ISO 16140-2:2016

NORME ISO
INTERNATIONALE 16140-2
Première édition
2016-06-15
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Validation des
méthodes —
Partie 2:
Protocole pour la validation de
méthodes alternatives (commerciales)
par rapport à une méthode de
référence
Microbiology of the food chain — Method validation —
Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary)
methods against a reference method
Numéro de référence
ISO 16140-2:2016(F)
©
ISO 2016

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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
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ISO 16140-2:2016(F)

Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principes généraux de la validation des méthodes alternatives . 1
5 Méthodes qualitatives — Protocole technique de validation . 2
5.1 Étude comparative des méthodes . 2
5.1.1 Considérations générales . 2
5.1.2 Étude de méthodes appariées ou non appariées . 2
5.1.3 Étude de sensibilité . 3
5.1.4 Étude de niveau relatif de détection . 7
5.1.5 Étude d’inclusivité et étude d’exclusivité. 9
5.2 Étude interlaboratoires .11
5.2.1 Considérations générales .11
5.2.2 Protocole de mesure .11
5.2.3 Calculs et récapitulatif des données .12
5.2.4 Interprétation des données .15
6 Méthodes quantitatives — Protocole technique de validation .17
6.1 Étude comparative des méthodes .17
6.1.1 Considérations générales .17
6.1.2 Étude de justesse relative .17
6.1.3 Étude du profil d’exactitude .21
6.1.4 Étude de la limite de quantification .25
6.1.5 Étude d’inclusivité et étude d’exclusivité.26
6.2 Étude interlaboratoires .27
6.2.1 Considérations générales .27
6.2.2 Protocole de mesure .28
6.2.3 Calculs, récapitulatif et interprétation des données .29
Annexe A (informative) Classification de types d’échantillon et suggestions de
combinaisons cibles pour les études de validation.32
Annexe B (normative) Ordre de préférence pour l’utilisation d’échantillons naturellement
et artificiellement contaminés dans les études de validation .48
Annexe C (informative) Protocoles généraux de contamination par mélange et de
contamination artificielle d’aliments .49
Annexe D (informative) Modèles de calcul de RLOD en utilisant les données provenant de
l’étude comparative des méthodes .52
Annexe E (normative) Aspects à prendre en compte lors du choix des souches pour les
études d’inclusivité et d’exclusivité .54
Annexe F (informative) Considérations pour les calculs du niveau de détection relatif
(RLOD) entre laboratoires effectués dans le cadre d’une étude interlaboratoires .56
Annexe G (informative) Principe du profil d’exactitude pour la validation de
modèles quantitatifs .59
Annexe H (informative) Application du profil d’exactitude dans l’étude comparative
des méthodes .61
Annexe I (informative) Exemple d’application du profil d’exactitude pour une
étude interlaboratoires .64
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Bibliographie .68
iv © ISO 2016 – Tous droits réservés

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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 9, Microbiologie.
Cette première édition de l’ISO 16140-2, conjointement avec l’ISO 16140-1, annule et remplace
l’ISO 16140:2003. Cette édition constitue une révision technique. Elle incorpore également
l’Amendement ISO 16140:2003:Amd.1:2011.
L’ISO 16140 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Validation des méthodes:
— Partie 1: Vocabulaire
— Partie 2: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) par rapport à une
méthode de référence
Les parties suivantes sont en cours de préparation:
— Partie 3: Protocole de vérification de méthodes de référence et alternatives validées appliquées dans un
laboratoire
— Partie 4: Protocole pour la validation de méthodes de laboratoire (internes)
— Partie 5: Protocole pour la validation interlaboratoires de méthodes non commerciales par plan factoriel
— Partie 6: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) pour la confirmation
microbiologique et le typage
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Introduction
De nombreuses méthodes alternatives, qui sont pour la plupart commerciales, sont actuellement
utilisées pour évaluer la qualité microbiologique de matières premières et de produits finis ainsi que
l’état microbiologique de l’environnement de production. Ces méthodes sont souvent plus rapides
et plus faciles à mettre en œuvre que la méthode normalisée correspondante. Les développeurs, les
utilisateurs finaux et les autorités ont besoin d’un protocole commun et fiable permettant de valider ces
méthodes alternatives. Les données obtenues fourniront également aux utilisateurs finaux potentiels
des données de performance pour une méthode donnée, leur permettant ainsi de faire un choix réfléchi
concernant l’adoption d’une méthode particulière. Ces données obtenues peuvent également constituer
la base de la certification d’une méthode par un organisme indépendant.
La présente partie de l’ISO 16140:
— vise à fournir un protocole et des lignes directrices spécifiques pour la validation des méthodes
commerciales plus rapides et plus faciles à mettre en œuvre que la méthode de référence
correspondante,
— peut également être appliquée pour la validation d’autres méthodes non commerciales, utilisées à la
place de la méthode de référence,
— vise à remplacer le protocole de validation publié dans la première version de l’ISO 16140
(ISO 16140:2003), et
— est principalement rédigée pour la validation de méthodes permettant de cultiver le micro-
organisme cible, mais peut également être appliquée aux méthodes relatives aux micro-organismes
non cultivables, notamment les virus (par exemple le norovirus) et les parasites protozoaires (par
exemple Cryptosporidium ou Giardia). Dans ces cas-là, certaines expressions doivent être interprétées
pour s’adapter à la situation des organismes non cultivables.
L’application de la présente partie de l’ISO 16140 requiert une expertise des domaines tels que la
microbiologie, la réalisation de plans d’expérience et l’analyse statistiques, comme indiqué dans les
parties respectives. L’expertise statistique comprend un aperçu de la théorie de l’échantillonnage,
des plans d’expériences, des analyses statistiques de données microbiologiques (qualitatives et
quantitatives) et un aperçu de concepts statistiques relatifs à l’échantillonnage aléatoire, l’hétérogénéité
de l’échantillon, la stabilité de l’échantillon, les plans d’expériences et les composantes de la variance.
Lorsque la présente partie de l’ISO 16140 sera réexaminée, il sera tenu compte de tous les renseignements
disponibles à ce moment-là, à savoir dans quelle mesure les lignes directrices auront été suivies et les
raisons pour lesquelles il aura été nécessaire d’y déroger dans le cas de produits particuliers.
L’harmonisation des méthodes de validation ne peut pas être immédiate. Pour certains groupes de
produits, des Normes internationales et/ou nationales dont les méthodes ne sont pas conformes à la
présente partie de l’ISO 16140, peuvent déjà avoir été publiées. Il y a lieu d’espérer que les révisions de
ces normes conduiront à leur modification afin d’être en conformité avec l’ISO 16140 et que, dans le
futur, les écarts restants par rapport à la présente partie de l’ISO 16140 seront uniquement des écarts
[3]
justifiés sur le plan technique. Par exemple, l’ISO 16297 traite d’une validation très particulière pour
un produit donné (l’état hygiénique des échantillons de lait cru) et conservera son statut de norme
verticale en parallèle de l’ISO 16140. Si cette validation est nécessaire, la norme verticale prévaut.
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NORME INTERNATIONALE ISO 16140-2:2016(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des
méthodes —
Partie 2:
Protocole pour la validation de méthodes alternatives
(commerciales) par rapport à une méthode de référence
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 16140 établit le principe général ainsi que le protocole technique de validation
des méthodes alternatives, qui sont pour la plupart commerciales, dans le domaine de la microbiologie
de la chaîne alimentaire. Les études de validation conformément à la présente partie de l’ISO 16140 sont
destinées à être effectuées par des organismes impliqués dans la validation de méthode.
La présente partie de l’ISO 16140 est applicable à la validation de méthodes pour l’analyse (détection ou
quantification) de micro-organismes présents dans:
— les produits destinés à la consommation humaine,
— les produits destinés à l’alimentation animale,
— les échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manutention de
produits alimentaires, et
— les échantillons au stade de la production primaire.
La présente partie de l’ISO 16140 est notamment applicable aux bactéries et aux champignons. Certains
paragraphes de la présente partie de l’ISO 16140 peuvent être applicables à d’autres micro-organismes
ou à leurs métabolites au cas par cas. À l’avenir, des préconisations concernant d’autres organismes
(par exemple, virus et parasites) seront incluses dans la présente partie ou dans une partie distincte de
l’ISO 16140.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités en référence de manière normative, en intégralité ou en partie, dans
le présent document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule
l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence
s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 16140-1, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 2: Vocabulaire
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 16140-1 s’appliquent.
4 Principes généraux de la validation des méthodes alternatives
Le protocole de validation comprend deux étapes:
— une étude comparative de la méthode alternative (commerciale) par rapport à la méthode de
référence, réalisée au sein du laboratoire organisateur,
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— une étude interlaboratoires de la méthode alternative (commerciale) par rapport à la méthode de
référence, réalisée au sein de différents laboratoires.
Les règles techniques de réalisation de l’étude comparative des méthodes et de l’étude interlaboratoires
sont données dans l’Article 5 et dans l’Article 6, en fonction de la nature qualitative ou quantitative
de la méthode alternative (commerciale). Les données obtenues dans certaines parties de l’étude de
validation sont évaluées à l’aide des limites d’acceptabilité (AL) et aucune évaluation statistique des
données n’est effectuée. Ces AL reposent sur le jugement des experts et sur les données obtenues lors
des études de validation existantes.
5 Méthodes qualitatives — Protocole technique de validation
5.1 Étude comparative des méthodes
5.1.1 Considérations générales
L’étude comparative des méthodes est la partie du processus de validation effectuée au sein du
laboratoire organisateur. Elle comprend trois parties, à savoir:
— une étude comparative des résultats de la méthode de référence par rapport aux résultats de la
méthode alternative des échantillons (naturellement et/ou artificiellement) contaminés (appelée
étude de sensibilité),
— une étude comparative permettant de déterminer le niveau de détection relatif (RLOD) dans des
échantillons artificiellement contaminés (appelée étude RLOD),
— une étude d’inclusivité/d’exclusivité de la méthode alternative.
Les résultats (tableaux et calculs) des différentes parties et l’interprétation des résultats, y compris des
résultats divergents, doivent être consignés dans un rapport d’étude.
La taille des prises d’essai utilisées doit être celle indiquée dans la méthode de référence.
5.1.2 Étude de méthodes appariées ou non appariées
Les méthodes de référence et alternative doivent être réalisées avec, dans la mesure du possible, avec
un échantillon exactement identique (même prise d’essai). Cependant, il existe une distinction entre les
études dans lesquelles la même prise d’essai peut être utilisée pour la méthode de référence et pour la
méthode alternative, puisque les deux méthodes comportent exactement la même étape initiale dans le
protocole (d’enrichissement) et les études dans lesquelles deux prises d’essais sont nécessaires afin d’en
utiliser une pour la méthode de référence et une pour la méthode alternative (par exemple, en raison
de bouillons d’enrichissement différents). Dans le cas où la même prise d’essai est utilisée pour les deux
méthodes, les résultats desdites méthodes sont étroitement liés les uns aux autres. Par exemple, pour
un échantillon non contaminé, il convient que les deux méthodes aboutissent à un résultat négatif. En
raison de cette relation, les données produites par la méthode de référence et la méthode alternative
sont nommées «données appariées». Dans la présente partie de l’ISO 16140, l’expression «étude de
méthodes appariées» sera utilisée pour ce type d’étude.
La situation contraire est également possible lorsque l’étape (d’enrichissement) initiale des méthodes
de référence et alternative n’est pas commune. Dans ce cas, deux prises d’essai, prélevées du même
lot de produit, doivent être utilisées pour les deux méthodes et les données obtenues sont nommées
«données non appariées». Dans la présente partie de l’ISO 16140, l’expression «étude de méthodes
non appariées» sera utilisée pour ce type d’étude. Le fait d’obtenir une étude de méthodes appariées
ou non appariées dépend des protocoles de la méthode de référence et de la méthode alternative. Si
l’étape initiale des protocoles (d’enrichissement) est commune aux deux méthodes, le modèle d’étude de
méthodes appariées est obligatoire.
Ce paragraphe décrit l’étude comparative des méthodes pour le cas où l’étape initiale du protocole
(d’enrichissement) de la méthode de référence et de la méthode alternative est identique (étude de
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méthodes appariées) et pour le cas contraire (étude de méthodes non appariées). Les différences
entre ces deux types d’études sont spécifiées dans le texte, lorsque nécessaire.
5.1.3 Étude de sensibilité
L’étude de sensibilité vise à déterminer la différence de sensibilité entre la méthode de référence
et la méthode alternative. Cette étude est effectuée en utilisant des échantillons naturellement
et/ou artificiellement contaminés. Différents types et catégories doivent être soumis à essai à cette
fin. Des limites d’acceptabilité ont été définies pour la différence maximale acceptable en fonction du
type d’étude (études de méthodes appariées/études de méthodes non appariées) et du nombre de
catégories soumises à essai.
5.1.3.1 Sélection des catégories devant être utilisées
La sélection des catégories et des types utilisés pour la validation dépendra du type ou du groupe du
micro-organisme et du domaine d’application de la validation.
Si la méthode est destinée à être appliquée à une vaste gamme d’aliments, alors au moins cinq catégories
d’aliment doivent être étudiées. Le rapport d’étude de validation doit mentionner les catégories
d’aliment utilisées dans cette étude. Si la méthode doit être validée pour un nombre limité de catégories
d’aliment, par exemple pour les catégories «produits à base de viande prêts à consommer ou prêts à
réchauffer» et «lait et produits laitiers pasteurisés traités thermiquement», alors seules ces catégories
ont besoin d’être étudiées. Outre les aliments, des échantillons prélevés sur des aliments pour animaux,
dans l’environnement et au stade de la production primaire peuvent être inclus comme catégories
supplémentaires. Cela permettra d’élargir l’application de l’utilisation de la méthode alternative pour
ces catégories supplémentaires.
Pour toutes les catégories sélectionnées (aliments et autres), au moins trois types différents par
catégorie doivent être compris dans l’étude. L’Annexe A présente un aperçu des catégories et des types
par micro-organisme particulier pouvant être pertinents pour la validation. Il convient d’utiliser
l’Annexe A pour faciliter la sélection des catégories, des types et des matrices en fonction du micro-
organisme particulier impliqué. Il convient de ne pas la considérer comme étant obligatoire.
Lors de la sélection des échantillons pour l’étude, trouver les échantillons naturellement contaminés est
une priorité absolue. S’il n’est pas possible d’obtenir un nombre suffisant d’échantillons naturellement
contaminés, l’utilisation d’échantillons artificiellement contaminés est permise (voir les Annexes B
et C). Il convient de fournir tous les détails relatifs à la préparation des échantillons artificiellement
ensemencés dans le rapport d’étude de validation. Il est souhaitable que la nature des échantillons
d’aliment choisis soient aussi diversifiée que possible afin de réduire tout biais lié aux spécialités
alimentaires locales et d’élargir le domaine de validation.
La sélection des différents types doit permettre d’inclure dans l’étude à la fois des échantillons
présentant une microflore annexe (naturelle) élevée ou faible, ainsi que différents types de stress, en
fonction de la transformation ou non des produits.
EXEMPLE Pour la validation d’une méthode pour le dénombrement de Listeria monocytogenes et de la
catégorie «produits à base de viande prêts à consommer ou prêts à réchauffer», les types peuvent être (1) produits
cuits (flore annexe faible, stress à la chaleur), (2) produits de salaison ou fermentés (flore annexe élevée, stress au
pH) et (3) viandes crues de salaison (fumées) (a < 0,92) (flore annexe intermédiaire, stress osmotique a ).
w w
Dans certains cas, par exemple pour une méthode alternative applicable à une vaste gamme d’aliments,
il est possible de combiner les catégories «prêt à consommer» et «cru» à partir d’un même groupe
de produit. Par exemple, les catégories de viandes (ou de produits à base de viande) crues et prêtes
à consommer peuvent être combinées en seule catégorie sous-divisée en trois types divisés selon
les types d’aliment pertinents crus et prêts à consommer. Il convient que la sélection des catégories
d’aliment (combinées) repose sur l’analyse des risques.
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5.1.3.2 Nombre d’échantillons
Pour chaque catégorie soumise à examen, un minimum de 60 échantillons individuels constitués d’au
moins trois types contenant au moins 20 échantillons représentatifs par type doit être soumis à essai
(trois types × 20 échantillons pour chaque type = 60 échantillons). Des résultats positifs partiels doivent
être obtenus pour chaque type soumis à essai, avec la méthode de référence ou alternative (c’est-à-dire
qu’il convient que les échantillons ne soient pas tous positifs ou tous négatifs). Idéalement, il convient
que 10 échantillons (50 %) soumis à essai par type soient positifs et que 10 échantillons soient négatifs,
l’intervalle devant s’étendre de 25 % à 75 %. Pour chaque catégorie, au moins 30 échantillons doivent
avoir un résultat positif par la méthode de référence et/ou alternative.
5.1.3.3 Résultat de la méthode alternative et confirmation
De nombreux protocoles de méthodes alternatives comprennent deux étapes, la première étant l’étape
d’enrichissement et de détection, et la deuxième étant la confirmation du résultat de détection obtenu
lors de la première étape. Le résultat final de la méthode alternative est le résultat obtenu après la
deuxième étape. Le résultat final sera identique au résultat obtenu après enrichissement et détection si
aucune étape de confirmation n’est incluse dans le protocole de la méthode alternative.
Dans l’étude de sensibilité, le résultat (final) de la méthode alternative doit être confirmé. Dans l’étude
de méthodes non appariées, tous les résultats obtenus avec la méthode alternative doivent être
confirmés. Dans l’étude de méthodes appariées, seuls les résultats positifs obtenus avec la méthode
alternative, pour lesquels le résultat correspondant avec la méthode de référence était négatif, doivent
être confirmés. Cette confirmation est nécessaire pour déterminer si le résultat est un vrai positif
ou un faux positif. Le ou les essai(s) de confirmation doit/doivent permettre de récupérer un isolat et
de le confirmer comme étant la cible de la méthode. Ce(s) essai(s) peut/peuvent reposer sur le mode
opératoire de confirmation de la méthode de référence, sur l’étape de confirmation de la méthode
alternative si ce mode opératoire permet d’isoler et de confirmer l’identité de l’analyte cible, sur
une combinaison des deux, ou sur tout autre moyen permettant d’isoler et de confirmer l’identité de
l’analyte cible.
Si les bouillons d’enrichissement des méthodes de référence et alternative diffèrent en termes de
nombre de bouillons d’enrichissement (par exemple, primaires/non sélectifs et secondaires/sélectifs)
ou de durée totale d’incubation, une voie de confirmation supplémentaire de l’étude de validation est
nécessaire. La première voie doit être celle utilisée dans la mét
...