ISO 8259:2024
(Main)Soil quality — Bioaccessibility of organic and inorganic pollutants from contaminated soil and soil-like materials
Soil quality — Bioaccessibility of organic and inorganic pollutants from contaminated soil and soil-like materials
This document specifies a method for testing the bioaccessibility of substances from contaminated soil and soil-like materials. The method is not applicable for volatile contaminants. Furthermore, the method is only applicable if suitable analytical methods for extraction and detection of substances and/or elements from complex digestion assays are available. NOTE During the in vivo validation with minipigs, the PAHs naphthalene, acenaphthylene, acenaphthene and fluorene were not evaluated due to their volatility. However, the results of the overall recovery indicate if volatilisation has occurred during the test.
Qualité du sol — Bioaccessibilité des polluants organiques et inorganiques provenant d’un sol ou de matériaux de type sol pollués
Le présent document spécifie une méthode pour déterminer la bioaccessibilité de substances issues de sol et de matériaux de type sol pollués. La méthode n’est pas applicable aux polluants volatils. En outre, la méthode n’est applicable que si des méthodes d’analyse adéquates pour l’extraction et la détection de substances et/ou d’éléments issus d’essais de digestion complexes sont disponibles. NOTE Durant la validation in vivo sur des mini-porcs, les HAP naphtalène, acénaphtylène, acénaphtène et fluorène n’ont pas été évalués à cause de leur volatilité. Néanmoins, les résultats du taux de recouvrement indiquent si une volatilisation a eu lieu pendant l’essai.
General Information
Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 8259
First edition
Soil quality — Bioaccessibility of
2024-07
organic and inorganic pollutants
from contaminated soil and soil-like
materials
Qualité du sol — Bioaccessibilité des polluants organiques et
inorganiques provenant d’un sol ou de matériaux de type sol
pollués
Reference number
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Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle of the test . 2
4.1 Human digestion .2
4.2 General test description .3
4.3 Applicability .4
4.4 Substances and elements .5
4.5 Contaminated soil and soil-like materials .6
5 Sampling and pre-treatment of soil and soil-like materials . 6
6 Reagents and apparatus . 6
6.1 Reagents .6
6.2 Enzymes and digestive aids .7
6.3 Apparatus .7
7 Test system . 7
7.1 Set-up of apparatus .7
7.2 Artificial digestive juices .8
8 Preparation and analysis of the sample. 9
8.1 Sample preparation .9
8.2 Test procedure .10
8.3 Separation of dissolved contaminants from particle-bound contaminants .10
8.4 Quantification . . .11
8.4.1 General .11
8.4.2 Analysis of inorganic substances . .11
8.4.3 Analysis of organic substances . .11
9 Calculation of bioaccessibility .12
10 Quality assurance .13
10.1 General . 13
10.2 Quantification of the bioaccessible content . 13
10.3 Mass balance and overall recovery . 13
10.4 Additional control measurements .14
11 Test report . 14
Annex A (informative) Enzymes and digestive aids.16
Annex B (informative) Method performance characteristics for selected bioaccessible
inorganic and organic substance fractions . 17
Annex C (informative) Example of an assay with artificial digestive juices, adjusting the
pH value and resulting volumes .21
Annex D (informative) Example of the extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)
from the gastrointestinal phase solution .22
Bibliography .26
iii
Foreword
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bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
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This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 7, Impact
assessment.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
The concept of bioavailability is used during risk assessment of contaminants and contaminated land. It
is used during human health risk assessment by application of in vitro methods designed to assess the
bioaccessible fraction of a chemical such as the one described in this document.
ISO 17402 provides a general overview of the definitions and concept of bioavailability and of available
methods to assess the bioavailability for several exposure pathways. ISO 15800 provides guidance on the
soil and site characterization necessary for the evaluation of human exposure to substances present in
soil including bioaccessibility and bioavailability. ISO 17924 describes a method to assess the bioaccessible
fraction of metals in a contaminated soil after soil ingestion. This document describes a test procedure
for the estimation of human bioaccessibility after oral uptake of both metals and non-volatile organic
contaminants from soil.
To evaluate the health effects of the oral ingestion of contaminated soil or soil-like materials by humans, it
is necessary to consider the total concentration of a contaminant in soil, the quantity of soil ingested, the
dissolution of the contaminants from soil in the gastrointestinal tract as well as their absorption through
membranes. Simulation of human absorption and bioavailability of contaminants can be determined in
animal tests. For ethical reasons, and to reduce the amount of work and time needed, in vitro methods have
been developed determining the quantity of contaminants that can be dissolved from the contaminated soil
and soil-like materials by the digestive juices in the digestive tract.
Contaminants bound to soil and soil-like materials are generally only dissolved to a partial extent by the
digestive juices in the digestive tract. The degree of dissolution depends on the type of contaminant, the
characteristics of the soil and soil-like materials and the components of the digestive juices in the digestive
tract. The dissolved contaminants can be absorbed into the organism in the gastrointestinal tract.
Contaminants that remain bound are largely excreted in an unchanged state. The quantity actually resorbed
is always less than or, at most, equal to the dissolved quantity.
Digestive juices are complex mixtures of electrolytes, enzymes and digestive aids. The composition of the
digestive juices varies depending on their type, characteristics and quantity, and depends on exogenous and
endogenous factors. The type of food consumed is a significant exogenous factor in this regard.
The presence of food has an impact on the dissolution process of contaminants from soil particles ingested
by humans to their gastrointestinal juices. Therefore, it is relevant to add a food surrogate in an in vitro
test, to mimic the true situation in vivo. Food surrogates like milk powder are acting as emulsifiers because
the absorption of lipophilic substances depends significantly on the presence of lipids, for example from
food, which causes the secretion of bile salts, as well as the formation of micelles resulting in higher
[56,61]
bioaccessibilities for hydrophobic organic contaminants. In addition, they can also have an impact on
inorganic contaminants. The use of food additives in in vitro testing simulates dissolution in children after a
standard meal (e.g. baby food) to achieve “realistic worst case” estimates for risk assessment especially for
[34]
organic contaminants .
This document standardizes a test system to assess the bioaccessible fraction of pollutants in contaminated
soils and soil-like materials with the aid of artificial digestive juices. The composition of the used artificial
digestive juices corresponds approximately to the average composition of natural digestive juices of humans
in the case of stimulated secretion, as occurs during the intake of foodstuffs. The treatment duration of
the samples with gastric juice is 2 h and corresponds to the average residence times of foodstuffs in the
stomach. In contrast, the treatment duration with intestinal juice is 3 h and based on the residence time of
[61]
foodstuff components in the upper section of the small intestine, which is the main site of absorption. To
simulate food consumption and, hence, take the influence of foodstuff into account, milk powder is added to
the test system as food surrogate. Soil and soil-like sample material that has not been crushed or ground is
generally used after sieving at ≤ 2 mm simulating soil ingestion by eating without extensive mastication (e.g.
by young children).
This method has been validated in vivo for arsenic, lead, cadmium, chromium, nickel and mercury by animal
[40]
testing. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) including Benzo[a]pyrene (BaP) were also used in in
vivo animal testing. An interlaboratory trial was carried out using arsenic, lead, cadmium and antimony as
[61]
well as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs) and trinitrotoluene.
v
Several in vitro methods have been developed for the estimation of contaminant bioaccessibility. There
are simplified approaches simulating the human gastrointestinal physiology by separate gastric and/
or intestinal tests or by using gastric and intestinal phases subsequently. The test method described in
ISO 17924 uses both a separate gastric phase as well as combined gastric and intestinal phases to assess
the bioaccessibility of contaminants. The methodology used in this document is based exclusively on a
combined gastric and intestinal phase. In contrast to ISO 17924, milk powder is used as food surrogate in
the method described in this document. In addition, the method described in this document is not limited
to inorganic contaminants but is also applicable to organic contaminants like PAHs or PCBs. The methods of
[42,43,46,47]
both standards are in vivo validated and comparisons of both methodologies have been published.
vi
International Standard ISO 8259:2024(en)
Soil quality — Bioaccessibility of organic and inorganic
pollutants from contaminated soil and soil-like materials
1 Scope
This document specifies a method for testing the bioaccessibility of substances from contaminated soil and
soil-like materials. The method is not applicable for volatile contaminants. Furthermore, the method is only
applicable if suitable analytical methods for extraction and detection of substances and/or elements from
complex digestion assays are available.
NOTE During the in vivo validation with minipigs, the PAHs naphthalene, acenaphthylene, acenaphthene
[40]
and fluorene were not evaluated due to their volatility. However, the results of the overall recovery indicate if
volatilisation has occurred during the test.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO/IEC 17025, General requirements for the competence of testing and calibration laboratories
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
contaminated soil and soil-like material
soil and soil-like material containing contaminants (3.2) that can
pose health risks if ingested by humans
3.2
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
Note 1 to entry: There is no assumption in this definition that harms results from the presence of the contaminant.
3.3
total content
analyte concentration in a sample that is measured using a largely exhaustive extraction method, e.g. after
aqua regia digestion (heavy metals) or solvent extraction (organic components)
3.4
duplicate determination
carrying out the method twice to determine the bioaccessibility (3.6), each time with a new subsample
3.5
bioavailability
fraction of a substance present in ingested soil or soil-like materials that reaches the systemic circulation
(blood stream)
3.6
bioaccessibility
fraction of a substance in soil or soil-like material that is liberated in (human) gastrointestinal juices and
thus available for absorption
Note 1 to entry: Bioaccessibility is expressed and calculated as percentage transfer of a substance from the solid
sample into the liquid phase (the gastrointestinal phase solution) of the in vitro test system specified by this document,
where the reference quantity is the conventional total content (3.3) of the solid sample as analysed after digestion or
extraction.
3.7
solid phase after centrifugation
solid phase remaining after centrifugation at the end of simulated digestion
Note 1 to entry: The solid phase after centrifugation contains the non-bioaccessible content and/or fraction.
3.8
mass balance
relationship between input and output of a specified substance in a defined system
Note 1 to entry: In this context, mass balance is the calculation of the contents of a contaminant (3.2) in the
gastrointestinal phase (supernatant) and in the pellet after centrifugation as well as the calculation of their sum.
3.9
overall recovery
quality assurance measure whereby the sum of the content in the gastrointestinal phase (supernatant) and
the solid phase after centrifugation (3.7) is compared with the total content (3.3), taking into account sample
inhomogeneity (3.10)
3.10
sample inhomogeneity
inhomogeneous distribution of the analyte in a sample that results in subsamples with different analyte
concentrations, described by the standard deviation of a replicate determination
4 Principle of the test
4.1 Human digestion
Digestion starts in the mouth, where, in addition to mechanical size reduction, an α-amylase contained in
the spittle initiates the hydrolysis of starches. However, experience shows that separate consideration of
[40]
this partial process is not essential with regard to the release of contaminants. Food is denatured in the
stomach by hydrochloric acid. At the same time, digestion of proteins by peptide hydrolases (pepsins) begins.
In addition, lipases that originate from the duodenum initiate the digestion of fats. Maximum secretion of
hydrochloric acid is achieved after 1 h. The hydrochloric acid is buffered to a pH value of between 3 and 4
[61]
by food components. The pH value only falls into a range of 1 to 2 again when digestion has progressed.
Depending on the characteristics of the food, it is transferred to the duodenum after a residence time of
between just a few minutes and several hours. Here, the hydrochloric acid is first buffered to a pH value
of 4 by hydrogen carbonate from the duodenum juice, pancreatic juice and bile. The pH value then increases
more slowly to between 6 and 7,5. The pancreatic juice contains a range of peptide hydrolases (trypsin,
chymotrypsin etc.), α-amylases for lysis of carbohydrates, and lipases for lysis of triglycerides into mono- or
diacylglycerides and fatty acids. Lipids can be digested by lipases only in emulsified form. Already in the
stomach, fats are mechanically suspended by the movements of the stomach. As a result of the influx of bile,
which contains bile acids and lecithins as natural surfactants, strong emulsification of fats and the products
of fat decomposition (di- and monoglycerides and fatty acids) occurs. In the small intestine (jejunum and
ileum), further digestive enzymes are also present, but these do not differ significantly from the enzymes
in the pancreatic juice in their effect. In total, the body produces an average of 0,5 l to 1,5 l of spittle, 2 l to
3 l of gastric juice, 0,5 l to 1,5 l of pancreatic juice, 0,8 l to 1 l of liver bile, which is concentrated by a factor
of approximately 7 in the gall bladder, and 2 l to 3 l of intestinal juice from the small intestine in 24 h. The
small intestine is the main organ for the absorption of food and drink components and pollutants. Here,
approximately 8 l to 9 l of water is resorbed with approximately 70 g of electrolytes, 300 g of carbohydrates,
100 g of proteins and 70 g of fats every day. In addition, a large majority of the bile acids is recovered as no
more than 4 g to 6 g is available to the body while several times this amount is required for digestion.
4.2 General test description
To assess the bioaccessibility of contaminants in soil or soil-like materials after oral ingestion, an in vitro
test is described using two artificial digestive juices (artificial gastric juice and artificial intestinal juice)
simulating the digestion in the human gastrointestinal tract under close to realistic physiological conditions,
i.e. at an elevated temperature (37 °C), with continuous agitation and at a pH value that is typical for gastric
or intestinal juices. A schematic workflow of the test is presented in Figure 1.
a
If necessary when particles floating on the surface of the test solution.
b
Quality assurance measure; if necessary, incl. filtration residue.
Figure 1 — Schematic diagram of test process
4.3 Applicability
The test to assess the bioaccessibility of contaminants in soil or soil-like materials can be used for
scientific research as well as for risk assessment of contaminated sites. Concerning the risk assessment, it
is presupposed that the national legal context is considered when and how bioavailability estimates can,
or should, contribute to risk assessment. Usually, bioaccessibility data are used during a detailed and site-
specific risk assessment (see ISO 15800) and in vitro tests are carried out if national threshold values based
on total concentrations are exceeded to a reasonable extent (i.e. which can result in an acceptable risk when
considering the bioaccessibility of the contaminant).
4.4 Substances and elements
The test has been validated in vivo for arsenic, lead, cadmium, chromium, nickel and mercury as well as for
[40]
polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by animal testing. However, correlation with bioaccessibility
– bioavailability for PAHs could not be clearly shown due to the metabolism of PAHs by the minipigs; and
[41]
comparison could only be carried out indirectly (by retention) .
An interlaboratory trial was carried out using arsenic, lead, cadmium and antimony as well as polycyclic
[61]
aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs) and trinitrotoluene. Results of the
inter-laboratory trial are presented in Annex B.
Up to now, the extractability by artificial digestive juices of organic contaminants from contaminated soil
and soil-like materials has been tested on a wide range of soil-like materials and technogenic materials for
the following compounds:
polycyclic aromatic hydrocarbons soil [29], [30], [57]
(PAHs or BaP)
p,p-DDT housedust [33]
γ-HCH (hexachlorocyclohexane) soil, housedust [33], [51]
petroleum hydrocarbons soil [57]
polychlorinated biphenyls (PCBs) soil, housedust [29], [33]
polychlorinated dibenzodioxines (PCDDs) red slag [52]
and polychlorinated dibenzofurans (PCDFs)
PCP housedust [33]
Permethrin housedust [33]
The bioaccessibility of inorganic substances, such as the elements arsenic, lead, cadmium, chromium and
mercury in their various forms and oxidation states, has also been investigated using a wide range of
contaminated soil and soil-like materials:
As soil [32], [40]
Cd soil, soil-like materials [32], [40], [53]
Cr soil, soil-like materials [40], [53]
Cu soil, soil-like materials [53]
Hg soil [40]
Mn soil, soil-like materials [53]
Ni soil [40]
Pb soil [30], [32]
U soil [32]
Zn soil, soil-like materials [53]
4.5 Contaminated soil and soil-like materials
Both anthropogenically and geogenically contaminated soil and soil-like materials can be investigated in
[40] [61]
this test system. The test was validated by animal testing and by an interlaboratory trial using soils
from different contaminated sites.
Other materials, such as fly ash, filter residues, blasting sand, materials from recycling processes, road
asphalt, road dust, domestic dust, sewage sludge, sediments from bodies of water, dredged material,
metallurgical waste from smelting works, other wastes for recovery and removal, and materials from the
[36,53]
mining and processing of ores, can also be investigated.
5 Sampling and pre-treatment of soil and soil-like materials
The sample size shall be sufficient to allow the laboratory investigation as well as the provision of retain
samples after preparation of the fraction < 2 mm from the samples. Soil and soil-like sample material that
shall not be crushed or ground is used for the test after sieving.
At least 100 g of dry mass (including a duplicate test and retain sample) of inhomogeneous or coarse soil and
soil-like materials should be available for the testing of bioaccessibility. Smaller quantities of soil and soil-
like sample material are acceptable in exceptional cases, such as an investigation of roof dust.
Total contents and bioaccessible contents should be determined by the same laboratory. If there are more
than 6 months between sampling and the measurements of bioaccessible contents, sampling should
be carried out again for the determination of bioaccessible contents. The total content should also be
determined again using the new sample.
6 Reagents and apparatus
6.1 Reagents
All reagents shall be of analytical quality as a minimum.
6.1.1 Water, deionized.
6.1.2 Sodium chloride, NaCl.
6.1.3 Sodium hydrogen carbonate, NaHCO .
6.1.4 Potassium chloride, KCl.
6.1.5 Potassium dihydrogen phosphate, KH PO .
2 4
6.1.6 Calcium chloride dihydrate, CaCl ⋅ 2 H O.
2 2
6.1.7 Magnesium chloride hexahydrate, MgCl ⋅ 6 H O.
2 2
6.1.8 Buffer solutions for calibration of the titration system with pH values of 2,0 and 7,0.
6.1.9 Hydrochloric acid HCl, w = 10 %.
HCl
6.1.10 Saturated sodium hydrogen carbonate solution.
6.1.11 Sodium azide for stabilization.
6.2 Enzymes and digestive aids
NOTE See Annex A for samples of suitable enzymes and suppliers of these enzymes.
6.2.1 Porcine mucin.
6.2.2 Porcine pancreatin.
6.2.3 Pepsin.
6.2.4 Trypsin.
6.2.5 Porcine bile extract.
6.2.6 Instant whole milk powder, small portion units, freshly opened, which keeps for a maximum of one
week if refrigerated.
6.3 Apparatus
6.3.1 Autotitration system, consisting of a control unit, automatic burettes, pH electrodes (single pore,
pH value 0 to 14, 30 °C to 60 °C), and a control and evaluation unit (optional).
6.3.2 Water bath with tangential or circular shaker, heated with variable holders for incubation vessels
or a tempering bath with a magnetic stirrer (T = 37 °C ± 0,5 °C).
6.3.3 Amber glass bottles (nominal capacity 500 ml, with a screw cap with holes for a pH electrode if
necessary and a dosing tip).
6.3.4 Soxhlet apparatus (optional).
6.3.5 0,5 l rotation perforator, for extraction media with a lower density (optional).
6.3.6 Centrifuge (7 000 g).
6.3.7 Analytical sieves for sample preparation, made of stainless steel (mesh size 2 mm). Mesh size
should be adapted if smaller soil fractions are investigated for other national requirements.
6.3.8 Filter for filtering gastrointestinal phase solutions to remove floating particles, mesh
size 20 µm, for analysis; made of stainless steel for organic compounds and made of plastic for inorganic
substances.
6.3.9 Analytical balance, for weighing out soil-like materials and reagents for the test system.
6.3.10 Drying cabinet.
7 Test system
7.1 Set-up of apparatus
Testing of the dissolution of pollutants from contaminated soil and soil-like materials by artificial digestive
juices is carried out under close-to-realistic physiological conditions, i.e. at an elevated temperature (37 °C),
with continuous agitation and at a pH value that is typical for gastric or intestinal juices. Testing is carried
out in 500 ml amber glass bottles (6.3.3), in a temperature-controlled water bath with a shaking function
−1
at a shaking frequency of 200 min or, alternatively, in a thermostat-controlled water bath (37 °C) on a
magnetic stirrer (6.3.2) with a polytetrafluorethylene-coated stirring rod. The agitation shall be so strong
that the soil and soil-like materials to be tested cannot deposit and become compacted at the base of the
vessel in the assays. The amber glass bottles (6.3.3) are closed by screw caps.
The pH value can be regulated manually or automatically.
If the pH value of the test assays is monitored using a pH meter and is regulated manually, the pH value
should be maintained as close to the specified values as possible. Fluctuations in the pH value around the
specified value should not be greater than 0,2 pH units when titrating the assays after the end of the initial
adjustment. Deviations in this regard shall be described in the test report.
A number of samples can be continuously agitated in 500 ml amber glass bottles with screw caps in a shaking
−1
water bath at 37 °C at 200 min at the same time. The pH value in the test assays is measured and regulated
at short intervals (in the range of seconds) using a computer-controlled autotitration system (6.3.1).
For special purposes, anaerobic conditions can be created using an inert gas (e.g. N ).
7.2 Artificial digestive juices
The composition of the artificial digestive juices in the test system is presented in Table 1 and Table 2. All
digestive juices contain electrolytes and biochemical components.
The inorganic components are dissolved in water (6.1.1) in separate stock solutions for gastric and intestinal
juices concentrated by a factor of between 10 and 1 000 and are then diluted to produce the relevant
inorganic working solution. The biochemical components are added to these solutions with the aid of stirring
or agitation immediately before they are used.
Artificial gastric juice contains the concentrations of NaCl, KCl, KH PO , pepsin and mucin specified in Table 1
2 4
in 100 ml. Artificial intestinal juice contains CaCl , MgCl , KCl, NaHCO , urea, lyophilized bile, pancreatin
2 2 3
and trypsin (see Table 2). The concentrations of the enzymes, mucous substances and other components of
artificial digestive juices lie within the range of the average concentrations of these components in natural
digestive juices.
In order to take into account the influence of foodstuffs such as carbohydrates, proteins and lipids on the
dissolution processes of contaminants in the gastrointestinal tract, whole milk powder is added to the test
system at the start of the stomach stage.
NOTE The whole milk powder serves as a surrogate for average fat-rich and protein-rich components of human
foodstuffs and primarily simulates the influence of foodstuffs on the dissolution process of contaminants in the
digestive tracts of babies and toddlers. Whole milk powder largely fulfils the requirements of a standardized material
and it is available to buy with a sufficiently constant level of quality. However, opened packages keep for only a limited
period of time.
Whole milk powder is added to the artificial gastric juice directly before the start of the test. Artificial
gastric juice is adjusted to a pH value of 2 using HCl. 100 g of milk powder is suspended for every 1 000 ml
in 20 min with stirring, allowed to soak and then adjusted to a pH value of 2 again. 1 000 ml of artificial
gastric juice together with milk powder results in 1 100 ml of gastric juice. The test starts with the addition
of 110 ml of this mixture to 2 g of sample.
Table 1 — Composition of artificial gastric juice (see also Annex A)
Addition to the stock solution Final concentration in gastric
concentrated by a factor of 50 juice
Stock solution g/l g/l
NaCl 145 2,9
KCl 35 0,70
KH PO 13,5 0,27
2 4
Enzymes and digestive aids
pepsin — 1,0
mucin — 3,0
Table 2 — Composition of artificial intestinal juice (see also Annex A)
Addition to the stock solution Final concentration in
Ingredient
concentrated by a factor of 100 intestinal juice
g/l g/l
Stock solution 1
KCl 30 0,30
NaHCO 100 1,0
Stock solution 2
CaCl ⋅ 2 H O 50 0,50
2 2
MgCl ⋅ 6 H O 20 0,20
2 2
Enzymes and digestive aids
trypsin — 0,30
urea — 0,30
pancreatin — 9,0
bile, lyophilized — 9,0
8 Preparation and analysis of the sample
8.1 Sample preparation
Sample preparation, including drying of the soil and soil-like materials, is carried out to determine physico-
chemical properties and to identify organic and inorganic contaminants. The particle size fraction of ≤ 2 mm
is used for chemical investigations of soil-like materials. Soil and soil-like materials that shall not be crushed
or ground is generally used for the test.
NOTE The particle size fraction of ≤ 2 mm was selected on the basis of probability considerations for ingestion of
[31]
soil particles by children as well as on a practicable solution for handling samples of soil and soil-like materials in
routine laboratories. However, it is important that the reference particle size fraction of the bioaccessible content and
the total content are the same.
In preparation for the bioaccessibility testing, particles with a particle diameter ≤ 2 mm are sieved out of at
least 100 g of the starting soil and soil-like material using an analytical sieve made of stainless steel (6.3.7).
If lower quantities of soil or soil-like materials are available, this shall be noted in the test report by the
laboratory. Even if coarse soil or soil-like materials is tested in the test system, which can be necessary if
the contaminated fractions are larger particles, for example, this shall be stated in the test report by the
laboratory.
The retain samples shall be kept for at least 6 months after the end of all tests.
8.2 Test procedure
8.2.1 The in vitro test on bioaccessibility is carried out only on small quantities of contaminated soil-like
materials because there are generally only small quantities of contaminated soil-like materials present in
[31]
the gastrointestinal tract and because the quantity of soil-like material in the test system affects the
dissolution rate of particle-bound contaminants. For this reason, no more than 2 g of contaminated soil-like
material should generally be put into a total of 200 ml of digestive juices (with regard to gastric and intestinal
stage). At higher contents of contaminated soil and soil-like materials, impairment of the dissolution rate is
possible, particularly of organic contaminants as a result of inactivation of digestive juice components, e.g.
by sorption of these components onto the soil or soil-like materials.
8.2.2 The test is initially carried out in duplicate with two subsamples.
8.2.3 Each subsample of 2 g of contaminated soil or soil-like materials ≤ 2 mm is suspended in 100 ml
of artificial gastric juice and 10 g of whole milk powder (resulting in 110 mL, see 7.2 for preparation). The
pH value of the suspension is adjusted to 2,0 ± 0,05 using 10 % hydrochloric acid.
8.2.4 The suspension is agitated continuously for 2 h at 37 °C. This can be done in a shaking water bath
−1
with a thermostat at a shaking frequency of 200 min . Alternatively, the assay can be stirred in a water bath
with a thermostat and a magnetic stirrer using a polytetrafluorethylene-coated stirring rod.
If the pH value increases above 4,0, it shall be adjusted back to 2,5 using 10 % hydrochloric acid.
8.2.5 After 2 h, 100 ml of artificial intestinal juice is added to the digestion assay and the pH value of the
assay is adjusted to 7,5 during 60 min to 90 min in the course of the test using NaHCO (solid). The intestinal
phase lasts 3 h.
8.2.6 After the pH-value plateaus at 7,5, the pH value of the assay is kept at 7,5 using the autotitrator or else
manually using hydrochloric acid. The target pH value of 7,5 shall not be exceeded by more than 0,2 pH units
at any time. For this purpose, the pH value shall be checked and documented at least every 10 min at the
start of the intestinal stage and at larger intervals later on.
When the digestion assays are being agitated, particles from the soil-like material and components of the
digestive juices can accumulate at the wall of the vessel above the aqueous phase. These deposited particles
shall be shaken back into the suspension manually from time to time.
Annex C describes an example of an assay with artificial digestive juices, the monitoring of the pH value, and
the resulting volumes.
NOTE In the case the pH value exceeds 7,7, it is possible that irreversible precipitation of inorganic contaminants
occurs. If precipitation occurs, the measured concentration of the contaminant in the gastrointestinal phase solution
would be too low (i.e. not reflecting the conditions at pH 7,5) and, hence, the in vitro test would underestimate the
bioaccessible fraction of this contaminant.
8.3 Separation of dissolved contaminants from particle-bound contaminants
8.3.1 Immediately after completion of the intestinal phase, the test mixture is centrifuged for 20 min at
7 000 g (see Figure 1).
8.3.2 The dissolved contaminants remain in the supernatant after centrifugation (gastrointestinal phase
solution); the particle-bound contaminants enter the centrifugation solid phase. The supernatant is decanted off.
8.3.3 The solid phase is fully suspended with 30 ml of distilled water and centrifuged again.
8.3.4 The resulting supernatant is decanted off again and is combined with the supernatant of the first
centrifugation step. Only if necessary, the combined supernatants are filtered through a stainless-steel sieve
(mesh size 20 µm) for organic contaminants or through a plastic sieve for inorganic compounds (6.3.8). This
ensures that any particles possibly present with a lower density (i.e. floating on the surface of the solution)
are removed from the supernatant. The particles are added to the centrifugation solid phase.
8.3.5 For measurement of analytes in the centrifugation solid phases, they shall be processed as a whole,
i.e. it is not feasible to divide them into aliquot portions. Thus, for each group of analytes, separate absorption
assays are necessary.
8.4 Quantification
8.4.1 General
Chemical analysis of the relevant parameters is carried out in accordance with the standards appropriate
for the quantification of the contaminant(s) to be measured, taking into account the areas of application
specified in these standards (e.g. for inorganic substances ISO 11047, ISO 11885, ISO 17294-2, ISO 22036
or ISO 54321 and for organic substances ISO 18475, ISO 14154, ISO 18287, ISO 22478, EN 15308, EN 16181,
EN 16190, and References [21],[24]-[26], or [28]). As a result of the use of whole milk powder, additional
pretreatment – e.g. digestion in the case of heavy metals – or clean-up is generally necessary. If analysis
cannot be carried out immediately after the experiment is carried out, the centrifugation supernatants and
solid phases shall be stabilized by adding 1 ml of 20 % sodium azide solution (6.1.11) to each to prevent
microbial decomposition.
8.4.2 Analysis of inorganic substances
To determine the fraction rem
...
Norme
internationale
ISO 8259
Première édition
Qualité du sol — Bioaccessibilité
2024-07
des polluants organiques et
inorganiques provenant d’un sol ou
de matériaux de type sol pollués
Soil quality — Bioaccessibility of organic and inorganic
pollutants from contaminated soil and soil-like materials
Numéro de référence
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe de l’essai . 2
4.1 Digestion chez l’homme .2
4.2 Description générale de l’essai .3
4.3 Applicabilité .4
4.4 Substances et éléments .5
4.5 Sol et matériaux de type sol pollués .6
5 Échantillonnage et prétraitement du sol et des matériaux de type sol. 6
6 Réactifs et appareillage . 6
6.1 Réactifs .6
6.2 Enzymes et substances favorisant la digestion.7
6.3 Appareillage .7
7 Système d’essai . 8
7.1 Configuration de l’appareillage . .8
7.2 Liquides digestifs artificiels .8
8 Préparation et analyse de l’échantillon . . 9
8.1 Préparation de l’échantillon .9
8.2 Mode opératoire de l’essai .10
8.3 Séparation des polluants dissous des polluants liés aux particules .10
8.4 Quantification . . .11
8.4.1 Généralités .11
8.4.2 Analyse des substances inorganiques .11
8.4.3 Analyse des substances organiques .11
9 Calcul de la bioaccessibilité .12
10 Contrôle qualité .13
10.1 Généralités . 13
10.2 Quantification de la teneur bioaccessible . 13
10.3 Bilan massique et taux de recouvrement .14
10.4 Mesures de contrôle supplémentaires .14
11 Rapport d’essai . 14
Annexe A (informative) Enzymes et substances favorisant la digestion .16
Annexe B (informative) Caractéristiques de performance de la méthode pour les fractions
bioaccessibles de substances inorganiques et organiques sélectionnées. 17
Annexe C (informative) Exemple d’un essai avec des liquides digestifs artificiels, ajustement du
pH et volumes obtenus .21
Annexe D (informative) Exemple d’extraction d’hydrocarbures aromatiques polycycliques
(HAP) à partir de la solution de la phase gastro-intestinale .22
Bibliographie .26
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de tout
droit de propriété revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas reçu
notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois, il y a lieu
d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations plus récentes
sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse www.iso.org/patents.
L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de brevet.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 7,
Évaluation des impacts.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
Le concept de biodisponibilité est utilisé lors de l’évaluation des risques liés aux polluants et aux sites pollués.
Il est utilisé dans le cadre de l’évaluation des risques pour la santé humaine par application de méthodes
in vitro conçues pour évaluer la fraction bioaccessible d’une substance chimique, telles que celle décrite
dans le présent document.
L’ISO 17402 fournit une présentation générale des définitions et du concept de biodisponibilité et des
méthodes disponibles pour évaluer la biodisponibilité pour différentes voies d’exposition. L’ISO 15800 donne
des recommandations relatives à la caractérisation du sol et du site nécessaire à l’évaluation de l’exposition
humaine aux substances présentes dans le sol, y compris la bioaccessibilité et la biodisponibilité. L’ISO 17924
décrit une méthode d’évaluation de la fraction bioaccessible des métaux dans un sol pollué après ingestion de
sol. Le présent document décrit un mode opératoire d’essai pour l’estimation de la bioaccessibilité humaine
après ingestion à la fois de métaux et de polluants organiques non volatils provenant du sol.
Afin d’évaluer les effets sur la santé de l’ingestion par l’homme de sol ou de matériaux de type sol pollués,
il est nécessaire de prendre en considération la concentration totale d’un polluant dans le sol, la quantité
de sol ingérée, la dissolution des polluants provenant du sol dans le tractus gastro-intestinal, ainsi que leur
absorption à travers les membranes. Une simulation de l’absorption et de la biodisponibilité des polluants
chez l’homme peut être déterminée par des essais sur des animaux. Pour des raisons éthiques, et afin de
réduire la quantité de travail et le temps nécessaires, des méthodes in vitro ont été développées afin de
déterminer la quantité de polluants, liés au sol et à des matériaux de type sol pollués, pouvant être dissoute
par les liquides digestifs dans le tube digestif.
Les polluants liés au sol et aux matériaux de type sol ne sont généralement dissous qu’en partie par les liquides
digestifs dans le tube digestif. Le degré de dissolution dépend du type de polluant, des caractéristiques du sol
et des matériaux de type sol, ainsi que des composés des liquides digestifs dans le tube digestif. Les polluants
dissous peuvent être absorbés dans l’organisme au niveau du tractus gastro-intestinal. Les polluants qui
restent liés à la matrice sont en grande partie excrétés sous une forme inchangée. La quantité effectivement
résorbée est toujours inférieure ou, au plus, égale à la quantité dissoute.
Les liquides digestifs sont des mélanges complexes d’électrolytes, d’enzymes et de substances favorisant la
digestion. La composition des liquides digestifs varie en fonction de leur type, de leurs caractéristiques et
de leur quantité, et dépend de facteurs exogènes et endogènes. Le type d’aliment consommé est un facteur
exogène significatif à cet égard.
La présence d’aliment a un impact sur le processus de dissolution des polluants provenant des particules
de sol ingérées par l’homme par ses liquides gastro-intestinaux. Il est donc pertinent d’ajouter un substitut
alimentaire dans un essai in vitro afin de reproduire la véritable situation in vivo. Les substituts alimentaires
tels que le lait en poudre agissent comme des émulsifiants, car l’absorption de substances lipophiles dépend
fortement de la présence de lipides, par exemple issus de l’aliment, qui provoque la sécrétion de sels biliaires,
ainsi que la formation de micelles ce qui accroît la bioaccessibilité des polluants organiques hydrophobes.
[56,61]
De plus, ils peuvent aussi avoir un impact sur les polluants inorganiques. L’utilisation de compléments
alimentaires dans les essais in vitro simule la dissolution chez les enfants après un repas classique (par
exemple, aliment pour bébé) afin d’obtenir des estimations du «cas réaliste le plus défavorable» pour
[34]
l’évaluation des risques, notamment pour les polluants organiques .
Le présent document normalise un système d’essai pour évaluer la fraction bioaccessible de polluants dans
des sols et matériaux de type sol pollués à l’aide de liquides digestifs artificiels. La composition des liquides
digestifs artificiels utilisés correspond approximativement à la composition moyenne de liquides digestifs
naturels de l’homme dans le cas d’une sécrétion stimulée, comme c’est le cas lors de l’ingestion d’aliments.
Le temps de résidence des échantillons dans le liquide gastrique est de 2 h et correspond au temps de séjour
moyen des aliments dans l’estomac. Par contre, le temps de résidence dans le liquide intestinal est de 3 h
et est fondé sur le temps de séjour de composants des denrées alimentaires dans la partie supérieure de
[61]
l’intestin grêle, qui est le principal site d’absorption. Afin de simuler la consommation d’aliments et, donc,
de prendre en compte l’influence des aliments, du lait en poudre est ajouté au système d’essai en tant que
substitut alimentaire. Un échantillon de sol ou de matériau de type sol qui n’a pas été broyé est en général
utilisé après tamisage à ≤ 2 mm simulant une ingestion de sol en avalant sans mastication poussée (par
exemple, comme chez les jeunes enfants).
v
Cette méthode a été validée in vivo pour l’arsenic, le plomb, le cadmium, le chrome, le nickel et le mercure
[40]
par des essais sur animaux. Des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), notamment le
benzo[a]pyrène (BaP), ont également été utilisés dans le cadre d’essais in vivo sur des animaux. Un
essai interlaboratoires a été réalisé sur l’arsenic, le plomb, le cadmium et l’antimoine, ainsi que sur des
[61]
hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), des polychlorobiphényles (PCB) et le trinitrotoluène .
Plusieurs méthodes in vitro ont été développées pour l’estimation de la bioaccessibilité des polluants.
Il existe des approches simplifiées simulant la physiologie gastro-intestinale humaine avec des essais
gastriques et/ou intestinaux distincts ou impliquant consécutivement une phase gastrique et une phase
intestinale. La méthode d’essai décrite dans l’ISO 17924 utilise une phase gastrique distincte, ainsi que des
phases gastrique et intestinale combinées pour évaluer la bioaccessibilité de polluants. La méthodologie
utilisée dans le présent document repose exclusivement sur une phase gastrique et intestinale combinée.
Contrairement à l’ISO 17924, du lait en poudre est utilisé en tant que substitut alimentaire dans le cadre
de la méthode décrite dans le présent document. De plus, la méthode décrite dans le présent document
n’est pas limitée aux polluants inorganiques, mais est aussi applicable aux polluants organiques tels que les
hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) ou les polychlorobiphényles (PCB). Les méthodes des deux
[42,43,46,47]
normes ont été validées in vivo et des comparaisons des deux méthodologies ont été publiées .
vi
Norme internationale ISO 8259:2024(fr)
Qualité du sol — Bioaccessibilité des polluants organiques
et inorganiques provenant d’un sol ou de matériaux de type
sol pollués
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode pour déterminer la bioaccessibilité de substances issues de sol et
de matériaux de type sol pollués. La méthode n’est pas applicable aux polluants volatils. En outre, la méthode
n’est applicable que si des méthodes d’analyse adéquates pour l’extraction et la détection de substances et/
ou d’éléments issus d’essais de digestion complexes sont disponibles.
NOTE Durant la validation in vivo sur des mini-porcs, les HAP naphtalène, acénaphtylène, acénaphtène et fluorène
[40]
n’ont pas été évalués à cause de leur volatilité. Néanmoins, les résultats du taux de recouvrement indiquent si une
volatilisation a eu lieu pendant l’essai.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO/IEC 17025, Exigences générales concernant la compétence des laboratoires d'étalonnages et d'essais
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
sol et matériau de type sol pollué
<évaluation de la bioaccessibilité chez l’homme> sol et matériau de type sol contenant des polluants (3.2) qui
peuvent constituer des risques pour la santé humaine s’ils sont ingérés
3.2
polluant
substance ou agent présent(e) dans le sol et résultant de l’activité humaine
Note 1 à l'article: La présente définition ne présume pas l’existence d’un danger dû à la présence du polluant.
3.3
teneur totale
concentration d’analyte dans un échantillon qui est mesurée en utilisant une méthode d’extraction largement
exhaustive, par exemple après digestion à l’eau régale (métaux lourds) ou extraction au solvant (composés
organiques)
3.4
détermination en duplicat
réalisation de la méthode deux fois pour déterminer la bioaccessibilité (3.6), en utilisant à chaque fois un
nouveau sous-échantillon
3.5
biodisponibilité
fraction d’une substance présente dans un sol ou des matériaux de type sol ingérés, qui atteint la circulation
générale (circulation sanguine)
3.6
bioaccessibilité
fraction d’une substance dans un sol ou un matériau de type sol, libérée dans les sucs gastro-
intestinaux (humains) et donc disponible pour absorption
Note 1 à l'article: La bioaccessibilité est exprimée et calculée sous la forme d’un pourcentage de transfert d’une
substance de l’échantillon solide vers la phase liquide (la solution de la phase gastro-intestinale) du système d’essai
in vitro spécifié par le présent document, où la quantité de référence est la teneur totale (3.3) de l’échantillon solide tel
qu’analysé classiquement après digestion ou extraction.
3.7
phase solide après centrifugation
phase solide restant dans le culot après centrifugation à la fin d’une digestion simulée
Note 1 à l'article: La phase solide après centrifugation contient la teneur et/ou la fraction non bioaccessible.
3.8
bilan massique
relation entre l’entrée et la sortie d’une substance spécifiée dans un système défini
Note 1 à l'article: Dans ce contexte, le bilan massique est le calcul des teneurs d’un polluant (3.2) dans la phase gastro-
intestinale (surnageant) et dans le culot après centrifugation, ainsi que le calcul de leur somme.
3.9
taux de recouvrement
mesure du contrôle qualité par laquelle la somme de la teneur dans la phase gastro-intestinale (surnageant)
et la phase solide après centrifugation (3.7) est comparée à la teneur totale (3.3), en tenant compte de
l’hétérogénéité de l’échantillon (3.10)
3.10
hétérogénéité de l’échantillon
distribution hétérogène de l’analyte dans un échantillon qui conduit à des sous-échantillons ayant différentes
concentrations en analyte, décrite par l’écart-type d’une détermination des duplicats
4 Principe de l’essai
4.1 Digestion chez l’homme
La digestion commence dans la bouche, où, en plus de la réduction mécanique de taille, une α-amylase
contenue dans la salive initie l’hydrolyse des amidons. L’expérience montre toutefois que la prise en compte
[40]
séparée de ce processus partiel n’est pas essentielle en ce qui concerne le relargage des polluants. La
nourriture est dénaturée dans l’estomac par de l’acide chlorhydrique. Dans le même temps, la digestion
des protéines par des hydrolases peptidiques (pepsines) commence. De plus, les lipases qui proviennent
du duodénum initient la digestion des graisses. La sécrétion maximale de l’acide chlorhydrique est
obtenue après 1 h. L’acide chlorhydrique est tamponné à un pH compris entre 3 et 4 par les composants
[61]
alimentaires. Le pH revient seulement dans une plage de 1 à 2 lorsque la digestion a progressé. Selon les
caractéristiques de la nourriture, il est transféré au duodénum après un temps de séjour allant de quelques
minutes à plusieurs heures. À ce niveau, l’acide chlorhydrique est d’abord tamponné à un pH de 4 par de
l’hydrogénocarbonate provenant du suc du duodénum, du suc pancréatique et de la bile. Le pH augmente
alors plus lentement jusqu’à atteindre une valeur comprise entre 6 et 7,5. Le suc pancréatique contient un
éventail d’hydrolases peptidiques (trypsine, chymotrypsine, etc.), des α-amylases pour la lyse des glucides,
et des lipases pour la lyse des triglycérides en mono- ou diacylglycérides et des acides gras. Les lipides ne
peuvent être digérés par les lipases que sous une forme émulsifiée. Déjà dans l’estomac, les graisses sont
mises mécaniquement en suspension par les mouvements de l’estomac. Du fait de l’influx de bile, qui contient
des acides biliaires et des lécithines comme tensioactifs naturels, une forte émulsification des graisses et
des produits de décomposition des graisses (di- et monoglycérides et acides gras) a lieu. Dans l’intestin
grêle (jéjunum et iléon), d’autres enzymes digestives sont également présentes, mais leur effet ne diffère pas
significativement de celui des enzymes présentes dans le suc pancréatique. Au total, le corps produit une
moyenne de 0,5 l à 1,5 l de salive, de 2 l à 3 l de suc gastrique, de 0,5 l à 1,5 l de suc pancréatique, de 0,8 l à
1 l de bile hépatique, qui est concentrée d’un facteur d’environ 7 dans la vésicule biliaire, et de 2 l à 3 l de suc
intestinal provenant de l’intestin grêle en 24 h. L’intestin grêle est le principal organe où a lieu l’absorption
des composants alimentaires et de boissons et des polluants. À ce niveau, environ 8 l à 9 l d’eau sont résorbés
avec environ 70 g d’électrolytes, 300 g de glucides, 100 g de protéines et 70 g de graisses chaque jour. De
plus, une grande majorité des acides biliaires est récupérée, car l’organisme n’en dispose que de 4 g à 6 g,
alors qu’à plusieurs reprises cette quantité est exigée pour la digestion.
4.2 Description générale de l’essai
Afin d’évaluer la bioaccessibilité des polluants dans le sol ou les matériaux de type sol après ingestion, un
essai in vitro est décrit, lequel utilise deux liquides digestifs artificiels (liquide gastrique artificiel et liquide
intestinal artificiel) simulant la digestion dans le tractus gastro-intestinal humain dans des conditions
physiologiques proches de la réalité, c’est-à-dire à une température élevée (37 °C), sous agitation continue et
à un pH caractéristique des liquides gastrique ou intestinal. Une représentation schématique du déroulement
de l’essai est donnée à la Figure 1.
a
Si nécessaire, lorsque des particules flottent à la surface de la solution d’essai.
b
Mesure de contrôle qualité; si nécessaire, y compris les résidus de filtration.
Figure 1 — Schéma du processus d’essai
4.3 Applicabilité
L’essai visant à évaluer la bioaccessibilité de polluants présents dans le sol ou les matériaux de type sol peut
être utilisé à des fins de recherche scientifique ainsi que pour l’évaluation des risques des sites pollués. En ce
qui concerne l’évaluation des risques, cela présuppose de prendre en compte le contexte législatif national,
quand et comment les estimations de la biodisponibilité peuvent contribuer à l’évaluation des risques ou
quand et comment il convient qu’elles y contribuent. En général, les données de bioaccessibilité sont utilisées
lors d’une évaluation des risques détaillée et spécifique du site (voir ISO 15800) et des essais in vitro sont
réalisés si les valeurs seuils nationales fondées sur les concentrations totales sont dépassées dans une
mesure raisonnable (c’est-à-dire qui peuvent entraîner un risque acceptable lors de la prise en compte de la
bioaccessibilité du polluant).
4.4 Substances et éléments
L’essai a été validé in vivo pour l’arsenic, le plomb, le cadmium, le chrome, le nickel et le mercure ainsi que
[40]
pour les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) par des essais sur animaux. Cependant, la
corrélation avec la bioaccessibilité - biodisponibilité pour les HAP n’a pas pu être clairement démontrée
en raison de la métabolisation des HAP par les mini-porcs et la comparaison n’a pu être effectuée
[41]
qu’indirectement (par rétention) .
Un essai interlaboratoires a été réalisé sur l’arsenic, le plomb, le cadmium et l’antimoine, ainsi que sur des
[61]
hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), des polychlorobiphényles (PCB) et le trinitrotoluène.
Les résultats de l’essai interlaboratoires sont présentés à l’Annexe B.
À ce jour, l’extractabilité par des liquides digestifs artificiels des polluants organiques provenant de sols et
de matériaux de type sol pollués a été soumise à essai sur une large gamme de matériaux de type sol et de
matériaux technogènes pour les composés suivants:
hydrocarbures aromatiques polycycliques sol [29], [30], [57]
(HAP ou BaP)
p,p-DDT poussière domestique [33]
γ-HCH (hexachlorocyclohexane) sol, poussière domestique [33], [51]
hydrocarbures sol [57]
polychlorobiphényles (PCB) sol, poussière domestique [29], [33]
dibenzodioxines polychlorées (PCDD) et diben- scorie rouge [52]
zofuranes polychlorés (PCDF)
phéncyclidine (PCP) poussière domestique [33]
Perméthrine poussière domestique [33]
La bioaccessibilité des substances inorganiques, telles que les éléments arsenic, plomb, cadmium, chrome
et mercure sous leurs diverses formes et états d’oxydation, a également été étudiée en utilisant une large
gamme de sols et de matériaux de type sol pollués:
As sol [32], [40]
Cd sol, matériaux de type sol [32], [40], [53]
Cr sol, matériaux de type sol [40], [53]
Cu sol, matériaux de type sol [53]
Hg sol [40]
Mn sol, matériaux de type sol [53]
Ni sol [40]
Pb sol [30], [32]
U sol [32]
Zn sol, matériaux de type sol [53]
4.5 Sol et matériaux de type sol pollués
Dans ce système d’essai, il est possible d’étudier les sols et matériaux de type sol pollués à la fois
[40]
d’origine anthropique et géogénique. L’essai a été validé par des essais sur animaux et par un essai
[61]
interlaboratoires menés sur des sols provenant de différents sites pollués.
D’autres matériaux, tels que les cendres volantes, les résidus de filtration, le sable de sablage, les matériaux
issus des processus de recyclage, l’asphalte routier, la poussière de route, la poussière domestique, les boues
de stations d’épuration, les sédiments des masses d’eau, les matériaux de dragage, les déchets métallurgiques
provenant des fonderies, d’autres déchets destinés à être valorisés et éliminés, et les matériaux provenant
[36,53]
de l’extraction et du traitement des minerais peuvent également être étudiés .
5 Échantillonnage et prétraitement du sol et des matériaux de type sol
La quantité de l’échantillon doit être suffisante pour permettre l’étude en laboratoire et la conservation
d’échantillon après la préparation de la fraction < 2 mm des échantillons. L’échantillon de sol ou de matériau
de type sol qui ne doit pas être broyé ou concassé est utilisé pour l’essai après tamisage.
Il convient de disposer d’au moins 100 g de masse sèche (permettant un essai en duplicat et la conservation
d’échantillon) de sol ou de matériaux de type sol non homogènes ou grossiers pour les essais de
bioaccessibilité. De plus petites quantités d’échantillon de sol ou de matériau de type sol sont acceptables
dans des cas exceptionnels, par exemple une étude des poussières de toiture.
Il convient que les teneurs totales et les teneurs bioaccessibles soient déterminées par le même laboratoire.
Si plus de 6 mois se sont écoulés entre l’échantillonnage et les mesures des teneurs bioaccessibles, il convient
de procéder à un nouvel échantillonnage pour la détermination des teneurs bioaccessibles. De même, il
convient également de déterminer la teneur totale en utilisant le nouvel échantillon.
6 Réactifs et appareillage
6.1 Réactifs
Tous les réactifs doivent être au minimum de qualité analytique.
6.1.1 Eau, déionisée.
6.1.2 Chlorure de sodium, NaCl.
6.1.3 Hydrogénocarbonate de sodium, NaHCO .
6.1.4 Chlorure de potassium, KCl.
6.1.5 Dihydrogénophosphate de potassium, KH PO .
2 4
6.1.6 Chlorure de calcium dihydraté, CaCl ⋅ 2 H O.
2 2
6.1.7 Chlorure de magnésium hexahydraté, MgCl ⋅ 6 H O.
2 2
6.1.8 Solutions tampons pour l’étalonnage du système de titrage avec des valeurs de pH de 2,0 et 7,0.
6.1.9 Acide chlorhydrique HCl, w = 10 %.
HCl
6.1.10 Solution d’hydrogénocarbonate de sodium saturée.
6.1.11 Azoture de sodium pour la stabilisation.
6.2 Enzymes et substances favorisant la digestion
NOTE Voir Annexe A pour les échantillons d’enzymes appropriées et les fournisseurs de ces enzymes.
6.2.1 Mucine porcine.
6.2.2 Pancréatine porcine.
6.2.3 Pepsine.
6.2.4 Trypsine.
6.2.5 Extrait de bile porcine.
6.2.6 Lait entier en poudre à dissolution instantanée, petites portions unitaires, fraîchement ouvertes,
se conservant pendant une semaine au maximum si elles sont placées au réfrigérateur.
6.3 Appareillage
6.3.1 Système d’autotitrage, constitué d’une unité de commande, de burettes automatiques, d’électrodes
de pH (à unique orifice, avec une plage de mesure de pH de 0 à 14, à une température comprise de 30 °C
à 60 °C), et d’une unité de commande et d’évaluation (facultative).
6.3.2 Bain-marie à agitation tangentielle ou circulaire, chauffé, avec divers supports pour les récipients
d’incubation ou un bain chauffant avec agitateur magnétique (T = 37 °C ± 0,5 °C).
6.3.3 Flacons en verre ambré (capacité nominale de 500 ml, avec bouchon à vis perforé d’un trou
permettant d’introduire une électrode de pH si nécessaire et un embout de dosage).
6.3.4 Extracteur de Soxhlet (facultatif).
6.3.5 Distillateur rotatif (de type Ludwig) de 0,5 l, pour les milieux d’extraction de plus faible masse
volumique (facultatif).
6.3.6 Centrifugeuse (7 000 g).
6.3.7 Tamis analytiques pour la préparation des échantillons, en acier inoxydable (taille de maille
de 2 mm). Il convient d’adapter la taille des mailles si de plus petites fractions de sol sont étudiées pour
répondre à d’autres exigences nationales.
6.3.8 Filtre pour filtrer les solutions de phase gastro-intestinale afin d’éliminer les particules
flottantes, d’une taille de maille de 20 µm, pour l’analyse; en acier inoxydable pour les composés organiques
et en plastique pour les substances inorganiques.
6.3.9 Balance analytique, pour peser les matériaux de type sol et les réactifs pour le système d’essai.
6.3.10 Étuve.
7 Système d’essai
7.1 Configuration de l’appareillage
La dissolution des polluants provenant de sols et de matériaux de type sol pollués par des liquides digestifs
artificiels est réalisée dans des conditions physiologiques proches de la réalité, c’est-à-dire à une température
élevée (37 °C), sous agitation continue et à un pH caractéristique des liquides gastrique ou intestinal. L’essai
est réalisé dans des flacons en verre ambré de 500 ml (6.3.3), dans un bain-marie à température contrôlée
−1
avec une fonction d’agitation à une fréquence d’agitation de 200 min ou, en variante, dans un bain-marie
thermostaté (37 °C) placé sur un agitateur magnétique (6.3.2) avec un barreau d’agitation revêtu de
polytétrafluoroéthylène. L’agitation doit être suffisamment forte pour que le sol et les matériaux de type sol
soumis à essai ne puissent pas se déposer et se compacter au fond du récipient lors des essais. Les flacons en
verre ambré (6.3.3) sont fermés à l’aide de bouchons à vis.
Le pH peut être régulé manuellement ou automatiquement.
Si le pH des suspensions d’essai est surveillé à l’aide d’un pH-mètre et qu’il est régulé manuellement,
il convient de le maintenir à une valeur aussi proche que possible des valeurs spécifiées. Il convient que les
fluctuations de pH autour de la valeur spécifiée ne soient pas supérieures à 0,2 unité de pH lors du titrage des
essais après la fin de l’ajustement initial. Les écarts à cet égard doivent être décrits dans le rapport d’essai.
Un certain nombre d’échantillons peuvent être agités simultanément en continu dans des flacons en verre
ambré de 500 ml munis de bouchons à vis dans un bain-marie à agitation à 37 °C à une fréquence d’agitation
−1
de 200 min . Le pH des suspensions d’essai est mesuré et régulé à intervalles courts (de l’ordre des secondes)
à l’aide d’un système d’autotitrage commandé par ordinateur (6.3.1).
Pour des applications particulières, des conditions anaérobies peuvent être créées à l’aide d’un gaz inerte
(par exemple, N ).
7.2 Liquides digestifs artificiels
La composition des liquides digestifs artificiels dans le système d’essai est présentée dans le Tableau 1 et le
Tableau 2. Tous les liquides digestifs contiennent des électrolytes et des composés biochimiques.
Les composés inorganiques sont dissous dans de l’eau (6.1.1) dans des solutions mères séparées pour les
liquides gastrique et intestinal, concentrées d’un facteur compris entre 10 et 1 000 et sont ensuite dilués
pour produire la solution de travail inorganique pertinente. Les composés biochimiques sont ajoutés à ces
solutions sous agitation juste avant leur utilisation.
Le liquide gastrique artificiel contient du NaCl, du KCl, du KH PO , de la pepsine et de la mucine selon les
2 4
concentrations spécifiées dans le Tableau 1 dans 100 ml. Le liquide intestinal artificiel contient du CaCl , du
MgCl , du KCl, du NaHCO , de l’urée, de la bile lyophilisée, de la pancréatine et de la trypsine (voir Tableau 2).
2 3
Les concentrations des enzymes, des substances muqueuses et des autres composés des liquides digestifs
artificiels se situent dans la plage des concentrations moyennes de ces composés dans les liquides digestifs
naturels.
Afin de tenir compte de l’influence des aliments (par exemple, des glucides, des protéines et des lipides)
sur les processus de dissolution des polluants dans le tractus gastro-intestinal, du lait entier en poudre est
ajouté au système d’essai au début de la phase gastrique.
NOTE Le lait entier en poudre sert de substitut aux composés habituels riches en matières grasses et riches en
protéines des aliments et simule principalement l’influence des aliments sur le processus de dissolution des polluants
dans le tube digestif des bébés et des tout-petits. Le lait entier en poudre satisfait en grande partie aux exigences d’un
matériau normalisé et il est commercialisé avec un niveau de qualité suffisamment constant. Toutefois, la durée de
conservation des produits ouverts est limitée.
Du lait entier en poudre est ajouté au liquide gastrique artificiel juste avant le début de l’essai. Le liquide
gastrique artificiel est ajusté à un pH de 2 à l’aide de HCl. 100 g de lait en poudre sont ajoutés par tranche
de 1 000 ml, mis en suspension pendant 20 min sous agitation, laissés à imprégner, puis le pH est à nouveau
ajusté à la valeur de 2. 1 000 ml de liquide gastrique artificiel avec du lait en poudre donne 1 100 ml de
liquide gastrique. L’essai commence avec l’ajout de 110 ml de ce mélange à 2 g d’échantillon.
Tableau 1 — Composition du liquide gastrique artificiel (voir également Annexe A)
Ajout à la solution mère Concentration finale dans le
concentrée d’un facteur de 50 liquide gastrique
Solution mère g/l g/l
NaCl 145 2,9
KCl 35 0,70
KH PO 13,5 0,27
2 4
Enzymes et substances favorisant la digestion
pepsine — 1,0
mucine — 3,0
Tableau 2 — Composition du liquide intestinal artificiel (voir également Annexe A)
Ajout à la solution mère Concentration finale dans
Ingrédient
concentrée d’un facteur de 100 le liquide intestinal
g/l g/l
Solution mère 1
KCl 30 0,30
NaHCO 100 1,0
Solution mère 2
CaCl ⋅ 2 H O 50 0,50
2 2
MgCl ⋅ 6 H O 20 0,20
2 2
Enzymes et substances favorisant la digestion
trypsine — 0,30
urée — 0,30
pancréatine — 9,0
bile, lyophilisée — 9,0
8 Préparation et analyse de l’échantillon
8.1 Préparation de l’échantillon
La préparation de l’échantillon, notamment le séchage du sol ou des matériaux de type sol, est effectuée afin
de déterminer les propriétés physico-chimiques et d’identifier les polluants organiques et inorganiques. La
fraction granulométrique ≤ 2 mm est utilisée pour les études chimiques de matériaux de type sol. Du sol ou
des matériaux de type sol qui ne doivent pas être broyés ou concassés sont généralement utilisés pour l’essai.
NOTE Le choix de la fraction granulométrique ≤ 2 mm repose sur des considérations de probabilité pour l’ingestion
[31]
de particules de sol par les enfants ainsi que sur l’aspect pratique pour la manipulation d’échantillons de sol et de
matériaux de type sol dans des laboratoires de routine. Cependant, il est important que la fraction granulométrique de
référence de la teneur bioaccessible et celle de la teneur totale soient identiques.
Dans le cadre de la préparation de l’essai de bioaccessibilité, les particules d’un diamètre de particule ≤ 2 mm
sont récupérées par tamisage à partir d’au moins 100 g du sol ou du matériau de type sol de départ à l’aide
d’un tamis analytique en acier inoxydable (6.3.7). Si des quantités plus faibles de sol ou de matériaux de
type sol sont disponibles, le laboratoire doit l’indiquer dans le rapport d’essai. Même si un sol grossier ou des
matériaux de type sol grossiers sont soumis à essai dans le système d’essai, ce qui peut être nécessaire si les
fractions polluées sont des particules plus grosses, par exemple, le laboratoire doit l’indiquer dans le rapport
d’essai.
Les échantillons doivent être conservés pendant au moins 6 mois après la fin de tous les essais.
8.2 Mode opératoire de l’essai
8.2.1 L’essai in vitro de bioaccessibilité n’est réalisé que sur de petites quantités de matériaux de type sol
pollués, car il n’y a généralement que de faibles quantités de matériaux de type sol pollués présents dans le
[31]
tractus gastro-intestinal et la quantité de matériau de type sol dans le système d’essai a une incidence
sur le taux de dissolution des polluants liés aux particules. Pour cette raison, il convient généralement de
ne pas introduire plus de 2 g de matériau de type sol pollué pour un volume total de 200 ml de liquides
digestifs (correspondant aux phases gastrique et intestinale). Pour des teneurs en sol ou matériaux de type
sol pollués plus élevées, une diminution du taux de dissolution est possible, en particulier des polluants
organiques, à la suite de l’inactivation des composés des liquides digestifs, par exemple par sorption de ces
composés sur le sol ou les matériaux de type sol.
8.2.2 L’essai est initialement réalisé en duplicat sur deux sous-échantillons.
8.2.3 Mettre en suspension chaque sous-échantillon de 2 g de sol ou de matériaux de type sol pollués
de ≤ 2 mm dans 100 ml de liquide gastrique artificiel et 10 g de lait entier en poudre (ce qui donne un volume
de 110 ml, voir 7.2 relatif à la préparation). Ajuster le pH de la suspension à 2,0 ± 0,05 en utilisant de l’acide
chlorhydrique à 10 %.
8.2.4 Agiter la suspension en continu pendant 2 h à 37 °C. Cette opération peut être effectuée dans un bain-
−1
marie à
...
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