ISO 16198:2015
(Main)Soil quality - Plant-based test to assess the environmental bioavailability of trace elements to plants
Soil quality - Plant-based test to assess the environmental bioavailability of trace elements to plants
ISO 16198:2015 specifies the plant-based test, called biotest, which enables estimation of the environmental bioavailability of trace elements to plants either basically as the concentration in shoots and roots or in a more integrative way as the net uptake flux in plants.
Qualité du sol — Test végétal pour l'évaluation de la biodisponibilité environnementale des éléments traces pour les végétaux
L'ISO 16198:2015 spécifie le test végétal, dénommé «biotest» qui permet d'estimer la biodisponibilité environnementale des éléments traces pour les végétaux, soit simplement sous la forme de concentrations dans les parties aériennes et racinaires, soit de façon plus globale sous forme de flux de prélèvement net dans les végétaux.
General Information
Relations
Overview
ISO 16198:2015 defines a standardized plant-based test (biotest) to assess the environmental bioavailability of trace elements to plants. The method estimates bioavailability either as concentrations in shoots and roots or as a more integrative net uptake flux. The procedure combines a pre-growth phase in hydroponics with a subsequent exposure phase where plants grow in contact with soil or soil materials under oxic conditions. The standard is intended for soils, amended soils and soil materials, and is validated for a set of key trace elements.
Key topics and technical requirements
- Biotest design: Two successive steps - pre-growth in hydroponics followed by plant growth in contact with test soil. Roots are in contact with soil without penetrating it, enabling rhizosphere processes while simplifying root recovery.
- Endpoints: Measurement of trace element concentrations in shoots and roots and calculation of net uptake flux as an integrative bioavailability metric.
- Target species: Standard suggests three species - cabbage (Brassica oleracea), tall fescue (Festuca arundinacea) and tomato (Lycopersicon esculentum) - with options to include other species (Annex A).
- Validated trace elements: Includes As, Cd, Cr, Co, Cu, Pb, Ni, Zn; additional elements may be assessed where appropriate.
- Apparatus and conditions: Specifies laboratory and biological apparatus, nutrient solutions, climatic conditions in growth chambers, sample pre-treatment, digestion and analytical methods (see Annexes for technical drawings and procedures).
- Validity and data handling: Includes validity criteria, statistical analysis, data presentation, and reporting requirements to ensure reproducibility and comparability across labs.
- Limitations: Not designed for trace elements prone to volatilization or for bioavailability from foliar deposition; not intended for organic contaminants without adapting the mesh to avoid sorption.
Applications and who uses it
ISO 16198:2015 is used by:
- Environmental and soil testing laboratories for bioavailability assessment of trace elements.
- Contaminated land assessors and remediation consultants for risk assessment, site comparison, and remediation effectiveness.
- Regulators and policymakers setting soil quality standards and land-use decisions.
- Agronomists and researchers studying plant uptake, rhizosphere interactions, and the impact of soil amendments (composts, sludges, wastewaters). Practical applications include comparing bioavailability across soils, validating chemical extraction methods against biological uptake, monitoring amended soils, and supporting land management or regulatory compliance.
Related standards
ISO 16198 references and complements other soil-quality standards such as ISO 17402 (bioavailability framework), ISO 11269-2 (effects on plant growth), and normative methods for water, pH and carbon analysis (e.g., ISO 3696, ISO 10390, ISO 10694). These related standards help ensure consistent sample preparation, analytical quality and interpretation.
Frequently Asked Questions
ISO 16198:2015 is a standard published by the International Organization for Standardization (ISO). Its full title is "Soil quality - Plant-based test to assess the environmental bioavailability of trace elements to plants". This standard covers: ISO 16198:2015 specifies the plant-based test, called biotest, which enables estimation of the environmental bioavailability of trace elements to plants either basically as the concentration in shoots and roots or in a more integrative way as the net uptake flux in plants.
ISO 16198:2015 specifies the plant-based test, called biotest, which enables estimation of the environmental bioavailability of trace elements to plants either basically as the concentration in shoots and roots or in a more integrative way as the net uptake flux in plants.
ISO 16198:2015 is classified under the following ICS (International Classification for Standards) categories: 13.080.30 - Biological properties of soils. The ICS classification helps identify the subject area and facilitates finding related standards.
ISO 16198:2015 has the following relationships with other standards: It is inter standard links to ISO/IEC TR 18047-3:2004. Understanding these relationships helps ensure you are using the most current and applicable version of the standard.
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16198
First edition
2015-01-15
Soil quality — Plant-based test
to assess the environmental
bioavailability of trace elements to
plants
Qualité du sol — Test végétal pour l’évaluation de la biodisponibilité
environnementale des éléments traces pour les végétaux
Reference number
©
ISO 2015
© ISO 2015
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Published in Switzerland
ii © ISO 2015 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 3
5 Laboratory apparatus . 5
6 Reagents . 5
6.1 General . 5
7 Biological and growing apparatus. 6
7.1 Plant species . 6
7.2 Biotest apparatus . 6
7.3 Composition of the nutrient solutions . 9
7.4 Climatic conditions in the growth chamber.10
8 Pre-treatment and analysis of soil or soil material sample .10
8.1 Sample size and particle size reduction .10
8.2 Analyses .10
9 Experimental and analytical procedure .11
9.1 Overview of the procedure .11
9.2 Selection and preparation of seeds .11
9.3 Preculture period: Germination and pre-growth in hydroponics .11
9.4 Preparation and incubation of soil or soil material .12
9.5 Test culture period: Plant growth in contact with soil or soil material .12
9.6 Plant harvests.13
9.7 Grinding and digestion of shoots and roots .13
9.8 Analytical determination.14
10 Validity criteria .14
11 Assessment of the results .14
11.1 Determination of trace element concentrations and uptake flux in plants .14
11.2 Data presentation .16
11.3 Expression of the results .16
12 Statistical analysis .16
12.1 General .16
12.2 Plant biomasses .16
12.3 Bioavailability end points .17
13 Test report .17
Annex A (informative) Plant species adapted to the biotest procedure .19
Annex B (informative) Technical drawings of the different components of the biotest .21
Annex C (informative) Seed selection and seed density in plant pot for a range of species tested
with the standardized experimental procedure .24
Annex D (informative) Digestion and analysis of plant samples .26
Annex E (informative) Range of biomasses and trace element quantities in control plant pots .28
Annex F (informative) Ring-test .29
Bibliography .43
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any
patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or on
the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 7, Soil and site
assessment.
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Introduction
One of the main objectives of ISO 17402 is to define a conceptual framework of the bioavailability of
contaminants in soils and soil materials, and to provide a guidance for the selection of methods able to
be standardized for the measurement of bioavailability. Bioavailability was thus defined according to
three successive steps:
a) “environmental availability”;
b) “environmental bioavailability”;
c) “toxicological bioavailability”.
The environmental bioavailability is consequently a prerequisite to the assessment of the toxicological
bioavailability and is directly related to the impact of pollutants on major functions of soil in the
ecosystem and more particularly to habitat and retention functions.
Environmental bioavailability can be estimated with either chemical or biological methods. In the case
of trace elements, chemical methods are usually the cheapest, easy to perform, and some of them are
already standardized at national or international level (e.g. ISO 19730). However, chemical methods
which, strictly speaking, measure the environmental availability in soils have to be correlated with
biological measurements before being used as indicators of environmental bioavailability. Whatever
chemical methods are employed, none are designed per se to address the diversity of responses observed
among different plant species or cultivars which can be attributed to a) the uptake behaviour of plants
(i.e. sensitive, tolerant, accumulator, or hyper-accumulator of trace elements) and/or b) the ability of
plants to alter the biological, physical and physical-chemical properties of their “bio-influenced zone” at
the soil-root interface, i.e. the so-called rhizosphere. It could alternatively, be suggested to apply chemical
methods directly to the rhizosphere but the sampling of the rhizosphere is definitely too tedious to be
applied routinely.
For biological methods, four standardized biotests account for rhizosphere processes as they are based
on soil-grown plants (ISO 11269-1, ISO 11269-2, ISO 17126, and ISO 22030). However, these were only
designed to predict trace element phytotoxicity, i.e. the toxicological bioavailability. In these biotests,
roots grow directly in the soil, therefore requiring a tedious washing procedure to reliably measure
trace elements accumulated in the roots. Indeed, the amount of trace elements accumulated in shoots of
non-accumulator plant species is not sufficiently sensitive to be used for assessing the environmental
bioavailability of trace elements compared to the amount accumulated in the whole plant, roots included.
Thus, there is still a need to develop biological methods accounting for rhizosphere processes and enabling
to include the root compartment in order to properly estimate the environmental bioavailability of trace
elements to plants.
Consequently, the present International Standard introduces a biotest based on the growing of roots in
contact with the soil but without penetrating it. Although this experimental design is partly artificial, it
enables a fair comparison of the bioavailability of trace elements between tested soils. In addition, the
end point measured can be more directly related to the measurement of the environmental availability
than any end point based on the measurement of toxicity.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16198:2015(E)
Soil quality — Plant-based test to assess the environmental
bioavailability of trace elements to plants
1 Scope
This International Standard specifies the plant-based test, hereafter called the biotest. It enables
estimation of the environmental bioavailability of trace elements to plants either basically as the
concentration in shoots and roots or in a more integrative way as the net uptake flux in plants. The
biotest procedure includes two successive steps: (i) a pre-growth of plants in hydroponics and (ii) a
growth of plants in contact with soil samples. The concentration in shoots and roots as well as the
net uptake flux of trace elements in plants are determined at the end of the second step of the biotest
procedure.
This biotest is applicable to the assessment of environmental bioavailability of trace elements to plants,
more particularly to agricultural plants, in soils or soil materials under oxic conditions, considering that
— three plant species (cabbage, Brassica oleracea; tall fescue, Festuca arundinacea; tomato, Lycopersicon
esculentum; 7.1) are suggested in the standardized biotest procedure, but additional target-plant
species can also be used (see 7.1, Annex A), and
— the standardized biotest procedure is validated for a range of trace elements including arsenic
(As), cadmium (Cd), chromium (Cr), cobalt (Co), copper (Cu), lead (Pb), nickel (Ni), and zinc (Zn), but
additional trace elements can also be accounted for (see Annex A).
The biotest can be applied to soils and soil materials, including soils amended before or after field
sampling with composts, sludges, wastewaters, and other (waste) materials.
NOTE 1 This biotest is not designed to assess the environmental bioavailability of trace elements that are
prone to volatilisation or resulting from uptake occurring in plant leaves following, e.g. atmospheric fallout.
NOTE 2 This biotest is not designed to assess the environmental bioavailability to plants of organic
contaminants. A similar experimental procedure could be used but the physical separation between plant roots
and soil using a polyamide mesh needs to be adapted to avoid organic contaminant sorption on the mesh.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis)
ISO 11269-2, Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora — Part 2: Effects of
contaminated soil on the emergence and early growth of higher plants
ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric
method
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
[SOURCE: ISO 11074:2005, 3.5.1]
Note 1 to entry: There is no assumption in this definition that harm results from the presence of the contaminant
3.2
environmental availability
fraction of contaminant physico-chemically driven by desorption processes potentially available to
organisms
[SOURCE: ISO 17402:2008, 3.4]
3.3
environmental bioavailability
fraction of the environmentally available compound which an organism takes up through physiologically
driven processes
[SOURCE: ISO 17402:2008, 3.5]
3.4
habitat function
ability of soil/soil materials to serve as a habitat for micro-organisms, plants, soil-living animals, and
their interactions (biocenosis)
[SOURCE: ISO 11074:2005, 3.4.3]
3.5
trace element
−1
chemical element in soil occurring at concentration generally less than 100 mg kg
Note 1 to entry: Given according to Reference [16].
3.6
retention function
ability of soil/soil materials to adsorb pollutants in such a way that they cannot be mobilized via the
water pathway and translocated into the terrestrial food chain
[SOURCE: ISO 11074:2005, 3.4.13]
3.7
rhizosphere
volume of soil around living roots that is influenced by root activities
Note 1 to entry: Given according to Reference [17].
3.8
soil
upper layer of the earth’s crust transformed by weathering and physical/chemical and biological
processes. It is composed of mineral particles, organic matter, water, air, and living organisms organized
in genetic soil horizons
[SOURCE: ISO 11074:2005, 2.1.8]
2 © ISO 2015 – All rights reserved
3.9
soil material
material coming from soil and displaced and/or modified by human activity, including excavated soil,
dredged materials, manufactured soils, and treated soils and fill materials
[SOURCE: ISO 17402:2008, 3.16]
3.10
toxicological bioavailability
internal concentration of pollutant accumulated and/or related to a toxic effect
[SOURCE: ISO 17402:2008, 3.18]
4 Principle
This International Standard describes the experimental procedure of the biotest developed initially
by References [18], [19], and [20]. This biotest consists of two successive steps of plant growth (see
Figure 1). During the first step (i.e. preculture period), plant seedlings are grown in hydroponics for
14 d to achieve an adequate plant biomass and a dense, planar root mat. During the second step (i.e. test
culture period), the root mat of pre-grown plants is put in contact for 8 d with a 6 mm-thick layer of soil
sample sieved to 2 mm.
Key
a seed germination (7 d) 8 air diffuser
b seedling pre-growth (7 d) 9 30-µm mesh
1 preculture period in hydroponics – 14 d 10 air
2 test culture period soil-plant contact – 8 d 11 root mat
3 aluminium foil 12 nutrient solution 2
4 floating platform 13 shoots
5 seeds 14 soil layer (6 mm thick)
6 plant pot 15 nutrient solution 3
7 nutrient solution 1 16 filter paper wicks
Figure 1 — The two-step procedure of the biotest
A set of control plants is harvested at the end of the preculture period in hydroponics to determine the
pools of trace elements in plant shoots and roots before exposure to soil. Whole plants (shoots and roots)
are then harvested at the end of the test culture period. Biomasses and trace element concentrations in
shoots and roots are determined. The end points of the biotest are a) the concentration of trace elements
in shoots and roots at the end of the test culture period and b) the net uptake flux of trace elements in
[21]
the whole plants during the test culture period. If these end points are usually correlated, the uptake
flux is expected to be more representative of the trace element bioavailability to plants during the test
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culture period (i.e. the exposure to tested soils) as, conversely to concentrations, the uptake flux does
not include the portion of trace elements taken up during the preculture period (11.1).
As plant growth during the pre-culture period is usually sufficient to prevent the occurrence of
phytotoxic symptoms induced by adverse soil chemical properties or excessive accumulation of trace
elements in plant, the biotest enables a fair comparison of trace element bioavailability over a broad
range of soils, including heavily contaminated soils.
5 Laboratory apparatus
The following equipment shall be used. All equipment that comes into contact with the sample (soils,
plants, or reagents) shall not adsorb substantially trace elements and shall not contaminate the sample.
5.1 Sieving equipment, nominal screen size 2 mm.
5.2 Crushing equipment, jaw crusher and cutting device.
5.3 Balance, with an accuracy of at least 100 mg.
5.4 Balance, with an accuracy of at least 1 mg.
5.5 Growth chamber, suitable for maintaining specific climatic conditions as specified in 7.4.
5.6 Ventilated oven, suitable for drying soil or soil material at 25 °C and shoots and roots at 50 °C.
5.7 Scissors, with blades made of zirconium oxide.
5.8 Grinder and marbles, made of zirconium oxide.
6 Reagents
6.1 General
Use reagents of analytical grade purity with a concentration of investigated trace elements (e. g. As, Cd,
-1
Co, Cr, Cu, Ni, Pb, and Zn) lower or equal to 5 mg kg . Water used shall comply with grade 3 according to
ISO 3696.
−1
6.2 Water, distilled or demineralized with a specific conductivity of at most 5 µS cm at 25 °C and a pH
within the range 5,0 to 7,5.
-1
6.3 Hydrogen peroxide (H O , 34,01 g mol ).
2 2
-1
6.4 Calcium chloride dihydrate (CaCl ·2H O, 147,07 g mol ).
2 2
-1
6.5 Boric acid (H BO , 61,83 g mol ).
3 3
-1
6.6 Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO ) ·4H O, 236,15 g mol ).
3 2 2
-1
6.7 Potassium nitrate (KNO , 101,1 g mol ).
-1
6.8 Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO ·7H O, 246,48 g mol ).
4 2
-1
6.9 Potassium phosphate (KH PO , 136,09 g mol ).
2 4
-1
6.10 Ethylenediaminetetraacetic acid iron(III) sodium (NaFe(III)EDTA, 367,05 g mol ).
-1
6.11 Copper chloride dihydrate (CuCl ·2H O, 170,48 g mol ).
2 2
-1
6.12 Manganese chloride tetrahydrate (MnCl ·4H O, 197,91 g mol ).
2 2
-1
6.13 Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO ·7H O, 287,54 g mol ).
4 2
-1
6.14 Sodium molybdate dihydrate (Na MoO ·2H O, 241,95 g mol ).
2 4 2
7 Biological and growing apparatus
7.1 Plant species
The three following species, i.e. cabbage (B. oleracea), tall fescue (F. arundinacea), and tomato (L.
esculentum), are used during the biotest deployment. These three plant species were selected among non-
accumulator, common agricultural species for their ability to collectively maximize the phytoavailability
of trace elements (more specifically that of As, Cd, Cu, Pb, and Zn) in soils exhibiting a broad range
[21]
of physical-chemical properties and origin of trace element. For each of the three species, the
following cultivars are recommended: castelard for B. oleracea, calina for F. arundinacea, and fline for
L. esculentum. However, in the only case where recommended cultivars are not commercially available
other cultivars may be used provided that they exhibit an adequate growth and homogeneous root mat
during the biotest procedure for the different soils tested. Specify in the test report the reasons for
selecting different cultivars than those recommended. For a given cultivar, seeds used for a single set of
experiment shall come from the same batch.
Additional species can be selected, e.g. species with specific physiological characteristics or with
ecological, agricultural or economic significance in certain regions of the world or for specific site
assessment, provided that these species exhibit an adequate growth and homogeneous root mat during
the biotest procedure for the different soils tested. A list of plant species adapted to be grown in the
biotest, but only partly validated for the standardized procedure, is given in Annex A. Specify in the test
report the reasons for selecting additional species.
NOTE 1 The biotest procedure should be used with untreated seeds (i.e. not treated with any pesticide) as
much as possible. If not feasible, specify it in the test report.
NOTE 2 If other cultivars than those recommended are used, it is to note that this can alter the biotest
measurement in a similar extent than if different species were used.
7.2 Biotest apparatus
The following apparatus shall be used. Apparatus that comes into contact with the sample (soils, plants
or reagents) shall not adsorb the component of interest and shall not contaminate the sample.
The plant-receiving pot (i.e. plant pot) is designed to contain the whole plants from the beginning of the
preculture period to the end of the test culture period. The plant pot enables plants to develop a planar
and dense root mat while maintaining a physical separation with the tested soil sample. The plant pot
consists in a cylinder fitted to an upper plate at the top and closed at the bottom with a polyamide mesh
(30 µm pore size) using an adjustable clamp (see Figure 2). The mesh shall be well tightened.
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Key
1 upper plate
2 cylinder
3 adjustable clamp
4 30 µm polyamide mesh
Figure 2 — Plant-receiving pot assembly
The assembly used for the first step, i.e. the pre-culture period, is designed to enable seeds to germinate
and for seedlings to develop a dense and planar mat of roots in hydroponics. This assembly enables
a close contact between seeds or seedling roots and the nutrient solution. This assembly consists in
a perforated platform floating over a tank-containing nutrient solution. Perforations passing through
the floating platform enable to lodge plant pots. The nutrient solution is continuously aerated with a
bubbling system composed of an air-pump, capillary tubes connected with derivations and diffusers
diving into the nutrient solution (see Figure 3). The floatability of the platform is critical to ensure a
homogeneous contact of all the plant pots in a tank with the aerated nutrient solution. This assembly
also limits the exposure of the nutrient solution to light radiations, thereby avoiding algal development.
23 46
Key
1 tank
2 perforated floating platform
3 nutrient solution 1 or 2
4 air diffuser
5 air
6 tube
7 air-pump
Figure 3 — Assembly used for the preculture period
The assembly used for the second step, i.e. the test culture period, is designed to enable a close contact
between the root mat and the soil layer. It is made of two parts and three filter paper wicks sandwiched
in between: a) a contact assembly that firmly press the plant pot over the soil layer using fastenings and
b) a 0,5 dm screw-top jar filled with the nutrient solution 3 (see Figure 4). This assembly enables (i) the
root mat to be maintained in contact with the whole surface area of the soil layer, and (ii) the filter paper
wicks to remain fully moistened during the entire duration of the test culture period.
Key
1 wing nut 6 soil-receiving plate
2 plant pot 7 screw-top
3 soil layer (6 mm thick) 8 filter paper wicks
4 screw 9 screw-top jar
5 screw nut 10 nutrient solution 3
Figure 4 — Soil-plant contact assembly used for the test culture period
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Except for the adjustable clamp, the filter paper wicks and the polyamide mesh, all the components
of the plant-based test are reusable provided that they are subjected to a two-step washing, firstly, in
hot water to remove adhering mucilage and microbial biofilms then secondly, in a volume fraction of
10 % HNO , followed by a thorough rinsing with distilled or demineralized water. A thorough list of
the components along with specification is given in Table 1 for information and technical drawings
are given in Annex B. Home-made apparatus may be built provided that the size of the different parts
remains proportional and that component specification is similar.
Table 1 — Components of the biotest (informative)
a b
Component No. Quantity Specification
PVC, high density, high tempera-
Cylinder 1 1
ture, for food contact
Upper plate 2 1 HDPE for food contact
Plant pot
Polyamide mesh / 1 100 × 100 mm, 30 µm pore size
Adjustable clamp / 1 180 mm × 2,4 mm
12 dm , 400 mm×294 mm
c
Tank 3 1 × 165 mm, Opaque HDPE for food
contact
Perforated floating plat-
4 1 Extruded polystyrene platform
form
Preculture
3 −1
Air flow 100 - 200 dm h out-
period
Two outputs Air-pump / 1
−1
put
Capillary tube / 2 PVC, int. diam. ca. 4 mm
Derivation / 1 If necessary
Air-diffuser / 2 Ceramic diffuser, 100 × 10 mm
Opaque and white PP for food
Screwtop jar 5 1
contact
Filter paper wick / 3 Hardened ashless filter paper
HDPE for food contact, 6 mm
Test culture
Soil-receiving plate 6 1
thickness
period
d
Screw / 4 HDPE
d
Screw nut / 8 HDPE
d
Wing nut / 4 HDPE
a
Component number as referenced in the technical drawings depicted in Annex B.
b
For one item of each of the three biotest components (i.e. plant pot and apparatus for preculture and test culture
periods).
c 3
Adapted for 12 plant pots per tank filled with 6 dm of nutrient solution.
d
Only two screws can be used to reduce time-fitting, with only four screw nuts and two wing nuts.
7.3 Composition of the nutrient solutions
Three different nutrient solutions shall be prepared for the deployment of the biotest for (i) seed
germination, (ii) seedling pre-growth in hydroponics [steps (i) and (ii) are included in the preculture
period], and (iii) plant growth during the test culture period.
-3
During seed germination (preculture period), the nutrient solution 1 shall be composed of 600 µmol·dm
-3
CaCl (6.4) and 2 µmol·dm H BO (6.5).
2 3 3
During seedling growth in hydroponics (preculture period), the nutrient solution 2 shall be prepared
-3
KH PO (6.9);
by adding the nutrients in the following order and concentration: 500 µmol·dm
2 4
-3 -3 -3
2 000 µmol·dm KNO (6.7); 2 000 µmol·dm Ca(NO ) (6.6); 1 000 µmol·dm MgSO (6.8);
3 3 2 4
-3 -3 -3 -3
0,2 µmol·dm CuCl (6.11); 10 µmol·dm H BO (6.5); 2 µmol·dm MnCl (6.12); 1 µmol·dm
2 3 3 2
-3 -3
ZnSO (6.13); 0,05 µmol·dm Na MoO (6.14); and 100 µmol·dm NaFe(III)EDTA (6.10).
4 2 4
During plant growth in the test culture period, the nutrient solution 3 shall be prepared by adding
-3 -3
the nutrients in the following order and concentration: 50 µmol·dm KH PO (6.9); 2 000 µmol·dm
2 4
-3 -3
KNO (6.7); 2 000 µmol·dm Ca(NO ) (6.6); and 1 000 µmol·dm MgSO (6.8).
3 3 2 4
Nutrient solutions shall be prepared with distilled or demineralized water (6.2).
7.4 Climatic conditions in the growth chamber
Plants can be grown in growth chamber, phytotron, or greenhouse provided that the climatic conditions
comply with those listed in Table 2. Monitor and record the temperature and the relative humidity in the
growth chamber in short intervals (<1 h). Measure and record the illumination at least at the beginning
and at the end of the biotest procedure.
Table 2 — Climatic conditions for the deployment of the biotest (normative)
Climatic conditions Day Night
Photoperiod, in h 16 8
a -2 -1 b
PAR , in µmol photons m s , at 400–700 nm 200 - 400 /
Temperature, in °C 25 ± 3 20 ± 2
Relative humidity, in % 75 ± 5 70 ± 5
a
Photosynthetically active radiation.
b
At the canopy level.
8 Pre-treatment and analysis of soil or soil material sample
8.1 Sample size and particle size reduction
The test portion shall be prepared to have a grain size less than or equal to 2 mm. The material shall
not be finely ground, which would likely alter the bioavailability. Material >2 mm of natural origin (e.g.
stones, pebbles, twigs) shall be separated and discarded from the sample. If the laboratory sample
cannot be crushed or sieved because of its water content, it is allowed, in this case only, to reduce the
water content until the laboratory sample can be sieved. The drying temperature shall not exceed 25 °C.
NOTE Drying, even below 25 °C, of samples collected from volcanic soil exhibiting allophanic properties
should be avoided. This kind of soil sample should be stored moist at 4 °C.
8.2 Analyses
Determine the following physical-chemical properties of soil or soil material:
— initial water content according to ISO 11465;
— water holding capacity according to ISO 11269-2;
— texture according to ISO 11277;
— pH in H O or CaCl according to ISO 10390;
2 2
— organic carbon concentration according to ISO 10694.
NOTE The determination of texture, pH and organic carbon concentration is necessary for the interpretation
of the results.
10 © ISO 2015 – All rights reserved
9 Experimental and analytical procedure
9.1 Overview of the procedure
Figure 5 introduces the different steps of the procedure described hereafter.
Preculture Test culture Plant TE analysis
Seed selection
and preparation period period Harvest in plants
(9.2) (9.3) (9.5) (9.6) (9.7 & 9.8)
Soil preparation
and incubation
(9.4)
Day 0Day 14 Day 22
NOTE 1 Dark boxes stand for the two steps of the biotest procedure.
NOTE 2 TE means trace element.
Figure 5 — Sequential steps of the experimental and analytical procedures
9.2 Selection and preparation of seeds
Select the seeds to be used in the biotest (Annex C). Reject empty husks, damaged seeds, or unevenly
shaped or sized seeds.
Store selected seeds in darkness and in dry conditions, ideally at 4 °C, to preserve germination capacity.
9.3 Preculture period: Germination and pre-growth in hydroponics
Before germination, sterilize the surface of the seeds by immersion for 10 min in a volume fraction of
6 % H O , then rinse the seeds three times with distilled or demineralized water.
2 2
Then put the required number of seeds at the surface of the polyamide mesh in the plant pot, according to
the following density: 50, 80, and 40 seeds per plant pot for B. Oleracea, F. arundinacea, and L. esculentum,
respectively. Additional seed density for a range of species tested with the standardized experimental
procedure is given in Annex C.
Prepare for each soil or soil material tested a minimum of five replicates (i.e. plant pots) per plant species.
In addition, prepare a minimum of five plant pots to serve as controls of trace element concentration in
plants (particularly for the micronutrients Cu and Zn) upon completion of the preculture period. To
obtain enough plant pots with a homogeneous plant biomass to serve as controls and for the test culture
period, multiply the number of initial plant pots to grow by a security factor of 1,2 at least. Calculate the
total number of plant pots to prepare per plant species using Formula (1):
nn=×[( nn)]+× f (1)
ps rc
where:
n is the total number of plant pots to prepare per plant species;
p
n is the number of soil or soil material tested;
s
n is the number of replicates (minimum 5);
r
n is the number of plant pots which serve as control of the preculture period (minimum 5),
c
f is the security factor (minimum 1,2).
After sowing, plant pots are passed through the floating platform (12 plant pots per floating platform)
placed at the top surface of 6 dm of the nutrient solution 1 in the tank. Germinate the seeds for two to four
days in darkness by covering the tank with an aluminium foil. When functional photosynthetic organs
(green pigmentation on cotyledons or leaves) appear, the aluminium foil can be removed. Seedlings are
then grown up to the end of the first week over the same nutrient solution. Nutrient solution 1 does not
need to be renewed.
After the first week, seedlings are grown for one additional week at the top surface of 6 dm of the
nutrient solution 2. The nutrient solution 2 shall be renewed every third day. Randomize the plant pot
position in the floating platform at each renewal. At each renewal, the preculture apparatus (tank and
floating platform) shall be replaced and thoroughly washed in hot water and then in a volume fraction
of 10 % HNO followed by a thorough rinsing with distilled or demineralized water.
During these two weeks in hydroponics, nutrient solutions shall be aerated with a bubbling system.
9.4 Preparation and incubation of soil or soil material
In parallel with the preculture period, tested samples of soil or soil material are incubated for two
weeks in darkness in similar climatic conditions as the plants (7.4). This incubation step should enable
to reach chemical equilibrium in samples following the microbial flush due to moistening. After putting
the adequate mass (as dry matter) of each sample in an adequate container, samples are packed to a
-3
soil density of ca. 1,2 g cm , then moistened at 70 % of their water holding capacity with the nutrient
solution 3. Determine the water holding capacity with a soil or soil material packed to a soil density
-3
similar to that of the soil laid in the soil-receiving plate (i. e. ca. 1,2 g cm ). An opening in each container
should allow equilibrium with the ambient atmosphere. Moisture content shall be checked regularly and
adjusted if necessary with the addition of the nutrient solution 3.
One day before the beginning of the test culture period, a fresh equivalent of 9 g of dry soil or soil
material are laid down on each soil-receiving plate to obtain a soil layer of ca. 6 mm thickness and ca.
-3 −3
1,2 g cm soil density. If a soil cannot be packed to a density of 1,2 g cm , adjust the mass of soil to
obtain in any case a soil layer thickness of ca. 6 mm and report this deviation in the test report (see
Clause 13). Soil-receiving plates are then individually put over 0,5-dm screwtop jars containing the
nutrient solution 3 in which the filter paper wick is dipping. The water holding capacity of samples is
subsequently increased up to 100 %. Soil-receiving plates shall be covered up to the beginning of the test
culture period to maintain the soil samples in darkness and to limit evaporation.
9.5 Test culture period: Plant growth in contact with soil or soil material
At the end of the preculture period, visually select the replicates of plant pots showing homogenous plant
biomasses, and discard the others. Thoroughly rinse the selected plant pots under a flow of distilled or
demineralized water. Finally, put each plant pot in contact with a soil-receiving plate for 8 days using
12 © ISO 2015 – All rights reserved
the contact system. Nutrient solution 3 should be renewed every second day, excepted on the last day
of the test culture period. Randomize soil-plant contact assembly at each renewal. At each renewal,
replace over 0,5-dm screw-top jars and thoroughly wash them in hot water, then in a volume fraction
of 10 % HNO followed by a thorough rinsing with distilled or demineralized water. During renewal, soil
receiving systems should be handled cautiously to avoid any alteration of the wicks. The wicks should
continuously be kept wet to ensure an adequate and continuous supply of water and nutrients to the
roots. Any altered wick shall be reinforced by opening the soil receiving system and inserting a new
wick.
9.6 Plant harvests
At the end of the preculture period, select visually and harvest the replicates of plant pots serving as
control for each plant species. At the end of the test culture period, separate the plant pots from the soil
receiving systems and harvest the plants.
Remove the polyamide mesh from the bottom of plant pots and rinse the plants (both shoots and roots)
thoroughly under a flow of distilled or demineralized water. Thoroughly rinse the surface of the root mat
that was previously in contact with soil or soil material, to avoid significant contamination by <30 µm
soil particles (i.e. smaller than the pore diameter of polyamide mesh). Then remove the plants from the
pots.
Depending on the scope of the investigation, two end points, i.e. trace elements concentration in shoots
and roots and/or uptake flux in the whole plant, can be determined. If trace element concentrations
in shoots and roots are considered as end points, shoots have to be separated from roots by cutting.
Alternatively, if the flux of trace elements to plants is considered as the unique end point of interest,
plants can be kept intact (i.e. shoots and roots pooled together). Seed husks should be removed and
thrown out or pooled with roots for easiness provided they significantly modify neither the biomass,
nor the trace element stock in root compartment.
Put the plant samples (i.e. shoots, roots or shoots, and roots pooled together) in adequate containers,
then oven-dry at max. 50 °C. When steady biomass is achieved (usually after ca. 3 d), remove the plant
samples from the oven and weigh with an accuracy of ±1 mg for biomass determination. Then conserve
plant samples under dry conditions in their container until grinding.
To prevent any contamination, handle plant samples with laboratory gloves and separate shoots from
roots with scissors made of zirconium oxide (5.7).
9.7 Grinding and digestion of shoots and roots
Grinding step is only necessary if a subsample is going to be digested. In that event, grind plant samples
(i.e. shoots and roots individually or pooled together) with a grinder made of zirconium oxide (5.8).
Alternatively, if digestion concerns the whole sample, cut the plant sample in small fragments with
scissors made of zirconium oxide blades (5.7).
Use an adequate procedure to digest plant samples. The chosen procedure shall enable to thoroughly
digest plant tissues including silicon dioxide (i.e. phytoliths) and other poorly soluble minerals. In case
concentration of volatile trace elements (e.g. arsenic or selenium) has to be determined, adapt the
procedure to avoid any loss of tr
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16198
Première édition
2015-01-15
Qualité du sol — Test végétal pour
l’évaluation de la biodisponibilité
environnementale des éléments traces
pour les végétaux
Soil quality — Plant-based test to assess the environmental
bioavailability of trace elements to plants
Numéro de référence
©
ISO 2015
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Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Appareillage de laboratoire . 5
6 Réactifs . 5
6.1 Généralités . 5
7 Matériel biologique et de croissance . 6
7.1 Espèces végétales . 6
7.2 Matériel pour le biotest . 7
7.3 Composition des solutions nutritives . 9
7.4 Conditions climatiques dans la chambre de culture.10
8 Prétraitement et analyse de l’échantillon de sol ou de matériau du sol .10
8.1 Taille de l’échantillon et réduction granulométrique .10
8.2 Analyses .10
9 Mode opératoire expérimental et analytique .11
9.1 Vue d’ensemble du mode opératoire .11
9.2 Sélection et préparation des semences . .11
9.3 Période de préculture: germination et pré-croissance en hydroponie .11
9.4 Préparation et incubation du sol ou du matériau du sol .12
9.5 Période de culture test: croissance des plantes en contact avec le sol ou le matériau
du sol .13
9.6 Récoltes des plantes .13
9.7 Broyage et minéralisation des parties aériennes et racinaires .13
9.8 Dosage analytique .14
10 Critères de validité .14
11 Évaluation des résultats .15
11.1 Détermination des concentrations en éléments traces et des flux de prélèvement dans
les végétaux.15
11.2 Présentation des données .16
11.3 Expression des résultats .16
12 Analyse statistique .17
12.1 Généralités .17
12.2 Biomasses des végétaux .17
12.3 Paramètres d’évaluation de la biodisponibilité .17
13 Rapport d’essai .17
Annexe A (informative) Espèces végétales adaptées au mode opératoire du biotest .19
Annexe B (informative) Dessins industriels des différentes pièces du biotest .21
Annexe C (informative) Sélection et densité des semences dans les pots pour une gamme
d’espèces végétales soumises à essai avec le mode opératoire expérimental normalisé .24
Annexe D (informative) Minéralisation et analyse des échantillons de végétaux .26
Annexe E (informative) Gamme de biomasses et de quantités d’éléments traces dans les
pots témoins .28
Annexe F (informative) Essai circulaire .29
Bibliographie .43
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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de
la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’OMC concernant
les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos — Informations
supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 7,
Évaluation des sols et des sites.
Introduction
L’un des principaux objectifs de l’ISO 17402 est de définir un cadre conceptuel de la biodisponibilité
des contaminants dans le sol et les matériaux du sol et de fournir une ligne directrice pour la sélection
de méthodes pouvant être normalisées pour mesurer la biodisponibilité. La biodisponibilité a donc été
définie sous la forme des trois étapes successives suivantes:
a) la «disponibilité environnementale»;
b) la «biodisponibilité environnementale»;
c) la «biodisponibilité toxicologique».
La biodisponibilité environnementale constitue donc une condition préalable à l’évaluation de la
biodisponibilité toxicologique et est directement liée à l’impact des polluants sur les fonctions principales
du sol dans l’écosystème et plus particulièrement des fonctions d’habitat et de rétention.
La biodisponibilité environnementale peut être estimée à l’aide de méthodes chimiques ou biologiques.
Dans le cas des éléments traces, les méthodes chimiques sont généralement les moins onéreuses. Elles
sont faciles à réaliser et certaines sont déjà normalisées au niveau national ou international (par exemple
l’ISO 19730). Il est néanmoins nécessaire d’établir une corrélation entre les méthodes chimiques qui, à
proprement parler, mesurent la disponibilité environnementale dans le sol et les mesures biologiques
avant de les utiliser comme indicateurs de la biodisponibilité environnementale. Quelle que soit la
méthode chimique employée, aucune n’est intrinsèquement conçue pour tenir compte de la diversité
des réponses observées dans diverses espèces végétales ou diverses variétés, ce qui peut être attribué:
a) au comportement de prélèvement des végétaux (c’est-à-dire un comportement sensible, tolérant,
accumulateur ou hyper-accumulateur d’éléments traces) et/ou b) à la capacité des végétaux à modifier
les propriétés biologiques, physiques et physico-chimiques de leur «zone bio-influencée» au niveau
de l’interface sol-racine, c’est-à-dire la rhizosphère. Il pourrait également être suggéré d’appliquer
les méthodes chimiques directement sur la rhizosphère mais l’échantillonnage de la rhizosphère est
incontestablement trop fastidieux pour être réalisé en routine.
Pour les méthodes biologiques, quatre biotests normalisés rendent compte des processus rhizosphériques
car ils sont basés sur des végétaux qui poussent dans le sol (ISO 11269-1, ISO 11269-2, ISO 17126, et
ISO 22030). Toutefois, ces méthodes ont uniquement été conçues pour prédire la phytotoxicité des
éléments traces, c’est-à-dire la biodisponibilité toxicologique. Dans ces biotests, les racines poussent
directement dans le sol, ce qui exige donc la mise en place d’un mode opératoire de lavage fastidieux
pour obtenir des mesures fiables des éléments traces accumulés dans les racines. En effet, la quantité
d’éléments traces accumulés dans les parties aériennes d’espèces végétales non accumulatrices n’est
pas suffisamment sensible pour être utilisée dans l’évaluation de la biodisponibilité environnementale
des éléments traces par rapport à la quantité accumulée dans la plante entière (racines comprises). En
conséquence, il reste nécessaire de développer des méthodes biologiques rendant compte des processus
rhizosphériques et permettant d’inclure le compartiment racinaire en vue d’estimer correctement la
biodisponibilité environnementale des éléments traces pour les végétaux.
La présente Norme internationale concerne par conséquent un biotest basé sur la croissance des racines
au contact du sol mais sans pénétration des racines dans le sol. Bien que ce dispositif expérimental soit
en partie artificiel, il permet d’établir une comparaison non biaisée de la biodisponibilité des éléments
traces entre les sols soumis à essai. En outre, le paramètre mesuré peut être lié plus directement à la
mesure de la disponibilité environnementale que tout autre paramètre fondé sur la mesure de la toxicité.
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NORME INTERNATIONALE ISO 16198:2015(F)
Qualité du sol — Test végétal pour l’évaluation de la
biodisponibilité environnementale des éléments traces
pour les végétaux
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie le test végétal, ci-après dénommé «biotest». Il permet d’estimer
la biodisponibilité environnementale des éléments traces pour les végétaux, soit simplement sous la
forme de concentrations dans les parties aériennes et racinaires, soit de façon plus globale sous forme
de flux de prélèvement net dans les végétaux. Le mode opératoire du biotest comprend deux étapes
successives: (i) une phase de pré-croissance des végétaux en hydroponie et (ii) une phase de croissance
des végétaux en contact avec des échantillons de sol. La concentration dans les parties aériennes et
racinaires ainsi que le flux de prélèvement d’éléments traces dans les végétaux sont déterminés à l’issue
de la seconde étape du mode opératoire du biotest.
Le présent biotest s’applique à l’évaluation de la biodisponibilité environnementale des éléments traces
pour les végétaux, plus particulièrement pour les plantes cultivées, dans les sols ou les matériaux du sol
en conditions oxydantes, en considérant que:
— trois espèces végétales (chou, Brassica oleracea; fétuque élevée, Festuca arundinacea; tomate,
Lycopersicon esculentum; 7.1) sont conseillées dans le mode opératoire normalisé du biotest, mais il
est également possible d’utiliser des espèces végétales cibles supplémentaires (7.1, Annexe A), et
— le mode opératoire normalisé du biotest est validé pour une gamme d’éléments traces incluant
l’arsenic (As), le cadmium (Cd), le chrome (Cr), le cobalt (Co), le cuivre (Cu), le nickel (Ni), le plomb
(Pb), et le zinc (Zn). Des éléments traces supplémentaires peuvent néanmoins être pris en compte
(voir Annexe A).
Le biotest peut être appliqué aux sols et aux matériaux du sol, y compris les sols ayant reçu avant ou
après l’échantillonnage sur le terrain des apports de compost, de boues, d’eaux usées et d’autres produits
résiduaires organiques ou inorganiques.
NOTE 1 Le présent biotest n’est pas conçu pour évaluer la biodisponibilité environnementale des éléments
traces fortement volatils ou résultant d’un processus de prélèvement qui se produit au niveau des parties aériennes
des végétaux suite, par exemple, à des retombées atmosphériques.
NOTE 2 Le présent biotest n’est pas conçu pour évaluer la biodisponibilité environnementale des contaminants
organiques pour les végétaux. Un mode opératoire similaire pourrait être utilisé, mais il est nécessaire d’adapter
la séparation physique entre les racines des végétaux et le sol réalisée au moyen d’une toile en polyamide pour
éviter la sorption des contaminants organiques sur la toile.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11269-2, Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du sol — Partie 2: Effets
des sols contaminés sur l’émergence et la croissance des végétaux supérieurs
ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des
sols — Méthode par tamisage et sédimentation
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
contaminant
substance ou agent présent(e) dans le sol du fait de l’activité humaine
[SOURCE: ISO 11074:2005, 3.5.1]
Note 1 à l’article: La présente définition ne présuppose pas l’existence d’un danger dû à la présence du contaminant
3.2
disponibilité environnementale
fraction du contaminant potentiellement disponible pour des organismes et qui résulte de processus
physico-chimiques de désorption
[SOURCE: ISO 17402:2008, 3.4]
3.3
biodisponibilité environnementale
fraction du composé disponible dans le sol qu’un organisme absorbe par des processus physiologiques
[SOURCE: ISO 17402:2008, 3.5]
3.4
fonction d’habitat
capacité des sols/matériaux du sol à servir d’habitat aux micro-organismes, aux végétaux et aux animaux
vivant dans le sol et à leurs interactions (biocénose)
[SOURCE: ISO 11074:2005, 3.4.3]
3.5
élément trace
−1
élément chimique présent dans le sol à une concentration généralement inférieure à 100 mg kg
Note 1 à l’article: Définition donnée conformément à la Référence [16].
3.6
fonction de rétention
capacité des sols/matériaux du sol à adsorber les contaminants de sorte qu’ils ne puissent pas être
entraînés par lixiviation ni transférés à la chaîne alimentaire terrestre
[SOURCE: ISO 11074:2005, 3.4.13]
3.7
rhizosphère
volume de sol autour des racines vivantes influencé par les activités racinaires
Note 1 à l’article: Définition donnée conformément à la Référence [17].
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3.8
sol
couche supérieure de la croûte terrestre transformée par des processus climatiques, physico-chimiques
et biologiques. Elle est composée de particules minérales, de matières organiques, d’eau, d’air et
d’organismes vivants organisés en horizons de sols génétiques
[SOURCE: ISO 11074:2005, 2.1.8]
3.9
matériau du sol
matériau provenant du sol et déplacé et/ou modifié par l’activité humaine, comprenant les terres
excavées, les matériaux de dragage, les sols artificiels, les sols traités et les matériaux de remblai
[SOURCE: ISO 17402:2008, 3.16]
3.10
biodisponibilité toxicologique
concentration interne d’un polluant accumulée et/ou liée à un effet toxique
[SOURCE: ISO 17402:2008, 3.18]
4 Principe
La présente Norme internationale décrit le mode opératoire expérimental du biotest développé à
l’origine par les Références [18], [19] et [20]. Ce biotest comporte deux étapes successives de croissance
des végétaux (voir Figure 1). Pendant la première étape (c’est-à-dire la période de préculture), des
plantules sont cultivées en hydroponie pendant 14 jours pour obtenir une biomasse végétale suffisante
et un tapis racinaire dense et plan. Pendant la deuxième étape (c’est-à-dire la période de culture test), le
tapis racinaire des végétaux précultivés est mis en contact pendant 8 jours avec une couche d’échantillon
de sol tamisé à 2 mm de 6 mm d’épaisseur.
Légende
a Germination des semences (7 jours) 8 Diffuseur d’air
b Pré-croissance des plantules (7 jours) 9 Toile, maille de 30 µm
1 Période de préculture en hydroponie – 14 jours 10 Air
2 Période de culture test avec contact sol-plantes – 8 jours 11 Tapis racinaire
3 Feuille d’aluminium 12 Solution nutritive 2
4 Plate-forme flottante 13 Parties aériennes
5 Semences 14 Couche de sol (6 mm d’épaisseur)
6 Pot 15 Solution nutritive 3
7 Solution nutritive 1 16 Mèches de papier filtre
Figure 1 — Mode opératoire du biotest en deux étapes
Un ensemble de végétaux témoins est récolté à la fin de la période de préculture en hydroponie pour
déterminer la quantité d’éléments traces dans les parties aériennes et racinaires des végétaux avant
leur exposition au sol. Les végétaux entiers (parties aériennes et racinaires) sont ensuite récoltés à la
fin de la période de culture test. Les biomasses et les concentrations en éléments traces dans les parties
aériennes et racinaires sont déterminées. Les paramètres qui peuvent être mesurés sur le biotest sont
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a) la concentration en éléments traces dans les parties aériennes et racinaires à la fin de la période
de culture test et b) le flux de prélèvement net d’éléments traces dans les végétaux entiers pendant la
[21]
période de culture test. Si ces paramètres sont généralement corrélés , on s’attend à ce que le flux de
prélèvement soit plus représentatif de la biodisponibilité des éléments traces pour les végétaux pendant
la période de culture test (c’est-à-dire l’exposition aux sols soumis à essai) car, contrairement aux
concentrations, le flux de prélèvement ne comprend pas la portion d’éléments traces prélevée pendant
la période de préculture (11.1).
La croissance des végétaux pendant la période de préculture étant généralement suffisante pour
empêcher la survenue de symptômes phytotoxiques provoqués par des propriétés chimiques
défavorables du sol ou l’accumulation excessive d’éléments traces dans le végétal, le biotest permet
d’effectuer une comparaison non biaisée de la biodisponibilité des éléments traces sur une vaste gamme
de sols, y compris les sols fortement contaminés.
5 Appareillage de laboratoire
L’appareillage suivant doit être utilisé. Tous les équipements qui viennent en contact avec l’échantillon
(sols, végétaux ou réactifs) ne doivent pas adsorber les éléments traces de façon importante et ne doivent
pas contaminer l’échantillon.
5.1 Matériel de tamisage, avec des tamis à mailles nominales de 2 mm.
5.2 Outils de concassage, tels que concasseur à mâchoires et dispositif de coupe.
5.3 Balance avec une précision d’au moins 100 mg.
5.4 Balance avec une précision d’au moins 1 mg.
5.5 Chambre de croissance, capable de maintenir des conditions climatiques spécifiques telles que
spécifiées au 7.4.
5.6 Étuve ventilée, capable de sécher un sol ou un matériau du sol à 25 °C et des parties aériennes et
racinaires à 50 °C.
5.7 Ciseaux, avec des lames en oxyde de zirconium.
5.8 Broyeur à billes, en oxyde de zirconium.
6 Réactifs
6.1 Généralités
Utiliser des réactifs de qualité analytique ayant une concentration en éléments traces étudiés (par
-1
exemple As, Cd, Co, Cr, Cu, Ni, Pb et Zn) inférieure ou égale à 5 mg kg . L’eau utilisée doit être de qualité 3
conformément à l’ISO 3696.
−1
6.2 Eau, distillée ou déminéralisée ayant une conductivité spécifique maximale de 5 µS cm à 25 °C et
un pH de 5,0 à 7,5.
-1
6.3 Peroxyde d’hydrogène (H O , 34,01 g mol ).
2 2
-1
6.4 Chlorure de calcium dihydraté (CaCl ·2H O, 147,07 g mol ).
2 2
-1
6.5 Acide borique (H BO , 61,83 g mol ).
3 3
-1
6.6 Nitrate de calcium tétrahydraté (Ca(NO ) ·4H O, 236,15 g mol ).
3 2 2
-1
6.7 Nitrate de potassium (KNO , 101,1 g mol ).
-1
6.8 Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO ·7H O, 246,48 g mol ).
4 2
-1
6.9 Phosphate de potassium (KH PO , 136,09 g mol ).
2 4
-1
6.10 Éthylène diamino-tétra-acétate ferrique disodique (NaFe(III)EDTA, 367,05 g mol ).
-1
6.11 Chlorure de cuivre dihydraté (CuCl ·2H O, 170,48 g mol ).
2 2
-1
6.12 Chlorure de manganèse tétrahydraté (MnCl ·4H O, 197,91 g mol ).
2 2
-1
6.13 Sulfate de zinc heptahydraté (ZnSO ·7H O, 287,54 g mol ).
4 2
-1
6.14 Molybdate de sodium dihydraté (Na MoO ·2H O, 241,95 g mol ).
2 4 2
7 Matériel biologique et de croissance
7.1 Espèces végétales
Les trois espèces suivantes, à savoir le chou (B. oleracea), la fétuque élevée (F. arundinacea) et la tomate
(L. esculentum), sont utilisées pendant la mise en œuvre du biotest. Ces trois espèces végétales ont été
sélectionnées parmi les espèces agricoles communes, non accumulatrices, pour leur capacité à maximiser
collectivement la phytodisponibilité des éléments traces (plus spécifiquement celle d’As, de Cd, de Cu,
de Pb et de Zn) dans les sols présentant une vaste gamme de propriétés physico-chimiques et d’origines
[21]
des éléments traces . Pour chacune des trois espèces, les variétés suivantes sont recommandées:
castelard pour B. oleracea, calina pour F. arundinacea et fline pour L. esculentum. Toutefois, dans le seul
cas où les variétés recommandées ne sont pas disponibles dans le commerce, d’autres variétés peuvent
être utilisées à condition de présenter une croissance adéquate et un tapis racinaire homogène au cours
de la mise en œuvre du biotest pour les différents sols soumis à essai. Spécifier, dans le rapport d’essai,
les raisons de la sélection de variétés différentes de celles recommandées. Pour une variété donnée, les
semences utilisées pour une seule série d’expérimentation doivent provenir du même lot.
Des espèces supplémentaires peuvent être sélectionnées, par exemple des espèces présentant des
caractéristiques physiologiques spécifiques ou ayant une pertinence écologique, agricole ou économique
dans certaines régions du monde ou pour une évaluation de site spécifique, à condition de présenter
une croissance adéquate et un tapis racinaire homogène pendant la mise en œuvre du biotest pour les
différents sols soumis à essai. Une liste d’espèces végétales adaptées à être cultivées avec le biotest, mais
seulement partiellement validée pour le mode opératoire normalisé est fournie à l’Annexe A. Spécifier,
dans le rapport d’essai, les raisons de la sélection d’espèces supplémentaires.
NOTE 1 Il convient autant que possible de mettre en œuvre le mode opératoire du biotest avec des semences
non traitées (c’est-à-dire non traitées avec des produits phytosanitaires). Si cela n’est pas réalisable, le spécifier
dans le rapport d’essai.
NOTE 2 Si d’autres variétés que celles recommandées sont utilisées, il est à noter que cela peut modifier les
mesures réalisées à l’aide du biotest de la même manière que si des espèces différentes étaient utilisées.
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7.2 Matériel pour le biotest
Le matériel suivant doit être utilisé. Toutes les pièces qui viennent en contact avec l’échantillon (sols,
végétaux ou réactifs) ne doivent pas adsorber le composant concerné et ne doivent pas contaminer
l’échantillon.
Le pot contenant le végétal (nommé « pot » par la suite) est conçu pour contenir les végétaux entiers
depuis le début de la période de préculture jusqu’à la fin de la période de culture test. Le pot permet aux
végétaux de développer un tapis racinaire plan et dense tout en maintenant une séparation physique
avec l’échantillon de sol soumis à essai. Le pot comprend un cylindre sur la face supérieure duquel est
fixée une plaque supérieure et qui est fermé à la base par une toile en polyamide (maille de 30 μm) à
l’aide d’une pince réglable (Figure 2). La toile doit être bien tendue.
Légende
1 Plaque supérieure
2 Cylindre
3 Pince réglable
4 Toile en polyamide, maille de 30 µm
Figure 2 — Dispositif du pot contenant le végétal
Le dispositif utilisé pour la première étape, c’est-à-dire la période de préculture, est conçu pour permettre
aux semences de germer et aux plantules de développer un tapis racinaire dense et plan en hydroponie. Ce
dispositif assure un contact étroit entre les semences ou les racines des plantules et la solution nutritive.
Ce dispositif comprend une plate-forme flottante perforée placée à la surface d’un bac contenant une
solution nutritive. Les perforations réalisées dans la plate-forme flottante permettent d’y loger les pots.
La solution nutritive est aérée en continu avec un système de bullage composé d’une pompe à air, de
tubes capillaires raccordés à l’aide de dérivations et de diffuseurs plongés dans la solution nutritive (voir
Figure 3). La flottabilité de la plateforme est essentielle pour garantir un contact homogène de tous les
pots placés dans un bac avec la solution nutritive aérée. Ce dispositif limite également l’exposition de la
solution nutritive aux rayonnements lumineux, évitant ainsi le développement d’algues.
23 46
Légende
1 Bac
2 Plate-forme flottante perforée
3 Solution nutritive 1 ou 2
4 Diffuseur d’air
5 Air
6 Tube
7 Pompe à air
Figure 3 — Dispositif utilisé pour la période de préculture
Le dispositif utilisé pour la seconde étape, c’est-à-dire la période de culture test, est conçu pour permettre
un contact étroit entre le tapis racinaire et la couche de sol. Il est constitué de deux parties et de trois
mèches de papier filtre insérées entre elles: a) un dispositif de mise en contact qui appuie fermement
le pot sur la couche de sol à l’aide de fixations et b) un récipient à couvercle vissé de 0,5 dm rempli de
solution nutritive 3 (voir Figure 4). Ce dispositif permet (i) au tapis racinaire d’être maintenu en contact
avec la surface entière de la couche de sol et (ii) aux mèches de papier filtre de rester complètement
humidifiées pendant toute la durée de la période de culture test.
Légende
1 Écrou papillon 6 Plaque réceptionnant le sol
2 Pot 7 Couvercle vissé
3 Couche de sol (6 mm d’épaisseur) 8 Mèches de papier filtre
4 Vis 9 Récipient à couvercle vissé
5 Écrou simple 10 Solution nutritive 3
Figure 4 — Dispositif de mise en contact sol-plante utilisé pour la période de culture test
8 © ISO 2015 – Tous droits réservés
À l’exception de la pince réglable, des mèches de papier filtre et de la toile en polyamide, toutes les pièces
du biotest sont réutilisables à condition d’être soumises à un lavage en deux étapes, tout d’abord dans
de l’eau chaude pour éliminer le mucilage adhérent et les biofilms microbiens puis dans une fraction
volumique de HNO à 10 %, suivi d’un rinçage complet avec de l’eau distillée ou déminéralisée. Une liste
complète des pièces ainsi que leur spécification est fournie dans le Tableau 1 à titre d’information, tandis
que les dessins industriels figurent à l’Annexe B. L’utilisateur peut fabriquer le matériel par ses propres
moyens à condition que la taille des différentes parties reste proportionnelle et que la spécification des
composants soit similaire.
Tableau 1 — Composants du biotest (informatif)
a b
Pièce Nº Quantité Spécification
PVC, haute densité, température
Cylindre 1 1
élevée, pour contact alimentaire
Plaque supérieure 2 1 HDPE pour contact alimentaire
Pot
100 × 100 mm, 30 µm de diamètre
Toile en polyamide / 1
de pores
Pince réglable / 1 180 mm × 2,4 mm
12 dm , 400 mm×294 mm
c
Bac 3 1 × 165 mm, plaque en HDPE
opaque pour contact alimentaire
Plate-forme en polystyrène
Plate-forme flottante perforée 4 1
extrudé
Période de pré-
3 −1
Débit d’air de 100 à 200 dm h
Pompe à air doubles sorties / 1
culture
−1
sortie
Tube capillaire / 2 PVC, diam. int. 4 mm env.
Dérivation / 1 Si nécessaire
Diffuseur céramique,
Diffuseur d’air / 2
100 × 10 mm
PP opaque et blanc pour contact
Récipient à couvercle vissé 5 1
alimentaire
Mèche de papier filtre / 3 Papier filtre sans cendres, durci
HDPE pour contact alimentaire,
Période de
Plaque réceptionnant le sol 6 1
6 mm d’épaisseur
culture test
d
Vis / 4 HDPE
d
Écrou simple / 8 HDPE
d
Écrou papillon / 4 HDPE
a
Numéro des pièces tel que référencé dans les dessins industriels présentés à l’Annexe B.
b
Pour un exemplaire de chacun des trois dispositifs du biotest (c’est-à-dire le pot et les dispositifs pour les périodes de
préculture et de culture test).
c 3
Adapté pour 12 pots par bac rempli avec 6 dm de solution nutritive.
d
Il est possible de n’utiliser que deux vis pour réduire le temps de fixation, avec seulement quatre écrous simples et deux
écrous papillons.
7.3 Composition des solutions nutritives
Trois solutions nutritives différentes doivent être préparées pour la mise en œuvre du biotest pour (i)
la germination des semences, (ii) la précroissance des plantules en hydroponie [les étapes (i) et (ii) sont
incluses dans la période de préculture] et (iii) la croissance des plantes pendant la période de culture
test.
Pendant la germination des semences (période de préculture), la solution nutritive 1 doit être composée
-3 -3
de 600 µmol·dm de CaCl (6.4) et de 2 µmol·dm de H BO (6.5).
2 3 3
Pendant la croissance des plantules en hydroponie (période de préculture), la solution nutritive 2 doit
-3
être préparée en ajoutant les nutriments à la concentration et dans l’ordre suivants: 500 µmol·dm de
-3 -3 -3
KH PO (6.9); 2 000 µmol·dm de KNO (6.7); 2 000 µmol·dm de Ca(NO ) (6.6); 1 000 µmol·dm
2 4 3 3 2
-3 -3 -3
de MgSO (6.8); 0,2 µmol·dm de CuCl (6.11); 10 µmol·dm de H BO (6.5); 2 µmol·dm de MnCl (6.12);
4 2 3 3 2
-3 -3 -3
1 µmol·dm de ZnSO (6.13); 0,05 µmol·dm de Na MoO (6.14); et 100 µmol·dm de NaFe(III)
4 2 4
EDTA (6.10).
Au cours de la croissance des végétaux pendant la période de culture test, la solution nutritive 3 doit
-3
être préparée en ajoutant les nutriments à la concentration et dans l’ordre suivants: 50 µmol·dm de
-3 -3 -3
KH PO (6.9); 2 000 µmol·dm de KNO (6.7); 2 000 µmol·dm de Ca(NO ) (6.6); et 1 000 µmol·dm
2 4 3 3 2
de MgSO (6.8).
Les solutions nutritives doivent être préparées avec de l’eau distillée ou déminéralisée (6.2).
7.4 Conditions climatiques dans la chambre de culture
Les végétaux peuvent être cultivés dans une chambre de culture, un phytotron ou une serre à condition
que les conditions climatiques soient conformes à celles indiquées dans le Tableau 2. Mesurer et
enregistrer la température et l’humidité relative de l’air dans la chambre de culture à des intervalles
rapprochés (< 1 h). Mesurer et enregistrer l’éclairage au moins au début et à la fin du mode opératoire
du biotest.
Tableau 2 — Conditions climatiques pour la mise en œuvre du biotest (normatif)
Conditions climatiques Jour Nuit
Photopériode, en h 16 8
a -2 -1 b
RPA , en µmol de photons m s , à 400–700 nm 200 – 400 /
Température, en °C 25 ± 3 20 ± 2
Humidité relative, en % 75 ± 5 70 ± 5
a
Rayonnement photosynthétiquement actif.
b
Au niveau de la canopée.
8 Prétraitement et analyse de l’échantillon de sol ou de matériau du sol
8.1 Taille de l’échantillon et réduction granulométrique
La prise d’essai doit être préparée pour obtenir une granulométrie inférieure ou égale à 2 mm. Le
matériau ne doit pas être broyé finement car cette opération pourrait altérer la biodisponibilité. Les
matériaux d’origine naturelle > 2 mm (par exemple pierres, gravillons, brindilles) doivent être triés et
éliminés de l’échantillon. Si l’échantillon ramené au laboratoire ne peut pas être concassé ou tamisé en
raison de sa teneur en eau, il est permis, dans ce cas uniquement, de réduire sa teneur en eau jusqu’à ce
qu’il puisse être tamisé. La température de séchage ne doit pas dépasser 25 °C.
NOTE Il convient d’éviter de sécher, même à une température inférieure à 25 °C, les échantillons provenant
d’un sol volcanique qui présente des propriétés andiques. Il est recommandé de conserver ce type d’échantillon
de sol humide à 4 °C.
8.2 Analyses
Déterminer les propriétés physico-chimiques suivantes du sol ou du matériau du sol:
— teneur initiale en eau conformément à l’ISO 11465;
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— capacité de rétention en eau conformément à l’ISO 11269-2;
— texture conformément à l’ISO 11277;
— pH dans l’H O ou le CaCl conformément à l’ISO 10390;
2 2
— concentration en carbone organique conformément à l’ISO 10694.
NOTE La détermination de la texture, du pH et de la concentration en carbone organique est nécessaire à
l’interprétation des résultats.
9 Mode opératoire expérimental et analytique
9.1 Vue d’ensemble du mode opératoire
La Figure 5 présente les différentes étapes du mode opératoire décrit ci-après.
NOTE 1 Les cases sombres représentent les deux étapes du mode opératoire du biotest.
NOTE 2 ET signifie «élément trace».
Figure 5 — Étapes séquentielles des modes opératoires expérimental et analytique
9.2 Sélection et préparation des semences
Sélectionner les semences à utiliser dans le biotest (Annexe C). Rejeter les enveloppes vides, les semences
endommagées et celles qui présentent une forme ou une taille inhabituelle.
Conserver les semences sélectionnées au sec et à l’obscurité, idéalement à 4 °C, afin de préserver la
capacité de germination.
9.3 Période de préculture: germination et pré-croissance en hydroponie
Avant la germination, stériliser la surface des semences par immersion pendant 10 min dans une fraction
volumique de H O à 6 %, puis rincer trois fois les semences avec de l’eau distillée ou déminéralisée.
2 2
Placer ensuite le nombre requis de semences à la surface de la toile en polyamide dans le pot, selon
la densité suivante: 50, 80 et 40 semences par pot pour B. Oleracea, F. arundinacea et L. esculentum,
respectivement. La densité de semences à utiliser pour une gamme d’espèces testées avec le mode
opératoire expérimental normalisé est donnée à l’Annexe C.
Pour chaque sol ou matériau du sol soumis à essai, préparer au moins cinq réplicats (c’est-à-dire pots)
par espèce végétale. En outre, préparer au moins cinq pots servant de témoins de la concentration en
éléments traces dans les végétaux (en particulier pour les micronutriments Cu et Zn) à l’issue de la
période de préculture. Pour obtenir suffisamment de pots avec une biomasse végétale homogène pour
servir de témoins et pour la période de culture test, multiplier le nombre de pots à cultiver par un
coefficient de sécurité de 1,2 au moins. Calculer le nombre total de pots à préparer par espèce végétale
à l’aide de la Formule (1):
nn=×[( nn)]+× f (1)
ps rc
où
n est le nombre total de pots à préparer par espèces végétale;
p
n est le nombre de sols ou de matériaux du sol soumis à essai;
s
n est le nombre de réplicats (minimum 5);
r
n est le nombre de pots servant de témoins de la période de préculture (minimum 5);
c
f est le coefficient de sécurité (minimum 1,2).
Après le semis, les pots sont logés dans les perforations de la plate-forme flottante (douze pots par plate-
forme flottante) posée à la surface de 6 dm de la solution nutritive 1 dans le bac. Faire ensuite germer les
semences pendant deux à quatre jours dans l’obscurité en recouvrant le bac d’une feuille d’aluminium.
Lorsque des organes photosynthétiques fonctionnels (pigmentation verte sur les cotylédons ou les
feuilles) apparaissent, la feuille d’aluminium peut être retirée. Les plantules sont ensuite cultivées sur
la même solution nutritive jusqu’à la fin de la première semaine. Il n’est pas nécessaire de renouveler la
solution nutritive 1.
Après la première semaine, les plantules sont cultivées pendant une semaine supplémentaire à la
surface de 6 dm de la solution nutritive 2. La solution nutritive 2 doit être renouvelée tous les trois
jours. Placer les pots dans la plate-forme flottante de façon aléatoire à chaque renouvellement. À chaque
renouvellement, le dispositif de préculture (bac et plate-forme flottante) doit être remplacé et lavé
soigneusement dans de l’eau chaude puis dans une fraction volumique de HNO à 10 %, avant d’être
minutieusement rincé avec de l’eau distillée ou déminéralisée.
Pendant ces deux semaines en hydroponie, les solutions nutritives doivent être oxygénées par un
système de bullage.
9.4 Préparation et incubation du sol ou du matériau du sol
Parallèlement à la période de préculture, les échantillons de sol ou de matériau du sol soumis à essai
sont incubés pendant deux semaines dans l’obscurité dans des conditions climatiques similaires à
celles utilisées pour les végétaux (7.4). Il convient que cette étape d’incubation permette d’atteindre
l’équilibre chimique dans les échantillons après la prolifération microbienne liée à l’humectation.
Après avoir introduit la masse adéquate (sous forme de matière sèche) de chaque échantillon dans
un récipient approprié, les échantillons sont tassés pour obtenir une masse volumique apparente de
-3
sol d’environ 1,2 g cm , puis humectés à 70 % de leur capacité de rétention en eau avec la solution
nutritive 3. Déterminer la capacité de rétention en eau avec un sol ou un matériau du sol tassé à une
masse volumique apparente similaire à ce
...
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