alternative) method per sample
Reference Alternative method Confirmed Interpretation
method (including any confirmations alternative (based on the confirmed
as described in the method alternative-method result)
a
alternative-method protocol) (by any means)
b
+ + Not needed Positive Agreement (PA)
b
- - Not needed Negative Agreement (NA)
Negative Deviation due to false
b
+ - Not needed negative alternative-method result
(ND )
FN(alt)
- + + Positive Deviation (PD)
Positive Deviation due to false
- + - positive alternative-method result
c
(PD )
FP(alt)
a
Confirmation of the alternative-method result is done according to 5.1.3.3.
b
No need for additional confirmation test(s). Confirmed alternative-method result is the same as the alternative-method
result.
c
This false positive result (FP) shall also be used to calculate the false positive ratio.
Table 2 — Comparison and interpretation of sample results between the reference and alternative
methods for an unpaired study
Result of the (reference or alternative) method per sample
Reference Alternative method Confirmed Interpretation
method (including any confirmations alternative method (based on the confirmed
a,b
as described in the (by any means) alternative-method result)
alternative-method protocol)
+ + + Positive Agreement (PA)
Positive Agreement due to false
+ + - positive alternative-method result
c
(PA )
FP(alt)
- - - Negative Agreement (NA)
Negative Agreement due to false
- - + negative alternative-method result
(NA )
FN(alt)
+ - - Negative Deviation (ND)
Negative Deviation due to false
+ - + negative alternative-method result
(ND )
FN(alt)
- + + Positive Deviation (PD)
Positive Deviation due to false
- + - positive alternative-method result
c
(PD )
FP(alt)
a
Confirmation of the alternative-method result is done according to 5.1.3.3
b
Confirmation by any means is only required when the result of the alternative method does not produce viable organisms.
This is used as the confirmed alternative method result in comparison to the reference method result.
c
These false positive results (FP) shall also be used to calculate the false positive ratio.
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Determine the Total Negative Deviation (TND) and Total Negative Agreement (TNA) for the validation study.
Paired evaluation: Total Negative Deviation: TND = ND
FN(alt)
Total Negative Agreement: TNA = NA + PD
FP(alt)
Unpaired evaluation: Total Negative Deviation: TND = ND + ND + PA
FN(alt) FP(alt)
Total Negative Agreement: TNA = NA + NA + PD
FN(alt) FP(alt)
Table 3 — Summary of results obtained with the reference and alternative methods (after
confirmation) of all samples for each category
Reference-method positive Reference-method negative
(R+) (R-)
+/+ -/+
Alternative-method positive (A+)
Positive Agreement (PA) Positive Deviation (PD)
+/– −/−
Alternative-method negative (A-)
Total Negative Deviation (TND) Total Negative Agreement (TNA)
Based on data summarized in Table 3 for the combined categories per category and per type, calculate
the values for sensitivity of the alternative method (see Formula (1)) and of the reference method (see
Formula (2)), as well as the relative trueness (see Formula (3)) and false positive ratio and false negative
ratio for the alternative method after the additional confirmation of the results (see Formula (4)).
Sensitivity for the alternative method:
()PA+PD
SE = ×100% (1)
alt
PA++TNDPD
()
Sensitivity for the reference method:
()PA+TND
SE = ×100% (2)
ref
()PA+TND+PD
Relative trueness:
PA+TNA
()
RT= ×100% (3)
N
False positive ratio (FPR) and false negative ratio (FNR) for the alternative method:
PD
FP()alt
Paired evaluation: FPR=×100 %
TNA
(4)
PA + PD
FP()altFPa()lt
Unpaired evaluationn: FPR= ×100 %
TNA
NA +ND
FN()altFNa()lt
Falsen egativeratio: FNR =
PA +TND ++ PD
where
N is the total number of samples (PA + PD + TND + TNA);
FP is the false positive results;
FN is the false negative results.
For explanation of the abbreviated terms used, see Tables 1 to 3.
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(en)
The confirmed alternative-method results shall be used to determine whether the alternative method
produces comparable results to the reference method.
Calculate the difference between (TND – PD) for both paired and unpaired studies and the sum of (TND +
PD) for paired studies. Check whether the difference and/or sum of PD and TND conform to the Acceptability
Limit (AL) stated in Table 4 with respect to the type of study (paired or unpaired) and the number of
categories used in the evaluation.
NOTE 1 Acceptability Limits (AL) are based on data and consensus expert opinion. The AL are not based on
statistical analysis of the data.
The interpretation of results shall be done per category and for all categories used in the validation study.
An interpretation of results shall also be done per enrichment protocol in case different protocols are used
for different types of samples. A sensitivity study can also exist of a partly paired and unpaired study. In that
case the results for (TND + PD) shall be evaluated based on the number of positive samples obtained for the
categories tested using the paired study design. The results for (TND – PD) shall be evaluated based on the
number of positive samples obtained for the full study (so all categories belonging to both the paired and
unpaired study design).
The AL is not met when the observed value is higher than the AL. When the AL is not met, if the number
of positive samples is higher than expected according to the number of categories (e.g. having 60 or more
positive samples for one single category), it is possible to use the second column of Table 4 and switch to
higher AL. When the AL is not met, investigations should be made (e.g. root cause analysis) in order to provide
an explanation of the observed results. Based on the AL and the additional information, it is decided whether
the alternative method is regarded as not fit for purpose for the category or categories involved. The reasons
for acceptance of the alternative method in case the AL is not met shall be stated in the study report.
Table 4 — Acceptability limit parameters and values for a paired and unpaired study design in
relation to the number of positive samples obtained
c
Paired study Unpaired study Mixed study
Number of Number of positive
categories samples (N+) a b
(TND - PD ) (TND + PD) (TND - PD) (TND - PD) (TND + PD)
1 30 to 59 3 6 3 3 6
2 60 to 89 4 8 4 4 8
3 90 to 119 5 10 5 5 10
4 120 to 149 5 12 5 5 12
5 150 to 179 5 14 5 5 14
6 180 to 209 6 16 6 6 16
7 210 to 239 6 18 7 7 18
8 240 to 269 6 20 7 7 20
9 270 to 299 7 22 8 8 22
10 300 to 329 7 24 8 8 24
11 330 to 359 7 26 9 9 26
12 360 to 389 8 28 9 9 28
13 390 to 419 8 30 10 10 30
14 420 to 449 8 32 10 10 32
15 450 to 479 9 34 11 11 34
16 480 to 509 9 36 11 11 36
17 510 to 539 9 38 12 12 38
18 540 to 569 10 40 12 12 40
a
TND = total number of samples with Negative Deviation results.
b
PD = number of samples with Positive Deviation results.
c
Mixed study includes both paired and unpaired study design.
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(en)
TTabablele 4 4 ((ccoonnttiinnueuedd))
c
Paired study Unpaired study Mixed study
Number of Number of positive
categories samples (N+) a b
(TND - PD ) (TND + PD) (TND - PD) (TND - PD) (TND + PD)
19 570 to 599 10 42 13 13 42
20 600 to 629 10 44 13 13 44
21 630 to 659 11 46 14 14 46
22 660 to 689 11 48 14 14 48
23 690 to 719 11 50 15 15 50
24 720 to 749 12 52 15 15 52
25 750 to 779 12 54 16 16 54
a
TND = total number of samples with Negative Deviation results.
b
PD = number of samples with Positive Deviation results.
c
Mixed study includes both paired and unpaired study design.
NOTE 2 A negative value for (TND – PD) is acceptable as this indicates a better performance of the alternative
method compared to the reference method.
NOTE 3 Information on differences observed between results of the alternative method before and after
confirmation of the results (step 1 and step 2) according to the alternative-method protocol is commonly presented
in the validation report as additional information but is not used in the overall assessment of the alternative-method
performance.
5.1.4, last sentence
Replace the text with the following:
The level of contamination shall be determined. This allows calculation of the LOD of the alternative
method, which is required in order to verify the performance of the alternative method upon implementation
of the validated method in a laboratory in accordance with ISO 16140-3. The level of contamination is
determined by performing a most probable number (MPN) analysis on the (stabilized) inoculated samples
(preferably) and/or through the enumeration of the inoculum at the time of inoculation, see 5.1.4.3.
5.1.4.1, second paragraph
Replace the text with the following:
A minimum of three levels per type shall be prepared consisting of at least a negative control level, a low
level and a higher level. Ideally, the low level shall be the theoretical detection level (i.e. 0,7 cfu per test
portion) and the higher level just above the theoretical detection level (e.g. 1 cfu to 1,5 cfu per test portion).
For fastidious bacteria, the low level can significantly exceed the theoretical detection level; thus, the low
and high level should be adjusted appropriately. A fixed ratio (e.g. 1:2) between the low- and high-level
contamination should be used to aid in determining the final contamination levels. At least the low level
should provide fractional recovery by either the reference method or the alternative method (fractional
recovery at the low level should be between 25 % and 75 % of the number of samples tested). An evaluation
shall be performed to ensure the relationship and consistency of the number of positives of the intermediate
and high level. In cases where the alternative method produces fractional recovery at the low level and the
reference method produces all positive results, the results of the RLOD study are not valid and a root cause
analysis shall be performed.
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(en)
The level of contamination of the sample used (except for the negative control) shall be determined as in
5.1.4. At the negative control level, at least five replicate samples should be tested by both methods. For
the second (low) level (theoretical detection level), at least 20, and for the third (higher) level, at least five
replicate samples should be tested by both methods. The negative control level shall not produce positive
(by isolation of the target organism) results. When positive results are obtained, the experiments have to be
repeated for all levels.
5.1.4
Add the following text at the end of the subclause:
5.1.4.3 Calculation of the LOD
LOD shall be calculated for each category for the alternative method and optionally for the reference
method. The LOD is used in method verification (see ISO 16140-3).
For each category evaluated, determine the contamination of the low level by performing a 3-level MPN for
the particular (food) item tested using the reference method (preferably) at the time of the RLOD experiment
and/or by the enumeration of the inoculum at the time of inoculation using a non-selective medium. When
enumeration is performed, the inoculum for the low and high contamination levels should be determined.
The MPN and 95 % confidence interval shall be determined for the fractional level only. For the low (or
fractional) contamination level, analyse 20 test portions plus 5 test portions at approximately 2 times the
test portion size and 5 test portions at approximately half of the test portion size evaluated in the validation
study (e.g. if the reference method test portions were 25 g, evaluate 5 test portions at 50 g and 5 test portions
at 10 g). To each test portion, add a proportionate amount of enrichment broth as described in the reference
method to maintain the enrichment volume to mass ratio (e.g. a reference method with a 1:10 enrichment
ratio, add 450 ml to the 50 g test portions and 90 ml to the 10 g test portions). Analyse the test portions
following the reference method from enrichment to confirmation. Use the number of positive results per
1)
test portion size to calculate the MPN value. An Excel®-based program for calculating MPN values is freely
available for download at https:// standards .iso .org/ iso/ 7218 (download the file “MPN calculation Excel
program”).
Enumerate the inoculum at the time of inoculation by plating onto non-selective agar (see ISO 7218 for
guidance on plating). Agar plates should be incubated under conditions to allow for optimal growth of the
target microorganism.
Use the number of positive results per test portion size and the MPN value or the results of the enumeration of
the inoculum to calculate the LOD and 95 % confidence interval. An Excel®-based program for calculating
LOD values is freely available for download at https:// standards .iso .org/ iso/ 16140/ -2/ ed -1/ en/ amd/ 1/
(download the file “PODLOD_ver12”). The LOD value is calculated per category tested in the RLOD study
and shall be expressed as cfu/test portion.
NOTE The 20 test portions from the low level are the same as the 20 test portions used in the RLOD study.
Therefore, only 5 test portions at 2 times and 5 at approximately half of the test portion size are analysed in addition
to the RLOD study.
1) Excel® is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(en)
5.2.1
Add the following text after the second sentence of the first paragraph:
The interlaboratory study shall be conducted with collaborators belonging to more than one country.
The collaborators shall be competent to perform both the reference method as well as the alternative method.
NOTE Competence can be demonstrated in different ways (e.g. for the reference method, a documented proof of
meeting the requirements of ISO/IEC 17025, and for the alternative method, a documented training).
5.2.2, third bullet
Replace the text with the following:
— at least three different levels of contamination shall be used: a negative control (L ) and two levels (L
0 1
and L ). At least one of these shall produce fractional positive results. The level of contamination needed
to obtain fractional recovery shall be based on the RLOD study data of the reference method in the
method comparison study. Theoretically, an average level of contamination of 1 cfu/sample is adequate to
obtain fractional recovery. The level of contamination shall be determined. This allows calculation of the
LOD of the alternative method, which is required in order to verify the performance of the alternative
method upon implementation of the validated method in a laboratory in accordance with ISO 16140-3.
The level of contamination is determined by performing an MPN analysis at the time of the start of the
interlaboratory study, see 5.2.4.4.
5.2.3, title
Replace the text with the following:
Summary of data and trueness calculations
5.2.3, after the third paragraph
Replace the text with the following:
Table 9 — Summarized results for all collaborators for a paired study
Result of the (reference or alternative) method per sample
Reference Alternative Confirmed alternative Interpretation
a b
method method method (based on the confirmed alternative-method result)
c
+ + Not needed Positive Agreement (PA)
c
- - Not needed Negative Agreement (NA)
Negative Deviation due to false negative
c
+ - Not needed
alternative-method result (ND )
FN(alt)
- + + Positive Deviation (PD)
Positive Deviation due to false positive
- + -
d
alternative-method result (PD )
FP(alt)
a
The alternative-method results includes any confirmations as described in the alternative-method protocol.
b
The confirmed alternative-method result is the result after additional confirmation as described in the protocol for the
validation study.
c
No need for additional confirmation test(s). Confirmed alternative-method result is the same as the alternative-method
result.
d
This false positive result (FP) shall also be used to calculate the false positive ratio.
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(en)
Table 10 — Summarized results for all collaborators for an unpaired study
Result of the (reference or alternative) method per sample
Reference Alternative Confirmed alternative Interpretation
a b
method method method (based on the confirmed alternative-method result)
+ + + Positive Agreement (PA)
+ + - Positive Agreement due to false positive
c
alternative-method result (PA )
FP(alt)
- - - Negative Agreement (NA)
- - + Negative Agreement due to false negative
alternative-method result (NA )
FN(alt)
+ - - Negative Deviation (ND)
+ - + Negative Deviation due to false negative
alternative-method result (ND )
FN(alt)
- + + Positive Deviation (PD)
- + - Positive Deviation due to false positive
alternative-method result (PD )
FP(alt)
a
The alternative-method result includes any confirmations as described in the alternative-method protocol.
b
The confirmed alternative-method result is the result after additional confirmation as described in the protocol for the
validation study.
Determine the Total Negative Deviation (TND) and Total Negative Agreement (TNA) for the validation study.
Paired evaluation: Total Negative Deviation: TND = ND
FN(alt)
Total Negative Agreement: TNA = NA + PD
FP(alt)
Unpaired evaluation: Total Negative Deviation: TND = ND + ND + PA
FN(alt) FP(alt)
Total Negative Agreement: TNA = NA + NA + PD
FN(alt) FP(alt)
Table 11 — Summary of results for all collaborators obtained with the reference and alternative
methods (after confirmation) for level L or L
1 2
Reference-method positive Reference-method negative
(R+) (R-)
+/+ -/+
Alternative-method positive (A+)
Positive Agreement (PA) Positive Deviation (PD)
+/− −/−
Alternative-method negative (A-)
Total Negative Deviation (TND) Total Negative Agreement (TNA)
Based on data summarized in Table 11, calculate the values for sensitivity of the alternative method (see
Formula (8)) and of the reference method (see Formula (9)), as well as the relative trueness (see Formula (10))
and false positive ratio and false negative ratio for the alternative method after the additional confirmation
of the results (see Formula (11)).
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(en)
Sensitivity for the alternative method:
()PA+PD
SE = ×100% (8)
alt
PA++TNDPD
()
Sensitivity for the reference method:
()PA+TND
SE = ×100% (9)
ref
PA++TNDPD
()
Relative trueness:
()PA+TNA
RT= ×100% (10)
N
False positive ratio (FPR) and false negative ratio (FNR) for the alternative method:
PD
FP()alt
Paired evaluation: FPR=×100 %
TNA
(11)
PA + PD
FP()altFPa()lt
Unpaired evaluationn: FPR= ×100 %
TNA
NA +ND
FN()altFNa()lt
Falsen egativeratio: FNR =
PA +TND ++ PD
where
N is the total number of samples (TNA + PA + PD + TND);
FP is the false positive results;
FN is the false negative results.
For explanation of the abbreviated terms used, see Tables 9 to 11.
The confirmed alternative-method results shall be used to determine whether the alternative method
produces comparable results to the reference method.
5.2.4
Replace the text with the following:
5.2.4 Interpretation of trueness data
5.2.4.1 Paired study
For a paired study, calculate the difference between (TND – PD) and the sum of (TND + PD) for the level(s)
where fractional recovery was obtained (so L and possibly L ). The values found for (TND – PD) and (TND
1 2
+ PD) shall not be higher than the Acceptability Limits (ALs) given in Table 12 with respect to the number of
participating laboratories (N ).
lab
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(en)
Table 12 — Acceptability limits for a paired study design in relation to the number of collaborating
laboratories
N (TND – PD) (TND + PD)
lab
10 3 4
11 4 4
12 to 13 4 5
14 to 16 4 6
17 4 7
18 5 7
19 to 20 5 8
The AL is not met when the observed value is higher than the AL. When the AL is not met, investigations
should be made (e.g. root cause analysis) in order to provide an explanation of the observed results. Based
on the AL and the additional information, it is decided whether the alternative method is regarded as not fit
for purpose. The reasons for acceptance of the alternative method in case the AL is not met shall be stated in
the study report.
5.2.4.2 Unpaired study
For an unpaired study, calculate the difference between (TND – PD) for the level(s) where fractional recovery
was obtained (so L and possibly L ). The observed value found for (TND – PD) shall not be higher than the
1 2
AL. The AL is defined as [(TND – PD) ] and calculated per level where fractional recovery was obtained as
max
described below using the following three parameters:
P
x ref
()
p+ = (12)
()
ref
N
x()ref
where
P is number of samples with a positive result obtained with the reference method at level x
x(ref)
(L or L ) for all laboratories;
1 2
N is number of samples tested at level x (L or L ) with the reference method by all laboratories.
x(ref) 1 2
CP
x alt
()
p+ = (13)
()
alt
N
x()alt
where
CP is number of samples with a confirmed positive result obtained with the alternative method at
x(alt)
level x (L or L ) for all laboratories;
1 2
N is number of samples tested at level x (L or L ) with the alternative method by all laboratories.
x(alt) 1 2
TNDP− DN=×32pp+ ++ −+pp×+ (14)
() () () () ()
()()
x()ref
max refalt refalt
where N is number of samples tested at level x (L or L ) with the reference method by all laboratories.
x(ref) 1 2
The AL is not met when the observed value is higher than the AL. When the AL is not met, investigations
should be made (e.g. root cause analysis) in order to provide an explanation of the observed results. Based
on the AL and the additional information, it is decided whether the alternative method is regarded as not fit
for purpose. The reasons for acceptance of the alternative method when the AL is not met shall be stated in
the study report.
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(en)
5.2.4.3 Calculation of the relative level of detection
For both a paired and unpaired study, the variation of the relative levels of detection (RLOD) between
laboratories shall be assessed. Conduct this evaluation in accordance with Annex F. The ALs for the RLOD of
paired and unpaired studies are found in 5.1.4.2.
In addition, the data can be evaluated using the probability of detection (POD) model described in
[6]
Reference [14] and included in the AOAC validation guidelines. The evaluation using the POD model can
give additional information on the equivalence of the methods.
5.2.4.4 Calculation of the LOD
LOD shall be calculated for each category used in the interlaboratory study for the alternative method
and optionally for the reference method. The LOD is used in method verification (see ISO 16140-3). For
method verification, it is only necessary to calculate the LOD for the alternative method. This shall be done
by the expert laboratory only at the time the interlaboratory study starts. The MPN and 95 % confidence
interval shall be determined for the fractional level only. Determine for the L level the contamination
level by performing a 3-level MPN for the particular (food) item tested in the interlaboratory study using
the reference method. For the low (or fractional) contamination level, analyse 20 test portions plus 5 test
portions at approximately 2 times the test portion size and 5 test portions at approximately half of the test
portion size evaluated in the validation study (e.g. if the reference method test portions were 25 g, evaluate
5 test portions at 50 g and 5 test portions at 10 g). To each test portion, add a proportionate amount of
enrichment broth as described in the reference method to maintain the enrichment volume to mass ratio
(e.g. a reference method with a 1:10 enrichment ratio, add 450 ml to the 50 g test portions and 90 ml to
the 10 g test portions). Analyse the test portions following the reference method from enrichment to
confirmation. Use the number of positive results per test portion size to calculate the MPN value. An Excel®-
based program for calculating MPN values is freely available for download at https:// standards .iso .org/ iso/
7218 (download the file “MPN calculation Excel program”).
Use the number of positive results per test portion size from the alternative method and the MPN value
obtained using the reference method to calculate the LOD of the alternative method and 95 % confidence
interval. An Excel®-based program for calculating LOD values is freely available for download at https://
standards .iso .org/ iso/ 16140/ -2/ ed -1/ en/ amd/ 1/ (download the file “PODLOD-interlab”). The LOD value
shall be expressed as cfu/test portion.
6.1.1
Add the following text at the end of the subclause:
The organizing laboratory shall be competent to perform both the reference method as well as the
alternative method.
NOTE Competence can be demonstrated in different ways (e.g. for the reference method, a documented proof of
meeting the requirements of ISO/IEC 17025, and for the alternative method, a documented training).
6.1.2.3, first paragraph after Figure 1
Replace the
...
Norme
internationale
ISO 16140-2
Première édition
Microbiologie de la chaîne
2016-06-15
alimentaire — Validation des
méthodes —
AMENDEMENT 1
2024-09
Partie 2:
Protocole pour la validation
de méthodes alternatives
(commerciales) par rapport à une
méthode de référence
AMENDEMENT 1: Révision de
l’évaluation des données des études de
comparaison de méthodes qualitatives,
des calculs du niveau de détection
de l'étude interlaboratoires et de
l’interprétation de l’étude de justesse
relative, et ajout d’un protocole
pour la détermination de la stérilité
commerciale pour des produits
spécifiques
Microbiology of the food chain — Method validation —
Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary)
methods against a reference method
AMENDMENT 1: Revision of qualitative method comparison
study data evaluation, relative level of detection calculations in
the interlaboratory study, calculation and interpretation of the
relative trueness study, and inclusion of a commercial sterility
testing protocol for specific products
Numéro de référence
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr) © ISO 2024
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2024
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n'avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l'adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion de
l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la chaîne alimentaire,
du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO
et le CEN (Accord de Vienne).
Une liste de toutes les parties de la série ISO 16140 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iii
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des
méthodes —
Partie 2:
Protocole pour la validation de méthodes alternatives
(commerciales) par rapport à une méthode de référence
AMENDEMENT 1: Révision de l’évaluation des données des études
de comparaison de méthodes qualitatives, des calculs du niveau
de détection de l'étude interlaboratoires et de l’interprétation
de l’étude de justesse relative, et ajout d’un protocole pour la
détermination de la stérilité commerciale pour des produits
spécifiques
Introduction
Remplacer le texte par ce qui suit:
Introduction
0.1 Série ISO 16140
La série ISO 16140 a été étendue en réponse à la nécessité de disposer de différents protocoles pour la
validation ou la vérification des méthodes d’essai. Elle succède à l’ISO 16140:2003. La série ISO 16140
comprend six parties ayant le titre général, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes:
— Partie 1: Vocabulaire;
— Partie 2: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) par rapport à une méthode
de référence;
— Partie 3: Protocole pour la vérification de méthodes de référence et de méthodes alternatives validées dans
un seul laboratoire;
— Partie 4: Protocole pour la validation de méthodes dans un seul laboratoire;
— Partie 5: Protocole pour la validation interlaboratoires de méthodes non commerciales par plan factoriel;
— Partie 6: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) pour la confirmation
microbiologique et le typage.
L’ISO 17468 est une Norme internationale étroitement liée, qui établit les règles techniques pour le
développement et la validation de méthodes normalisées.
En général, deux étapes sont nécessaires avant de pouvoir utiliser une méthode en laboratoire:
— la première étape est la validation de la méthode. Celle-ci est effectuée à l’aide d’une étude dans un seul
laboratoire suivie d’une étude interlaboratoires (voir le présent document, l’ISO 16140-5 et l’ISO 16140-6).
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr)
Dans le cas où une méthode est validée dans un seul laboratoire (voir l’ISO 16140-4), aucune étude
interlaboratoires n’est effectuée;
— la seconde étape est la vérification des méthodes, au cours de laquelle un laboratoire prouve qu’il
peut effectuer une méthode validée de manière satisfaisante. Celle-ci est décrite dans l’ISO 16140-3.
La vérification est uniquement applicable aux méthodes qui ont été validées à l’aide d’une étude
interlaboratoires.
On distingue en général deux types de méthodes: les méthodes de référence et les méthodes alternatives.
Une méthode de référence est définie dans l’ISO 16140-1:2016, 2.59, comme étant une «méthode reconnue
internationalement et largement acceptée». La note à l’article précise que «ces normes sont des normes ISO
et des normes publiées conjointement par l’ISO et le CEN ou d’autres normes régionales/nationales de niveau
équivalent».
Dans la série ISO 16140, les méthodes de référence comprennent les méthodes de référence normalisées (ISO et
CEN) telles que définies dans l’ISO 17468:2023, 3.7, en tant que «méthode de référence décrite dans une norme».
Une méthode alternative (méthode soumise à validation) est définie dans l’ISO 16140-1:2016, 2.4, en tant
que «méthode d’analyse permettant de détecter ou de quantifier, pour une catégorie de produits donnée,
le même analyte que celui détecté ou quantifié avec la méthode de référence correspondante». La note à
l’article précise que: «La méthode peut être commerciale. L’adjectif «alternatif» se réfère à la totalité
du «mode opératoire d’analyse et du système réactionnel». Ce terme recouvre tous les éléments nécessaires
à la mise en œuvre de la méthode, qu'ils soient matériels ou autres.»
L’ISO 16140-4 traite de la validation dans un seul laboratoire. Par conséquent, les résultats sont
uniquement valides pour le laboratoire effectuant l’étude. Dans ce cas, aucune vérification (comme décrit
dans l’ISO 16140-3) n’est applicable. L’ISO 16140-5 décrit les protocoles applicables aux méthodes non
commerciales dans lesquelles une validation plus rapide est nécessaire ou dans lesquelles la méthode à
valider est hautement spécialisée, et le nombre de laboratoires participants requis par le présent document
ne peut pas être atteint. L’ISO 16140-4 et l’ISO 16140-5 peuvent être utilisées pour la validation avec
méthode de référence. L’ISO 16140-4 (concernant les méthodes qualitatives et quantitatives) et l’ISO 16140-5
(concernant les méthodes quantitatives uniquement) peuvent également être utilisées pour la validation
sans méthode de référence.
Le logigramme de la Figure 0.1 donne un aperçu des relations entre les différentes parties susmentionnées. Il
aide également l’utilisateur à choisir la partie appropriée de la série ISO 16140, en tenant compte de l’objectif
de l’étude et des remarques énoncées ci-dessus.
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr)
Figure 0.1 — Logigramme relatif à l’application de la série ISO 16140
NOTE Dans le présent document, les termes «catégorie», «type» et/ou «matrice» sont parfois associés au
terme «(aliment)» pour une meilleure compréhension. Cependant, le terme «(aliment)» peut être remplacé par «aliment
pour (animaux)» et par les autres secteurs de la chaîne alimentaire tels que mentionnés à l'Article 1.
L’ISO 16140-6 est quelque peu différente des autres parties de la série ISO 16140 car elle concerne une
situation très spécifique dans laquelle seul le mode opératoire de confirmation d’une méthode doit être validé
[par exemple, la confirmation biochimique des Enterobacteriaceae (voir l’ISO 21528-2)]. Le mode opératoire
de confirmation modifie un résultat suspecté (présomptif) en un résultat positif confirmé. La validation
des méthodes alternatives de typage (par exemple, sérotypage de Salmonella) est également couverte par
l’ISO 16140-6. L'étude de validation de l’ISO 16140-6 définit clairement la ou les géloses sélectives à partir
desquelles les souches peuvent être confirmées en utilisant la méthode alternative de confirmation. Lorsque
la méthode alternative de confirmation est validée, elle ne peut être appliquée que si les souches sont
cultivées sur une gélose utilisée et jugée acceptable lors de l’étude de validation. La Figure 0.2 illustre les
situations dans lesquelles une méthode alternative de confirmation validée conformément à l’ISO 16140-6
peut être appliquée (voir le texte dans les cases).
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr)
Figure 0.2 — Utilisation de méthodes alternatives de confirmation (voir l’ISO 16140-6)
EXEMPLE Un exemple d’application d’une méthode alternative de confirmation validée est donné ci-après.
Une méthode alternative de confirmation fondée sur une ELISA a été validée (conformément à l’ISO 16140-6)
pour remplacer la confirmation biochimique de Salmonella tel qu’il est décrit dans l’ISO 6579-1. Lors de l’étude de
validation, la gélose XLD (gélose obligatoire conformément à l’ISO 6579-1) ainsi que la gélose BGA et une gélose
chromogène spécifiée (deux géloses facultatives pour le deuxième ensemencement conformément à l’ISO 6579-1) ont
été utilisées pour commencer la confirmation. La méthode de confirmation validée peut être utilisée pour remplacer
la confirmation biochimique dans les conditions suivantes:
— par des laboratoires utilisant l’ISO 6579-1; ou
— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée selon l’ISO 16140-2 faisant référence à l’ISO 6579-1
pour la confirmation; ou
— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée selon l’ISO 16140-2 dont la confirmation débute
avec la gélose XLD et/ou la gélose BGA et/ou la gélose chromogène spécifiée.
La méthode de confirmation validée ne peut pas être utilisée dans les conditions suivantes:
— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée selon l’ISO 16140-2 faisant uniquement référence à
des géloses autres que celles incluses dans la validation pour commencer la confirmation (par exemple, la gélose
Hektoen et la gélose SS uniquement); ou
— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée selon l’ISO 16140-2 faisant uniquement référence à
un mode opératoire de confirmation ne nécessitant pas d’isolement sur gélose.
0.2 Protocoles de validation dans la série ISO 16140
Le présent document décrit l’approche générale de validation de la méthode dans le domaine de la
microbiologie de la chaîne alimentaire et sert de fondement à d’autres parties de la série ISO 16140, qui y font
référence. Une connaissance des caractéristiques de performance, des catégories (d’aliments), du protocole
technique et de l’analyse des données tels que décrits dans le présent document, facilite l’application de la
série ISO 16140 en général.
Article 4
Ajouter le texte suivant à la fin du paragraphe:
Pour la validation d’une méthode qualitative alternative, une méthode de référence qualitative est choisie
pour effectuer l’étude de validation. Cela est couramment effectué à l’aide de prises d’essai de 10 g, 25 g
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr)
ou plus. Dans certains cas, il peut être intéressant de valider une méthode alternative qualitative par rapport
à une méthode de référence quantitative, à l’aide de prises d’essai plus petites.
EXEMPLE 1 Le critère Enterobacteriaceae pour le lait pasteurisé et les autres produits pasteurisés liquides
du Règlement (CE) n° 2073/2005 est < 10 UFC/ml et fait référence à la méthode quantitative ISO 21528-2.
Dans ce cas, il est intéressant de valider la performance des méthodes alternatives qualitatives par rapport
à la méthode de référence (quantitative) spécifiée. Pour cela, le protocole technique pour la validation
des méthodes qualitatives (voir Article 5) doit être utilisé. Pour cette étude de validation, les résultats
quantitatifs de la méthode de référence doivent être convertis en résultats qualitatifs avant l’interprétation
selon l’Article 5.
−2
EXEMPLE 2 Lorsqu’une ou plusieurs colonies sont observées sur une boîte en utilisant 1 ml d’une dilution 10 , ce
résultat correspond à une détection positive dans 0,01 g.
NOTE L’Annexe J fournit le cas particulier de validation d’une méthode pour la détermination de la stérilité
commerciale de produits spécifiques [produits laitiers et produits liquides à base de plantes stérilisés ou à ultra-haute
température (UHT)].
Si une modification technique d’une méthode alternative (commerciale) validée est jugée majeure, une
nouvelle validation de cette méthode alternative conformément au présent document est nécessaire.
Lorsqu’une nouvelle validation de la méthode alternative est effectuée, l’impact sur les caractéristiques
de performance doit être évalué pour déterminer si les modifications doivent être jugées majeures (les
caractéristiques de performance ont nettement changé) ou mineures (un impact nul ou mineur sur les
caractéristiques de performance a été observé). Dans certains cas, une modification technique majeure
de la méthode peut être jugée mineure si l’étude de la nouvelle validation montre l’absence d’impact
significatif sur les caractéristiques de performance ou les résultats d’essai. Une modification (technique)
majeure qui, après nouvelle validation, a un impact majeur sur les caractéristiques de performance de la
méthode alternative, nécessite une nouvelle vérification de la méthode par le laboratoire de l’utilisateur,
conformément à l’ISO 16140-3.
5.1.1
Ajouter le texte suivant à la fin du paragraphe:
Le laboratoire organisateur doit avoir les compétences pour mettre en œuvre la méthode de référence et la
méthode alternative.
NOTE Les compétences peuvent être démontrées de différentes manières (par exemple, pour la méthode de
référence, une preuve documentée de la conformité aux exigences de l’ISO/IEC 17025 et pour la méthode alternative,
une formation documentée).
5.1.2
Ajouter le texte suivant à la fin du paragraphe:
Lorsque la méthode de référence et la méthode alternative reposent sur deux principes différents et sont
effectués avec la même prise d’essai mais pas avec le même mode opératoire d’enrichissement, une étude
de données appariées est effectuée. Par exemple, lorsqu’une méthode alternative qualitative est validée par
rapport à une méthode de référence quantitative à une limite de 100 UFC/g. Dans ce cas, une suspension de
la matrice (d’aliment) peut être utilisée pour ensemencer les milieux de culture de la méthode de référence
et de la méthode alternative avant l’enrichissement/la multiplication du micro-organisme.
5.1.3.3
Ajouter le texte suivant à la fin du paragraphe:
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr)
La méthode alternative doit être évaluée pour une taille de prise d’essai définie (par exemple 25 g, 200 g,
375 g) pendant l’étude de validation. La méthode est jugée validée pour n’importe quelle taille de prise
d’essai jusqu’à la taille de prise d’essai validée si le protocole d’essai (rapport de dilution, durée d’incubation
et température d'incubation) est le même que celui utilisé pendant l'étude de validation.
EXEMPLE Une méthode de référence utilisée dans une étude de validation selon le présent document a été validée
pour une «vaste gamme d’aliments» en utilisant une prise d’essai de 25 g et un rapport de dilution de 1:10. La méthode
alternative a été validée pour une «vaste gamme d’aliments» en utilisant une prise d’essai de 375 g et un rapport de
dilution de 1:5 à une durée d’incubation déterminée. En pratique, un laboratoire utilisateur peut utiliser la méthode
alternative pour toutes les matrices d’aliments (vaste gamme d’aliments) en utilisant une taille de prise d’essai allant
jusqu’à 375 g et un rapport de dilution de 1:5 à la durée d’incubation validée (sauf indication contraire de la part de
l’organisme chargé de la validation de la méthode).
5.1.3.4
Ajouter le texte suivant avant la dernière phrase du deuxième alinéa:
L’interprétation des résultats (accord positif, accord négatif, etc.) repose sur une comparaison du résultat
de la méthode de référence (colonne 1 des Tableaux 1 et 2) et du résultat de la méthode alternative, incluant
les confirmations décrites dans le protocole de la méthode alternative (colonne 2 des Tableaux 1 et 2). Si
des déviations positives ou négatives sont obtenues, il convient d’ajouter une note de bas de page à la fin
de chaque tableau pour fournir des explications supplémentaires pour l’interprétation des déviations. Les
notes de bas de page indiquent si le résultat est dû à un résultat faux positif ou faux négatif de la méthode
alternative. La note de bas de page est une comparaison des résultats de la méthode alternative (incluant les
confirmations décrites dans le protocole de la méthode alternative) (colonne 2 des Tableaux 1 et 2) et de la
méthode alternative après confirmation (par n’importe quel moyen) (colonne 3 des Tableaux 1 et 2).
5.1.3.4, après le deuxième alinéa
Remplacer le texte par ce qui suit:
Tableau 1 — Comparaison et interprétation de résultats des échantillons entre la méthode
de référence et la méthode alternative pour une étude de méthodes appariées
Résultat de la méthode (de référence ou alternative) en fonction de l’échantillon
Méthode Méthode alternative Méthode Interprétation
de référence (incluant les confirmations alternative après (sur la base du résultat de la méthode
décrites dans le protocole de la confirmation alternative après confirmation)
méthode alternative) (par n’importe quel
a
moyen)
b
+ + Non requis Accord positif (PA)
b
- - Non requis Accord négatif (NA)
Déviation négative due à un résultat
b
+ - Non requis faux négatif de la méthode alternative
(ND )
FN(alt)
- + + Déviation positive (PD)
Déviation positive due à un résultat
- + - faux positif de la méthode alternative
c
(PD )
FP(alt)
a
La confirmation du résultat de la méthode alternative est effectuée selon 5.1.3.3.
b
Aucun essai de confirmation supplémentaire n’est nécessaire. Le résultat de la méthode alternative après confirmation est
identique au résultat de la méthode alternative.
c
Ce résultat faux positif (FP) doit également être utilisé pour calculer le rapport des résultats faux positifs.
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr)
Tableau 2 — Comparaison et interprétation de résultats des échantillons entre la méthode de
référence et la méthode alternative pour une étude de méthodes non appariées
Résultat de la méthode (de référence ou alternative) en fonction de l’échantillon
Méthode Méthode alternative Méthode Interprétation
de référence (incluant les confirmations alternative après (sur la base du résultat de la méthode
décrites dans le protocole de la confirmation alternative après confirmation)
méthode alternative) (par n’importe quel
a,b
moyen)
+ + + Accord positif (PA)
Accord positif dû à un résultat faux
+ + - positif de la méthode alternative
c
(PA )
FP(alt)
- - - Accord négatif (NA)
Accord négatif dû à un résultat faux
- - + négatif de la méthode alternative
(NA )
FN(alt)
+ - - Déviation négative (ND)
Déviation négative due à un résultat
+ - + faux négatif de la méthode alternative
(ND )
FN(alt)
- + + Déviation positive (PD)
Déviation positive due à un résultat
- + - faux positif de la méthode alternative
c
(PD )
FP(alt)
a
La confirmation du résultat de la méthode alternative est effectuée selon 5.1.3.3.
b
La confirmation par n’importe quel moyen est uniquement requise lorsque le résultat de la méthode alternative ne produit
pas d’organismes viables. Celui-ci est utilisé comme résultat de la méthode alternative après confirmation en comparaison avec
le résultat de la méthode de référence.
c
Ces résultats faux positifs (FP) doivent également être utilisés pour calculer le rapport des résultats faux positifs.
Déterminer la déviation négative totale (TND) et l’accord négatif total (TNA) pour l’étude de validation.
Évaluation des méthodes appariées: Déviation négative totale: TND = ND
FN(alt)
Accord négatif total: TNA = NA + PD
FP(alt)
Évaluation des méthodes non appariées: Déviation négative totale: TND = ND + ND + PA
FN(alt) FP(alt)
Accord négatif total: TNA = NA + NA + PD
FN(alt) FP(alt)
Tableau 3 — Récapitulatif des résultats obtenus avec la méthode de référence et la méthode
alternative (après confirmation) de tous les échantillons pour chaque catégorie
Résultat positif de la méthode de Résultat négatif de la méthode de
référence référence
(R+) (R−)
Résultat positif de la méthode +/+ −/+
alternative (A+) Accord positif (PA) Déviation positive (PD)
Résultat négatif de la méthode +/− −/−
alternative (A−) Déviation négative totale (TND) Accord négatif total (TNA)
D’après les données récapitulées dans le Tableau 3, pour l’ensemble des catégories combinées, pour chaque
catégorie et pour chaque type, calculer les valeurs de sensibilité de la méthode alternative [voir Formule (1)]
et de la méthode de référence [voir Formule (2)], ainsi que la justesse relative [voir Formule (3)] et le rapport
de résultats faux positifs pour la méthode alternative après confirmation supplémentaire des résultats [voir
Formule (4)].
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr)
Sensibilité de la méthode alternative:
()PA+PD
SE = ×100% (1)
alt
PA++TNDPD
()
Sensibilité de la méthode de référence:
()PA+TND
SE = ×100% (2)
ref
PA+TND+PD
()
Justesse relative:
()PA+TNA
RT= ×100% (3)
N
Rapport des résultats faux positifs (FPR) et des résultats faux négatifs (FNR) pour la méthode alternative:
PD
FP()alt
Évaluation desméthodesappariées : FPR =×100 %
TNA
(4)
PA + PD
FP()altFPa()lt
Évaluuation desméthodesnon appariées : FPR= ××100 %
TNA
NA + ND
FN()altFN()aalt
Rapport des résultats faux négatifsF: NR =
PA ++TNDP D
où
N est le nombre total d’échantillons (PA + PD + TND + TNA);
FP correspond aux résultats faux positifs;
FN correspond aux résultats faux négatifs.
Pour une explication des abréviations utilisées, voir les Tableaux 1 à 3.
Les résultats de la méthode alternative après confirmation doivent être utilisés pour déterminer si la
méthode alternative produit des résultats comparables à ceux de la méthode de référence.
Calculer la différence entre (TND – PD) pour des études de méthodes appariées et non appariées, et la somme
de (TND + PD) pour des études de méthodes appariées. Vérifier si cette différence et/ou cette somme de PD
et TND sont conformes à la limite d'acceptabilité (AL) donnée dans le Tableau 4 en tenant compte du type
d’étude (méthodes appariées ou non appariées) et du nombre de catégories utilisé lors de l'évaluation.
NOTE 1 Les limites d’acceptabilité (AL) sont basées sur des données et reposent sur un consensus d’experts. Les
limites AL ne reposent pas sur l’analyse statistique des données.
L’interprétation des résultats doit être effectuée pour chaque catégorie et pour l’ensemble des catégories
utilisées lors de l’étude de validation. Une interprétation des résultats doit également être réalisée pour
chaque protocole d’enrichissement au cas où différents protocoles sont utilisés pour différents types
d’échantillons. Une étude de sensibilité peut également comprendre des études de méthodes appariées
et non appariées. Dans ce cas, les résultats pour (TND + PD) doivent être évalués sur la base du nombre
d'échantillons positifs obtenus pour les catégories soumises à essai en utilisant l'étude de méthodes
appariées. Les résultats pour (TND – PD) doivent être évalués sur la base du nombre d'échantillons positifs
obtenus pour l’ensemble de l’étude (donc toutes les catégories appartenant aux études de méthodes appariées
et non appariées.
L'AL n’est pas satisfaisante lorsque la valeur observée est supérieure à l’AL. Lorsque l’AL n’est pas satisfaisante,
si le nombre d’échantillons positifs est plus élevé que prévu en fonction du nombre de catégories (par
exemple au moins 60 échantillons positifs pour une seule catégorie), il est possible d’utiliser la deuxième
colonne du Tableau 4 et de sélectionner une AL plus élevée. Lorsque l’AL n’est pas satisfaisante, il convient
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr)
de faire des recherches (par exemple, une analyse des causes) pour donner une explication des résultats
observés. D’après l’AL et les informations supplémentaires, la décision de considérer la méthode alternative
comme inadaptée à la catégorie ou aux catégories impliquées est prise. Si l’AL n’est pas satisfaisante, les
raisons de l’acceptation de la méthode alternative doivent être indiquées dans le rapport d’étude.
Tableau 4 — Paramètres et valeurs de limite d'acceptabilité pour des études de méthodes appariées
et non appariées en fonction du nombre de d'échantillons positifs obtenus
Étude de
Étude de méthodes
Nombre
c
méthodes non Étude mixte
Nombre de
appariées
d'échantillons
appariées
catégories
positifs (N+)
a b
(TND - PD ) (TND + PD) (TND - PD) (TND - PD) (TND + PD)
1 30 à 59 3 6 3 3 6
2 60 à 89 4 8 4 4 8
3 90 à 119 5 10 5 5 10
4 120 à 149 5 12 5 5 12
5 150 à 179 5 14 5 5 14
6 180 à 209 6 16 6 6 16
7 210 à 239 6 18 7 7 18
8 240 à 269 6 20 7 7 20
9 270 à 299 7 22 8 8 22
10 300 à 329 7 24 8 8 24
11 330 à 359 7 26 9 9 26
12 360 à 389 8 28 9 9 28
13 390 à 419 8 30 10 10 30
14 420 à 449 8 32 10 10 32
15 450 à 479 9 34 11 11 34
16 480 à 509 9 36 11 11 36
17 510 à 539 9 38 12 12 38
18 540 à 569 10 40 12 12 40
19 570 à 599 10 42 13 13 42
20 600 à 629 10 44 13 13 44
21 630 à 659 11 46 14 14 46
22 660 à 689 11 48 14 14 48
23 690 à 719 11 50 15 15 50
24 720 à 749 12 52 15 15 52
25 750 à 779 12 54 16 16 54
a
TND = nombre total d’échantillons ayant des résultats de déviation négative.
b
PD = nombre d’échantillons ayant des résultats de déviation positive.
c
L’étude mixte comprend une étude de méthodes appariées et une étude de méthodes non appariées.
NOTE 2 Une valeur négative pour (TND – PD) est acceptable car cela indique une meilleure performance de la
méthode alternative que celle de la méthode de référence.
NOTE 3 Les informations sur les différences observées entre les résultats de la méthode alternative avant et après
confirmation des résultats (étapes 1 et 2) selon le protocole de la méthode alternative sont généralement présentées
dans le rapport de validation, sous forme d’informations supplémentaires. Elles ne sont cependant pas utilisées dans
l’évaluation globale de la performance de la méthode alternative.
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr)
5.1.4, dernière phrase
Remplacer le texte par ce qui suit:
Le niveau de contamination doit être déterminé. Cela permet de calculer le LOD de la méthode alternative,
qui est requis afin de vérifier la performance de la méthode alternative lors de la mise en œuvre de la méthode
validée dans un laboratoire conformément à l’ISO 16140-3. Le niveau de contamination est déterminé en
effectuant une analyse du nombre le plus probable (NPP) sur les échantillons ensemencés (stabilisés) (de
préférence) et/ou par dénombrement de l’inoculum au moment de l’ensemencement, voir 5.1.4.3.
5.1.4.1, deuxième alinéa
Remplacer le texte par ce qui suit:
Au moins trois niveaux par type doivent être préparés, parmi lesquels au moins un niveau de témoin négatif,
un niveau bas et un niveau supérieur. Idéalement, le niveau bas doit être le niveau de détection théorique
(par exemple 0,7 UFC par prise d'essai) et le niveau élevé doit être légèrement supérieur au niveau de
détection théorique (par exemple, de 1 UFC à 1,5 UFC par prise d'essai). Pour les bactéries fastidieuses, le
niveau bas peut dépasser significativement le niveau de détection théorique; il convient donc d’ajuster le
niveau bas et le niveau supérieur de manière appropriée. Il convient d’utiliser un rapport fixe (par exemple,
1:2) entre la contamination de niveau bas et de niveau supérieur pour faciliter la détermination des niveaux
de contamination finaux. Il convient que le niveau bas permette a minima d’obtenir des résultats positifs
partiels par la méthode de référence ou la méthode alternative (il convient que les résultats positifs partiels
au niveau bas soient compris entre 25 % et 75 % du nombre d’échantillons soumis à essai). Une évaluation
doit être effectuée pour contrôler la relation et la cohérence du nombre de résultats positifs des niveaux
intermédiaire et supérieur. Si la méthode alternative produit des résultats positifs partiels au niveau bas et
la méthode de référence produit des résultats entièrement positifs, les résultats de l'étude de RLOD ne sont
pas valides et une analyse des causes doit être effectuée.
Le niveau de contamination de l’échantillon utilisé (sauf pour le témoin négatif) doit être déterminé comme
en 5.1.4. Il convient de soumettre à essai par les deux méthodes au moins cinq réplicats du témoin négatif.
Au deuxième niveau (bas) (niveau de détection théorique), il convient de soumettre à essai par les deux
méthodes au moins 20 réplicats, et au troisième niveau (élevé), au moins 5. Le niveau de témoin négatif ne
doit pas produire de résultats positifs (par isolement de l’organisme cible). Lorsque des résultats positifs
sont obtenus, les essais doivent être répétés pour tous les niveaux.
5.1.4
Ajouter le texte suivant à la fin du paragraphe:
5.1.4.3 Calcul du LOD
Le LOD doit être calculé pour chaque catégorie pour la méthode alternative et facultativement pour la
méthode de référence. Le LOD est utilisé dans la vérification de la méthode (voir l’ISO 16140-3).
Pour chaque catégorie évaluée, déterminer la contamination du niveau bas en effectuant une analyse
du NPP à trois niveaux pour la matrice (d’aliment) particulière soumise à essai en utilisant la méthode de
référence (de préférence) au moment de l’essai de RLOD et/ou par dénombrement de l’inoculum au moment
de l’ensemencement à l’aide d’un milieu non sélectif. Lorsque le dénombrement est effectué, il convient de
déterminer l’inoculum pour les niveaux de contamination bas et élevé.
Le NPP et l’intervalle de confiance à 95 % doivent être déterminés pour le niveau partiel uniquement. Pour
le niveau de contamination bas (ou partiel), analyser 20 prises d’essai et 5 prises d’essai à environ 2 fois la
taille de la prise d’essai et 5 prises d’essai à environ la moitié de la taille de la prise d’essai évaluée lors de
l’étude de validation (par exemple si les prises d’essai de la méthode de référence étaient de 25 g, évaluer
5 prises d’essai à 50 g et 5 prises d’essai à 10 g). À chaque prise d’essai, ajouter une quantité proportionnelle
de bouillon d’enrichissement tel que décrit dans la méthode de référence pour maintenir le rapport volume/
masse d’enrichissement (par exemple, pour une méthode de référence avec un rapport d’enrichissement de
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr)
1:10, ajouter 450 ml aux prises d’essai de 50 g et 90 ml aux prises d’essai de 10 g). Analyser les prises d’essai
en respectant la méthode de référence de l’enrichissement à la confirmation. Utiliser le nombre de résultats
1)
positifs par taille de prise d’essai pour calculer la valeur du NPP. Un programme Excel® permettant de
calculer les valeurs du NPP peut être téléchargé gratuitement via le lien https:// standards .iso .org/ iso/ 7218
(télécharger le fichier «Programme Excel de calcul du NPP»).
Dénombrer l’inoculum au moment de l’inoculation par ensemencement sur de la gélose non sélective
(voir l’ISO 7218 pour des recommandations sur l’ensemencement). Il convient d’ensemencer les boîtes de
gélose dans des conditions propices à la croissance optimale du micro-organisme cible.
Utiliser le nombre de résultats positifs par taille de prise d’essai et la valeur du NPP ou les résultats du
dénombrement de l’inoculum pour calculer le LOD et l’intervalle de confiance à 95 %. Un programme Excel®
permettant de calculer les valeurs du LOD peut être téléchargé gratuitement via le lien https:// standards
.iso .org/ iso/ 16140/ -2/ ed -1/ en/ amd/ 1/ (télécharger le fichier «PODLOD_ver12»). La valeur du LOD est
calculée par catégorie soumise à essai dans l’étude de RLOD et doit être exprimée en UFC/prise d’essai.
NOTE Les 20 prises d’essai du niveau bas sont les mêmes que les 20 prises d’essai utilisées lors de l’étude de RLOD.
Par conséquent, seules 5 prises d’essai à 2 fois la taille de la prise d’essai et 5 prises d’essai à environ la moitié de la
taille de la prise d’essai sont analysées en complément de l’étude de RLOD.
5.2.1
Ajouter le texte suivant après la deuxième phrase du premier alinéa:
L'étude interlaboratoires doit être effectuée avec des collaborateurs de plusieurs pays.
Les collaborateurs doivent avoir les compétences pour effectuer la méthode de référence et la méthode
alternative.
NOTE Les compétences peuvent être démontrées de différentes manières (par exemple, pour la méthode de
référence, une preuve documentée de la conformité aux exigences de l’ISO/IEC 17025 et pour la méthode alternative,
une formation documentée).
5.2.2, troisième puce
Remplacer le texte par ce qui suit:
— au moins trois niveaux de contamination différents doivent être utilisés: un témoin négatif (L ) et deux
niveaux (L et L ). Au moins l’un des deux doit produire des résultats positifs partiels. Le niveau de
1 2
contamination nécessaire pour obtenir des résultats positifs partiels doit être basé sur les données
d'étude de RLOD de la méthode de référence obtenues lors de l'étude comparative des méthodes.
En théorie, un niveau de contamination moyen de 1 UFC/échantillon est adéquat pour obtenir des résultats
positifs partiels. Le niveau de contamination doit être déterminé. Cela permet de calculer le LOD de la
méthode alternative, qui est requis afin de vérifier la performance de la méthode alternative lors de la
mise en œuvre de la méthode validée dans un laboratoire conformément à l’ISO 16140-3. Le niveau de
contamination est déterminé en effectuant une analyse du NPP au début de l’étude interlaboratoires, voir
5.2.4.4.
5.2.3, titre
Remplacer le texte par ce qui suit:
Résumé des données et calcul de la justesse
1) Excel® est un exemple d’un produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée par souci
de commodité à l'intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l'ISO à l’égard
de ce produit.
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr)
5.2.3, après le troisième alinéa
Remplacer le texte par ce qui suit:
Tableau 9 — Récapitulatif des résultats de tous les collaborateurs pour une étude de méthodes
appariées
Résultat de la méthode (de référence ou alternative) en fonction de l’échantillon
Méthode Méthode Méthode alternative Interprétation
a b
de référence alternative après confirmation (sur la base du résultat de la méthode
alternative après confirmation)
c
+ + Non requise Accord positif (PA)
c
- - Non requise Accord négatif (NA)
Déviation négative due à un résultat faux négatif de
c
+ - Non requise
la méthode alternative (ND )
FN(alt)
- + + Déviation positive (PD)
Déviation positive due à un résultat faux positif de la
- + -
d
méthode alternative (PD )
FP(alt)
a
Le résultat de la méthode alternative comprend les confirmations décrites dans le protocole de la méthode alternative.
b
Le résultat de la méthode alternative après confirmation est le résultat après confirmation supplémentaire tel qu’il est décrit
dans le protocole de l’étude de validation.
c
Aucun essai de confirmation supplémentaire n’est nécessaire. Le résultat de la méthode alternative après confirmation est
identique au résultat de la méthode alternative.
d
Ce résultat faux positif (FP) doit également être utilisé pour calculer le rapport des résultats faux positifs.
Tableau 10 — Récapitulatif des résultats de tous les collaborateurs pour une étude de méthodes non
appariées
Résultat de la méthode (de référence ou alternative) en fonction de l’échantillon
Méthode Méthode Méthode alternative Interprétation
a b
de référence alternative après confirmation (sur la base du résultat de la méthode
alternative après confirmation)
+ + + Accord positif (PA)
Accord positif dû à un résultat faux positif de la
+ + -
c
méthode alternative (PA )
FP(alt)
- - - Accord négatif (NA)
Accord négatif dû à un résultat faux négatif de la
- - +
méthode alternative (NA )
FN(alt)
+ - - Déviation négative (ND)
Déviation négative due à un résultat faux négatif de
+ - +
la méthode alternative (ND )
FN(alt)
- + + Déviation positive (PD)
Déviation positive due à un résultat faux positif de la
- + -
méthode alternative (PD )
FP(alt)
a
Le résultat de la méthode alternative comprend les confirmations décrites dans le protocole de la méthode alternative.
b
Le résultat de la méthode alternative après confirmation est le résultat après confirmation supplémentaire tel qu’il est décrit
dans le protocole de l’étude de validation.
Déterminer la déviation négative totale (TND) et l’accord négatif total (TNA) pour l’étude de validation.
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr)
Évaluation des méthodes appariées: Déviation négative totale: TND = ND
FN(alt)
Accord négatif total: TNA = NA + PD
FP(alt)
Évaluation des méthodes non appariées: Déviation négative totale: TND = ND + ND + PA
FN(alt) FP(alt)
Accord négatif total: TNA = NA + NA + PD
FN(alt) FP(alt)
Tableau 11 — Récapitulatif des résultats de tous les collaborateurs, obtenus avec la méthode
de référence et la méthode alternative (après confirmation) pour le niveau L ou L
1 2
Résultat positif de la méthode Résultat négatif de la méthode
de référence de référence
(R+) (R−)
Résultat positif de la méthode +/+ −/+
alternative (A+) Accord positif (PA) Déviation positive (PD)
Résultat négatif de la méthode +/− −/−
alternative (A−) Déviation négative totale (TND) Accord négatif total (TNA)
D’après les données récapitulées dans le Tableau 11, calculer les valeurs de sensibilité de la méthode
alternative [voir Formule (8)] et de la méthode de référence [voir Formule (9)], ainsi que la justesse relative
[voir Formule (10)] et le rapport de résultats faux positifs pour la méthode alternative après confirmation
supplémentaire des résultats [voir Formule (11)].
Sensibilité de la méthode alternative:
()PA+PD
SE = ×100% (8)
alt
PA++TNDPD
()
Sensibilité de la méthode de référence:
()PA+TND
SE = ×100% (9)
ref
PA++TNDPD
()
Justesse relative:
()PA+TNA
RT= ×100% (10)
N
Rapport des résultats faux positifs (FPR) et des résultats faux négatifs (FNR) pour la méthode alternative:
PD
FP()alt
Évaluation desméthodesappariées : FPR =×100 %
TNA
(11)
PA + PD
FP()altFPa()lt
Évaluuation desméthodesnon appariées : FPR= ××100 %
TNA
NA + ND
FN altFN aalt
() ()
Rapport des résultats faux négatifsF: NR =
PA ++TNDP D
où
N est le nombre total d’échantillons (TNA + PA + PD + TND);
FP correspond aux résultats faux positifs;
FN correspond aux résultats faux négatifs.
Pour une explication des abréviations utilisées, voir les Tableaux 9 à 11.
ISO 16140-2:2016/Amd.1:2024(fr)
Les résultats de la méthode alternative après confirmation doivent être utilisés pour déterminer si la
méthode alternative produit des résultats comparables à ceux de la méthode de référence.
5.2.4
Remplacer le texte par ce qui suit:
5.2.4 Interprétation des données de justesse
5.2.4.1 Étude de méthodes appariées
Pour une étude de méthodes appariées, calculer la différence entre (TND – PD) et la somme de (TND + PD)
pour les niveaux où des résultats positifs partiels ont été obtenus (soit L et éventuellement L ). Les valeurs
1 2
trouvées pour (TND – PD) et (TND + PD) ne doivent pas dépasser les limites d’acceptabilité (AL) données
dans le Tableau 12 en ce qui concerne le nombre de laboratoires participants (N ).
lab
Tableau 12 — Limites d’acceptabilité pour une étude de méthodes appariées en fonction du nombre
de laboratoires participants
N (TND – PD) (TND + PD)
lab
10 3 4
11 4 4
12 à 13 4 5
14 à 16 4 6
17 4 7
18 5 7
19 à 20 5 8
L'AL n’est pas satisfaisante lorsque la valeur observée est supérieure à l’AL. Lorsque l’AL n’est pas
satisfaisante, il convient de faire des recherches (par exemple, une analyse des causes) pour donner une
explication des résultats observés. D’après l’AL et les informations supplémentaires, la décision de considérer
la méthode alternative comme inadaptée est prise. Si l’AL n’est pas satisfaisante, les raisons de l’acceptation
de la méthode alternative doivent être indiquées dans le rapport d’étude.
5.2.4.2 Étude de méthodes non appariées
Pour une étude de méthodes non appariées, calculer la différence entre (TND – PD) pour les niveau
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