ISO 6579-4:2025

Norme
internationale
ISO 6579-4
Première édition
Microbiologie de la chaîne
2025-01
alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche, le
dénombrement et le sérotypage des
Salmonella —
Partie 4:
Identification du variant
monophasique de Salmonella
Typhimurium (1,4,[5],12:i:-) par
réaction de polymérisation en
chaîne (PCR)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
detection, enumeration and serotyping of Salmonella —
Part 4: Identification of monophasic Salmonella Typhimurium
(1,4,[5],12:i:-) by polymerase chain reaction (PCR)
Numéro de référence
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 3
4.1 Généralités .3
4.2 Préparation de colonies bien isolées .3
4.3 Mise en suspension d’une colonie .3
4.4 Amplification et détection . .3
5 Milieux de culture et réactifs . 3
6 Équipement et consommables . 3
7 Variant monophasique présumé de Salmonella Typhimurium . 4
8 Culture de l’isolat . 4
9 Mode opératoire . 4
9.1 Préparation de la suspension cellulaire ou de l’ADN .4
9.2 Amplification et détection par PCR .5
9.2.1 Généralités .5
9.2.2 Témoins de PCR .5
10 Expression des résultats . 5
11 Caractéristiques de performance des méthodes . 5
11.1 Validation conformément à l’ISO 17468 .5
11.2 Caractéristiques de performance .6
11.2.1 Étude d’évaluation de méthode(s) .6
11.2.2 Étude interlaboratoires .6
12 Rapport d’essai . 6
13 Assurance qualité . 7
Annexe A (normative) Milieux de culture et réactifs . 8
Annexe B (informative) Essai PCR multiplex en temps réel avec sonde pour l’identification du
variant monophasique de Salmonella Typhimurium (1,4,[5],12:i:-) .10
Annexe C (informative) Essai PCR multiplex avec électrophorèse sur gel d’agarose pour
l’identification du variant monophasique de Salmonella Typhimurium (1,4,[5],12:i:-) . 14
Annexe D (informative) Essai PCR simplex avec électrophorèse sur gel d’agarose pour
l’identification du variant monophasique de Salmonella Typhimurium (1,4,[5],12:i:-) .20
Annexe E (informative) Caractéristiques de performance .27
Bibliographie .34

iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de tout
droit de propriété revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas reçu
notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois, il y a lieu
d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations plus récentes
sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse www.iso.org/brevets.
L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de brevet.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie., en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la chaîne alimentaire,
du Comité européen de normalisation (CEN), conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO
et le CEN (Accord de Vienne).
Une liste de toutes les parties de la série ISO 6579 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.

iv
Introduction
Plusieurs législations internationale, régionale et nationale fixent des limites réglementaires pour
garantir la soi-disant «absence» de Salmonella spp. dans des échantillons de la chaîne alimentaire. De plus,
plusieurs règlements de la Commission européenne (CE) prescrivent également l’absence de sérotypes
particuliers de Salmonella qui se sont révélés être à l’origine d’un pourcentage relativement important de
salmonelloses chez l’Homme. L’un de ces sérotypes de Salmonella pour lesquels des critères légaux ont
été fixés est Salmonella Typhimurium, y compris son variant monophasique 1,4,[5],12:i:- (par exemple,
[10]
Règlement (CE) n° 1086/2011 ). Il est donc important de savoir si un sérotype identifié ayant pour formule
antigénique 1,4,[5],12:i:- est bien le variant monophasique de Salmonella Typhimurium (1,4,[5],12:i:1,2) et
non le variant monophasique d’un autre sérotype de Salmonella (S.) pour lequel aucun critère n’a été fixé,
tel que S. Lagos (1,4,[5],12:i:1,5), S. Agama (4,12:i:1,6), S. Farsta (4,[5],12:i:e,n,x), S. Tsevie (1,4,12:i:e,n,z ),
S. Gloucester (1,4,12,27:i:l,w) ou S. Tumodi (1,4,12:i:z ). La confirmation de la distinction entre les sérotypes
de Salmonella Typhimurium et Salmonella non Typhimurium peut être établie à l’aide d’une analyse
moléculaire, telle que les techniques de PCR décrites dans le présent document.

v
Norme internationale ISO 6579-4:2025(fr)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche, le dénombrement et le
sérotypage des Salmonella —
Partie 4:
Identification du variant monophasique de Salmonella
Typhimurium (1,4,[5],12:i:-) par réaction de polymérisation
en chaîne (PCR)
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel d’effectuer
les essais de recherche, de dénombrement et de (séro)typage de Salmonella uniquement dans des
laboratoires correctement équipés, sous la direction d’un microbiologiste compétent et de faire
très attention lors de l’élimination de tous les éléments incubés. Il convient que les personnes qui
utilisent le présent document soient familières avec les pratiques courantes de laboratoire. Le
présent document ne prétend pas couvrir tous les aspects de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à
son utilisation. Il incombe à l’utilisateur d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et
de sécurité.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode horizontale in vitro d’identification moléculaire et de
différenciation du variant monophasique de Salmonella enterica sous-espèce enterica sérotype Typhimurium
(1,4,[5],12:i:-) ne présentant pas l’antigène H de seconde phase H:1,2, à partir d’isolats. La méthode détecte
des séquences d’ADN spécifiques d’une région intergénique du groupe des flagellines de première phase
H pour l’identification de Salmonella enterica sous-espèce enterica sérotype Typhimurium (encore appelé
Salmonella Typhimurium) et des séquences d’ADN spécifiques de gènes associés à l’expression d’antigène
flagellaire H de seconde phase.
La méthode est applicable pour:
— la différenciation de l’isolat analysé entre le variant monophasique de Salmonella Typhimurium et le
variant monophasique d’un autre sérotype de Salmonella non Typhimurium ayant la même formule
antigénique;
— l’identification de l’isolat analysé comme étant soit le variant monophasique de Salmonella Typhimurium,
soit Salmonella Typhimurium (biphasique).
Le présent document est applicable à l’analyse d’une culture pure appartenant au genre Salmonella, isolée
à partir:
— de produits destinés à la consommation humaine;
— de produits destinés à l’alimentation animale;
— d’échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manutention de denrées
alimentaires;
— d’échantillons au stade de la production primaire.

Le présent document peut aussi être appliqué dans d’autres domaines pour l’identification du variant
monophasique de Salmonella Typhimurium (par exemple, domaine environnemental, santé humaine,
santé animale).
NOTE La présente méthode a été validée dans la cadre d’une étude d’évaluation de méthode et d’une étude
interlaboratoires à l’aide d’un large panel de souches différentes (souches cibles et non cibles), isolées à partir de
différentes sources (produits alimentaires, animaux, aliments pour animaux, échantillons de production primaire et
échantillons humains). Pour de plus amples informations sur la validation, voir Annexe E.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 7218, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences générales et recommandations pour les examens
microbiologiques
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
ISO 20836, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la
recherche de micro-organismes — Essais de performance thermique des thermocycleurs
ISO 22174, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la
recherche et la quantification de micro-organismes — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 22174 ainsi que les suivants
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
variant monophasique de Salmonella Typhimurium
variant de Salmonella enterica sous-espèce enterica sérotype Typhimurium ne présentant pas l’antigène H
de seconde phase H:1,2, ayant pour formule antigénique 1,4,[5],12:i:-
3.2
variant monophasique présumé de Salmonella Typhimurium
culture pure caractérisée comme appartenant au genre Salmonella, donnant une réaction positive pour
l’antigène O:4 et l’antigène H:i et une réaction négative pour l’antigène H de seconde phase H:1,2
3.3
point de franchissement du cycle seuil
point de la courbe d’amplification à partir duquel le signal de fluorescence s’élève au-dessus de la ligne de
base ou franchit un seuil prédéfini

4 Principe
4.1 Généralités
L’identification du variant monophasique de Salmonella Typhimurium comprend les trois étapes successives
décrites en 4.2 à 4.4, en commençant par une culture pure caractérisée comme appartenant au genre
Salmonella.
4.2 Préparation de colonies bien isolées
La culture est ensemencée en stries sur la surface d’un milieu gélosé non sélectif (pré-séché) et incubée
entre 34 °C et 38 °C pendant 24 h, afin d’obtenir des colonies bien isolées.
4.3 Mise en suspension d’une colonie
Une colonie bien isolée est sélectionnée et mise en suspension dans 100 µl de solution saline (0,85 % m/v)
ou dans 100 µl d’eau ultra-pure.
4.4 Amplification et détection
Les cellules bactériennes en suspension sont analysées par PCR pour la détection des séquences génétiques
propres à Salmonella Typhimurium (1,4,[5],12:i:1,2) et à son variant monophasique ne présentant pas
l’antigène H de seconde phase (1,4,[5],12:i:-), ainsi que pour la détection de séquences génétiques spécifiques
de gènes associés à l’expression de la seconde phase de l’antigène flagellaire H. Des essais PCR spécifiques
incluant des amorces et des sondes sont décrits aux Annexes B à D.
5 Milieux de culture et réactifs
Suivre les pratiques courantes de laboratoire conformément à l’ISO 7218. Pour les étapes en 4.3 et 4.4, utiliser
des réactifs et des consommables de qualité adaptée aux applications de biologie moléculaire (voir ISO 22174).
La composition des milieux de culture, des réactifs et leur préparation sont spécifiées à l’Annexe A. Pour
les essais de performance des milieux de culture, suivre les modes opératoires conformément à l’ISO 11133
et à l’Article A.4. Les amorces et les sondes pour l’identification du variant monophasique de Salmonella
Typhimurium (1,4,[5],12:i:-) sont répertoriées aux Annexes B à D.
6 Équipement et consommables
Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, à condition que ses
spécifications soient convenables. Le matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir ISO 7218) et
le matériel de biologie moléculaire (voir ISO 22174) et, en particulier, ce qui suit doit être utilisé.
6.1 Incubateur, réglable entre 34 °C et 38 °C.
NOTE La plage de températures comprises entre 34 °C et 38 °C pour l’incubation de milieux de culture inclut
l’utilisation d’incubateurs réglés à 35 °C ± 1 °C, 36 °C ± 2 °C ou 37 °C ± 1 °C.
6.2 Anses stériles, d’environ 3 mm de diamètre (10 µl) ou de 0,3 mm de diamètre (1 µl), ou un fil
à ensemencer (ose).
6.3 Bain-marie, réglable de 47 °C à 50 °C.
6.4 Réfrigérateur, fonctionnant à 5 °C ± 3 °C.
6.5 Enceinte de séchage, ou étuve, réglable entre 25 °C et 50 °C.

6.6 pH-mètre, ayant une exactitude d’étalonnage de ±0,1 unité de pH de 20 °C à 25 °C.
6.7 Matériel pour mise en suspension d’une colonie, par exemple tubes pour (micro)centrifugeuse.
6.8 Pipettes graduées et cônes à filtres pour pipettes, pour manipuler des volumes compris entre 0,2 µl
et 13,55 µl, selon l’essai PCR utilisé (voir Annexe B, C ou D). Pour plus de réactions par mélange, des volumes
plus importants sont nécessaires.
6.9 Mélangeur, Vortex ou équivalent.
6.10 Boîtes de Petri stériles, d’un diamètre d’environ 90 mm.
6.11 Équipement pour PCR et PCR en temps réel, par exemple microcentrifugeuse ou centrifugeuse
pour plaque.
6.12 Thermocycleur ou thermocycleur pour PCR en temps réel, étalonné conformément à l’ISO 20836.
6.13 Consommables associés à la technique de PCR classique ou PCR en temps réel, par exemple
des tubes pour PCR, des micro-plaques et films, un support de plaques, appropriés à l’utilisation avec
l’appareil de PCR sélectionné (voir Annexe B, C ou D).
6.14 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave), tels
que spécifiés dans l’ISO 7218.
7 Variant monophasique présumé de Salmonella Typhimurium
L’isolat à utiliser pour une identification ultérieure doit être une culture pure caractérisée comme
appartenant au genre Salmonella (voir ISO 6579-1). Un variant monophasique présumé de Salmonella
Typhimurium présentera une réaction positive pour les antigènes O:4 et H:i et une réaction négative pour
l’antigène H de seconde phase (voir ISO/TR 6579-3).
8 Culture de l’isolat
Ensemencer en stries la culture de l’Article 7 (par exemple avec une anse de 10 µl; 6.2) sur la surface d’un
milieu gélosé non sélectif (par exemple gélose nutritive; Article A.2) pour obtenir des colonies bien isolées.
Incuber les boîtes, surface de la gélose vers le bas, entre 34 °C et 38 °C (6.1) pendant 24 h ± 3 h.
9 Mode opératoire
9.1 Préparation de la suspension cellulaire ou de l’ADN
À l’aide d’un fil à ensemencer ou d’une anse stérile (6.2), prélever et mettre en suspension (une partie)
une colonie dans 100 µl de solution saline (0,85 % m/v; Article A.3) ou dans 100 µl d’eau ultra-pure dans
un tube approprié (6.7).
Mélanger (6.9) pour homogénéiser la suspension.
Une aliquote de 2 µl ou 2,5 µl, selon l’essai PCR choisi, de cette suspension de cellules bactériennes est utilisée
(voir Tableau B.2, C.2, D.2, D.3 ou D.4).
Il est également possible d’utiliser un extrait d’ADN pour l’essai PCR. L’extraction de l’ADN peut par exemple
être effectuée par lyse cellulaire thermique ou par une autre méthode d’extraction appropriée. S’ils sont
fiables, les kits commerciaux peuvent également être utilisés pour l’extraction de l’ADN, en suivant les
instructions du fabricant.
9.2 Amplification et détection par PCR
9.2.1 Généralités
Différents protocoles peuvent être utilisés pour la PCR multiplex en temps réel avec sonde, la PCR multiplex
suivie d’une détection par électrophorèse sur gel d’agarose des produits d’amplification ou la PCR simplex
suivie d’une détection par électrophorèse sur gel d’agarose.
Un essai PCR multiplex en temps réel avec sonde est donné à l’Annexe B.
Un essai PCR multiplex avec électrophorèse sur gel d’agarose est donné à l’Annexe C.
Un essai PCR simplex avec électrophorèse sur gel d’agarose est donné à l’Annexe D.
Respecter toutes les exigences, y compris l’utilisation d’un équipement approprié (6.11), relatives à
l’amplification par PCR (en temps réel) spécifiées dans l'ISO 22174.
9.2.2 Témoins de PCR
Utiliser des témoins (de processus) pour les essais PCR conformément à l’ISO 22174.
Pour la PCR en temps réel (voir Annexe B) et la PCR simplex (voir Annexe D), un témoin interne
d’amplification (TIA) doit également être utilisé car les cibles pourraient toutes être négatives. Étant donné
que la PCR multiplex (voir Annexe C) donnera toujours un fragment de PCR (1 000 pb ou 250 pb), ce mode
opératoire ne nécessite pas de TIA.
10 Expression des résultats
Les résultats obtenus, avec les témoins spécifiés dans l’ISO 22174, doivent être non ambigus, sinon la PCR
doit être recommencée.
Le résultat de la PCR sera:
a) soit positif si un produit PCR spécifique est détecté et que tous les témoins donnent les résultats
attendus;
b) soit négatif dans les limites de détection, si un produit PCR spécifique n’a pas été détecté et que les
témoins donnent les résultats attendus.
Si l’essai PCR identifie l’isolat comme étant un variant monophasique de Salmonella Typhimurium, consigner
le résultat de préférence en donnant la formule antigénique telle que déterminée.
Il est possible qu’un isolat soit identifié phénotypiquement comme un variant monophasique de Salmonella
Typhimurium, mais génotypiquement (par PCR) comme une Salmonella Typhimurium biphasique. Cela peut
être dû au fait que les gènes sont présents, mais ne sont pas phénotypiquement exprimés. Pour l’identification
de ces isolats, les résultats de la PCR prévalent sur les résultats de séro-agglutination.
11 Caractéristiques de performance des méthodes
11.1 Validation conformément à l’ISO 17468
Les méthodes PCR décrites aux Annexes B, C et D ont été validées conformément à l’ISO 17468. Toutes
les données pertinentes obtenues aux étapes 1 à 5 de l’ISO 17468, ainsi que les résultats de l’étude
interlaboratoires (étape 6 de l’ISO 17468) ont été rapportées dans la Référence [8].
Les caractéristiques de performance des trois méthodes PCR (inclusivité et exclusivité) ont été déterminées
dans une étude d’évaluation de méthode(s) (décrite en 11.2.1) et dans une étude interlaboratoires
(décrite en 11.2.2).
11.2 Caractéristiques de performance
11.2.1 Étude d’évaluation de méthode(s)
Les trois essais PCR décrits aux Annexes B, C et D ont été évalués dans le cadre d’une étude d’évaluation
de méthode, en analysant 172 souches différentes (souches cibles et non cibles), isolées à partir de différentes
sources (produits alimentaires, animaux, aliments pour animaux, échantillons de production primaire
et échantillons humains), dans deux laboratoires différents. Pour les essais d’inclusivité et d’exclusivité,
les résultats de sérotypage de Salmonella obtenus par méthode d’agglutination sur lame ont été comparés
aux résultats de sérotypage obtenus pour chaque méthode PCR.
Toutes les données sont présentées à l’Annexe E et plus de détails sont disponibles dans la référence [8].
L’étude d’évaluation de la méthode dépend de l’objectif spécifique visé pour lequel l’essai PCR est mené
et ses performances évaluées, à savoir si seul le variant monophasique de Salmonella Typhimurium est
considéré comme une souche cible (et fait donc partie de l’étude d’inclusivité) ou si Salmonella Typhimurium
(biphasique) est également considéré comme une souche cible.
Si l’objectif visé est de déterminer si la souche analysée est le variant monophasique de Salmonella
Typhimurium et non le variant monophasique d’un autre sérotype de Salmonella non Typhimurium, alors
le variant monophasique de Salmonella Typhimurium et Salmonella Typhimurium (biphasique) peuvent
être considérés comme souches cibles et les trois essais PCR décrits aux Annexes B, C et D présentent
des performances équivalentes pour l’identification de souches de variant monophasique de Salmonella
Typhimurium (voir Tableau E.1).
Si l’objectif est d’identifier si la souche analysée est soit un variant monophasique de Salmonella
Typhimurium, soit une Salmonella Typhimurium (biphasique), il convient alors de considérer Salmonella
Typhimurium comme une souche non cible. À cette fin, la PCR multiplex avec électrophorèse sur gel (voir
Annexe C) peut sembler moins spécifique pour certaines souches que les deux autres méthodes par PCR (voir
Tableau E.2), car cette méthode est moins adaptée pour distinguer les Salmonella Typhimurium biphasiques
des monophasiques.
11.2.2 Étude interlaboratoires
Les caractéristiques de performance de chaque méthode PCR (voir Annexes B, C et D) ont été déterminées
dans le cadre d’une étude interlaboratoires (étape 6 de l’ISO 17468) afin de déterminer l’inclusivité et
l’exclusivité des trois méthodes, en suivant les modes opératoires décrits dans l’ISO 16140-6. Des détails sur
l’étude interlaboratoires et un récapitulatif des données sont fournis à l’Article E.2 pour chaque essai PCR.
Un récapitulatif des données d’inclusivité et d’exclusivité est donné dans le Tableau E.4.
Dans l’étude d’inclusivité, des souches cibles pures devant être détectées par la méthode ont été soumises
à essai. Pour cette étude interlaboratoires, le variant monophasique de Salmonella Typhimurium a été la
seule souche cible considérée.
Dans l’étude d’exclusivité, des souches pures non cibles, qui ne devraient pas être détectées par la méthode
mais qui peuvent potentiellement présenter une réactivité croisée, ont été soumises à essai. Pour cette
étude interlaboratoires, des sérotypes de Salmonella autres que le variant monophasique de Salmonella
Typhimurium, notamment Salmonella Typhimurium (biphasique) et d’autres Enterobacteriaceae ont été
considérés comme souches non cibles.
12 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit préciser au moins ce qui suit:
— la méthode d’essai utilisée, avec référence au présent document, c’est-à-dire à l’ISO 6579-4;
— toutes les conditions opératoires non spécifiées dans le présent document, ou considérées comme
facultatives ou informatives (notamment aux annexes informatives), ainsi que les détails de tout incident
survenu pouvant avoir influé sur le ou les résultats d’essai;

— tout écart par rapport au présent document;
— tous les renseignements nécessaires à l’identification complète de l’échantillon;
— le ou les résultats d’essai obtenus;
— la date de l’essai.
13 Assurance qualité
Il convient que le laboratoire possède un système de contrôle qualité afin de garantir que l’équipement,
les réactifs et les techniques sont adaptés à la méthode. L’utilisation de témoins positifs, de témoins négatifs
et de blancs entre dans le cadre de la méthode. Les essais de performance des milieux de culture sont
spécifiés à l’Article A.4 et décrits dans l’ISO 11133.

Annexe A
(normative)
Milieux de culture et réactifs
A.1 Généralités
Les spécifications générales de l’ISO 11133 sont applicables à la préparation et aux essais de performance
des milieux de culture décrits dans cette annexe. Si des milieux de culture ou des réactifs sont préparés
à partir de milieux/réactifs complets déshydratés ou si des milieux/réactifs prêts à l’emploi sont utilisés,
suivre les instructions du fabricant concernant la préparation, les conditions de stockage, la date de
péremption et l’utilisation.
Les durées de conservation des milieux indiquées dans la présente annexe ont été démontrées dans
des études. L’utilisateur doit vérifier la durée de conservation dans ses propres conditions de stockage
(comme spécifié dans l’ISO 11133).
Les essais de performance des milieux de culture sont décrits à l’Article A.4.
A.2 Gélose nutritive (exemple de milieu gélosé non sélectif)
A.2.1 Composition
Extrait de viande 3,0 g
a
Peptone 5,0 g
®c
Chlorure de sodium (NaCl) (facultatif) (numéro de registre CAS 7647-14-5) 5,0 g
b
Agar-agar 9,0 g à 18,0 g
Eau 1 000 ml
a
Par exemple, digestat enzymatique de caséine.
b
Selon le pouvoir gélifiant de l’agar.
c ®
Numéro de registre du Chemical Abstracts Service (CAS) est une marque commerciale de l’American
Chemical Society (ACS). Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et
ne signifie nullement que l’ISO approuve l’emploi du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent
être utilisés s’il est démontré qu’ils aboutissent aux mêmes résultats.
A.2.2 Préparation
Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau, en chauffant et en agitant fréquemment.
Si nécessaire, ajuster le pH (6.6)de sorte qu’après stérilisation il soit de 7,0 ± 0,2 à une température comprise
entre 20 °C et 25 °C.
Répartir le milieu de culture dans des tubes ou des flacons de capacité appropriée.
Stériliser à l’autoclave (6.14) réglé à 121 °C pendant 15 min.
A.2.3 Préparation des boîtes de gélose nutritive
Refroidir le milieu dans un bain-marie (6.3) réglé à une température comprise entre 47 °C et 50 °C, mélanger
et verser un volume compris entre 15 ml et 20 ml environ dans des boîtes de Petri stériles d’environ 90 mm
de diamètre (6.10). Laisser solidifier.

Juste avant l’emploi, sécher soigneusement les boîtes de gélose (de préférence après avoir retiré les couvercles
et retourné les boîtes) dans l’enceinte de séchage ou l’étuve (6.5) réglée entre 25 °C et 50 °C, jusqu’au séchage
de la surface de la gélose.
Conserver les boîtes coulées en les protégeant de la déshydratation, à 5 °C (6.4), pendant quatre semaines
au maximum.
A.3 Solution saline (0,85 % m/v)
A.3.1 Composition ®
Chlorure de sodium (NaCl)      (n° CAS 7647-14-5) 8,5 g
Eau 1 000 ml
A.3.2 Préparation
Dissoudre le chlorure de sodium dans l’eau.
Si nécessaire, ajuster le pH (6.6)de sorte qu’après stérilisation il soit de 7,0 ± 0,2 à une température comprise
entre 20 °C et 25 °C.
Répartir la solution, par quantités nécessaires à l’essai, dans des tubes ou des flacons de capacité appropriée.
Stériliser à l’autoclave (6.14) réglé à 121 °C pendant 15 min.
Conserver la solution dans des flacons ou tubes fermés à 5 °C (6.4), six mois au maximum.
A.4 Essais de performance pour l’assurance de la qualité des milieux de culture
Les définitions de la sélectivité et de la productivité sont données dans l’ISO 11133. En général, suivre les
modes opératoires d’essai de performance décrits dans l’ISO 11133, y compris les niveaux d’inoculum pour
les organismes cibles et non cibles. Le Tableau A.1 fournit une présentation détaillée des souches témoins à
utiliser pour les essais de performance des milieux de culture spécifiés dans le présent document.
Tableau A.1 — Essais de performance pour l’assurance de la qualité des milieux de culture
a b
Milieu Fonction Incubation Souches témoins Numéros WDCM Critères
c,d
Gélose Productivité 24 h ± 3 h/ Salmonella Typhimurium 00031 Bonne
nutritive 34 °C à 38 °C croissance
c,d
Salmonella Enteritidis 00030
a
Pour plus d’informations sur les numéros d’identification des cultures des souches de collection et sur leurs descriptions
détaillées, se référer au catalogue de souche de référence disponible à l’adresse www .wfcc .info; WDCM: World Data Centre
for Microorganisms.
b
Catégories de croissance: 0: pas de croissance; 1: croissance faible (inhibition partielle) et 2: bonne croissance (voir
ISO 11133).
c
Certaines restrictions nationales et directives peuvent nécessiter l’utilisation d’un sérotype différent. Se référer aux
exigences nationales relatives au choix des sérotypes de Salmonella.
d
Souche au choix; l’une des souches doit être utilisée au minimum.

Annexe B
(informative)
Essai PCR multiplex en temps réel avec sonde pour l’identification du
variant monophasique de Salmonella Typhimurium (1,4,[5],12:i:-)
B.1 Généralités
La présente annexe décrit une méthode de PCR multiplex en temps réel avec sonde reposant sur l’activité
de la 5′-nucléase pour l’identification du variant monophasique de Salmonella Typhimurium (1,4,[5],12:i:-)
et la différenciation par rapport aux autres sérotypes monophasiques de Salmonella non Typhimurium, en
ciblant les séquences génétiques suivantes:
— liaison entre fliA et la séquence d’insertion IS200 (présente dans Salmonella Typhimurium (1,4,[5],12:i:1,2)
et dans le variant monophasique de Salmonella Typhimurium (1,4,[5],12:i:-));
— liaison entre fljB et hin (présent dans les isolats exprimant l’antigène H de seconde phase);
— liaison entre hin et iroB (présent dans les isolats exprimant l’antigène H de seconde phase).
Pour l’expression de l’antigène H de seconde phase, les deux produits d’amplification, fljB – hin et hin – iroB
doivent être détectés. Si l’un des deux produits n’est pas détecté, l’expression de l’antigène H de seconde
phase est interrompue.
La PCR multiplex en temps réel avec sonde contient également un témoin interne d’amplification (TIA)
hétérologue issu du plasmide pUC18/19. Par PCR en temps réel, un fragment allant de M13pm18 à des
séquences de pBR322 est amplifié. Cette séquence n’est pas présente naturellement.
NOTE Un autre TIA, avec ses amorces et sa sonde spécifiques, peut être utilisé s’il aboutit aux mêmes résultats.
B.2 Mode opératoire
B.2.1 Principe
Trois séquences génétiques spécifiques et une séquence du TIA sont amplifiées et détectées par une méthode
de PCR multiplex en temps réel avec sonde reposant sur l’activité de la 5′-nucléase.
B.2.2 Réactifs pour la PCR
B.2.2.1 Généralités
Voir ISO 22174.
B.2.2.2 Amorces et sondes
Les amorces et les sondes sont présentées dans la Référence [7]. Les séquences sont répertoriées dans
le Tableau B.1.
Tableau B.1 — Séquences des amorces et des sondes
Séquence Nom de l’amorce/ Séquence de l’amorce/de la sonde (5′-3′) Taille de
cible de la sonde l’amplicon (pb)
fliA-IS200F CAT TAC ACC TTC AGC GGT AT
fliA-IS200 fliA-IS200R CTG GTA AGA GAG CCT TAT AGG 254
a
Sonde fliA-IS200-sonde2 FAM – CGG CAT GAT TAT CCG TTT CTA CAG AGG – BHQ1
fljB-hinF TGG TGC TGT TAG CAG AC
fljB-hin fljB-hinR TCA ACA CTA ACA GTC TGT CG 297
b
Sonde fljB-hin YY – AAC CGC CAG TTC ACG CAC – BHQ2
hin-iroBF GTG TGG CAT AAA TAA ACC GA
hin-iroB hin-iroBR AGG CTT ACC TGT GTC ATC CA 274
c
Sonde hin-iroB ROX – TAA CGC GCT CAC GAT AAG GC – BHQ2
Amorce sens de TIA GTC GGG AAA CCT GTC G
d
TIA Amorce antisens de TIA GCT CAC ATG TTC TTT CCT GC 207
e
Sonde de TIA Cy5 – CGG GGA GAG GCG GTT– BHQ3
NOTE D’autres fluorophores et quenchers appropriés peuvent être utilisés.
a f
FAM: 6-Carboxyfluorescéine, BHQ1: Black Hole Quencher 1™.
b f
YY: Yakima Yellow™, BHQ2: Black Hole Quencher 2™.
c f
ROX: Carboxy-X-rhodamine™, BHQ2: Black Hole Quencher 2™.
d
TIA: Témoin interne d’amplification.
e ® f
Cy5: Cyanine 5 , BHQ3: Black Hole Quencher 3™.
f
Les produits avec des appellations commerciales ou des marques commerciales ne sont cités que dans un souci de commodité
à l’intention des utilisateurs du présent document et cela ne signifie nullement que l’ISO approuve l’emploi du produit ainsi
désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils aboutissent aux mêmes résultats.
B.2.3 Configuration de la PCR en temps réel
B.2.3.1 Configuration de la réaction
Le volume total de PCR est de 25 µl par réaction PCR. Les réactifs pour la préparation du mélange réactionnel
sont répertoriés dans le Tableau B.2.
Tableau B.2 — Préparation du mélange réactionnel
Réactif Concentration finale Volume par réaction
a
(concentration de solution mère) (µl)
Tampon de PCR 10× sans chlorure de magnésium 1× 2,5
Mélange de dNTP (2 mmol/l chacun) 200 µmol/l chacun 2,5 ®
Chlorure de magnésium (50 mmol/l) (n° CAS 7786-30-3) 2,5 mmol/l 1,25
fliA-IS200F (20 pmol/µl) 0,4 pmol/µl 0,5
fliA-IS200R (20 pmol/µl) 0,4 pmol/µl 0,5
fljB-hinF (20 pmol/µl) 0,4 pmol/µl 0,5
fljB-hinR (20 pmol/µl) 0,4 pmol/µl 0,5
hin-iroBF (20 pmol/µl) 0,4 pmol/µl 0,5
NOTE Pour le TIA, le pUC 18 peut également être utilisé. 1 fg de pUC 18/19 correspond à environ 3,4 × 10 copies.
a
Le volume par réaction dépend de la concentration du réactif dans la solution mère et est déterminé par la concentration
finale.
b
Les caractéristiques de performance de cet essai ont été évaluées avec la polymérase Taq Platinum™ disponible sur le marché
et le tampon de PCR 10X (Invitrogen). Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne
signifie nullement que l’ISO approuve l’emploi du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est
démontré qu’ils aboutissent aux mêmes résultats.

TTaabblleeaau Bu B.2 2 ((ssuuiitte)e)
Réactif Concentration finale Volume par réaction
a
(concentration de solution mère) (µl)
hin-iroBR (20 pmol/µl) 0,4 pmol/µl 0,5
Amorce sens de TIA (20 pmol/µl) 0,4 pmol/µl 0,5
Amorce antisens de TIA (20 pmol/µl) 0,4 pmol/µl 0,5
Sonde fliA-IS200-sonde2 (5′FAM-3′BHQ1) (5 pmol/µl) 0,125 pmol/µl 0,625
Sonde fljB-hin (5′YY-3′BHQ2) (10 pmol/µl) 0,25 pmol/µl 0,625
Sonde hin-iroB (5′ROX-3′BHQ2) (10 pmol/µl) 0,25 pmol/µl 0,625
Sonde de TIA (5′Cy5–3′BHQ3) (10 pmol/µl) 0,25 pmol/µl 0,625
b
Taq polymérase 2 U 0,2
TIA - ADN pUC19 Environ 10 copies 1,0
Suspension cellulaire ou extrait d’ADN (9.1) 2,5
Eau ultra-pure Compléter à 25 µl 8,55
NOTE Pour le TIA, le pUC 18 peut également être utilisé. 1 fg de pUC 18/19 correspond à environ 3,4 × 10 copies.
a
Le volume par réaction dépend de la concentration du réactif dans la solution mère et est déterminé par la concentration
finale.
b
Les caractéristiques de performance de cet essai ont été évaluées avec la polymérase Taq Platinum™ disponible sur le marché
et le tampon de PCR 10X (Invitrogen). Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne
signifie nullement que l’ISO approuve l’emploi du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est
démontré qu’ils aboutissent aux mêmes résultats.
B.2.3.2 Témoins de PCR
B.2.3.2.1 Généralités
Voir ISO 22174.
B.2.3.2.2 Témoin négatif de PCR
De l’eau ultra-pure est utilisée comme témoin négatif, voir ISO 22174.
B.2.3.2.3 Témoin positif de PCR
Une suspension cellulaire de Salmonella Typhimurium (1,4,[5],12:i:1,2) ou une solution contenant une
quantité suffisante définie et/ou un nombre de copies suffisant défini d’ADN cible de Salmonella Typhimurium
(1,4,[5],12:i:1,2) est utilisée comme témoin positif (pour la préparation, voir 9.1).
B.2.3.3 Programme température/temps
Appliquer le programme température/temps et le nombre de cycles indiqués dans le Tableau B.3 à 25 µl
du mélange réactionnel et aux témoins de PCR.
Tableau B.3 — Programme température/temps
a
Étape du cycle Température et temps Nombre de cycles
b
Activation/Dénaturation initiale 95 °C pendant 2 min -
Dénaturation 95 °C pendant 15 s
40 cycles
Amplification 61 °C pendant 1 min
a
Les températures mentionnées sont les températures qu’il convient que le thermocycleur (6.12) atteigne réellement. Celles-ci
ne correspondent pas nécessairement aux températures programmées. Si le thermocycleur présente un écart après étalonnage,
corriger cet écart.
b
Le temps d’activation dépend de la Taq polymérase utilisée.

B.3 Interprétation des résultats de PCR
Les résultats de PCR doivent être interpr
...