ISO 22174:2024
(Main)Microbiology of the food chain — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection and quantification of microorganisms — General requirements and definitions
Microbiology of the food chain — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection and quantification of microorganisms — General requirements and definitions
This document specifies the general requirements for the in vitro amplification of nucleic acid sequences (DNA or RNA). This document is applicable to the testing for microorganisms and viruses from the food chain using the polymerase chain reaction (PCR). This document, or parts of it, is applicable to other fields of PCR diagnostics based on a case-by-case evaluation. The minimum requirements laid down in this document are intended to ensure that comparable and reproducible results are obtained in different laboratories. This document has been established for microorganisms from the food chain and is applicable to: — products intended for human consumption; — products for feeding animals; — environmental samples in the area of food and feed production and handling; — samples from the primary production stage.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche et la quantification de micro-organismes — Exigences générales et définitions
Le présent document spécifie les exigences générales relatives à l’amplification in vitro des séquences d’acide nucléique (ADN ou ARN). Le présent document s’applique aux essais pour la détection de micro‑organismes et de virus issus de la chaîne alimentaire en faisant appel à la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Le présent document, ou certaines de ses parties, s’applique(nt) à d’autres domaines de diagnostic par PCR sur la base d’une évaluation au cas par cas. Les exigences minimales déclarées dans le présent document sont destinées à garantir l’obtention de résultats comparables et reproductibles dans des laboratoires différents. Le présent document a été conçu pour les micro‑organismes issus de la chaîne alimentaire et s’applique aux: — produits destinés à la consommation humaine; — produits destinés à l’alimentation animale; — échantillons environnementaux prélevés dans des zones de production et de manipulation de produits alimentaires et d’aliments pour animaux; — échantillons de production primaire.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 22174
Second edition
Microbiology of the food chain —
2024-08
Polymerase chain reaction (PCR)
for the detection and quantification
of microorganisms — General
requirements and definitions
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche et la
quantification de micro-organismes — Exigences générales et
définitions
Reference number
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Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
3.1 General terms .2
3.2 Terms related to the extraction and purification of DNA/RNA .3
3.3 Terms related to reverse transcription of RNA to DNA .4
3.4 Terms related to DNA amplification by PCR/RT-PCR .4
3.5 Terms related to controls .5
3.6 Terms related to qPCR .6
3.7 Terms related to dPCR .7
4 Principle . 8
4.1 General .8
4.2 Laboratory sample .9
4.3 Sampling, transport and storage.9
4.4 Preparation of test sample .9
5 Microbial enrichment and virus concentration . 9
5.1 Microbial enrichment .9
5.2 Virus concentration .9
6 Nucleic acid preparation . 10
6.1 General .10
6.2 Prevention of amplification of DNA from dead cells .10
6.3 Nucleic acid extraction, release and purification .10
6.4 Nucleic acid quality and quantity .10
7 PCR amplification . .11
8 Detection and confirmation of amplicons .11
9 General environmental laboratory requirements .12
9.1 General . 12
9.2 Laboratory setup . 12
9.2.1 General . 12
9.2.2 Control of flows . 13
9.2.3 Cleaning of laboratory .14
9.2.4 Environmental monitoring for nucleic acid contamination .14
10 Reagents and consumables . 14
11 Equipment . 14
12 Procedure .15
12.1 Enrichment and sample treatment . 15
12.2 Amplification .16
12.2.1 General .16
12.2.2 Control reaction .16
12.2.3 Detection of amplicon .18
12.2.4 Data analysis .18
12.3 Evaluation .19
12.3.1 Qualitative evaluation .19
12.3.2 Quantitative evaluation . 20
12.4 Test report .21
13 Performance characteristics of PCR-based methods .21
14 Validation and verification of PCR-based methods.21
14.1 General .21
iii
14.2 Validation .21
14.3 Verification . . 22
Annex A (informative) Fluorescence signals and amplification curve .23
Bibliography .26
iv
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
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this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology,
in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee CEN/TC 463,
Microbiology of the food chain, in accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO and
CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces ISO 22174:2005, ISO 20837:2006, ISO 20838:2006 and
ISO 22119:2011, which have been technically revised.
The main changes are as follows:
— inclusion of requirements for the implementation of digital PCR;
— inclusion of requirements for laboratory flows monitoring including environmental monitoring for PCR;
— extension of 12.2.2 control reaction with descriptions of the different controls;
— change of 12.3 to include quantitative evaluation;
— inclusion of Clause 14 on validation and verification.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
v
International Standard ISO 22174:2024(en)
Microbiology of the food chain — Polymerase chain reaction
(PCR) for the detection and quantification of microorganisms
— General requirements and definitions
1 Scope
This document specifies the general requirements for the in vitro amplification of nucleic acid sequences
(DNA or RNA).
This document is applicable to the testing for microorganisms and viruses from the food chain using the
polymerase chain reaction (PCR). This document, or parts of it, is applicable to other fields of PCR diagnostics
based on a case-by-case evaluation.
The minimum requirements laid down in this document are intended to ensure that comparable and
reproducible results are obtained in different laboratories.
This document has been established for microorganisms from the food chain and is applicable to:
— products intended for human consumption;
— products for feeding animals;
— environmental samples in the area of food and feed production and handling;
— samples from the primary production stage.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of the food chain — General requirements and guidance for microbiological examinations
ISO 20836, Microbiology of the food chain — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of microorganisms
— Thermal performance testing of thermal cyclers
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1 General terms
3.1.1
laboratory sample
sample as prepared for sending to the laboratory and intended for inspection or testing
[SOURCE: ISO 7002:1986, A.19]
3.1.2
test sample
sample prepared from the laboratory sample (3.1.1) according to the procedure specified in the method of
test and from which test portions (3.1.3) are taken
3.1.3
test portion
measured (volume or mass) representative sample taken from the laboratory sample (3.1.1)
[SOURCE: ISO 6887-1:2017, 3.5, modified — “for use in the preparation of the initial suspension” and Note 1
to entry deleted.]
3.1.4
reference material
material, sufficiently homogeneous and stable with respect to one or more specified properties, which has
been established to be fit for its intended use in a measurement process
Note 1 to entry: Reference material producers fulfilling the requirements of ISO 17034 are considered to be competent.
[SOURCE: ISO Guide 30:2015, 2.1.1, modified — Notes to entry deleted and a new Note 1 to entry added.]
3.1.5
matrix
all the components of the sample
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.38, modified — “(product)” deleted in the term.]
3.1.6
deoxyribonucleic acid
DNA
polymer of deoxyribonucleotides occurring in a double-stranded (dsDNA) or single-stranded (ssDNA) form
3.1.7
deoxyribonuclease
DNase
enzyme which degrades deoxyribonucleic acid (DNA) (3.1.6)
3.1.8
amplicon
deoxyribonucleic acid (DNA) (3.1.6) amplified by polymerase chain reaction (PCR) (3.1.17)
3.1.9
ribonucleic acid
RNA
polymer of ribonucleotides occurring in a double-stranded or single-stranded form
3.1.10
ribonuclease
RNase
enzyme which degrades ribonucleic acid (RNA) (3.1.9)
3.1.11
nucleic acid
polymer of deoxyribonucleotides or ribonucleotides
3.1.12
target nucleic acid sequence
nucleic acid sequence selected for amplification
3.1.13
endogenous sequence
nucleic acid sequence naturally present in the tested matrix (3.1.5)
3.1.14
exogenous sequence
nucleic acid sequence naturally absent in the tested matrix (3.1.5)
3.1.15
detection of polymerase chain reaction product
detection of amplicon
process which signals the presence of an amplicon (3.1.8)
3.1.16
confirmation of polymerase chain reaction product
confirmation of amplicon
process which demonstrates that the amplicon (3.1.8) originates from the target nucleic acid sequence
(3.1.12)
3.1.17
polymerase chain reaction
PCR
enzymatic procedure that allows in vitro amplification of deoxyribonucleic acid (DNA) (3.1.6)
3.1.18
endpoint polymerase chain reaction
endpoint PCR
procedure using PCR amplification followed by separate detection of amplicons (3.1.8) after the completion
of the PCR
3.1.19
real-time polymerase chain reaction
real-time PCR
procedure which combines PCR amplification with the detection and/or quantification of specific amplicons
(3.1.8) during the amplification process
3.1.20
multiplex polymerase chain reaction
multiplex PCR
PCR (3.1.17) allowing the detection of multiple targets simultaneously within a single reaction tube, where
more primer pairs (and probes) are used within one master mix (3.4.4)
3.2 Terms related to the extraction and purification of DNA/RNA
3.2.1
nucleic acid extraction
sample treatment for the release of nucleic acids (3.1.11)
3.2.2
nucleic acid purification
method to reduce the amount of polymerase chain reaction (PCR) (3.1.17) inhibitors in the eluate
3.3 Terms related to reverse transcription of RNA to DNA
3.3.1
reverse transcriptase
enzyme which catalyses the reverse transcription (3.3.2) of ribonucleic acid (RNA) (3.1.9) to a complementary
single-stranded deoxyribonucleic acid (cDNA)
3.3.2
reverse transcription
RT
synthesis of complementary single-stranded deoxyribonucleic acid (cDNA) from a ribonucleic acid (RNA)
template using a reverse transcriptase (3.3.1)
3.3.3
reverse transcription-polymerase chain reaction
RT-PCR
method consisting of two reactions, a reverse transcription (RT) (3.3.2) of ribonucleic acid (RNA) (3.1.9) to
single-stranded complementary deoxyribonucleic acid (cDNA), followed by a PCR (3.1.17)
Note 1 to entry: One-step RT-PCR is performed in a single tube.
Note 2 to entry: Two-step RT-PCR can either be performed sequentially in a single tube or in two different tubes.
3.4 Terms related to DNA amplification by PCR/RT-PCR
3.4.1
deoxyribonucleic acid polymerase
DNA polymerase
thermostable enzyme which catalyses DNA (3.1.6) synthesis
Note 1 to entry: DNA polymerase can also cleave a hybridized nucleic acid molecule using its 5′-3′-exonuclease activity.
It is dependent on the type of enzyme and can be present in, for example, Taq-, Tth- and Tfl-polymerase.
3.4.2
deoxyribonucleoside triphosphate
dNTP
solution containing deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxycytidine triphosphate (dCTP),
deoxyguanosine triphosphate (dGTP), deoxythymidine triphosphate (dTTP) and/or deoxyuridine
triphosphate (dUTP)
3.4.3
thermal cycler
automatic device that performs defined heating and cooling cycles usable for polymerase chain reaction
(PCR) (3.1.17) or real-time PCR (3.1.19) or digital PCR (3.7.1)
Note 1 to entry: The thermal cycler can be a block-based or (individual) reaction-chamber-based thermal cycler.
[SOURCE: ISO 20836:2021, 3.2.1, modified — “or digital PCR” added.]
3.4.4
master mix
mixture of reagents needed for nucleic acid amplification except for the target nucleic acid sequence (3.1.12)
[SOURCE: ISO 17822:2020, 3.27, modified — “nucleic acid sequence” replaced “DNA and the controls”.]
3.4.5
primer
oligonucleotide of defined length and sequence complementary to a segment of the target nucleic acid
sequence (3.1.12), used to signal the starting point for deoxyribonucleic acid (DNA) polymerase to extend the
new DNA strand
3.4.6
fluorescent probe
oligonucleotide of defined sequence coupled with one or more fluorescent molecules
Note 1 to entry: Any system emitting a fluorescence signal after specific hybridization to the target nucleic acid
sequence (3.1.12) which can be detected by the specific equipment can be used as a fluorescent probe.
3.4.7
background fluorescence
background
intrinsic level of fluorescence resulting from the reagents, consumables and instruments used
3.4.8
molecular beacon
fluorescent probe consisting of three different parts: a central part complementary to the target nucleic acid
sequence (3.1.12), plus a 5′-part and a 3′-part which are complementary, and where the reporter is attached
to one arm of the molecule, while the end of the other arm carries the quencher
3.4.9
hybridization probe
system of two fluorescent probes coupled with one fluorescent molecule each, where one molecule serves as
fluorescence resonance energy transfer (FRET) donor and the other serves as FRET acceptor
3.4.10
hydrolysis probe
fluorescent probe coupled with a fluorophore and quencher which are sterically separated by the
5′-3′-exonuclease activity of the enzyme during the amplification process
3.4.11
denaturation
process which results in the separation of the double-stranded nucleic acid into single-stranded nucleic acids
3.4.12
hybridization
specific binding of complementary nucleic acid sequences under suitable reaction conditions
3.4.13
annealing
pairing of complementary single strands of nucleic acids to form a double-stranded molecule
3.4.14
hot-start polymerase chain reaction
hot-start PCR
activation of thermostable deoxyribonucleic acid (DNA) polymerase by an initial heating step to avoid non-
specific amplification
3.5 Terms related to controls
3.5.1
negative process control
target free sample which is run through all stages of the analytical process
Note 1 to entry: The process can include sample preparation, enrichment, nucleic acid extraction and target
amplification.
3.5.2
positive process control
sample, spiked with a microorganism, treated in the same way as the test samples (3.1.2) to monitor the
entire process of the polymerase-chain-reaction-based method
3.5.3
internal process control
control used for the quality assessment of the entire protocol, which is therefore added to the investigated
sample material to undergo the same procedure as the target microorganism
Note 1 to entry: Due to its mode of action, an internal control shall be selected which assumingly is naturally absent in
the tested matrix.
3.5.4
negative extraction control
extraction blank
control carried through all steps of the nucleic acid extraction procedure in the absence of a test sample (3.1.2)
3.5.5
internal amplification control
nucleic acid (3.1.11) added to each reaction in a defined amount or copy number which serves as an internal
control for amplification
Note 1 to entry: This nucleic acid sequence can be endogenous (naturally present in the tested matrix) or exogenous
(naturally absent in the tested matrix).
Note 2 to entry: An exogenous internal amplification control can be homologous (amplified using the same primers
as used for amplification of the target) or heterologous (amplified using different primers than those used for
amplification of the target). A homologous internal amplification control amplicon shall be distinguishable from the
microbial target amplicon (e.g. by size or by insertion of a different probe-binding sequence).
3.5.6
external amplification control
control nucleic acid added to an aliquot of the extracted nucleic acid in a defined amount or copy number
serving as a control for amplification in a separate reaction
Note 1 to entry: It is strongly recommended that the external amplification control amplicon is distinguishable from
the target amplicon (e.g. by insertion of a restriction enzyme target sequence).
3.5.7
positive polymerase chain reaction control
positive PCR control
reaction containing the target nucleic acid in a defined amount or copy number
3.5.8
negative polymerase chain reaction control
negative PCR control
no-template control
NTC
PCR control made with water (or other PCR-inert substrate such as grinding or elution buffer) free of target
nucleic acid and PCR inhibitors
3.6 Terms related to qPCR
3.6.1
quantitative polymerase chain reaction
qPCR
method allowing the quantification in a nucleic acid template of the number of a specific nucleic acid
sequence using specific oligonucleotides
3.6.2
quantification cycle
C
q
cycle at which the fluorescence signal can be distinguished from the
background fluorescence (3.4.7) entering into the exponential phase of target amplification
Note 1 to entry: Quantification cycle is a generic term which includes cycle threshold (C ), crossing point (C ), take off
t p
point (TOP) and all other instrument specific terms referring to the fractional cycle used to detect or quantify the
target in the real-time PCR assay.
Note 2 to entry: The quantification cycle is based either on a threshold applied to all samples or on a regression
analysis of the signal, for each sample.
[SOURCE: ISO 20395:2019, 3.8, modified — The definition has been revised. “real-time PCR” replaced “qPCR”
in the domain and Note 1 to entry.]
3.6.3
relative quantification by real-time polymerase chain reaction
relative quantification by real-time PCR
procedure involving PCR amplification to determine the levels of changes of a target nucleic acid relative to
the levels of a reference nucleic acid of known concentration, measured within the same or in separate PCR
reactions
3.6.4
absolute quantification by real-time polymerase chain reaction
absolute quantification by real-time PCR
procedure involving PCR amplification to determine the concentration of a target nucleic acid in a sample by
comparison with a standard curve, derived from standards containing a defined amount of target
3.6.5
passive reference
fluorescent molecules present in the reaction mix used to normalize
the signal
3.7 Terms related to dPCR
3.7.1
digital polymerase chain reaction
digital PCR
dPCR
procedure in which nucleic acid templates are randomly and independently distributed across multiple
partitions (3.7.2) of nominally equivalent volume, such that some partitions contain template and others do
not, followed by PCR amplification of target sequences and detection of specific amplicons (3.1.8), providing
a count of the number of partitions with a positive and negative signal for the target template
Note 1 to entry: dPCR can also provide the qualitative results “detected” or “not detected”.
Note 2 to entry: In certain instances, whole cells or organisms can be partitioned and lysis is performed in the
individual partitions to allow amplification of target templates.
[SOURCE: ISO 20395:2019, 3.10, modified — “are randomly and independently” added before “distributed”.
Original Notes 1 and 2 to entry deleted and new Notes to entry added.]
3.7.2
partition
droplets or chambers of nominally equivalent volume into which digital polymerase chain reaction (dPCR)
(3.7.1) mix of reagents and template is randomly distributed and then amplified by PCR
[SOURCE: ISO 20395:2019, 3.22]
3.7.3
negative cluster
set of negative results from partitions that contained the reaction mix, without the target sequence,
representing the negative partitions
3.7.4
positive cluster
set of positive results from partitions that contained the reaction mix, with amplification of the target
sequence, representing the positive partitions
3.7.5
separability
distance between the negative cluster (3.7.3) and the positive cluster (3.7.4) in the analysis diagram (1D Dot
Plot) generated after reading the partition signals
Note 1 to entry: Separability can vary depending on the quality of the sample and the amount of target. Therefore, it is
important to pay attention to the separability of these two clusters when a weak positive sample is detected.
3.7.6
analysis threshold
limit of separation between the negative cluster (3.7.3) and the positive
cluster (3.7.4)
Note 1 to entry: The threshold limit can be set automatically by the analysis software or manually by the operator
3.7.7
limit of blank
LoB
highest number of partitions appearing positive, with more than 95 %
probability, when testing samples in the absence of the target nucleic acid sequence of the pathogen, which
determines the target sequence specific “false positive” limit
Note 1 to entry: The LoB should be determined, as a minimum, from replicates of the negative amplification control
(amplification LoB) (e.g. water, elution buffer) and negative samples containing the matrix (full method LoB). The
number of negative control replicates and negative samples should be justified by the user laboratory and should be
consistent with the validation tests performed by the developer.
3.7.8
passive reference
fluorescent molecule in the reaction medium allowing to count the
partitions (3.7.2) containing the reaction mixture
3.7.9
absolute quantification by digital polymerase chain reaction
absolute quantification by dPCR
procedure involving PCR amplification and target copy quantification which does not require a standard
curve to determine the concentration of a target nucleic acid in a sample
4 Principle
4.1 General
The procedure comprises the following consecutive steps:
a) preliminary microbial enrichment of the food-borne microorganism or concentration of the virus from
the laboratory sample, if required (see Clause 5);
b) nucleic acid extraction and purification, if required (see Clause 6);
c) amplification of the target nucleic acid sequence by PCR or RT-PCR using specific primers with the
addition of fluorescent probes or DNA double strand binding dyes in the case of real-time and digital
format (see Clause 7);
d) detection and confirmation of the specific amplicons on electrophoresis gel (endpoint PCR) or by
monitoring the fluorescence signal with an optical detection system (real-time or digital format) (see
Clause 8);
e) data analysis;
f) evaluation.
4.2 Laboratory sample
Any material from the food chain is suitable as a laboratory sample, provided it has been established by the
use of a relevant control (see Table 1) that the nucleic acid solution prepared from the test portion does not
completely inhibit the PCR.
4.3 Sampling, transport and storage
Sampling is not part of the method specified in this document. Follow the specific International Standard
dealing with the product concerned. Further details of sampling certain products are given in specific
standards that are listed in ISO 7218.
If there is no specific International Standard dealing with the sampling of the product concerned, it is
recommended that the parties concerned come to an agreement on this subject.
It is important that the laboratory receives a sample that is representative. Samples transported to the
laboratory are kept under conditions which will minimize any alteration in the number of microorganisms
present. The sample should not have been damaged or changed during transport or storage.
The recommended temperatures for samples during transport and storage are described in ISO 7218.
4.4 Preparation of test sample
Prepare the test sample from the laboratory sample in accordance with the specific International Standard
dealing with the product concerned. Follow the procedures specified in the ISO 6887 series. The preparation
of the test sample for the detection of viruses can be different and is specified in, for example, the ISO 15216
series for some products. If there is no specific International Standard available, it is recommended that the
parties concerned come to an agreement on this subject.
5 Microbial enrichment and virus concentration
5.1 Microbial enrichment
Microbial enrichment may start directly from the test portion. This can be done by stimulating growth of
the target microorganism by culturing the test portion in selective or non-selective liquid nutrient media.
Filtration and/or concentration such as immunomagnetic separation can be also used. Specific antimicrobial
compounds can be used to inhibit the growth of non-target microorganisms.
5.2 Virus concentration
The foodstuffs and food surfaces are often highly complex matrices and the target viruses can be present
at low concentrations. It is therefore necessary to carry out matrix-specific virus extraction and/or
concentration in order to provide a substrate for subsequent common parts of the process. The method
depends upon the matrix, some of which are specified in the ISO 15216 series.
6 Nucleic acid preparation
6.1 General
The purpose of the nucleic acid preparation step is to obtain a nucleic acid solution from the laboratory
sample that does not significantly inhibit the PCR. The microbial cells in the laboratory sample or enriched/
concentrated culture (see Clause 5) are lysed to release their nucleic acid (DNA and/or RNA). If required, a
concentration stage (e.g. centrifugation or filtration) is performed prior to lysis and/or a purification step
is performed following lysis. The nucleic acid solution obtained from the extraction step should contain a
sufficient amount of target nucleic acid of suitable quality.
The resulting nucleic acid solution should contain as few as possible substances with detectable PCR
inhibition or fluorescence interference.
NOTE 1 Fluorescence is often derived from coloured reaction vessels and some ingredients of enrichment broths.
Depending on the sample received it can be necessary to pre-treat or dilute the test portion, i.e. some
products can contain compounds that inhibit PCR. If PCR inhibition is identified (by the use of a control
reaction, see 12.3), the enriched test portion or the lysate can be diluted prior to the PCR step.
NOTE 2 The method of extraction can have a great influence on nucleic acids degradation and/or yield and/or
amplification efficiency. The most suitable extraction method strongly depends on the characteristics of the test
portion.
6.2 Prevention of amplification of DNA from dead cells
Some test portions can contain high amounts of DNA originating from dead cells of the target organism (e.g.
highly processed samples, environmental samples collected after disinfection or phage treated samples).
These dead cells, if present in high enough concentrations, can lead to PCR positive results, even though no
living organisms are present. To remove or inactivate DNA from dead cells prior to nucleic acid preparation,
a pre-treatment may be used if viable target organisms are not significantly affected by the process.
NOTE 1 Dead cells in this context are cells which have a damaged cell wall which allows certain DNA-binding
chemicals to penetrate into the cell and prevent subsequent PCR amplification.
NOTE 2 The yield of DNA removal from dead cells can be affected by different factors. The protocol performance
[17]
can be enhanced if some critical factors are considered.
6.3 Nucleic acid extraction, release and purification
Several DNA or RNA extraction principles may be used. For example, the following methods can be used:
a) Protein digestion: Break down proteins in the cell extract with proteases (e.g. Proteinase K) and RNA
with ribonucleases if relevant. Precipitate the resulting peptides then purify the nucleic acid solution
and concentrate further by ethanol precipitation in the presence of monovalent cations.
b) Thermal lysis: Nucleic acids can also be released by thermal cell disruption (e.g. by boiling for 10 min).
After the thermal cell disruption is complete, allow the sample to cool. Centrifuge the sample and use
the supernatant for PCR analysis. Before the thermal cell disruption and to facilitate cell disruption,
enzymatic treatment can be applied (e.g. lysozyme, for use with Gram-positive bacteria) followed by a
protease/proteinase incubation.
c) Other methods such as vigorous agitation with beads can be required when the organism has a
particularly tough cell wall (e.g. Mycobacterium spp.).
NOTE Commercial kits for nucleic acid extraction, release and purification are available on the market.
6.4 Nucleic acid quality and quantity
The quality and yield of nucleic acid extracted by a given method on a given matrix should be both repeatable
and reproducible in terms of amplification by PCR, provided there is sufficient nucleic acid in the matrix. In
particular, the method used shall allow the recovery of nucleic acid fragments with an average size equal to
or greater than the amplicons under investigation.
For some sample preparation methods and when the nucleic acids released are not stable, it is necessary to
use the nucleic acid solution immediately after the preparation. It is recommended to use nucleic extraction
methods which inactivate or remove DNases and RNases. The pH of the lysate should be suitable for DNA
and RNA stability.
In general, repeated freezing and thawing of nucleic acid solutions should be avoided. Use low binding
plasticware to store low copy numbers of nucleic acids, especially RNA.
The concentration of the nucleic acids isolated can be estimated by spectrophotometric or fluorometric
methods or by gel electrophoresis.
The purity of the nucleic acids isolated can be estimated by spectrophotometric methods or by gel
electrophoresis.
7 PCR amplification
A specific nucleic acid sequence is amplified using PCR (multiple nucleic acid sequences can also be targeted
simultaneously in a multiplex PCR format). The reaction is a cyclic process consisting of three stages:
a) denaturation of the double-stranded nucleic acid (dsDNA);
b) annealing of the primers (and probe) to the complementary target sequence;
c) extension of the attached primers by means of a thermostable DNA polymerase.
To reduce non-specific amplification, a hot-start master mix can be used together with an initial heating
step to perform a hot-start PCR.
RNA can be detected using RT-PCR, where the target is first transcribed into a complementary DNA (cDNA)
by reverse transcription with a reverse transcriptase. In the real-time PCR format, the fluorescence signal
is monitored in each cycle during the annealing stage or the extension stage depending on the probe used.
In the case of dPCR, reaction mix containing sample nucleic acid is randomly and independently distributed
into discrete partitions of equivalent volume such that some partitions contain no nucleic acid template and
others contain one or more template copies. The partitions are then thermally cycled to end-point.
NOTE 1 Following denaturation of double-stranded DNA, two oligonucleotide primers anneal (hybridize) to the
target DNA segment to be amplified. The primers are directed opposite to each other regarding their orientation to
the target sequence.
NOTE 2 Double-stranded regions are formed as a result of specific base-pairing between the primers and the target
sequence flanking the DNA segment to be amplified and serve as start positions for DNA synthesis by means of a heat-
stable DNA polymerase.
NOTE 3 The repeated process of heat denaturation, primer annealing and DNA synthesis (cycles) results in the near
exponential amplification of the DNA segment flanked by the primers.
NOTE 4 The annealing and elongation stage can be combined into one stage which results in a two-stage PCR cycle.
NOTE 5 In certain instances, whole cells or organisms can be partitioned and lysis is performed in the individual
partitions to allow amplification of target templates.
8 Detection and confirmation of amplicons
Amplicons from qualitative and quantitative reactions are detected by gel electrophoresis or through
monitoring of the fluorescence signal by optical detection system (depending on the PCR format used) or
any appropriate alternative.
During or after the PCR, the sequence of the amplicon should be verified to confirm the correct amplicon has
been amplified. For example, the following methods can be used:
a) real-time PCR or dPCR using, for example, hybridization probes, hydrolysis probes or molecular beacons;
b) DNA sequencing of th
...
Norme
internationale
ISO 22174
Deuxième édition
Microbiologie de la chaîne
2024-08
alimentaire — Réaction de
polymérisation en chaîne
(PCR) pour la recherche et la
quantification de micro-organismes
— Exigences générales et
définitions
Microbiology of the food chain — Polymerase chain reaction
(PCR) for the detection and quantification of microorganisms —
General requirements and definitions
Numéro de référence
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
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Tél.: +41 22 749 01 11
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Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
3.1 Termes généraux .2
3.2 Termes relatifs à l’extraction et à la purification de l’ADN/ARN .3
3.3 Termes relatifs à la transcription inverse de l’ARN en ADN .4
3.4 Termes relatifs à l’amplification de l’ADN par PCR/RT‑PCR .4
3.5 Termes relatifs aux témoins .6
3.6 Termes relatifs à la qPCR .7
3.7 Termes relatifs à la dPCR .8
4 Principe. 9
4.1 Généralités .9
4.2 Échantillon pour laboratoire .9
4.3 Échantillonnage, transport et stockage .9
4.4 Préparation de l’échantillon pour essai .10
5 Enrichissement microbien et concentration virale .10
5.1 Enrichissement microbien .10
5.2 Concentration virale .10
6 Préparation de l’acide nucléique . 10
6.1 Généralités .10
6.2 Prévention de l’amplification de l’ADN provenant de cellules mortes .11
6.3 Extraction, libération et purification des acides nucléiques .11
6.4 Qualité et quantité d’acide nucléique .11
7 Amplification par PCR .12
8 Détection et confirmation des amplicons .12
9 Exigences générales pour l’environnement de laboratoire .13
9.1 Généralités . 13
9.2 Configuration du laboratoire . 13
9.2.1 Généralités . 13
9.2.2 Contrôle des flux .14
9.2.3 Nettoyage du laboratoire . 15
9.2.4 Surveillance de l’environnement pour la contamination des acides nucléiques . 15
10 Réactifs et consommables .15
11 Équipement .16
12 Mode opératoire . 17
12.1 Enrichissement et traitement des échantillons.17
12.2 Amplification .17
12.2.1 Généralités .17
12.2.2 Témoins de réaction .17
12.2.3 Détection de l’amplicon . 20
12.2.4 Analyse des données . 20
12.3 Évaluation .21
12.3.1 Évaluation qualitative .21
12.3.2 Évaluation quantitative . 22
12.4 Rapport d’essai . 23
13 Caractéristiques de performance des méthodes basées sur la PCR .23
14 Validation et vérification des méthodes basées sur la PCR .23
14.1 Généralités . 23
iii
14.2 Validation . 23
14.3 Vérification . .24
Annexe A (informative) Signaux de fluorescence et courbe d’amplification .25
Bibliographie .28
iv
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l'adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion de
l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant‑propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la chaîne alimentaire,
du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO
et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace l’ISO 22174:2005, l’ISO 20837:2006, l’ISO 20838:2006 et
l’ISO 22119:2011, qui ont fait l’objet d’une révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— ajout d’exigences pour la mise en œuvre de la PCR digitale;
— ajout d’exigences relatives à la surveillance des flux de laboratoire, y compris la surveillance
environnementale pour la PCR;
— extension du paragraphe 12.2.2 Témoins de réaction, avec description des différents témoins;
— modification du paragraphe 12.3 pour inclure l’évaluation quantitative;
— ajout de l’Article 14 sur la validation et la vérification.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
v
Norme internationale ISO 22174:2024(fr)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche et la
quantification de micro-organismes — Exigences générales et
définitions
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie les exigences générales relatives à l’amplification in vitro des séquences d’acide
nucléique (ADN ou ARN).
Le présent document s’applique aux essais pour la détection de micro-organismes et de virus issus de la
chaîne alimentaire en faisant appel à la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Le présent document,
ou certaines de ses parties, s’applique(nt) à d’autres domaines de diagnostic par PCR sur la base d’une
évaluation au cas par cas.
Les exigences minimales déclarées dans le présent document sont destinées à garantir l’obtention de
résultats comparables et reproductibles dans des laboratoires différents.
Le présent document a été conçu pour les micro-organismes issus de la chaîne alimentaire et s’applique aux:
— produits destinés à la consommation humaine;
— produits destinés à l’alimentation animale;
— échantillons environnementaux prélevés dans des zones de production et de manipulation de produits
alimentaires et d’aliments pour animaux;
— échantillons de production primaire.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences générales et recommandations pour les examens
microbiologiques
ISO 20836, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la
recherche de micro-organismes — Essais de performance thermique des thermocycleurs
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1 Termes généraux
3.1.1
échantillon pour laboratoire
échantillon dans l’état de préparation où il est envoyé au laboratoire et destiné à être utilisé pour un contrôle
ou pour des essais
[SOURCE: ISO 7002:1986, A.19]
3.1.2
échantillon pour essai
échantillon préparé à partir de l’échantillon pour laboratoire (3.1.1) selon le mode opératoire spécifié dans la
méthode d’essai, et à partir duquel les prises d’essai (3.1.3) sont prélevées
3.1.3
prise d’essai
échantillon représentatif mesuré (volume ou masse) prélevé sur l’échantillon pour laboratoire (3.1.1)
[SOURCE: ISO 6887‑1:2017, 3.5, modifié — «pour servir à la préparation de la suspension mère» et la Note 1
à l’article ont été supprimés.]
3.1.4
matériau de référence
matériau, suffisamment homogène et stable quant à une ou plusieurs propriétés spécifiées, qui a été préparé
pour être adapté à son utilisation prévue dans un processus de mesure
Note 1 à l'article: Les fournisseurs de matériaux de référence qui satisfont aux exigences de l’ISO 17034 sont considérés
comme étant compétents.
[SOURCE: ISO Guide 30:2015, 2.1.1, modifié — Les notes à l’article ont été supprimées et une nouvelle Note 1
à l’article a été ajoutée.]
3.1.5
matrice
ensemble des composants de l’échantillon
[SOURCE: ISO 16140‑1:2016, 2.38, modifié — «(produit)» a été supprimé dans le terme.]
3.1.6
acide désoxyribonucléique
ADN
polymère de désoxyribonucléotides se présentant sous la forme de double brin (ADNdb) ou de brin
simple (ADNsb)
3.1.7
désoxyribonucléase
DNase
enzyme qui dégrade l’acide désoxyribonucléique (ADN) (3.1.6)
3.1.8
amplicon
acide désoxyribonucléique (ADN) (3.1.6) amplifié par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) (3.1.17)
3.1.9
acide ribonucléique
ARN
polymère de ribonucléotides se présentant sous la forme de double brin ou de simple brin
3.1.10
ribonucléase
RNase
enzyme qui dégrade l’acide ribonucléique (ARN) (3.1.9)
3.1.11
acide nucléique
polymère de désoxyribonucléotides ou de ribonucléotides
3.1.12
séquence d’acide nucléique cible
séquence d’acide nucléique utilisée pour l’amplification
3.1.13
séquence endogène
séquence d’acide nucléique naturellement présente dans la matrice (3.1.5) soumise à essai
3.1.14
séquence exogène
séquence d’acide nucléique naturellement absente de la matrice (3.1.5) soumise à essai
3.1.15
détection du produit de la réaction de polymérisation en chaîne
détection de l’amplicon
procédé permettant de reconnaître la présence d’un amplicon (3.1.8)
3.1.16
confirmation du produit de la réaction de polymérisation en chaîne
confirmation de l’amplicon
procédé apportant la preuve que l’amplicon (3.1.8) est issu de la séquence d’acide nucléique cible (3.1.12)
3.1.17
réaction de polymérisation en chaîne
PCR
méthode enzymatique permettant l’amplification in vitro de l’acide désoxyribonucléique (ADN) (3.1.6)
3.1.18
réaction de polymérisation en chaîne en point final
PCR en point final
mode opératoire utilisant l’amplification par PCR suivie d’une détection séparée des amplicons (3.1.8) après
la fin de la PCR
3.1.19
réaction de polymérisation en chaîne en temps réel
PCR en temps réel
mode opératoire qui combine l’amplification par PCR avec la détection et/ou la quantification d’amplicons
(3.1.8) spécifiques pendant le processus d’amplification
3.1.20
réaction de polymérisation en chaîne multiplexe
PCR multiplexe
PCR (3.1.17) permettant la détection de plusieurs cibles simultanément dans un seul tube réactionnel,
où plusieurs jeux d’amorces (et sondes) sont utilisés dans un mélange maître (3.4.4)
3.2 Termes relatifs à l’extraction et à la purification de l’ADN/ARN
3.2.1
extraction de l’acide nucléique
préparation d’un échantillon pour la libération des acides nucléiques (3.1.11)
3.2.2
purification de l’acide nucléique
méthode permettant de réduire la quantité d’inhibiteurs de réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
(3.1.17) dans l’éluat
3.3 Termes relatifs à la transcription inverse de l’ARN en ADN
3.3.1
transcriptase inverse
enzyme qui catalyse la transcription inverse (3.3.2) de l’acide ribonucléique (ARN) (3.1.9) en acide
désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) monocaténaire
3.3.2
transcription inverse
RT (Reverse Transcription)
processus de synthèse de l’acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) monocaténaire à partir d’une
matrice d’acide ribonucléique (ARN) utilisant une transcriptase inverse (3.3.1)
3.3.3
réaction de polymérisation en chaîne à transcription inverse
RT-PCR
méthode consistant en deux réactions, à savoir une transcription inverse (RT) (3.3.2) de l’acide ribonucléique
(ARN) (3.1.9) en acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) monocaténaire, suivie d’une PCR (3.1.17)
Note 1 à l'article: La RT‑PCR en une étape est réalisée dans un seul tube.
Note 2 à l'article: Les deux réactions de la RT‑PCR en deux étapes peuvent être réalisées l’une après l’autre, dans un
seul tube ou dans deux tubes différents.
3.4 Termes relatifs à l’amplification de l’ADN par PCR/RT-PCR
3.4.1
acide désoxyribonucléique polymérase
ADN polymérase
enzyme thermostable permettant la synthèse d’ADN (3.1.6)
Note 1 à l'article: L’ADN polymérase peut également cliver une molécule d’acide nucléique hybridée en utilisant son
activité exonucléasique 5′‑3′. Celle‑ci dépend du type d’enzyme et peut se manifester par exemple avec les polymérases
Taq, Tth et Tfl.
3.4.2
désoxyribonucléoside triphosphate
dNTP
solution composée de désoxyadénosine triphosphate (dATP), désoxycytidine triphosphate (dCTP),
désoxyguanosine triphosphate (dGTP), désoxythymidine triphosphate (dTTP) et/ou désoxyuridine
triphosphate (dUTP)
3.4.3
thermocycleur
appareil automatique qui réalise les cycles de chauffage et de refroidissement utilisables pour la réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) (3.1.17) ou la PCR en temps réel (3.1.19) ou la PCR digitale (3.7.1)
Note 1 à l'article: Le thermocycleur peut être un thermocycleur à bloc ou à chambre de réaction (individuelle).
[SOURCE: ISO 20836:2021, 3.2.1, modifié — «ou la PCR digitale» a été ajouté.]
3.4.4
mélange maître
mélange des réactifs nécessaires à l’amplification d’acide nucléique, à l’exception de la séquence d’acide
nucléique cible (3.1.12)
[SOURCE: ISO 17822:2020, 3.27, modifié — «matrice d’ADN cible et des témoins» a été remplacé par
«séquence d’acide nucléique cible».]
3.4.5
amorce
oligonucléotide de longueur et de séquence définies, complémentaire d’un segment de la séquence d’acide
nucléique cible (3.1.12), utilisé pour signaler le point de départ de l’acide désoxyribonucléique (ADN)
polymérase pour étendre le nouveau brin d’ADN
3.4.6
sonde fluorescente
oligonucléotide d’une séquence définie associée à une ou plusieurs molécules fluorescentes
Note 1 à l'article: Tout système émettant un signal de fluorescence après hybridation spécifique à la séquence d’acide
nucléique cible (3.1.12) qui peut être détecté par l’équipement spécifique peut être utilisé comme sonde fluorescente.
3.4.7
bruit de fond de fluorescence
bruit de fond
niveau intrinsèque de fluorescence résultant des réactifs, des consommables et des instruments utilisés
3.4.8
balise moléculaire
sonde fluorescente constituée de trois parties différentes: une partie centrale complémentaire de la séquence
d’acide nucléique cible (3.1.12), plus une partie 5′ et une partie 3′ complémentaires l’une de l’autre, et où
le reporter (donneur) est fixé sur un bras de la molécule, l’extrémité de l’autre bras portant le quencher
(capteur)
3.4.9
sonde d’hybridation
système de deux sondes fluorescentes associées chacune à une molécule fluorescente, dans lequel une
molécule sert de donneur FRET (transfert d’énergie de fluorescence par résonance) et l’autre d’accepteur FRET
3.4.10
sonde d’hydrolyse
sonde fluorescente associée à un fluorophore et un quencher (capteur) qui subissent une séparation stérique
du fait de l’activité exonucléasique 5′‑3′ de l’enzyme pendant le processus d’amplification
3.4.11
dénaturation
processus qui a pour résultat la séparation de l’acide nucléique bicaténaire en acides nucléiques
monocaténaires
3.4.12
hybridation
liaison spécifique de séquences complémentaires d’acides nucléiques dans les conditions de réaction
appropriées
3.4.13
hybridation «annealing»
appariement de séquences complémentaires à simple brin d’acides nucléiques pour former une molécule
bicaténaire
3.4.14
réaction de polymérisation en chaîne «hot-start»
PCR «hot start»
activation d’un acide désoxyribonucléique (ADN) polymérase thermostable par une étape initiale de
chauffage pour éviter une amplification non spécifique
3.5 Termes relatifs aux témoins
3.5.1
témoin négatif de processus
échantillon exempt de cible qui passe par toutes les étapes du processus d’analyse
Note 1 à l'article: Le procédé peut inclure la préparation de l’échantillon, l’enrichissement, l’extraction d’acide nucléique
et l’amplification de la cible.
3.5.2
témoin positif de processus
échantillon dopé en micro-organisme, traité de la même manière que les échantillons pour essai (3.1.2)
afin de surveiller l’ensemble du processus de la méthode basée sur la réaction de polymérisation en chaîne
3.5.3
témoin interne de processus
témoin utilisé pour l’évaluation de la qualité de l’ensemble du protocole, qui est donc ajouté à l’échantillon
examiné pour subir le même mode opératoire que le micro-organisme cible
Note 1 à l'article: En raison de son mode d’action, il faut sélectionner un témoin interne qui, par hypothèse,
est naturellement absent de la matrice soumise à essai.
3.5.4
témoin négatif d’extraction
blanc d’extraction
témoin soumis à toutes les étapes du mode opératoire d’extraction d’acide nucléique à l’exception de
l’adjonction d’un échantillon pour essai (3.1.2)
3.5.5
témoin interne d’amplification
acide nucléique (3.1.11) ajouté à chaque réaction de PCR en quantité ou nombre de copies définies et servant
de témoin interne d’amplification
Note 1 à l'article: Cette séquence d’acide nucléique peut être endogène (naturellement présente dans la matrice
soumise à essai) ou exogène (naturellement absente de la matrice soumise à essai).
Note 2 à l'article: Un témoin interne d’amplification exogène peut être homologue (amplifié à l’aide des mêmes amorces
que celles utilisées pour l’amplification de la cible) ou hétérologue (amplifié à l’aide d’amorces différentes de celles
utilisées pour l’amplification de la cible). Un amplicon de témoin interne d’amplification homologue doit pouvoir être
distingué de l’amplicon de la cible microbienne (par exemple, par sa taille ou par l’insertion d’une séquence différente
de liaison à la sonde).
3.5.6
témoin externe d’amplification
acide nucléique témoin ajouté en quantité ou nombre de copies définies à une aliquote de l’acide nucléique
extrait et servant de témoin d’amplification dans une réaction séparée
Note 1 à l'article: Il est fortement recommandé de pouvoir distinguer l’amplicon de témoin externe d’amplification de
l’amplicon cible (par exemple par l’insertion d’une séquence cible d’enzyme de restriction).
3.5.7
témoin positif de réaction de polymérisation en chaîne
témoin positif de PCR
réaction de PCR contenant la séquence d’acide nucléique cible en quantité ou en nombre de copies définies
3.5.8
témoin négatif de réaction de polymérisation en chaîne
témoin négatif de PCR
témoin sans échantillon
NTC (no‑template control)
témoin de PCR réalisé avec de l’eau (ou un autre substrat inerte vis‑à‑vis de la PCR, tel qu’un tampon de
broyage ou d’élution) exempte d’acide nucléique cible et d’inhibiteurs de PCR
3.6 Termes relatifs à la qPCR
3.6.1
réaction de polymérisation en chaîne quantitative
qPCR
méthode permettant la quantification dans une matrice d’acide nucléique du nombre d’une séquence
spécifique d’acide nucléique en utilisant des oligonucléotides spécifiques
3.6.2
cycle de quantification
Cq
cycle au cours duquel le signal de fluorescence peut
être distingué du bruit de fond de fluorescence (3.4.7) entrant dans la phase exponentielle de l’amplification
de la cible
Note 1 à l'article: «Cycle de quantification» est un terme générique qui couvre le cycle seuil (C), le point de
t
franchissement (C ), le point de décollage (TOP, take off point) et tous les autres termes spécifiques à l’instrument
p
faisant référence au cycle fractionnel utilisé pour détecter ou quantifier la cible dans l’essai par PCR en temps réel.
Note 2 à l'article: Le cycle de quantification s’appuie soit sur un seuil appliqué à tous les échantillons soit sur une
analyse de régression du signal, pour chaque échantillon.
[SOURCE: ISO 20395:2019, 3.8, modifié — La définition a été révisée. «qPCR» a été remplacé par
«PCR en temps réel» dans le domaine et la Note 1 à l’article.]
3.6.3
quantification relative par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel
quantification relative par PCR en temps réel
mode opératoire impliquant une amplification par PCR pour déterminer les niveaux de changement d’un
acide nucléique cible par rapport aux niveaux d’un acide nucléique de référence dont la concentration est
connue, mesurés dans la même réaction de PCR ou dans des réactions de PCR distinctes
3.6.4
quantification absolue par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel
quantification absolue par PCR en temps réel
mode opératoire impliquant une amplification par PCR pour déterminer la concentration d’un acide
nucléique cible dans un échantillon par comparaison avec une courbe standard, obtenue à partir d’étalons
contenant une quantité définie de cible
3.6.5
référence passive
molécules fluorescentes présentes dans le mélange
réactionnel, utilisées pour normaliser le signal
3.7 Termes relatifs à la dPCR
3.7.1
réaction de polymérisation en chaîne digitale
PCR digitale
dPCR
méthode consistant à répartir de manière aléatoire et indépendante des matrices d’acide nucléique entre
plusieurs partitions (3.7.2) d’un volume nominal équivalent, de sorte que certaines partitions contiennent
de la matrice d’acide nucléique et d’autres non, puis à soumettre les séquences cibles à une amplification par
PCR pour détecter les amplicons (3.1.8) spécifiques, en dénombrant les partitions avec un signal positif et
négatif pour l’acide nucléique cible
Note 1 à l'article: La dPCR peut également fournir les résultats qualitatifs «détecté» ou «non détecté».
Note 2 à l'article: Dans certains cas, des cellules ou des organismes entiers peuvent être partitionnés et la lyse est
effectuée dans les différentes partitions pour permettre l’amplification des acides nucléiques cibles.
[SOURCE: ISO 20395:2019, 3.10, modifié — «de manière aléatoire et indépendante» a été ajouté après
«répartir». Les Notes 1 et 2 à l’article d’origine ont été supprimées et de nouvelles notes à l’article ont été
ajoutées.]
3.7.2
partition
gouttelettes ou chambres de volume nominalement équivalent dans lesquelles le mélange de réactifs de la
réaction de polymérisation en chaîne digitale (dPCR) (3.7.1) et d’échantillon est réparti de manière aléatoire
puis amplifié par PCR
[SOURCE: ISO 20395:2019, 3.22]
3.7.3
population négative
ensemble de résultats négatifs provenant des partitions qui contenaient le mélange réactionnel, sans la
séquence cible, représentant les partitions négatives
3.7.4
population positive
ensemble de résultats positifs provenant des partitions qui contenaient le mélange réactionnel,
avec amplification de la séquence cible, représentant les partitions positives
3.7.5
séparabilité
distance entre la population négative (3.7.3) et la population positive (3.7.4) dans le diagramme d’analyse (1D
Dot Plot) généré après la lecture des signaux de partition
Note 1 à l'article: La séparabilité peut varier en fonction de la qualité de l’échantillon et de la quantité de cible. Il est
donc important de prêter attention à la séparabilité de ces deux populations lorsqu’un échantillon faiblement positif
est détecté.
3.7.6
seuil d’analyse
limite de séparation entre la population négative (3.7.3) et la
population positive (3.7.4)
Note 1 à l'article: Le seuil limite peut être fixé automatiquement par le logiciel d’analyse ou manuellement par
l’opérateur.
3.7.7
limite de blanc
LoB (limit of blank)
nombre le plus élevé de partitions apparaissant positives,
avec une probabilité supérieure à 95 %, lors de l’analyse d’échantillons en l’absence de la séquence d’acide
nucléique cible de l’agent pathogène, qui détermine la limite de «faux positif» spécifique de la séquence cible
Note 1 à l'article: Il convient de déterminer la LoB, au minimum, à partir de réplicats du témoin négatif d’amplification
(LoB d’amplification) (par exemple, eau, tampon d’élution) et d’échantillons négatifs contenant la matrice (LoB de la
méthode complète). Il convient que le nombre de réplicats de témoin négatif et le nombre d’échantillons négatifs soient
justifiés par le laboratoire utilisateur et soient en cohérence avec les essais de validation réalisés par le développeur.
3.7.8
référence passive
molécule fluorescente dans le milieu réactionnel permettant
de dénombrer les partitions (3.7.2) contenant le mélange réactionnel
3.7.9
quantification absolue par réaction de polymérisation en chaîne digitale
quantification absolue par dPCR
mode opératoire, impliquant une amplification par PCR et une quantification des copies cibles, qui n’exige
pas de courbe standard pour déterminer la concentration d’un acide nucléique cible dans un échantillon
4 Principe
4.1 Généralités
Le mode opératoire comporte plusieurs étapes consécutives:
a) l’enrichissement microbien préliminaire du micro-organisme ou de la concentration de virus présents
dans l’échantillon pour laboratoire, si exigé (voir Article 5);
b) l’extraction et la purification de l’acide nucléique, si exigé (voir Article 6);
c) l’amplification de la séquence d’acide nucléique cible par PCR ou RT‑PCR en utilisant des amorces
spécifiques, avec ajout de sondes fluorescentes ou de colorants se liant au double brin d’ADN en cas de
format en temps réel et digital (voir Article 7);
d) la détection et la confirmation des amplicons spécifiques par électrophorèse sur gel (PCR en point final)
ou par la surveillance du signal de fluorescence au moyen d’un système de détection optique (format en
temps réel ou digital) (voir Article 8);
e) l’analyse des données;
f) l’évaluation.
4.2 Échantillon pour laboratoire
Tout matériau provenant de la chaîne alimentaire convient comme échantillon pour laboratoire à condition
qu’il ait été établi par l’utilisation d’un témoin approprié (voir Tableau 1) que la solution d’acide nucléique
préparée à partir de la prise d’essai n’inhibe pas complètement la PCR.
4.3 Échantillonnage, transport et stockage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Suivre la Norme
internationale spécifique du produit concerné. Des détails supplémentaires sur l’échantillonnage de certains
produits sont donnés dans les normes spécifiques qui sont listées dans l’ISO 7218.
S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il est
recommandé que les parties concernées parviennent à un accord sur ce sujet.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif. Conserver les échantillons
acheminés vers le laboratoire dans des conditions réduisant le plus possible toute modification du nombre
de micro‑organismes présents. Il convient que l’échantillon n’ait pas été endommagé ni modifié au cours du
transport ou du stockage.
Les températures recommandées pour les échantillons pendant le transport et le stockage sont décrites
dans l’ISO 7218.
4.4 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai à partir de l’échantillon pour laboratoire conformément à la Norme
internationale spécifique du produit concerné. Suivre les modes opératoires spécifiés dans la série ISO 6887.
La préparation de l’échantillon pour essai pour la détection des virus peut être différente. Elle est spécifiée,
par exemple, dans la série ISO 15216 pour certains produits. S’il n’existe pas de Norme internationale
spécifique, il est recommandé que les parties concernées s’accordent sur ce sujet.
5 Enrichissement microbien et concentration virale
5.1 Enrichissement microbien
L’enrichissement microbien peut commencer directement à partir de la prise d’essai. Cela peut se faire
en stimulant la croissance du micro-organisme cible par culture de la prise d’essai dans des milieux
nutritifs liquides sélectifs ou non sélectifs. La filtration et/ou la concentration, comme la séparation
immunomagnétique, peuvent également être utilisées. Des composés antimicrobiens spécifiques peuvent
être utilisés pour inhiber la croissance des micro-organismes non ciblés.
5.2 Concentration virale
Les aliments et les surfaces alimentaires sont souvent des matrices très complexes et les virus cibles
peuvent être présents à de faibles concentrations. Il est donc nécessaire d’effectuer une extraction et/ou
une concentration du virus propre à la matrice afin de produire un substrat pour les parties communes
ultérieures du processus. La méthode dépend de la matrice, dont certaines sont spécifiées dans la série
ISO 15216.
6 Préparation de l’acide nucléique
6.1 Généralités
L’objectif de l’étape de préparation de l’acide nucléique est d’obtenir une solution d’acide nucléique à partir de
l’échantillon pour laboratoire qui n’a pas d’effet inhibiteur significatif sur la PCR. Les cellules microbiennes
présentes dans l’échantillon pour laboratoire ou la culture enrichie/concentrée (voir Article 5) sont lysées
afin de libérer leur acide nucléique (ADN et/ou ARN). Si exigé, effectuer une étape de concentration (par
exemple, centrifugation ou filtration) avant la lyse et/ou de purification après la lyse. Il convient que la
solution d’acide nucléique obtenue lors de l’étape d’extraction contienne une quantité suffisante d’acide
nucléique cible de qualité appropriée.
Il convient que la solution d’acide nucléique obtenue contienne le moins de substances possible avec une
inhibition détectable de la PCR ou une interférence de fluorescence.
NOTE 1 La fluorescence provient souvent de récipients de réaction colorés et de certains ingrédients des bouillons
d’enrichissement.
En fonction de l’échantillon reçu, il peut être nécessaire de prétraiter ou de diluer la prise d’essai, car certains
produits peuvent contenir des composés ayant un effet inhibiteur sur la PCR. Si une inhibition de la PCR est
identifiée (par l’utilisation de témoins de réaction, voir 12.3), la prise d’essai enrichie ou le lysat peuvent être
dilués avant l’étape de la PCR.
NOTE 2 La méthode d’extraction peut avoir une grande influence sur la dégradation des acides nucléiques et/ou
le rendement et/ou l’efficacité de l’amplification. La méthode d’extraction la plus appropriée dépend fortement des
caractéristiques de la prise d’essai.
6.2 Prévention de l’amplification de l’ADN provenant de cellules mortes
Certaines prises d’essai peuvent contenir de grandes quantités d’ADN provenant de cellules mortes de
l’organisme cible (par exemple, des échantillons fortement traités, des échantillons environnementaux
recueillis après désinfection ou des échantillons traités par des phages). Ces cellules mortes, si elles sont
présentes en concentrations suffisamment élevées, peuvent conduire à des résultats positifs de PCR, même
si aucun organisme vivant n’est présent. Afin d’éliminer ou d’inactiver l’ADN des cellules mortes avant la
préparation de l’acide nucléique, un prétraitement peut être utilisé si les organismes cibles viables ne sont
pas significativement affectés par le procédé.
NOTE 1 Les cellules mortes dans ce contexte sont des cellules dont la paroi cellulaire est endommagée, ce qui permet à
certaines substances chimiques liant l’ADN de pénétrer dans la cellule et d’empêcher par la suite l’amplification par PCR.
NOTE 2 Le rendement de l’élimination de l’ADN des cellules mortes peut être influencé par différents facteurs.
[17]
La performance du protocole peut être améliorée si certains facteurs critiques sont pris en compte .
6.3 Extraction, libération et purification des acides nucléiques
Plusieurs principes d’extraction de l’ADN ou de l’ARN peuvent être utilisés. Par exemple, les méthodes
suivantes peuvent être utilisées:
a) digestion des protéines: décomposer les protéines de l’extrait cellulaire avec des protéases (par exemple,
la protéinase K) et l’ARN avec des ribonucléases le cas échéant. Précipiter les peptides obtenus puis
purifier la solution d’acide nucléique et la concentrer davantage par précipitation à l’éthanol en présence
de cations monovalents;
b) lyse thermique: les acides nucléiques peuvent également être libérés par rupture thermique des cellules
(par exemple, par ébullition pendant 10 min). Une fois la rupture thermique des cellules terminée, laisser
refroidir l’échantillon. Centrifuger l’échantillon et utiliser le surnageant pour l’analyse par PCR. Avant la
rupture thermique des cellules et pour faciliter la désintégration cellulaire, un traitement enzymatique
peut être appliqué (par exemple, lysozyme, pour une utilisation avec des bactéries à Gram positif), suivi
d’une incubation de protéases/protéinases;
c) d’autres méthodes telles qu’une agitation vigoureuse avec des billes peuven
...
ISO/TC 34/SC 9 22174:2024(fr)
SecondeDeuxième édition
2024-08
Date : : 2024-08-10-07
ISO/TC 34/SC 9
Secrétariat : AFNOR
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Réaction de polymérisation
en chaîne (PCR) pour la recherche et la quantification de micro-
organismes — Exigences générales et définitions
Microbiology of the food chain — Polymerase chain reaction (PCR) for the detection and quantification of
microorganisms — General requirements and definitions
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de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique
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demandeur.
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Web Website: www.iso.org
Publié en Suisse
Sommaire Page
Avant-propos . iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
3.1 Termes généraux . 2
3.2 Termes relatifs à l’extraction et à la purification de l’ADN/ARN . 4
3.3 Termes relatifs à la transcription inverse de l’ARN en ADN . 4
3.4 Termes relatifs à l’amplification de l’ADN par PCR/RT-PCR . 4
3.5 Termes relatifs aux témoins . 6
3.6 Termes relatifs à la qPCR . 7
3.7 Termes relatifs à la dPCR . 8
4 Principe . 9
4.1 Généralités . 9
4.2 Échantillon pour laboratoire . 10
4.3 Échantillonnage, transport et stockage . 10
4.4 Préparation de l’échantillon pour essai . 10
5 Enrichissement microbien et concentration virale . 10
5.1 Enrichissement microbien . 10
5.2 Concentration virale . 11
6 Préparation de l’acide nucléique . 11
6.1 Généralités . 11
6.2 Prévention de l’amplification de l’ADN provenant de cellules mortes. 11
6.3 Extraction, libération et purification des acides nucléiques . 11
6.4 Qualité et quantité d’acide nucléique . 12
7 Amplification par PCR . 12
8 Détection et confirmation des amplicons . 13
9 Exigences générales pour l’environnement de laboratoire . 13
9.1 Généralités . 13
9.2 Configuration du laboratoire . 14
10 Réactifs et consommables . 16
11 Équipement . 17
12 Mode opératoire . 18
12.1 Enrichissement et traitement des échantillons . 18
12.2 Amplification . 18
12.3 Évaluation . 22
12.4 Rapport d’essai . 24
13 Caractéristiques de performance des méthodes basées sur la PCR . 24
14 Validation et vérification des méthodes basées sur la PCR . 24
14.1 Généralités . 24
14.2 Validation . 25
14.3 Vérification . 25
Annexe A (informative) Signaux de fluorescence et courbe d’amplification . 26
Bibliographie . 29
iii
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont décrites
dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents critères
d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été rédigé
conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de propriétébrevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO
n’avait pas reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application.
Toutefois, il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des
informations plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à
l'adresse www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou
partie de tels droits de brevetpropriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions spécifiques
de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion de l'ISO aux
principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce
(OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la chaîne alimentaire,
du Comité européen de normalisation (CEN), conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO
et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace l’ISO 22174:2005, l’ISO 20837:2006, l’ISO 20838:2006 et
l’ISO 22119:2011, qui ont fait l’objet d’une révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— ajout d’exigences pour la mise en œuvre de la PCR digitale;
— ajout d’exigences relatives à la surveillance des flux de laboratoire, y compris la surveillance
environnementale pour la PCR;
— extension du paragraphe 12.2.2 Témoins de réaction, avec description des différents témoins;
— modification du paragraphe 12.3 pour inclure l’évaluation quantitative;
— ajout de l’Article 14 sur la validation et la vérification.
iv
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
v
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Réaction de polymérisation
en chaîne (PCR) pour la recherche et la quantification de micro-
organismes — Exigences générales et définitions
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie les exigences générales relatives à l’amplification in vitro des séquences d’acide
nucléique (ADN ou ARN).
Le présent document s’applique aux essais pour la détection de micro-organismes et de virus issus de la chaîne
alimentaire en faisant appel à la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Le présent document,
ou certaines de ses parties, s’applique(nt) à d’autres domaines de diagnostic par PCR sur la base d’une
évaluation au cas par cas.
Les exigences minimales déclarées dans le présent document sont destinées à garantir l’obtention de résultats
comparables et reproductibles dans des laboratoires différents.
Le présent document a été conçu pour les micro-organismes issus de la chaîne alimentaire et s’applique aux:
— produits destinés à la consommation humaine;
— produits destinés à l’alimentation animale;
— échantillons environnementaux prélevés dans des zones de production et de manipulation de produits
alimentaires et d’aliments pour animaux;
— échantillons de production primaire.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur contenu,
des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments de la chaîne alimentaire — Exigences générales et recommandations pour
les examens microbiologiques
ISO 20836, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la
recherche de micro-organismes — Essais de performance thermique des thermocycleurs
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes ::
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https://www.iso.org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https://www.electropedia.org/
3.1 Termes généraux
3.1.1
échantillon pour laboratoire
échantillon dans l’état de préparation où il est envoyé au laboratoire et destiné à être utilisé pour un contrôle
ou pour des essais
[SOURCE: ISO 7002:1986, A.19]
3.1.2
échantillon pour essai
échantillon préparé à partir de l’échantillon pour laboratoire (3.1.1) selon le mode opératoire spécifié dans la
méthode d’essai, et à partir duquel les prises d’essai (3.1.3) sont prélevées
3.1.3
prise d’essai
échantillon représentatif mesuré (volume ou masse) prélevé sur l’échantillon pour laboratoire (3.1.1)
[SOURCE: ISO 6887-1:2017, 3.5, modifié — «pour servir à la préparation de la suspension mère» et la Note 1
à l’article ont été supprimés.]
3.1.4
matériau de référence
matériau, suffisamment homogène et stable quant à une ou plusieurs propriétés spécifiées, qui a été préparé
pour être adapté à son utilisation prévue dans un processus de mesure
Note 1 à l'article: Les fournisseurs de matériaux de référence qui satisfont aux exigences de l’ISO 17034 sont considérés
comme étant compétents.
[SOURCE: ISO Guide ISO 30:2015, 2.1.1, modifié — Les notes à l’article ont été supprimées et une nouvelle
Note 1 à l’article a été ajoutée.]
3.1.5
matrice
ensemble des composants de l’échantillon
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.38, modifié — «(produit)» a été supprimé dans le terme.]
3.1.6
acide désoxyribonucléique
ADN
polymère de désoxyribonucléotides se présentant sous la forme de double brin (ADNdb) ou de brin simple
(ADNsb)
3.1.7
désoxyribonucléase
DNase
enzyme qui dégrade l’acide désoxyribonucléique (ADN) (3.1.6)
3.1.8
amplicon
acide désoxyribonucléique (ADN) (3.1.6) amplifié par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) (3.1.17)
3.1.9
acide ribonucléique
ARN
polymère de ribonucléotides se présentant sous la forme de double brin ou de simple brin
3.1.10
ribonucléase
RNase
enzyme qui dégrade l’acide ribonucléique (ARN) (3.1.9)
3.1.11
acide nucléique
polymère de désoxyribonucléotides ou de ribonucléotides
3.1.12
séquence d’acide nucléique cible
séquence d’acide nucléique utilisée pour l’amplification
3.1.13
séquence endogène
séquence d’acide nucléique naturellement présente dans la matrice (3.1.5) soumise à essai
3.1.14
séquence exogène
séquence d’acide nucléique naturellement absente de la matrice (3.1.5) soumise à essai
3.1.15
détection du produit de la réaction de polymérisation en chaîne
détection de l’amplicon
procédé permettant de reconnaître la présence d’un amplicon (3.1.8)
3.1.16
confirmation du produit de la réaction de polymérisation en chaîne
confirmation de l’amplicon
procédé apportant la preuve que l’amplicon (3.1.8) est issu de la séquence d’acide nucléique cible (3.1.12)
3.1.17
réaction de polymérisation en chaîne
PCR
méthode enzymatique permettant l’amplification in vitro de l’acide désoxyribonucléique (ADN) (3.1.6)
3.1.18
réaction de polymérisation en chaîne en point final
PCR en point final
mode opératoire utilisant l’amplification par PCR suivie d’une détection séparée des amplicons (3.1.8) après
la fin de la PCR
3.1.19
réaction de polymérisation en chaîne en temps réel
PCR en temps réel
mode opératoire qui combine l’amplification par PCR avec la détection et/ou la quantification d’amplicons
(3.1.8) spécifiques pendant le processus d’amplification
3.1.20
réaction de polymérisation en chaîne multiplexe
PCR multiplexe
PCR (3.1.17) permettant la détection de plusieurs cibles simultanément dans un seul tube réactionnel,
où plusieurs jeux d’amorces (et sondes) sont utilisés dans un mélange maître (3.4.4)
3.2 Termes relatifs à l’extraction et à la purification de l’ADN/ARN
3.2.1
extraction de l’acide nucléique
préparation d’un échantillon pour la libération des acides nucléiques (3.1.11)
3.2.2
purification de l’acide nucléique
méthode permettant de réduire la quantité d’inhibiteurs de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) (3.1.17)
dans l’éluat
3.3 Termes relatifs à la transcription inverse de l’ARN en ADN
3.3.1
transcriptase inverse
enzyme qui catalyse la transcription inverse (3.3.2) de l’acide ribonucléique (ARN) (3.1.9) en acide
désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) monocaténaire
3.3.2
transcription inverse
RT (Reverse Transcription)
processus de synthèse de l’acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) monocaténaire à partir d’une
matrice d’acide ribonucléique (ARN) utilisant une transcriptase inverse (3.3.1)
3.3.3
réaction de polymérisation en chaîne à transcription inverse
RT-PCR
méthode consistant en deux réactions, à savoir une transcription inverse (RT) (3.3.2) de l’acide ribonucléique
(ARN) (3.1.9) en acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) monocaténaire, suivie d’une PCR (3.1.17)
Note 1 à l'article: La RT-PCR en une étape est réalisée dans un seul tube.
Note 2 à l'article: Les deux réactions de la RT-PCR en deux étapes peuvent être réalisées l’une après l’autre, dans un seul
tube ou dans deux tubes différents.
3.4 Termes relatifs à l’amplification de l’ADN par PCR/RT-PCR
3.4.1
acide désoxyribonucléique polymérase
ADN polymérase
enzyme thermostable permettant la synthèse d’ADN (3.1.6)
Note 1 à l'article: L’ADN polymérase peut également cliver une molécule d’acide nucléique hybridée en utilisant son
activité exonucléasique 5′‑3′. Celle‑ci dépend du type d’enzyme et peut se manifester par exemple avec les polymérases
Taq, Tth et Tfl.
3.4.2
désoxyribonucléoside triphosphate
dNTP
solution composée de désoxyadénosine triphosphate (dATP), désoxycytidine triphosphate (dCTP),
désoxyguanosine triphosphate (dGTP), désoxythymidine triphosphate (dTTP) et/ou désoxyuridine
triphosphate (dUTP)
3.4.3
thermocycleur
appareil automatique qui réalise les cycles de chauffage et de refroidissement utilisables pour la réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) (3.1.17) ou la PCR en temps réel (3.1.19) ou la PCR digitale (3.7.1)
Note 1 à l'article: Le thermocycleur peut être un thermocycleur à bloc ou à chambre de réaction (individuelle).
[SOURCE: ISO 20836:2021, 3.2.1, modifié — «ou la PCR digitale» a été ajouté.]
3.4.4
mélange maître
mélange des réactifs nécessaires à l’amplification d’acide nucléique, à l’exception de la séquence d’acide
nucléique cible (3.1.12)
[SOURCE: ISO 17822:2020, 3.27, modifié — «matrice d’ADN cible et des témoins» a été remplacé par
«séquence d’acide nucléique cible».]
3.4.5
amorce
oligonucléotide de longueur et de séquence définies, complémentaire d’un segment de la séquence d’acide
nucléique cible (3.1.12), utilisé pour signaler le point de départ de l’acide désoxyribonucléique (ADN)
polymérase pour étendre le nouveau brin d’ADN
3.4.6
sonde fluorescente
oligonucléotide d’une séquence définie associée à une ou plusieurs molécules fluorescentes
Note 1 à l'article: Tout système émettant un signal de fluorescence après hybridation spécifique à la séquence d’acide
nucléique cible (3.1.12) qui peut être détecté par l’équipement spécifique peut être utilisé comme sonde fluorescente.
3.4.7
bruit de fond de fluorescence
bruit de fond
niveau intrinsèque de fluorescence résultant des réactifs, des consommables et des instruments utilisés
3.4.8
balise moléculaire
sonde fluorescente constituée de trois parties différentes: une partie centrale complémentaire de la séquence
d’acide nucléique cible (3.1.12), plus une partie 5′ et une partie 3′ complémentaires l’une de l’autre, et où le
reporter (donneur) est fixé sur un bras de la molécule, l’extrémité de l’autre bras portant le quencher (capteur)
3.4.9
sonde d’hybridation
système de deux sondes fluorescentes associées chacune à une molécule fluorescente, dans lequel une
molécule sert de donneur FRET (transfert d’énergie de fluorescence par résonance) et l’autre d’accepteur
FRET
3.4.10
sonde d’hydrolyse
sonde fluorescente associée à un fluorophore et un quencher (capteur) qui subissent une séparation stérique
du fait de l’activité exonucléasique 5′‑3′ de l’enzyme pendant le processus d’amplification
3.4.11
dénaturation
processus qui a pour résultat la séparation de l’acide nucléique bicaténaire en acides nucléiques
monocaténaires
3.4.12
hybridation
liaison spécifique de séquences complémentaires d’acides nucléiques dans les conditions de réaction
appropriées
3.4.13
hybridation «annealing»
appariement de séquences complémentaires à simple brin d’acides nucléiques pour former une molécule
bicaténaire
3.4.14
réaction de polymérisation en chaîne «hot-start»
PCR «hot start»
activation d’un acide désoxyribonucléique (ADN) polymérase thermostable par une étape initiale de chauffage
pour éviter une amplification non spécifique
3.5 Termes relatifs aux témoins
3.5.1
témoin négatif de processus
échantillon exempt de cible qui passe par toutes les étapes du processus d’analyse
Note 1 à l'article: Le procédé peut inclure la préparation de l’échantillon, l’enrichissement, l’extraction d’acide nucléique
et l’amplification de la cible.
3.5.2
témoin positif de processus
échantillon dopé en micro-organisme, traité de la même manière que les échantillons pour essai (3.1.2) afin de
surveiller l’ensemble du processus de la méthode basée sur la réaction de polymérisation en chaîne
3.5.3
témoin interne de processus
témoin utilisé pour l’évaluation de la qualité de l’ensemble du protocole, qui est donc ajouté à l’échantillon
examiné pour subir le même mode opératoire que le micro-organisme cible
Note 1 à l'article: En raison de son mode d’action, il faut sélectionner un témoin interne qui, par hypothèse,
est naturellement absent de la matrice soumise à essai.
3.5.4
témoin négatif d’extraction
blanc d’extraction
témoin soumis à toutes les étapes du mode opératoire d’extraction d’acide nucléique à l’exception de
l’adjonction d’un échantillon pour essai (3.1.2)
3.5.5
témoin interne d’amplification
acide nucléique (3.1.11) ajouté à chaque réaction de PCR en quantité ou nombre de copies définies et servant
de témoin interne d’amplification
Note 1 à l'article: Cette séquence d’acide nucléique peut être endogène (naturellement présente dans la matrice soumise
à essai) ou exogène (naturellement absente de la matrice soumise à essai).
Note 2 à l'article: Un témoin interne d’amplification exogène peut être homologue (amplifié à l’aide des mêmes amorces
que celles utilisées pour l’amplification de la cible) ou hétérologue (amplifié à l’aide d’amorces différentes de celles
utilisées pour l’amplification de la cible). Un amplicon de témoin interne d’amplification homologue doit pouvoir être
distingué de l’amplicon de la cible microbienne (par exemple, par sa taille ou par l’insertion d’une séquence différente de
liaison à la sonde).
3.5.6
témoin externe d’amplification
acide nucléique témoin ajouté en quantité ou nombre de copies définies à une aliquote de l’acide nucléique
extrait et servant de témoin d’amplification dans une réaction séparée
Note 1 à l'article: Il est fortement recommandé de pouvoir distinguer l’amplicon de témoin externe d’amplification de
l’amplicon cible (par exemple par l’insertion d’une séquence cible d’enzyme de restriction).
3.5.7
témoin positif de réaction de polymérisation en chaîne
témoin positif de PCR
réaction de PCR contenant la séquence d’acide nucléique cible en quantité ou en nombre de copies définies
3.5.8
témoin négatif de réaction de polymérisation en chaîne
témoin négatif de PCR
témoin sans échantillon
NTC (no-template control)
témoin de PCR réalisé avec de l’eau (ou un autre substrat inerte vis-à-vis de la PCR, tel qu’un tampon de
broyage ou d’élution) exempte d’acide nucléique cible et d’inhibiteurs de PCR
3.6 Termes relatifs à la qPCR
3.6.1
réaction de polymérisation en chaîne quantitative
qPCR
méthode permettant la quantification dans une matrice d’acide nucléique du nombre d’une séquence
spécifique d’acide nucléique en utilisant des oligonucléotides spécifiques
3.6.2
cycle de quantification
Cq
cycle au cours duquel le signal de fluorescence peut être
distingué du bruit de fond de fluorescence (3.4.7) entrant dans la phase exponentielle de l’amplification de la
cible
Note 1 à l'article: «Cycle de quantification» est un terme générique qui couvre le cycle seuil (C ), le point de
t
franchissement (C ), le point de décollage (TOP, take off point) et tous les autres termes spécifiques à l’instrument faisant
p
référence au cycle fractionnel utilisé pour détecter ou quantifier la cible dans l’essai par PCR en temps réel.
Note 2 à l'article: Le cycle de quantification s’appuie soit sur un seuil appliqué à tous les échantillons soit sur une analyse
de régression du signal, pour chaque échantillon.
[SOURCE: ISO 20395:2019, 3.8, modifié — La définition a été révisée. «qPCR» a été remplacé par
«PCR en temps réel» dans le domaine et la Note 1 à l’article.]
3.6.3
quantification relative par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel
quantification relative par PCR en temps réel
mode opératoire impliquant une amplification par PCR pour déterminer les niveaux de changement d’un acide
nucléique cible par rapport aux niveaux d’un acide nucléique de référence dont la concentration est connue,
mesurés dans la même réaction de PCR ou dans des réactions de PCR distinctes
3.6.4
quantification absolue par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel
quantification absolue par PCR en temps réel
mode opératoire impliquant une amplification par PCR pour déterminer la concentration d’un acide nucléique
cible dans un échantillon par comparaison avec une courbe standard, obtenue à partir d’étalons contenant
une quantité définie de cible
3.6.5
référence passive
molécules fluorescentes présentes dans le mélange
réactionnel, utilisées pour normaliser le signal
3.7 Termes relatifs à la dPCR
3.7.1
réaction de polymérisation en chaîne digitale
PCR digitale
dPCR
méthode consistant à répartir de manière aléatoire et indépendante des matrices d’acide nucléique entre
plusieurs partitions (3.7.2) d’un volume nominal équivalent, de sorte que certaines partitions contiennent de
la matrice d’acide nucléique et d’autres non, puis à soumettre les séquences cibles à une amplification par PCR
pour détecter les amplicons (3.1.8) spécifiques, en dénombrant les partitions avec un signal positif et négatif
pour l’acide nucléique cible
Note 1 à l'article: La dPCR peut également fournir les résultats qualitatifs «détecté» ou «non détecté».
Note 2 à l'article: Dans certains cas, des cellules ou des organismes entiers peuvent être partitionnés et la lyse est
effectuée dans les différentes partitions pour permettre l’amplification des acides nucléiques cibles.
[SOURCE: ISO 20395:2019, 3.10, modifié — «de manière aléatoire et indépendante» a été ajouté après
«répartir». Les Notes 1 et 2 à l’article d’origine ont été supprimées et de nouvelles notes à l’article ont été
ajoutées.]
3.7.2
partition
gouttelettes ou chambres de volume nominalement équivalent dans lesquelles le mélange de réactifs de la
réaction de polymérisation en chaîne digitale (dPCR) (3.7.1) et d’échantillon est réparti de manière aléatoire
puis amplifié par PCR
[SOURCE: ISO 20395:2019, 3.22]
3.7.3
population négative
ensemble de résultats négatifs provenant des partitions qui contenaient le mélange réactionnel, sans la
séquence cible, représentant les partitions négatives
3.7.4
population positive
ensemble de résultats positifs provenant des partitions qui contenaient le mélange réactionnel,
avec amplification de la séquence cible, représentant les partitions positives
3.7.5
séparabilité
distance entre la population négative (3.7.3) et la populationpopulation positive (3.7.4) dans le diagramme
d’analyse (1D Dot Plot) généré après la lecture des signaux de partition
Note 1 à l'article: La séparabilité peut varier en fonction de la qualité de l’échantillon et de la quantité de cible. Il est donc
important de prêter attention à la séparabilité de ces deux populations lorsqu’un échantillon faiblement positif est
détecté.
3.7.6
seuil d’analyse
limite de séparation entre la population négative (3.7.3) et la
population positive (3.7.4)
Note 1 à l'article: Le seuil limite peut être fixé automatiquement par le logiciel d’analyse ou manuellement par
l’opérateur.
3.7.7
limite de blanc
LoB (limit of blank)
nombre le plus élevé de partitions apparaissant positives,
avec une probabilité supérieure à 95 %, lors de l’analyse d’échantillons en l’absence de la séquence d’acide
nucléique cible de l’agent pathogène, qui détermine la limite de «faux positif» spécifique de la séquence cible
Note 1 à l'article: Il convient de déterminer la LoB, au minimum, à partir de réplicats du témoin négatif d’amplification
(LoB d’amplification) (par exemple, eau, tampon d’élution) et d’échantillons négatifs contenant la matrice (LoB de la
méthode complète). Il convient que le nombre de réplicats de témoin négatif et le nombre d’échantillons négatifs soient
justifiés par le laboratoire utilisateur et soient en cohérence avec les essais de validation réalisés par le développeur.
3.7.8
référence passive
molécule fluorescente dans le milieu réactionnel permettant
de dénombrer les partitions (3.7.2) contenant le mélange réactionnel
3.7.9
quantification absolue par réaction de polymérisation en chaîne digitale
quantification absolue par dPCR
mode opératoire, impliquant une amplification par PCR et une quantification des copies cibles, qui n’exige pas
de courbe standard pour déterminer la concentration d’un acide nucléique cible dans un échantillon
4 Principe
4.1 Généralités
Le mode opératoire comporte plusieurs étapes consécutives:
a) l’enrichissement microbien préliminaire du micro-organisme ou de la concentration de virus présents
dans l’échantillon pour laboratoire, si exigé (voir Article 5);
b) l’extraction et la purification de l’acide nucléique, si exigé (voir Article 6);
c) l’amplification de la séquence d’acide nucléique cible par PCR ou RT-PCR en utilisant des amorces
spécifiques, avec ajout de sondes fluorescentes ou de colorants se liant au double brin d’ADN en cas de
format en temps réel et digital (voir Article 7);
d) la détection et la confirmation des amplicons spécifiques par électrophorèse sur gel (PCR en point final)
ou par la surveillance du signal de fluorescence au moyen d’un système de détection optique (format en
temps réel ou digital) (voir Article 8);
e) l’analyse des données;
f) l’évaluation.
4.2 Échantillon pour laboratoire
Tout matériau provenant de la chaîne alimentaire convient comme échantillon pour laboratoire à condition
) que la solution d’acide nucléique
qu’il ait été établi par l’utilisation d’un témoin approprié (voir Tableau 1
préparée à partir de la prise d’essai n’inhibe pas complètement la PCR.
4.3 Échantillonnage, transport et stockage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Suivre la Norme
internationale spécifique du produit concerné. Des détails supplémentaires sur l’échantillonnage de certains
produits sont donnés dans les normes spécifiques qui sont listées dans l’ISO 7218.
S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il est
recommandé que les parties concernées parviennent à un accord sur ce sujet.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif. Conserver les échantillons acheminés
vers le laboratoire dans des conditions réduisant le plus possible toute modification du nombre de
micro-organismes présents. Il convient que l’échantillon n’ait pas été endommagé ni modifié au cours du
transport ou du stockage.
Les températures recommandées pour les échantillons pendant le transport et le stockage sont décrites dans
l’ISO 7218.
4.4 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai à partir de l’échantillon pour laboratoire conformément à la Norme
internationale spécifique du produit concerné. Suivre les modes opératoires spécifiés dans la série ISO 6887.
La préparation de l’échantillon pour essai pour la détection des virus peut être différente. Elle est spécifiée,
par exemple, dans la série ISO 15216 pour certains produits. S’il n’existe pas de Norme internationale
spécifique, il est recommandé que les parties concernées s’accordent sur ce sujet.
5 Enrichissement microbien et concentration virale
5.1 Enrichissement microbien
L’enrichissement microbien peut commencer directement à partir de la prise d’essai. Cela peut se faire en
stimulant la croissance du micro-organisme cible par culture de la prise d’essai dans des milieux nutritifs
liquides sélectifs ou non sélectifs. La filtration et/ou la concentration, comme la séparation
immunomagnétique, peuvent également être utilisées. Des composés antimicrobiens spécifiques peuvent être
utilisés pour inhiber la croissance des micro-organismes non ciblés.
5.2 Concentration virale
Les aliments et les surfaces alimentaires sont souvent des matrices très complexes et les virus cibles peuvent
être présents à de faibles concentrations. Il est donc nécessaire d’effectuer une extraction et/ou une
concentration du virus propre à la matrice afin de produire un substrat pour les parties communes ultérieures
du processus. La méthode dépend de la matrice, dont certaines sont spécifiées dans la série ISO 15216.
6 Préparation de l’acide nucléique
6.1 Généralités
L’objectif de l’étape de préparation de l’acide nucléique est d’obtenir une solution d’acide nucléique à partir
de l’échantillon pour laboratoire qui n’a pas d’effet inhibiteur significatif sur la PCR. Les cellules microbiennes
présentes dans l’échantillon pour laboratoire ou la culture enrichie/concentrée (voir Article 5) sont lysées
afin de libérer leur acide nucléique (ADN et/ou ARN). Si exigé, effectuer une étape de concentration (par
exemple, centrifugation ou filtration) avant la lyse et/ou de purification après la lyse. Il convient que la
solution d’acide nucléique obtenue lors de l’étape d’extraction contienne une quantité suffisante d’acide
nucléique cible de qualité appropriée.
Il convient que la solution d’acide nucléique obtenue contienne le moins de substances possible avec une
inhibition détectable de la PCR ou une interférence de fluorescence.
NOTE 1 La fluorescence provient souvent de récipients de réaction colorés et de certains ingrédients des bouillons
d’enrichissement.
En fonction de l’échantillon reçu, il peut être nécessaire de prétraiter ou de diluer la prise d’essai, car certains
produits peuvent contenir des composés ayant un effet inhibiteur sur la PCR. Si une inhibition de la PCR est
identifiée (par l’utilisation de témoins de réaction, voir 12.3), la prise d’essai enrichie ou le lysat peuvent être
dilués avant l’étape de la PCR.
NOTE 2 La méthode d’extraction peut avoir une grande influence sur la dégradation des acides nucléiques et/ou le
rendement et/ou l’efficacité de l’amplification. La méthode d’extraction la plus appropriée dépend fortement des
caractéristiques de la prise d’essai.
6.2 Prévention de l’amplification de l’ADN provenant de cellules mortes
Certaines prises d’essai peuvent contenir de grandes quantités d’ADN provenant de cellules mortes de
l’organisme cible (par exemple, des échantillons fortement traités, des échantillons environnementaux
recueillis après désinfection ou des échantillons traités par des phages). Ces cellules mortes, si elles sont
présentes en concentrations suffisamment élevées, peuvent conduire à des résultats positifs de PCR, même si
aucun organisme vivant n’est présent. Afin d’éliminer ou d’inactiver l’ADN des cellules mortes avant la
préparation de l’acide nucléique, un prétraitement peut être utilisé si les organismes cibles viables ne sont pas
significativement affectés par le procédé.
NOTE 1 Les cellules mortes dans ce contexte sont des cellules dont la paroi cellulaire est endommagée, ce qui permet
à certaines substances chimiques liant l’ADN de pénétrer dans la cellule et d’empêcher par la suite l’amplification par
PCR.
NOTE 2 Le rendement de l’élimination de l’ADN des cellules mortes peut être influencé par différents facteurs.
[17]
La performance du protocole peut être améliorée si certains facteurs critiques sont pris en compte .
6.3 Extraction, libération et purification des acides nucléiques
Plusieurs principes d’extraction de l’ADN ou de l’ARN peuvent être utilisés. Par exemple, les méthodes
suivantes peuvent être utilisées:
a) digestion des protéines: décomposer les protéines de l’extrait cellulaire avec des protéases (par exemple,
la protéinase K) et l’ARN avec des ribonucléases le cas échéant. Précipiter les peptides obtenus puis
purifier la solution d’acide nucléique et la concentrer davantage par précipitation à l’éthanol en présence
de cations monovalents;
b) lyse thermique: les acides nucléiques peuvent également être libérés par rupture thermique des cellules
(par exemple, par ébullition pendant 10 min). Une fois la rupture thermique des cellules terminée, laisser
refroidir l’échantillon. Centrifuger l’échantillon et utiliser le surnageant pour l’analyse par PCR. Avant la
rupture thermique des cellules et pour faciliter la désintégration cellulaire, un traitement enzymatique
peut être appliqué (par exemple, lysozyme, pour une utilisation avec des bactéries à Gram positif), suivi
d’une incubation de protéases/protéinases;
c) d’autres méthodes telles qu’une agitation vigoureuse avec des billes peuvent être exigées lorsque
l’organisme possède une paroi cellulaire particulièrement résistante (par exemple, Mycobacterium spp.).
NOTE Des kits commerciaux pour l’extraction, la libération et la purification des acides nucléiques sont disponibles
sur le marché.
6.4 Qualité et quantité d’acide nucléique
Il convient que la qualité et le rendement de l’acide nucléique extrait par une méthode donnée avec une
matrice spécifiée soient à la fois répétables et reproductibles en ce qui concerne l’amplification par PCR,
à condition que la matrice contienne suffisamment d’acide nucléique. En particulier, la méthode utilisée doit
permettre la récupération de fragments d’acide nucléique de taille moyenne supérieure ou égale aux
amplicons recherchés.
Pour certaines méthodes de préparation des échantillons et lorsque les acides nucléiques libérés ne sont pas
stables, il est nécessaire d’utiliser la solution d’acide nucléique immédiatement après la préparation. Il est
recommandé d’utiliser des méthodes d’extraction nucléique qui inactivent ou éliminent les DNases et les
RNases. Il convient que le pH du lysat soit adapté pour assurer la stabilité de l’ADN et de l’ARN.
En général, il convient d’éviter de congeler et de décongeler plusieurs fois les solutions d’acide nucléique.
Utiliser des articles en plastique à faible pouvoir liant pour stocker les acides nucléiques ayant un faible
nombre de copies, en particulier pour l’ARN.
La concentration des acides nucléiques isolés peut être estimée par des méthodes spectrophotométriques ou
fluorométriques ou par électrophorèse sur gel.
La pureté des acides nucléiques isolés peut être estimée par des méthodes spectrophotométriques ou par
électrophorèse sur gel.
7 Amplification par PCR
Une séquence spécifique d’acide nucléique est amplifiée par PCR (plusieurs séquences d’acide nucléique
peuvent également être ciblées simultanément dans un format de PCR multiplexe). La réaction est un
processus cyclique comportant trois étapes:
a) la dénaturation de l’acide nucléique bicaténaire (ADNdb);
b) l’hybridation des amorces (et de la sonde) à la séquence cible complémentaire;
c) l’extension des amorces fixées à l’aide d’ADN polymérase thermostable.
Pour réduire l’amplification non spécifique, un mélange maître «hot start» peut être utilisé conjointement avec
une étape initiale de chauffage pour réaliser une PCR «hot start».
L’ARN peut être détecté par RT-PCR lorsque la cible a d’abord été transcrite en ADN complémentaire (ADNc)
par transcription inverse avec une transcriptase inverse. Dans le format PCR en temps réel, le signal de
fluorescence est contrôlé à chaque cycle pendant l’étape d’hybridation ou l’étape d’extension, selon la sonde
utilisée.
Dans le cas de la dPCR, le mélange réactionnel contenant l’acide nucléique de l’échantillon est réparti de
manière aléatoire et indépendante en partitions discrètes d’un volume équivalent, de sorte que certaines
partitions ne contiennent pas de matrice d’acide nucléique et que d’autres contiennent une ou plusieurs copies
de matrice. Les partitions sont ensuite soumises à un cycle thermique jusqu’au point
...
Questions, Comments and Discussion
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