ISO/TS 15213-3:2024

Spécification
technique
ISO/TS 15213-3
Première édition
Microbiologie de la chaîne
2024-05
alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche et le
dénombrement de Clostridium spp. —
Partie 3:
Recherche de Clostridium
perfringens
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
detection and enumeration of Clostridium spp. —
Part 3: Detection of Clostridium perfringens
Numéro de référence
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2024
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 3
4.1 Généralités .3
4.2 Enrichissement en milieu sélectif liquide .3
4.3 Isolement sur milieu sélectif solide .3
4.4 Confirmation .3
5 Milieux de culture et réactifs . 3
6 Appareillage et consommables . 3
7 Échantillonnage . 4
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 5
9 Mode opératoire . 5
9.1 Généralités .5
9.2 Prise d’essai et suspension mère .5
9.3 Enrichissement sélectif .5
9.4 Isolement .5
9.5 Confirmation de C. perfringens .6
9.5.1 Sélection des colonies à confirmer .6
9.5.2 Essai à la phosphatase acide .6
9.5.3 Essai sur gélose SIM (Mobilité indole sulfite) .7
9.5.4 Différenciation entre souches de C. perfringens pathogènes et non pathogènes
pour l’Homme (facultatif) .7
9.5.5 Interprétation .7
10 Expression des résultats . 7
11 Caractéristiques de performance indicatives de la méthode . 7
11.1 Validation basée sur les principes de l’ISO 17468 .7
11.2 Caractéristiques de performance indicatives .7
12 Rapport d’essai . 10
13 Contrôle qualité . 10
Annexe A (normative) Logigramme du mode opératoire .11
Annexe B (normative) Milieux de culture et réactifs .12
Annexe C (informative) Caractéristiques de performance indicatives de la méthode utilisant la
gélose d’isolement TSC et l’essai de confirmation à la phosphatase acide .21
Annexe D (informative) Caractéristiques de performance indicatives de la méthode utilisant
la gélose d’isolement TSC et l’essai sur gélose SIM .24
Annexe E (informative) Caractéristiques de performance indicatives de la méthode utilisant la
gélose d’isolement LENA et l’essai de confirmation à la phosphatase acide .27
Annexe F (informative) Caractéristiques de performance indicatives de la méthode utilisant
la gélose d’isolement LENA et l’essai de confirmation sur gélose SIM .30
Annexe G (informative) Différenciation moléculaire entre Clostridium perfringens pathogènes
et non pathogènes .33
Bibliographie .34

iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de propriété revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de
brevets.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la chaîne alimentaire,
du Comité européen de normalisation (CEN), conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO
et le CEN (Accord de Vienne).
Une liste de toutes les parties de la série ISO 15213 se trouve sur le site Web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.

iv
Introduction
Clostridium (C.) perfringens est une bactérie à coloration de Gram positive, anaérobie, formant des spores.
S’agissant d’une bactérie ubiquitaire, C. perfringens se trouve principalement dans le sol, mais également
dans le tube digestif des humains et des animaux. La présence d’un nombre élevé de C. perfringens peut donc
indiquer une préparation ou une manipulation inadéquate des produits alimentaires.
Un nombre élevé de C. perfringens dans les aliments prêts à consommer peut provoquer des maladies chez
l’Homme, qui se traduisent essentiellement par une diarrhée. Les souches sont classées par type toxinique,
selon leur capacité à produire différentes toxines dites «majeures» et «mineures». Les toxi-infections
alimentaires liées à C. perfringens sont essentiellement causées par des isolats de C. perfringens qui
produisent l’entérotoxine CPE (Clostridium Perfringens Enterotoxin).
Un élément caractéristique est la thermorésistance des spores; elles ont la capacité de germer et de se
multiplier dans les aliments prêts à consommer après le processus de cuisson. L’ingestion d’aliments
contaminés est suivie d’une maladie gastro-intestinale lorsque les entérotoxines de C. perfringens, capables
de résister à la lyse enzymatique, sont libérées pendant la phase de sporulation dans l’intestin grêle.
Les souches sont classées par type.
Le présent document décrit la méthode horizontale pour la recherche de C. perfringens dans les aliments,
les aliments pour animaux, les échantillons environnementaux et les échantillons prélevés au stade de la
production primaire. La méthode de dénombrement des bactéries Clostridium spp. Sulfito-réductrices est
décrite dans l’ISO 15213-1 et l’ISO 15213-2 décrit la méthode de dénombrement de C. perfringens. Ces trois
parties sont publiées dans le cadre d’une série de Normes internationales, car les méthodes sont étroitement
liées les unes aux autres. Ces méthodes sont souvent mises en œuvre consécutivement dans un laboratoire.

v
Spécification technique ISO/TS 15213-3:2024(fr)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche et le dénombrement de
Clostridium spp. —
Partie 3:
Recherche de Clostridium perfringens
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que les
analyses de recherche de Clostridium perfringens ne soient effectuées que dans des laboratoires
correctement équipés, sous la surveillance d’un microbiologiste expérimenté, et qu’un grand
soin soit apporté à l’élimination de tous les matériaux contaminés. Il convient que les utilisateurs
du présent document connaissent les pratiques normales de laboratoire. Le présent document ne
prétend pas traiter la totalité des aspects liés à la sécurité qui pourraient découler de son utilisation.
Il incombe à l’utilisateur de mettre en place des pratiques de santé et de sécurité appropriées.
1 Domaine d’application
Le présent document définit la recherche de Clostridium (C.) perfringens.
Le présent document s’applique:
— aux produits destinés à la consommation humaine;
— aux produits destinés à l’alimentation animale;
— aux échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la distribution des
aliments;
— aux échantillons issus du stade de la production primaire.
Cette méthode horizontale a été initialement développée pour l’examen de tous les échantillons provenant
de la chaîne alimentaire. Sur la base des informations disponibles au moment de la publication du présent
document, cette méthode est considérée comme parfaitement adaptée à l’examen de tous les échantillons
provenant de la chaîne alimentaire. Cependant, en raison de la grande diversité des produits de la chaîne
alimentaire, il est possible que cette méthode horizontale ne soit pas appropriée dans ses moindres détails à
tous les produits. Néanmoins, il est attendu que les modifications requises soient réduites au minimum afin
qu’elles n’entraînent pas de déviation significative de cette méthode horizontale.
NOTE Des études interlaboratoires avec un petit nombre de laboratoires participants (<10) ont été réalisées pour
les catégories d’aliments suivants:
— les produits à base de viande prêts à consommer et prêts à réchauffer;
— les œufs et ovoproduits (dérivés);
— les produits à base de poisson prêts à consommer et prêts à réchauffer;
— les fruits et légumes transformés;
— les préparations et céréales pour nourrissons (avec probiotiques);
— les aliments composés et les composants de repas.

La méthode a également été validée avec un petit nombre de laboratoires participants pour la catégorie
suivante:
— les échantillons environnementaux (production d’aliments ou d’aliments pour animaux).
Étant donné que cette méthode n’est pas couramment utilisée pour les échantillons au stade de la production
primaire, cette catégorie n’a pas été incluse dans l’étude interlaboratoires. Par conséquent, aucune
caractéristique de performance n’a été déterminée pour cette catégorie. La méthode n’a pas été validée pour
la catégorie «aliments pour animaux», car les échantillons pour essai utilisés dans l’étude interlaboratoires
étaient déjà naturellement contaminés par C. perfringens. Étant donné le nombre limité de laboratoires
participants dans les études interlaboratoires, les caractéristiques de performance calculées peuvent être
utilisées comme valeurs indicatives pour la performance de la méthode. Pour de plus amples informations
sur la validation, voir l’Article 11 et les Annexes C à F.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations pour les examens
microbiologiques
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
C. perfringens présumées
Clostridium perfringens présumées
bactéries sporulées formant des colonies caractéristiques sur un milieu sélectif spécifique dans des
conditions d’anaérobiose strictes
Note 1 à l'article: Les colonies de C. perfringens présumées sont des bactéries formant des spores qui sont capables de
produire des colonies caractéristiques dans les conditions spécifiées dans le présent document.
3.2
C. perfringens confirmées
Clostridium perfringens confirmées
bactéries qui produisent des colonies caractéristiques sur le milieu sélectif spécifié dans des conditions
d’anaérobiose strictes et qui possèdent l’enzyme phosphatase acide, ou sont capables de produire des
sulfites, ne sont pas capables de produire de l’indole et ne sont pas mobiles (gélose Sulfate Indole Motility)

3.3
C. perfringens pathogènes pour l’Homme
Clostridium perfringens pathogènes pour l’Homme
souches de C. perfringens confirmées (3.2) qui sont capables de produire l’entérotoxine CPE, codée par le
gène cpe
Note 1 à l'article: Le gène cpe peut être localisé sur le chromosome ou sur des grands plasmides. Ces isolats sont
capables de produire la CPE dans l’intestin grêle pendant la sporulation et de provoquer des maladies chez l’Homme.
3.4
recherche de C. perfringens
recherche de Clostridium perfringens
détermination de colonies confirmées de C. perfringens (3.2) dans une masse, un volume de produit, sur
une surface ou un objet donnés, lorsqu’un essai spécifié est réalisé
Note 1 à l'article: Les essais spécifiés sont présentés à l’Article 9.
4 Principe
4.1 Généralités
La recherche de C. perfringens requiert trois étapes successives telles que spécifiées à l’Annexe A.
4.2 Enrichissement en milieu sélectif liquide
Un milieu de culture sélectif (à température ambiante) est ensemencé avec une quantité déterminée de
l’échantillon pour essai si le produit initial est liquide, ou avec une quantité déterminée d’une suspension
mère dans le cas d’autres produits. Le milieu sélectif ensemencé est incubé à 46 °C pendant 18 h.
4.3 Isolement sur milieu sélectif solide
À partir des cultures obtenues en 4.2, deux milieux sélectifs gélosés sont ensemencés. Les boîtes sont
incubées à 37 °C et à 46 °C respectivement pendant 24 h en anaérobiose.
4.4 Confirmation
Des essais de confirmation sont réalisés. Le résultat est exprimé en tant que C. perfringens «détecté» ou «non
détecté» par volume d’échantillon. En complément, la méthode mentionnée à l’Annexe G peut être utilisée
pour une différenciation moléculaire entre les souches de C. perfringens non pathogènes et pathogènes pour
l’Homme.
5 Milieux de culture et réactifs
Suivre les pratiques courantes de laboratoire conformément à l’ISO 7218. La composition des milieux de
culture et des réactifs ainsi que leur préparation sont spécifiées à l’Annexe B. Pour les essais de performance
des milieux de culture, suivre les modes opératoires conformément à l’ISO 11133 et à l’Annexe B.
6 Appareillage et consommables
Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, à condition que ses
spécifications soient appropriées. L’appareillage courant de laboratoire de microbiologie (voir ISO 7218) et,
en particulier, ce qui suit doit être utilisé.
6.1 Appareillage approprié pour créer une anaérobiose, une jarre pouvant être hermétiquement
fermée ou tout autre équipement approprié permettant de créer et maintenir les conditions d’anaérobiose
pendant toute la durée d’incubation du milieu de culture. D’autres systèmes offrant des résultats équivalents,

tels que des chambres/enceintes anaérobies, peuvent être utilisés. Suivre les instructions du fabricant pour
leur installation et leur entretien.
La composition de l’atmosphère requise peut être obtenue par ajout d’un mélange de gaz (par exemple à
partir d’une bouteille de gaz) après évacuation de l’air de la jarre, par déplacement de l’atmosphère dans une
chambre ou par tout autre moyen approprié (comme des cartouches de gaz disponibles dans le commerce).
En règle générale, l’incubation en anaérobie nécessite une atmosphère contenant une fraction volumique
d’oxygène inférieure à 1 % et une fraction volumique de dioxyde de carbone comprise entre 9 % et 13 %.
6.2 Appareillage pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave)
6.3 Enceinte de séchage, ou four, ventilée, réglable entre 25 °C et 50 °C.
6.4 Congélateurs, réglable à −20 °C ± 2 °C et en dessous de −70 °C.
6.5 Étuve(s), réglable(s) à 37 °C ± 1 °C, 46 °C ± 1 °C.
6.6 pH-mètre, avec une précision d’étalonnage de ± 0,1 unité de pH à 25 °C.
6.7 Réfrigérateur, fonctionnant à 5 °C ± 3 °C.
6.8 Flacons, fioles ou tubes stériles, d’une capacité appropriée. Des flacons, fioles ou tubes avec des
capuchons à vis, en métal ou en plastique non toxiques, peuvent être utilisés.
6.9 Pipettes graduées ou pipettes automatiques stériles, de capacités nominales de 10 ml et 1 ml.
6.10 Anses stériles, d’environ 3 mm de diamètre (volume de 10 µl) et d’un volume de 1 µl, ou aiguille ou fil
à ensemencer (oëse métallique).
6.11 Boîtes de Petri stériles, d’un diamètre d’environ 90 mm.
6.12 Bain-marie à régulation thermostatique, réglable à une température comprise entre 44 °C et 47 °C.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Suivre la Norme
internationale spécifique du produit concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique traitant
de l’échantillonnage du produit concerné, il est recommandé que les parties concernées parviennent à un
accord sur ce sujet.
Des techniques d’échantillonnage recommandées sont décrites dans les documents suivants:
— l’ISO/TS 17728 pour les aliments et les aliments pour animaux;
— l’ISO 707 pour le lait et les produits laitiers;
— l’ISO 6887-3 pour les mollusques crus, les tuniciers et les échinodermes de zones de production primaire;
— l’ISO 13307 pour le stade de la production primaire;
— l’ISO 17604 pour les carcasses;
— l’ISO 18593 pour les surfaces.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif du produit étudié. Il convient que
l’échantillon n’ait pas été endommagé ni modifié au cours du transport ou du stockage.

8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai à partir de l’échantillon de laboratoire conformément à la Norme
internationale spécifique du produit concerné. Suivre les modes opératoires spécifiés dans la série de
normes ISO 6887.
S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique, il est recommandé que les parties concernées s’accordent
sur ce sujet.
9 Mode opératoire
9.1 Généralités
Le mode opératoire présenté à l’Annexe A doit être suivi.
9.2 Prise d’essai et suspension mère
Suivre les modes opératoires conformément à la série de normes ISO 6887 et à la Norme internationale
relative au produit concerné.
Préparer la suspension mère si le produit concerné n’est pas liquide. Ajouter 1 ml (6.9) de l’échantillon liquide
ou 1 ml (6.9) de la suspension mère (0,1 g de produit) à 9 ml de Milieu Perfringens Rapide (RPM, B.2). Sinon,
10 ml (6.9) de l’échantillon liquide ou de la suspension mère (1 g de produit) sont ajoutés à 90 ml de RPM (B.12).
Il est possible de mélanger ou de regrouper des échantillons du même type afin de réduire la charge de
travail lorsqu’un grand nombre d’échantillons doit être examiné. Cela peut être nécessaire pour refléter
la qualité microbiologique d’un grand lot de produit d’échantillons environnementaux ou requis par la
législation régionale.
De même, un certain nombre de prises d’essai peuvent être regroupées et examinées ensemble dans
de plus grandes quantités de milieux, ou les cultures de (pré)enrichissement des prises d’essai peuvent
être regroupées et soumises à un seul essai. Ces modes opératoires de regroupement sont décrits dans
l’ISO 6887-1. La possibilité de regrouper des échantillons d’un certain type doit être vérifiée conformément
au protocole décrit dans l’ISO 6887-1 .
NOTE La validation de cette méthode peut être effectuée conformément aux documents appropriés de l’ISO 16140
(toutes les parties).
9.3 Enrichissement sélectif
Incuber le bouillon d’enrichissement sélectif RPM dans des tubes ou flacons fermés (9.2) à 46 °C (6.5)
pendant 18 h ± 2 h.
9.4 Isolement
Laisser les boîtes de milieu d’ensemencement (B.3 et B.4) se stabiliser à température ambiante si elles étaient
stockées à une température inférieure. Si nécessaire, sécher la surface des boîtes (voir ISO 11133) dans une
enceinte de séchage ou un four (6.3) avant utilisation.
À partir de l’enrichissement sélectif obtenu en 9.3, ensemencer à l’aide d’une anse de 10 µl (6.10) la surface
d’une boîte de Pétri (6.11) contenant le milieu sélectif gélosé tryptose-sulfite à la cyclosérine (TSC, B.3) et d’une
boîte de Pétri (6.11) contenant le milieu sélectif gélosé lactose au jaune d’œuf et à la néomycine (LENA, B.4).
Incuber les boîtes gélosées TSC en anaérobiose (6.1) dans une étuve (6.5) à 37 °C pendant 24 h ± 2 h. Incuber
les boîtes gélosées LENA en anaérobiose (6.1) dans une étuve (6.5) à 46 °C pendant 24 h ± 2 h.
NOTE Après ensemencement des boîtes gélosées TSC, une surcouche de gélose TSC peut être utilisée pour
empêcher les colonies d’envahir la surface du milieu. Verser environ 5 ml du milieu TSC (voir B.3) en surcouche et
laisser solidifier les boîtes de Pétri sur une surface fraîche horizontale.

9.5 Confirmation de C. perfringens
9.5.1 Sélection des colonies à confirmer
9.5.1.1 Les colonies typiques sur gélose TSC sont noires ou grises à jaune-brun, même si la couleur est pâle.
Les colonies typiques sur LENA présentent une couleur jaune (fermentation acide à partir du lactose) et une
précipitation (réaction à la lécithinase).
Les boîtes gélosées TSC doivent être lues dans les 30 min qui suivent la fin de l’incubation en anaérobiose,
car la couleur des colonies peut s’estomper rapidement et finir par disparaître sous l’effet de l’exposition à
l’oxygène. Si des jarres anaérobies sont utilisées, il convient de contrôler les boîtes, jarre par jarre ou par
petites fractions si l’incubation a été réalisée dans une enceinte anaérobie (6.1, 6.5).
Pour confirmation, prélever cinq colonies présumées de C. perfringens dans chaque boîte contenant des
colonies typiques (voir 9.4). Si plusieurs morphologies sont présentes parmi les colonies, sélectionner une
colonie de chaque morphologie pour la sous-culture et la confirmation.
9.5.1.2 Laisser les boîtes gélosées se stabiliser à température ambiante si elles étaient stockées à une
température inférieure. Si nécessaire, sécher la surface des boîtes avant utilisation (voir l’ISO 11133).
Étaler chaque colonie sélectionnée à l’aide d’une anse stérile (6.10) sur une boîte de gélose au sang non
sélective, par exemple, de la gélose Columbia (B.5). Si la gélose au sang n’est pas disponible, une base de
gélose Columbia ou un autre milieu riche en nutriments (par exemple, la gélose tryptone soja ou la gélose
d’infusion de cœur et de cervelle) peuvent être utilisés avec ou sans sang. Plusieurs isolats peuvent être
étalés sur des secteurs identifiés de boîtes gélosées non sélectives. Il convient que les stries donnent des
colonies bien isolées.
Incuber les boîtes en anaérobiose (6.1) à 37 °C (6.5) pendant 20 h ± 2 h. Immédiatement après incubation,
sélectionner des colonies fraîchement cultivées et bien isolées en vue de la confirmation. La confirmation
peut être réalisée par essai à la phosphatase acide (9.5.2), ou par essai sur gélose SIM (Mobilité Indole
Sulfite) (9.5.3).
NOTE Des modes opératoires alternatifs (voir l’ISO 7218) peuvent être utilisés pour confirmer que les colonies
typiques correspondent à C. perfringens, sous réserve d’avoir validé la pertinence du mode opératoire alternatif (voir
l’ISO 16140-4 ou l’ISO 16140-6).
Après incubation, ces boîtes peuvent être réfrigérées à 5 °C (6.7) pendant 48 h au maximum avant lecture.
Pour les boîtes incubées en anaérobiose, maintenir l’atmosphère anaérobie.
9.5.2 Essai à la phosphatase acide
9.5.2.1 Il est établi que, outre C. perfringens, d’autres souches de Clostridium (par exemple, certaines souches
de C. baratii) peuvent produire de la phosphatase acide, mais cette aptitude est très limitée. Un pourcentage
très faible de faux positifs est donc attendu.
9.5.2.2 Les colonies se développant en anaérobiose sur des boîtes de gélose au sang ou de gélose nutritive
sont étalées sur un papier filtre et 2 à 3 gouttes de réactif de la phosphatase acide (B.6) sont déposées sur les
colonies. Si un kit d’essai disponible dans le commerce est utilisé, suivre les instructions du fabricant.
NOTE Il est possible d’ajouter au goutte-à-goutte le réactif de la phosphatase acide sur les colonies, si aucune
autre étude des colonies n’est nécessaire.
9.5.2.3 Une couleur violacée développée dans les 3 min à 4 min est considérée comme une réaction
positive.
9.5.3 Essai sur gélose SIM (Mobilité indole sulfite)
Des colonies qui se sont développées en anaérobiose sur les boîtes de gélose au sang ou de gélose nutritive
sont inoculées par piqûre droite dans des tubes contenant de la gélose SIM (B.7). Les tubes sont incubés
pendant 22 h ± 2 h à 37 °C (6.5), en atmosphère anaérobie (6.1) avec les bouchons des tubes de gélose SIM
desserrés. Après incubation, la lecture des tubes est effectuée pour déterminer:
— la production de sulfite: les tubes présentant un noircissement sont positifs;
— la mobilité: les tubes présentant une croissance en dehors de la piqûre d’inoculation sont positifs;
— la production d’indole: les tubes présentant un anneau de couleur rouge directement après ajout du
réactif de Kovacs (B.8) sont positifs.
C. perfringens est positive à la production de sulfite et négative à la production d’indole et à la mobilité.
9.5.4 Différenciation entre souches de C. perfringens pathogènes et non pathogènes pour l’Homme
(facultatif)
En complément, la méthode décrite à l’Annexe G peut être utilisée pour une différenciation moléculaire entre
les souches de C. perfringens pathogènes et non pathogènes pour l’Homme.
9.5.5 Interprétation
C. perfringens produit une coloration noire ou grise à jaune-brune sur la gélose TSC, même si la coloration
est légère, et possède la phosphatase acide ou est positive à la production de sulfite, négative à la production
d’indole et à la mobilité sur la gélose SIM.
10 Expression des résultats
Selon l’interprétation des résultats, indiquer la détection ou la non-détection de C. perfringens dans une prise
d’essai de x g ou x ml de produit, ou sur la surface prélevée/écouvillonnée ou par dispositif de prélèvement.
11 Caractéristiques de performance indicatives de la méthode
11.1 Validation basée sur les principes de l’ISO 17468
En utilisant la méthode de référence normalisée, une étude interlaboratoires avec un petit nombre de
laboratoires participants (<10) a été menée sur la base des principes de l’ISO 17468.
Les caractéristiques de performance indicatives de la méthode, issues de l’étude interlaboratoires,
sont décrites en 11.2.
NOTE Dans le présent document, les termes «catégorie», «produit», «matrice» et «type» sont combinés avec
«aliment» pour améliorer la clarté du présent document. Toutefois, le terme «aliment» est interchangeable avec
«aliments pour animaux» et fait référence à d’autres domaines de la chaîne alimentaire comme mentionné dans l'
Article 1 de ce document.
11.2 Caractéristiques de performance indicatives
Les caractéristiques de performance indicatives de la méthode (spécificité, sensibilité, LOD ) ont été
déterminées dans des études interlaboratoires. Toutes les données sont fournies dans les Annexes C à F. Il
est possible que les valeurs dérivées des études interlaboratoires ne soient pas applicables à des catégories
(d’aliments) autres que celles utilisées dans l’étude.
Un résumé des valeurs indicatives de LOD est donné dans les Tableaux 1 à 4.
Tableau 1 — Résumé des valeurs indicatives de LOD de l’étude interlaboratoires pour la gélose
d’isolement TSC et la phosphatase acide comme méthode de confirmation
Catégorie (d’aliment) Produit (aliment) LOD Taille de la Souche utilisée dans l’étude
prise d’essai interlaboratoires
en ufc/prise
d’essai
Produits à base de Viande en conserve 2,9 (1,7 – 5,1) 1 gramme Clostridium perfringens
a
viande prêts à consom- CECT 4110
mer et prêts à réchauf-
fer
Œufs et ovoproduits Poudre d’œuf 0,9 (0,4 – 2,3) 1 gramme Clostridium perfringens
NCTC 13170 (WDCM 00201)
Produits à base de pois- Poisson en 3,2 (1,3 – 7,6) 1 gramme Clostridium perfringens CECT 4110
son prêts à consommer conserve
et prêts à réchauffer
Fruits et légumes trans- Ananas 1,0 (0,6 – 1,5) 1 gramme Clostridium perfringens
formés NCTC 13170 (WDCM 00201)
en conserve
Préparations et céréales Formule infantile 4,9 (3,1 – 7,6) 1 gramme Clostridium perfringens CECT 4110
pour nourrissons à base de probio-
tiques
Aliments composés et Soupe instantanée 0,5 (0,2 – 1,4) 1 gramme Clostridium perfringens
composants de repas NCTC 13170 (WDCM 00201)
Échantillons environ- Écouvillons 1,7 (0,7 – 4,4) Chiffonnette Clostridium perfringens CECT 4110
nementaux (production
d’aliments ou d’aliments
pour animaux)
a
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT).
Tableau 2 — Résumé des valeurs indicatives de LOD de l’étude interlaboratoires pour la gélose
d’isolement TSC et l’essai sur gélose SIM comme méthode de confirmation
Catégorie (d’ali- Produit (ali- LOD Taille de la prise Souche utilisée dans
ment) ment) d’essai l’étude interlaboratoires
en ufc/prise d’essai
Produits à base Viande en 2,9 (1,7 – 5,1) 1 gramme Clostridium perfringens
de viande prêts à conserve CECT 4110
consommer et prêts à
réchauffer
Œufs et ovoproduits Poudre d’œuf 2,0 (0,9 – 5,1) 1 gramme Clostridium perfringens
NCTC 13170 (WDCM 00201)
Produits à base Poisson en 3,0 (1,2 – 7,2) 1 gramme Clostridium perfringens
de poisson prêts à conserve CECT 4110
consommer et prêts à
réchauffer
Fruits et légumes Ananas 1,1 (0,8 – 1,7) 1 gramme Clostridium perfringens
transformés NCTC 13170 (WDCM 00201)
en conserve
Préparations et Formule infan- 2,9 (1,9 – 4,5) 1 gramme Clostridium perfringens
céréales pour nour- tile à base de CECT 4110
rissons probiotiques
Aliments composés et Soupe instan- 0,5 (0,2 – 1,4) 1 gramme Clostridium perfringens
composants de repas tanée NCTC 13170 (WDCM 00201)
Échantillons environ- Écouvillons 2,5 (1,4 – 4,5) Chiffonnette Clostridium perfringens
nementaux (pro- CECT 4110
duction d’aliments
ou d’aliments pour
animaux)
Tableau 3 — Résumé des valeurs indicatives de LOD de l’étude interlaboratoires pour la gélose
d’isolement LENA et la phosphatase acide comme méthode de confirmation
Catégorie (d’ali- Produit (ali- LOD Taille de la prise Souche utilisée dans
ment) ment) d’essai l’étude interlaboratoires
en ufc/prise d’essai
Produits à base Viande en 3,0 (1,9 – 4,7) 1 gramme Clostridium perfringens
de viande prêts à conserve CECT 4110
consommer et prêts à
réchauffer
Œufs et ovoproduits Poudre d’œuf 0,7 (0,3 – 1,9) 1 gramme Clostridium perfringens
NCTC 13170 (WDCM 00201)
Produits à base Poisson en 3,5 (2,0 – 6,1) 1 gramme Clostridium perfringens
de poisson prêts à conserve CECT 4110
consommer et prêts à
réchauffer
Fruits et légumes Ananas 1,0 (0,6 – 1,6) 1 gramme Clostridium perfringens
transformés NCTC 13170 (WDCM 00201)
en conserve
Préparations et Formule infan- 3,6 (2,5 – 5,2) 1 gramme Clostridium perfringens
céréales pour nour- tile à base de CECT 4110
rissons probiotiques
Aliments composés et Soupe instan- 0,8 (0,3 – 2,0) 1 gramme Clostridium perfringens
composants de repas tanée NCTC 13170 (WDCM 00201)
Échantillons environ- Écouvillons 2,1 (1,2 – 3,8) Chiffonnette Clostridium perfringens
nementaux (pro- CECT 4110
duction d’aliments
ou d’aliments pour
animaux)
Tableau 4 — Résumé des valeurs indicatives de LOD de l’étude interlaboratoires pour la gélose
d’isolement LENA et l’essai sur gélose SIM comme méthode de confirmation
Catégorie (d’ali- Produit (ali- LOD Taille de la prise Souche utilisée dans
ment) ment) d’essai l’étude interlaboratoires
en ufc/prise d’essai
Produits à base Viande en 3,0 (1,9 – 4,7) 1 gramme Clostridium perfringens
de viande prêts à conserve CECT 4110
consommer et prêts à
réchauffer
Œufs et ovoproduits Poudre d’œuf 1,9 (0,8 – 4,5) 1 gramme Clostridium perfringens
NCTC 13170 (WDCM 00201)
Produits à base Poisson en 5,3 (3,0 – 9,3) 1 gramme Clostridium perfringens
de poisson prêts à conserve CECT 4110
consommer et prêts à
réchauffer
Fruits et légumes Ananas 1,3 (0,9 – 1,9) 1 gramme Clostridium perfringens
transformés NCTC 13170 (WDCM 00201)
en conserve
Préparations et Formule infan- 3,5 (2,5 – 4,8) 1 gramme Clostridium perfringens
céréales pour nour- tile à base de CECT 4110
rissons probiotiques
Aliments composés et Soupe instan- 1,3 (0,8 – 2,0) 1 gramme Clostridium perfringens
composants de repas tanée NCTC 13170 (WDCM 00201)
Échantillons environ- Écouvillons 2,0 (1,1 – 3,7) Chiffonnette Clostridium perfringens
nementaux (pro- CECT 4110
duction d’aliments
ou d’aliments pour
animaux)
12 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit préciser au moins ce qui suit:
— la méthode d’essai utilisée, avec une référence au présent document, c’est-à-dire l’ISO/TS 15213-3:2024;
— la méthode d’échantillonnage utilisée, si elle est connue;
— la taille de la prise d’essai et/ou la nature du sujet examiné;
— toutes les conditions opératoires non spécifiées dans le présent document, ou considérées comme
facultatives, ou informatives (y compris les annexes informatives), ainsi que les détails de tout incident
survenu pouvant avoir influencé le ou les résultats d’essai;
— tout écart par rapport au présent document;
— tous les renseignements nécessaires à l’identification complète de l’échantillon;
— le ou les résultats d’essai obtenus;
— la date de l’essai.
13 Contrôle qualité
Il convient que le laboratoire possède un système de maîtrise de la qualité afin de garantir que l’équipement,
les réactifs et les techniques sont adaptés à la méthode. L’utilisation de témoins positifs, de témoins négatifs
et de blancs entre dans le cadre de la méthode. Les essais de performance des milieux de culture sont
mentionnés à l’Annexe B et décrits dans l’ISO 11133.

Annexe A
(normative)
Logigramme du mode opératoire
La Figure A.1 présente le schéma du mode opératoire pour la recherche de C. perfringens dans les aliments,
les aliments pour animaux, les échantillons environnementaux et les échantillons prélevés au stade de la
production primaire.
Figure A.1 — Logigramme du mode opératoire de recherche de C. perfringens

Annexe B
(normative)
Milieux de culture et réactifs
B.1 Généralités
Les spécifications générales de l’ISO 11133 sont applicables à la préparation et aux essais de performance
des milieux de culture décrits dans la présente annexe. Si les milieux de culture ou les réactifs ont été
préparés à partir de milieux complets déshydratés/réactifs ou si des milieux/réactifs prêts à l’emploi sont
utilisés, suivre les instructions du fabricant concernant la préparation, les conditions de stockage, la date de
péremption et l’utilisation.
La durée de conservation des milieux indiqués dans la présente annexe a été déterminée dans certaines
études. L’utilisateur doit les vérifier en fonction de ses propres conditions de stockage (conformément à
l’ISO 11133).
Les essais de performance des milieux de culture sont décrits en B.9 et dans le Tableau B.1.
B.2 Milieu Perfringens Rapide (RPM)
B.2.1 Milieu de base Perfringens Rapide
B.2.1.1 Composition
Extrait de levure 11,0 g
Peptone de caséine 15,0 g
a
Pe
...