ISO 7218:1996

INTERNATIONAL
IS0
STANDARD 7218
Second edition
1996902- 15
Microbiology of food and animal feeding
stuffs - General rules for microbiological
examinations
Microbiologic des alimen ts -
R&g/es g&&ales pour /es examens
microbiologiques
Reference number
IS0 7218:1996(E)
IS0 7218:1996(E)
Contents
1 Scope . . . . . . . . . . . . . . . . . . .~.~.~.~.~.
2 Normative reference . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 Premises . . . . . . . . . . . . . . . .~.~.~.
3.1 Test areas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*.*.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*.*.
3.2 Additional areas
3.3 Location of the premises . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4 Equipping the premises
3.5 Maintenance and inspection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
...............................................................................................
4 Installations and equipment
.....................................................................................................
4.1 Microbiological cabinets
4.2 Balance .
......................................................................................................................
4.3 Homogenizer
4.4 pH-meter .
...........................................................................................................................
4.5 Autoclave
4.6 Incubator .
4.7 Refrigerator or cold-storage room .
4.8 Freezer .
......................................................................................... 10
4.9 Thermostatically controlled bath
.................................................................................................................
4.10 Sterilizing oven
4.11 Microwave oven .
...........................................................................................................
4.12 Optical microscope
..........................................................................................
4.13 Gas burner or wire incinerator
........................................................................ 12
4.14 Dispenser for culture media and reagents
.............................................................................................................
4.15 Mechanical stirrer
4.16 Colony-counting device .
..............................................................
4.17 Equipment for culture in a modified atmosphere
4.18 Other equipment .
5 Personnel .
.......................................................................................................................
5.1 Competence
5.2 Hygiene .
............................................................................................
6 Preparation of the equipment
........................................................................................................................
6.1 Preparation
6.2 Sterilization .
.........................................................................................................
6.3 Disposable apparatus
....................................................................................... 16
6.4 Management of clean equipment
......................................................................................
6.5 Management of sterile equipment
6.6 Decontamination .
.............................................................................................................................
6.7 Washing
0 IS0 1996
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be
reproduced or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical,
including photocopying and microfilm, without permission in writing from the
publisher.
International Organization for Standardization
CH-1211 Geneve 20 l Switzerland
Case Postale 56 l
Printed in Switzerland
ii
IS0 7218:1996(E)
@ IS0
.......................................... 17
7 Preparation and sterilization of culture media and reagents
7.1 Distilled water .
..............................................................................................
7.2 Preparation of culture media
7.3 Sterilization .
..............................................................................................................................
7.4 Storage
............................................................................................. 19
7.5 Melting of agar culture media
..............................................................................................
7.6 De-aeration of culture media
.................................................................................................
7.7 Preparation of Petri dishes
............................................................................................................
8 Laboratory samples
8.1 Sampling .
8.2 Transport .
8.3 Receipt and storage .
......................................................................................................................
8.4 Test portions
......................................................... 22
9 Examination techniques and expression of results
..................................................................... 22
9.1 Hygienic precautions during the examination
.............................................................. 23
9.2 Preparation of the initial suspension and dilutions
.......................................................................................... 23
9.3 Counting using a solid medium
................................... 29
9.4 Counting using a liquid medium: Most probable number technique
...............................................................................................................
9.5 Detection method
9.6 Basic identification techniques .
Annexes
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .~. 38
A Confidence interval limits for estimated counts
B MPN tables . . . . . . . .~.~.~.
C Bibliography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . .
Ill
IS0 7218:1996(E) @ IS0
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (IS0 member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through IS0 technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take
part in the work. IS0 collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC)
on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member
bodies for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of
the member bodies casting a vote.
International Standard IS0 7218 was prepared by Technical Committee lSO/TC 34, Agricultural
food products, Subcommittee SC 9, Microbiology.
This second edition cancels and replaces the first edition (IS0 7218:1985), which has been
technically revised.
Annexes A and B form an integral part of this International Standard. Annex C is for information
only.
IV
IS0 7218:1996(E)
@ IS0
Introduction
When conducting microbiological examinations, it is especially important
- that only those microorganisms which are present in the samples are isolated or enumerated,
and
- that the microorganisms do not contaminate the environment.
In order to achieve this, it is necessary to pay attention to personal hygiene and to use working
techniques which ensure, as far as possible, exclusion of extraneous contamination
(see clause 5).
Since, in this International Standard, it is possible to give only a few examples of the precautions
to be taken during microbiological examinations, a thorough knowledge of the microbiological
techniques and of the microorganisms involved is essential. It is important that the analyses be
conducted as accurately as possible, including calculation of the number of microorganisms and
the variability of the results (part of this is given by the confidence limits; see clause 9).
Ultimately, it is the responsibility of the head of the laboratory to judge whether the manipulations
are safe and can be considered to be good laboratory practice.
A large number of manipulations can, for example, unintentionally lead to cross-contamination and
the analyst should always verify the accuracy of the results given by his or her technique.
In order to conduct the examinations correctly, it is necessary to take certain precautions when
constructing and equipping the laboratory (see clause 3).
Certain precautions must be taken, not only for reasons of hygiene, but also to ensure good
reproducibility of the results. It is not possible to specify all the precautions to be taken in all
circumstances, but this International Standard at least provides the main measures to be taken
when preparing, sterilizing and storing the media and the equipment (see clauses 6 and 7).
If the guidance given in this International Standard is followed, this will also contribute towards the
protection of the health of the personnel. Additional information on this subject is to be found in the
literature listed in annex C.
V
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INTERNATIONAL STANDARD o IS0 IS0 7218:1996(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs -
General rules for microbiological examinations
1 Scope
This International Standard gives general instructions for carrying out microbiological examinations
in accordance with specific standards.
The purpose of this International Standard is to help to ensure the validity of the examinations, to
ascertain that the general techniques used for conducting these examinations are the same in all
laboratories, to help achieve homogeneous results in different laboratories, and to contribute
towards the protection of the health of the laboratory personnel by preventing risks of infection.
This International Standard may be used wholly or partly for the accreditation of a laboratory by
national organizations.
2 Normative reference
The following standard contains provisions which, through reference in this text, constitute
provisions of this International Standard. At the time of publication, the edition indicated was valid.
All standards are subject to revision, and parties to agreements based on this International
Standard are encouraged to investigate the possibility of applying the most recent editions of the
standards indicated below. Members of IEC and IS0 maintain registers of currently valid
International Standards.
IS0 6887:1983, Microbiology - General guidance for the preparation of dilutions for
microbiological examina tion
3 Premises
3.1 Test areas
The areas required for the specific operation of a microbiology laboratory are as follows:
- receipt, storage, preparation and processing of the samples;
- preparation and sterilization of culture media and equipment;
- performance of analyses: weighing, dilutions, inoculations, subculturing, incubation,
preservation of the strains, etc.;
- decontamination and cleaning of equipment, and processing of the analysis waste.

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3.2 Additional areas
The areas included in this category are, for example:
- entrances, corridors, stairways, goods lifts or lifts;
- administrative areas (e.g. secretarial, offices, documentation rooms, etc.);
- cloakrooms and toilets;
- archive rooms;
- stores.
3.3 Location of the premises
The environment within which the microbiological analyses are carried out shall not affect the
reliability of the analyses.
Care shall be taken to locate the premises so as to avoid risk of cross-contamination Application
of the “no-way-back” principle may help to achieve this aim.
Care shall be taken to ensure protection against extreme conditions such as excess tl emperature,
dust, humidity, steam, noise, vibration, exposure to direct sunlight, etc.
The surface area shall be sufficiently large to keep the work areas clean and orderly. For all test
premises, a work station of approximately 20 m* is recommended for each analyst.
During the course of the tests, care shall be taken to limit access to the test areas to only those
persons required to conduct the tests.
Separate rooms and/or separate areas and/or specific enclosures shall be provided for the
following:
- receipt and storage of samples;
- preparation of samples, particularly in the case of raw materials (e.g. powdered products
containing a high number of microorganisms);
- manipulation of pathogens (e.g. Salmonella, Listeria monocytogenes);
- preparation and sterilization of culture media and equipment;
- cleaning of glassware and of other equipment, as well as the decontamination of equipment
and contaminated culture media;
. - checking the sterility of foodstuffs.
Separation of the following areas should also be considered:
- the areas used for the preparation of culture media, and the room used for sterilization of
culture media and of the equipment; and
- the decontamination area and washing area.
Incubators, refrigerators and freezers can be placed in specific, specially adapted rooms.
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@ IS0
3.4 Equipping the premises
3.4.1 The test premises shall be fitted out in the following ways in order to reduce the risks of
contamination by dust and therefore by microorganisms:
- the walls, ceilings and floors should be smooth, easy to clean, and resistant to detergents and
disinfectants used in laboratories;
- overhead pipes conveying fluids should not cross the premises unless they are hermetically
enclosed;
- solar radiation protection systems shall be installed on the outside of the windows, except in
special cases;
- windows and doors shall be able to be closed hermetically when conducting the tests in order
to minimize draughts; furthermore, they shall be designed so as to avoid the formation of dust
traps and thus facilitate their cleaning.
3.4.2 The ambient temperature and air quality (microorganism content, humidity, dust spreading
rate, etc.) shall be compatible with carrying out the tests. A filter ventilation system for incoming air
is recommended for this purpose.
When tests are to be conducted in a low-contamination atmosphere, the room shall be specially
equipped with a clean air laminar-flow cabinet and/or a safety cabinet.
This equipment shall comply with the relevant regulations.
3.4.3 The laboratory bench tops and furniture shall be manufactured in smooth, impermeable
material, which is easy to clean and disinfect. In order to prevent the accumulation of dust, the
cupboards shall, if possible, reach up to the ceiling.
Laboratory furniture shall be designed so as to facilitate cleaning the floors (e.g. movable
furniture).
Enclosed storage facilities shall be available for storing documents used when manipulating the
samples, culture media, reagents, etc.
NOTE - It is desirable that documents or books which are not frequently used be placed
outside the test areas.
3.4.4 The premises shall be well lit with avoidance of interfering reflections. It is advisable to avoid
as far as possible exposure of the work places and sensitive equipment (incubators in particular)
to direct sunlight.
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IS0 7218: 1996(E)
3.5 Maintenance and inspection
The floors, wails, ceilings, laboratory bench tops and furniture shall be subjected to regular
maintenance and repair in order to avoid cracks where dirt might particularly accumulate and thus
cause a source of contamination.
Regular cleaning and disinfection shall be carried out in order to keep the premises in a condition
suitable for conducting tests.
The ventilation systems and their filters shall be regularly maintained and filters changed when
necessary.
The microbiological quality of surfaces and air shall be monitored regularly.
Surface contamination may be estimated by directly applying to the surface a contact plate
containing suitable neutralizing agents. The air quality may be examined by exposing for 15 min
an open Petri dish containing a non-selective agar culture medium [e.g. plate count agar (PCA)].
NOTE - Other methods can also be used in order to estimate surface and air contamination.
4 Installations and equipment
In general, all installations and equipment shall be kept clean and in proper working condition.
Maintenance operations should be monitored. The monitoring instruments shall be regularly
serviced.
4.1 Microbiological cabinets
4.1 .l Description
A cabinet is a dust-removed work station equipped with horizontal or vertical laminar air-flow. In
microbiology, a safety cabinet is used to retain the microorganisms on filters.
Conventionally, the maximum tolerable number of particles per cubic metre with a size greater
than 0,5 urn represents the dust-spreading class of a safety cabinet. For cabinets used in food
microbiology, the number of particles shall not exceed 4 000 per cubic metre.
Cabinets are of two types:
a) clean-air cabinets, which are intended to protect the product from extraneous contamination,
and to minimize contamination due to the operator;
b) safety cabinets, which are intended to protect the product from extraneous contamination,
and also to protect the operator and the environment.
Safety cabinets should be used for all work involving pathogens.
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@ IS0
4.1.2 Maintenance and inspection
The efficiency of a safety cabinet shall be checked on receipt and thereafter at regular intervals by
a qualified person (a yearly inspection is recommended). In the case of cabinets with prefilters, the
latter shall be changed regularly.
Cabinets should be cleaned and disinfected after use. Periodic verification of any microbial
contamination should be carried out by a check of the working surface and walls of the cabinet.
.
‘A periodic verification of the proportion of microorganisms present shall be carried out using the
usual equipment. For example, expose several open Petri dishes containing a non-selective agar
culture medium (e.g. PCA) in each cabinet for 30 min. Other methods can also be used.
4.2 Balance
4.2.1 Use
A food microbiology laboratory shall be equipped with balances of the required range and
accuracy for the different products to be weighed. In general, two degrees of accuracy are
required: 5 0,Ol g and rf: 0,OOOl g.
These balances are mainly used for weighing the test portion of the sample to be analysed and
the components of the culture media and reagents. They may also possibly be used for carrying
out measurements of dilution fluid volumes by weight.
4.2.2 Maintenance and inspection
The balance shall be placed on a stable horizontal support and shall be protected from vibrations.
It shall be checked regularly by calibration with working standards (preferably each working day).
At least once a year, its entire range shall be monitored by a qualified person.
The balance pan shall be cleaned, if necessary, after each use and at least once a day. The
mechanism shall be cleaned and checked by a qualified service engineer at least once a year.
4.3 Homogenizer
4.3.1 Description
This equipment is used to prepare the initial suspension from the test sample of non-liquid
products.
The following apparatus may be used:
- a peristaltic homogenizer with sterile plastic bags, possibly with a device for adjusting velocity
and time; or
IS0 7218:1996(E) @ IS0
- a rotary homogenizer, the rotational speed of which is between 8 000 r/min and 45 000 dmin
inclusive, with sterilizable glass or metal bowls equipped with covers.
In certain special cases, the homogenization can be carried out with sterilizable glass beads
having an appropriate diameter (approximately 6 mm; see specific standards).
4.3.2 Use
The usual operating time of a peristaltic homogenizer is 1 min to 2 min. This type of apparatus
shall not be used for certain foodstuffs, such as
- products which risk puncturing the bag (presence of sharp, hard or dry particles), or
- products which are difficult to homogenize because of their texture (e.g. salami-type sausage).
The rotary homogenizer shall operate for a duration such that the number of revolutions is
between 15 000 and 20 000 inclusive. Even with the slowest homogenizer, this time shall not
exceed 23 min.
Glass beads can be used for the preparation, by shaking, of the initial suspensions of certain
viscous or thick products, in particular certain dairy products (see specific standards).
4.3.3 Maintenance and inspection
and maintained in accordance with the rnanufacfurers’
The different appliances shall be inspecte
instructions.
4.4 pH-meter
4.4.1 Description
A pH-meter is used to measure the potential difference, at a determined temperature, between a
measuring electrode and a reference one, both electrodes being introduced into the product. It
shall be capable of measuring to an accuracy of + 0,l pH units and its minimum measuring
threshold shall be 0,Ol pH units. The pH-meter shall be equipped with either manual or automatic
temperature equalization.
NOTE - The measuring electrode and the reference electrode are usually grouped together
in a combined electrode system.
4.4.2 Use
-A pH-meter is used to measure the pH of each batch of culture media and reagents (7.2) to check
if adjustment is needed. It may also be used to measure and/or adjust the pH of the test sample or
of the initial suspension. Use of a pH-meter will be discussed in the standard specific to the
product to be analysed, in which the conditions for the determination of the pH, for the adjustment
of the pH, as well as the method of cleaning and of decontamination of the electrodes will be
specified.
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@ IS0
4.4.3 Maintenance and inspection
The pH-meter shall be calibrated, in accordance with the manufacturer ’s instructions, using at
least two standard buffer solutions, at least daily before use. The standard solutions have pH
values which are known to be within the second decimal at the measurement temperature (in
general, pH 4,00 and pH 7,00 at 20 “C). They shall encompass the measured pH values.
The electrodes shall be checked and maintained in accordance with the manufacturer ’s
instructions. It is necessary, in particular, to monitor regularly:
- the condition of the electrodes with respect to ageing and soiling;
- the response time and stability.
Prior to each use, check that the measuring bulb of the electrodes is completely immersed in
distilled water or any other liquid, as recommended by the manufacturer; otherwise, immerse it
24 h prior to conducting any measurements.
Clean the electrodes after each use. In order to take into account the soiling and ageing of the
electrodes, regularly clean them more thoroughly in accordance with the manufacturer ’s
instructions.
Store the electrodes in accordance with the manufacturer ’s instructions.
4.5 Autoclave
4.5.1 Description
An autoclave is an appliance which enables a saturated steam temperature of at least 121 “C to
be attained with a view to the destruction of microorganisms.
4.5.2 Use
During the same sterilization cycle, the autoclave shall not be used to sterilize clean equipment
(and/or culture media) and also to decontaminate used equipment (and/or used culture media). It
is preferable to use separate autoclaves for these two processes.
The autoclave shall be equipped with:
- at least one safety valve;
- a pressure gauge;
- a drain cock;
- a regulation device allowing the temperature to be maintained to within Ifr 1 “C of the
scheduled value;
- a thermometer or a recording thermocouple.
It should preferably also be equipped with a duration indicator or a programmer/timer.
@ IS0
IS0 7218: 1996(E)
With steam sterilization all air must be expelled prior to the pressure build-up. If the autoclave is
not fitted with an automatic evacuation device, it is necessary to remove the air until a continuous
jet of steam is emitted.
4.5.3 Maintenance and inspection
The autoclave shall be kept in perfect operating condition and shall be regularly inspected by the
competent departments in accordance with the manufacturer ’s instructions.
All the monitoring instruments shall be kept in perfect working order and shall be verified regularly.
Descaling, if necessary, and draining operations shall be carried out regularly.
4.6 Incubator
4.6.1 Description
An incubator consists of a chamber which enables a temperature to be kept stable and evenly
distributed to within + 1 “C, unless otherwise stated.
4.6.2 Use
Incubators shall be equipped with a regulation system which allows the temperature to be kept
even and stable over their entire working volume.
If the ambient temperature is close to or higher than that of the incubator, it is necessary to fit a
cooling system to the chamber.
Incubators walls should be protected from direct sunlight.
If possible, incubators should not be completely filled in one single operation because the culture
media will take a long time to equilibrate to temperature, whatever type of incubator is used
(forced-air convection or otherwise).
When loading incubators, attention should be paid to air circulation; under no circumstances shall
Petri dishes or tubes be placed within 25 mm of the inside walls of the incubator. Stacks shall not
be of more than six Petri dishes and shall be separated by at least 25 mm.
4.6.3 Maintenance and inspection
The homogeneous temperature within the working volume shall be checked using several
thermometers or thermocouples.
The measurement accuracy should be four times better than the requested accuracy (e.g. for a
requested accuracy of + 2 “C, the measurement accuracy should be & 0,5 “C).
The temperature stability shall be checked, for example, with one or more maximum and minimum
thermometers.
The incubator temperature shall be checked at least every working day. For this purpose, each
incubator shall incorporate at least one thermometer, whose bulb is immersed in glycerol
contained in a sealed bottle. Other checking systems of equivalent performance can be used.
@ IS0 IS0 7218:1996(E)
The inner and outer walls of the incubator shall be regularly cleaned and disinfected and, if
appropriate, dust shall be removed from the ventilation system.
4.7 Refrigerator or cold-storage room
4.7.1 Description
These are chambers which allow cold storage to be guaranteed. The temperature, unless
*
otherwise specified, shall be + 3 “C + 2 OC except for the conservation of analysis samples where
the temperature shall be + 2 OC & 2 “C.
4.7.2 Use
Different chambers shall be available for the storage of:
- non-inoculated culture media and reagents;
- samples for analysis;
- microorganism strains and incubated media.
The refrigerators and cold-storage rooms shall be loaded in such a way that appropriate air
circulation is maintained.
4.7.3 Maintenance and inspection
The temperature of each chamber shall be checked each working day using a thermometer or a
permanently installed probe. (See 4.6.3 for the accuracy of the apparatus).
The following maintenance operations shall be carried out regularly:
- removal of dust from the blades or from the external heat-exchange plates;
- defrosting;
- cleaning and disinfection of the inside of the chambers.
4.8 Freezer
4.8.1 Description
A freezer has chambers which allow frozen storage to be guaranteed. The temperature, unless
otherwise specified, shall be below -18 “C, preferably equal to -24 “C + 2 “C.
4.8.2 Use
Different chambers shall be available for the storage of:
- some non-inoculated culture media and reagents;
- samples for analysis;
IS0 7218:1996(E) @ IS0
- microorganism strains.
The freezer shall be loaded in such a way that a sufficiently low temperature is maintained, in
particular when unfrozen products are introduced.
4.8.3 Maintenance and inspection
The temperature of each chamber shall be checked each working day using a thermometer or a
permanently installed probe. (See 4.6.3 for the accuracy of the apparatus.)
The following maintenance operations shall be carried out regularly:
- removal of dust from the blades and from the external heat-exchange plates;
- defrosting;
- cleaning and disinfection of the inside of the chambers.
4.9 Thermostatically controlled bath
4.9.1 Description
This is a bath which allows a specified temperature to be maintained. Unless otherwise stated, the
accuracy shall be & 0,5 “C. The working temperatures are stipulated in each method of
application.
4.9.2 Use
The main uses are the following:
- maintenance of sterile molten agar media at 47 OC + 2 “C;
- incubation of inoculated culture media at a constant temperature;
- preparation of initial solutions at a controlled temperature (e.g. preparation of the initial
suspensions of caseinates requires the latter to be maintained for 15 min in the bath at 37 OC) ;
- heat treatment of initial suspensions at a controlled temperature (e.g. counting of spores can
require the destruction of vegetative cells).
For precise temperature control, the thermostatically controlled bath shall be equipped with a
circulating water pump and an automatic heating-regulation system. The agitation of the liquid
shall not cause dispersal of droplets.
4.9.3 Maintenance and inspection
Each bath shall be equipped with a thermometer or a thermocouple independent of the automatic
regulation system.
The bath temperature shall be checked each time it is used, preferably daily.
The level of the liquid in the bath (water, ethylene glycol, etc.) shall be checked regularly.
@ IS0 IS0 7218:1996(E)
In order to avoid any microbial proliferation, the liquid shall be changed frequently.
4.10 Sterilizing oven
4.10.1 Description
A sterilizing oven is a chamber which allows a temperature of 170 OC to 180 “C to be attained for
the destruction of microorganisms by dry heat.
4.10.2 Use
Only metal or glass equipment is sterilized in the sterilizing oven. When the correct temperature is
reached, the sterilizing operation shall last at least 1 h.
WARNING - Volumetric glassware shall not be sterilized in a sterilizing oven.
The temperature shall be evenly distributed within the chamber.
The oven shall be equipped with:
- a thermostat;
- a thermometer or a recording thermocouple.
It should preferably also be equipped with a duration indicator or a programmer/timer.
4.10.3 Maintenance and inspection
Check that the temperature is homogeneous over the working volume.
The oven shall be kept in perfect operating condition and the monitoring instruments shall be
verified regularly.
Regular cleaning is recommended.
4.11 Microwave oven
4.11 .l Description
This is an apparatus which allows a product to be heated using microwaves.
4.11.2 Use
In the present state of the art, only one use is possible: melting of the agar culture media.
The apparatus used operates at atmospheric pressure. It shall be able to heat the culture media in
a controlled manner via a microwave emission cycle. The distribution of the microwaves shall be
homogeneous within the product so as to avoid zones of overheating. For a better heat
distribution, apparatus equipped with a turntable should be used.
IS0 7218:1996(E) @ IS0
WARNING - Handle with care ! Heating up agar culture media in a microwave oven can
cause delay in boiling.
NOTE - In the absence of sufficient assessment of the efficiency of microwaves for
sterilizing culture media, this use cannot be yet included in this International Standard.
4.12 Optical microscope
4.12.1 Use
An optical microscope contains objectives with different magnifications. Using a high-
magnification objective with oil immersion allows observation of the morphology of the micro-
organism in its aqueous suspension or after staining. The microscope should preferably be fitted
with a phase-contrast objective and substage condenser to improve the examination of live
cultures.
NOTE - Instruments (plate microscopes) with low-power magnification and ideally
stereoscopic focusing are available for the examination of colonies of bacteria on or in agar
culture media.
4.12.2 Maintenance and inspection
After use involving immersion, the lens shall be cleaned, in such a way as not to affect the optical
quality, in order to remove the product used for immersion.
At least once a year, an authorized member of the personnel shall carry out a general cleaning
operation, checking the mechanism and optics.
4.13 Gas burner or wire incinerator
A gas burner is used for creating and maintaining a protection zone around a hot spot. It is used
for sterilizing metal wires and loops, by bringing them up to red heat.
The wire incinerator is preferable when sterilizing metal wires or loops after manipulating
pathogenic bacteria.
4.14 Dispenser for culture media and reagents
4.14.1 Description
This is an instrument or apparatus used to distribute culture media and reagents into tubes, bottles
or Petri dishes (e.g. measuring cylinder, manual syringe, automatic syringe, peristaltic pump or
machine with automated delivery).
4.14.2 Use
In the case of the aseptic distribution of sterile culture media and reagents, all parts of the
instrument or apparatus in contact with the product to be dispensed shall be sterile (see 6.2).
IS0 7218:1996(E)
@ IS0
The accuracy of the instrument or apparatus shall be appropriate to the accuracy of the volume to
be dispensed. In particular, the accuracy required for the volumes of dilution fluid used for
conducting the decimal dilutions is + 2 %.
4.14.3 Maintenance and inspection
These instruments shall be kept in perfect condition in accordance with the manufacturer ’s
instructions.
The volumes delivered shall be monitored regularly.
4.15 Mechanical stirrer
This allows the homogeneous mixing of diverse liquid media (e.g. decimal dilutions and samples of
liquid for testing) or a suspension of bacterial cells in a liquid.
Its principle is based on an eccentric rotational movement of the contents of test tubes (vortex).
4.16 Colony-counting device
This should preferably be equipped with a lighting system with a dark background, a magnifying
glass having a magnification of at least xl ,5, and a mechanical or electronic digital counter. Any
other automated counting systems of equivalent efficiency may be used (for example a laser
counter).
4.17 Equipment for culture in a modified atmosphere
4.17.1 Description
This is a jar that can be hermetically sealed or any other appropriate apparatus which enables
modified atmospheric conditions (e.g. anaerobiosis) to be maintained for the total incubation time
of the culture medium. Other systems of equivalent performance, for example anaerobic
chambers, may be used. Follow the manufacturer ’s instructions for installation and maintenance.
4.17.2 Use *
The composition of the atmosphere obtained by a gas mixture (e.g. from a gas cylinder) or by any
other appropriate means (such as commercially available gas packs) will be stipulated in the
specific International Standard.
4.17.3 Maintenance and inspection
An indicator for monitoring the nature of the atmosphere shall be placed in each chamber during
each use.
If a catalyst is fitted, this shall be regularly regenerated according to the manufacturer ’s
instructions.
IS0 7218: 1996(E) @ IS0
This equipment shall be regularly cleaned and disinfected.
4.18 Other equipment
Other equipment and apparatus are in everyday use, including the following: filtration apparatus,
glass or plastic containers {test tubes, flasks, bottles), glass or plastic Petri dishes, (most
commonly between 90 mm and 100 mm in diameter), glass or plastic pipettes (10 ml, 2 ml, 1 ml),
sampling instruments, wires and loops (of nickel/chromium, platinum/iridium or disposable plastic,
etc . ) .
5 Personnel
5.1 Competence
All personnel working in a microbiology laboratory shall have received adequate training to enable
them to conduct properly the operations entrusted to them.
The personnel in charge of performing the tests shall have a good knowledge of and sufficient
practical experience with microbiological techniques and the microorganisms sought. They shall
be able to interpret the accuracy and precision required to yield acceptable results. For that
purpose, they can, for example, take part in ring tests, use reference materials, or achieve self-
assessment tests for enumeration of microorganisms (see, in particular, relevant IDF publications).
All personnel shall receive relevant updated information, as necessary, in hygiene and laboratory
safety matters.
5.2 Hygiene
In the field of personal hygiene, the following precautions shall be taken in order to avoid
contaminating the samples and culture media, but also in order to avoid risk of infection of
personnel:
- wear laboratory clothing that is light-coloured, clean and in good condition, manufactured from
a fabric which limits the risks of flammability; this clothing shall not be worn outside the work
areas and, possibly, cloakrooms;
- wear protection for the hair and beard, if necessary;
- keep nails perfectly clean and well-groomed, and preferably short;
- wash hands thoroughly in lukewarm water, preferably delivered by a non-manual commanding
tap, using liquid or powder soap or, possibly, disinfectant, delivered preferably by a dispenser
maintained in a correct state of cleanliness, before and after microbiological examinations and
immediately after visiting the toilets; for drying hands, use single-use paper or single-use cloth
- towels;
- when inoculating, avoid speaking, coughing, etc.;
a
- do not smoke, drink or eat in the test areas;
- special precautions shall be taken by persons having infections (whitlow) or illnesses where
germs are likely to contaminate samples and may invalidate results;
@ IS0 IS0 7218:1996(E)
- do not put food for personal consumption in the laboratory refrigerators.
6 Preparation of the equipment
6.1 Preparation
The equipment used in microbiology shall be prepared in such a manner as to guarantee its
cleanliness and/or sterility up until the time of use.
The equipment used shall be washed prior to use, even if new.
Stopper tubes and cap bottles prior to sterilization by appropriate means (combed cotton, metal,
plastic stoppers, etc.).
Stopper the pipettes with combed cotton or any other appropriate material.
If necessary, the equipment to be sterilized should be placed in special containers or wrapped in
an appropriate material (special paper, aluminium, etc.). Equipment to be autoclaved empty
(i.e. without media or other aqueous solutions) should allow free access of steam, otherwise
sterilization will not be achieved.
6.2 Sterilization
6.2.1 Sterilization by dry heat
Heat in a sterilizing oven (4.10) for at least 1 h at 170 “C to 180 “C.
6.2.2 Sterilization by moist heat
Heat for at least 15 min at a minimum of 121 “C in an autoclave (4.5), preferably equipped with a
vacuum drying device. Temperature indicators can be used in order to make certain that the
temperature has been achieved (e.g. special papers).
6.3 Disposable apparatus
Disposable apparatus may be used in the same way as the re-usable glassware (Petri dishes,
pipettes, bottles, tubes, etc.) if the specifications are similar.
It is then advisable to make certain, by asking the manufacturer, that the proposed equipment is
indeed suitable for use in microbiology (in particular sterility) and that the material contains no
substances that inhibit the growth of microorganisms.
Disposable apparatus shall be decontaminated prior to its disposal. Besides the methods
described in 6.6, incineration may be used. If there is an incinerator on the premises,
decontamination and di
...

IS0
NORME
INTERNATIONALE
Deuxième édition
1 996-02- 1 5
Microbiologie des aliments - Règles
générales pour les examens
microbiologiques
Microbiology of food and animal feeding stuffs - General rules for
microbiologica I examinations
Numéro de référence
IS0 7218:1996(F)
IS0 721 8: 1 996( F)
Sommaire
1 Domaine d'application . 1
2 Référence normative . 1
3 Locaux . 1
3.1 Locaux d'essais . 1
3.2 Locaux annexes . 2
3.3 Implantation des locaux . 2
3.4 Aménagement des locaux . 3
3.5 Entretien et contrôle . 4
4 Matériels et équipement . 4
4.1 Hottes microbiologiques . -4
4.2 Balance . 5
4.3 Appareil pour l'homogénéisation . -6
4.4 pH-mètre . 7
4.5 Autoclave . 8
4.6 Etuve . 9
4.7 Réfrigérateur. chambre froide . 10
4.8 Congélateur . 10
4.9 Bain thermostaté . 11
4.10 Four à stériliser . 12
4.11 Four à micro-ondes . 13
4.1 2 Microscope optique . 13
4.1 3 Brûleur à gaz. incinérateur fil . 13
4.1 4 Répartiteur de milieux de culture et de réactifs . 14
4.1 5 Agitateur mécanique . 14
4.1 6 Dispositif de comptage des colonies . 14
4.1 7 Matériel pour culture en atmosphère modifiée . 15
4.1 8 Autres matériels . 15
5 Personnel . 15
5.1 Competence . 15
5.2 Hygiène . 16
6 Preparation du materiel . 16
6.1 Préparation . 16
6.2 Stérilisation . 17
6.3 Matériel à usage unique . 17
6.4 Gestion du matériel propre . 17
6.5 Gestion du matériel stérile . 17
6.6 Décontamination . 18
6.7 Lavage . 18
O IS0 1996
Droits de reproduction réservés . Sauf prescription différente. aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par
aucun procédé. électronique ou mécanique. y compris la photocopie et les
microfilms. sans l'accord écrit de l'éditeur .
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 CH-121 1 Genève 20 Suisse
Imprimé en Suisse
ii
IS0 721 8: 1 996( F)
@ IS0
7 Préparation et stérilisation des milieux de culture et des réactifs . 19
7.1 Eau distillée . 19
7.2 Préparation des milieux de culture . 19
7.3 Stérilisation . 20
7.4 Consewation . 21
7.5 Fusion des milieux de culture gélosés . 22
7.6 Désaération des milieux de culture . 22
7.7 Préparation et conservation des boîtes de Petri . 22
8 Échantillons pour laboratoire . 23
8.1 Echantillonnage . 23
8.2 Transport . 23
8.3 Réception et stockage . 23
8.4 Prises d'essai . 24
8.5 Conservation et destruction des échantillons pour laboratoire . 25
9 Techniques d'examen et expression des résultats . 25
9.1 Précautions hygiéniques pendant l'examen . 25
9.2 Préparation de la suspension mère et des dilutions . 26
9.3 Dénombrement par utilisation d'un milieu solide . 27
9.4 Dénombrement par utilisation d'un milieu liquide : Technique du nombre le plus
probable (NPP) . 32
9.5 Méthode de recherche . 35
9.6 Techniques de base d'identification . 36
Annexes
A Limites de l'intervalle de confiance pour l'estimation des petits nombres . 42
B Tables NPP . 44
C Bibliographie . 46
iii
IS0 721 8: 1996( F) @ IS0
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de IIISO). L'élaboration des Normes internationales
est en général confiée aux comités techniques de I'ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations
internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec I'ISO participent
également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux
comités membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert
l'approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
La Norme internationale IS0 7218 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits
agricoles alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (IS0 7218:1985), dont elle
constitue une révision technique.
Les annexes A et B font partie intégrante de la présente Norme internationale. L'annexe C est
donnée uniquement à titre d'information.
iv
0 IS0 IS0 721 8: 1 996( F)
I nt rod uct ion
Lorsque des examens microbiologiques sont effectués, il est spécialement important:
- d'isoler ou de dénombrer seulement les microorganismes présents dans les échantillons, et
- que les microorganismes ne contaminent pas l'environnement.
Pour cela, il faut veiller à l'hygiène personnelle et utiliser des techniques de travail qui assurent
autant que possible l'absence de contamination étrangère (voir article 5).
Puisqu'il n'est possible de donner dans la présente Norme internationale que quelques exemples
des précautions à prendre pendant les examens microbiologiques, la connaissance approfondie
des techniques microbiologiques et des microorganismes en question est essentielle. II faut donc
que les analyses soient conduites avec la plus grande rigueur possible, de même que le calcul du
nombre de microorganismes, et qu'il soit tenu compte de la variabilité des résultats (dont une
partie est donnée par les limites de confiance; voir article 9).
a
C'est finalement au responsable du laboratoire de juger si les manipulations sont sûres et peuvent
être considérées comme étant de bonnes pratiques de laboratoire.
De nombreuses manipulations peuvent par exemple entraîner involontairement des
contaminations croisées et il convient que l'analyste vérifie toujours la précision des résultats
donnés par sa technique.
Afin d'exécuter les examens de façon correcte, il est nécessaire de prendre certaines précautions
lors de la construction et de l'installation du laboratoire (voir article 3).
Certaines précautions sont à prendre, non seulement pour des raisons hygiéniques, mais
également pour assurer une bonne reproductibilité des résultats. II n'est pas possible de spécifier
toutes les précautions à prendre selon les circonstances, mais la présente Norme internationale
décrit au moins les dispositions principales à prendre en compte lors de la préparation, la
stérilisation et la conservation des milieux et du matériel (voir articles 6 et 7).
Si les indications contenues dans la présente Norme internationale sont suivies, cela contribuera
également à la protection de la santé du personnel. De plus amples informations à ce sujet seront
trouvées dans la littérature mentionnée en annexe C.
V
NORME INTERNATIONALE O IS0
IS0 721 8:1996(F)
Microbiologie des aliments - Règles generales pour les
examens microbiologiques
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale donne des règles générales pour la réalisation d'examens
microbiologiques effectués selon des normes spécifiques.
Le but de la présente Norme internationale est d'aider à garantir la validité des examens, à
s'assurer que les techniques générales utilisées pour effectuer ces examens sont les mêmes dans
tous les laboratoires, à participer ainsi à homogénéiser les résultats obtenus dans différents
0 laboratoires et à contribuer à la protection de la santé du personnel de laboratoire, en évitant les
risques d'infection.
La présente Norme internationale peut être utilisée dans son ensemble ou partiellement pour les
accréditations de laboratoire par les organismes nationaux.
2 Référence normative
La norme suivante contient des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la
publication, les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les
parties prenantes des accords fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à
rechercher la possibilité d'appliquer les éditions les plus récentes des normes indiquées ci-après.
Les membres de la CE1 et de I'ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur à
un moment donné.
IS0 6887: 1 983 Microbiologie - Directives générales pour la préparation des dilutions en vue de
O
l'examen microbiologique.
3 Locaux
3.1 Locaux d'essais
L'ensemble des locaux permettant de réaliser les diverses manipulations inhérentes à un
laboratoire de microbiologie sont:
- la réception, le stockage, la préparation et le traitement des échantillons;
- la préparation et la stérilisation des milieux de culture et du matériel;
- la réalisation des analyses: pesées, dilutions, ensemencements, repiquage, incubation,
conservation des souches, etc.;
IS0 7218:1996(F)
- la décontamination et le nettoyage des matériels d'analyse, ainsi que le traitement des
déchets d'analyse.
3.2 Locaux annexes
Sont considérés dans cette catégorie, par exemple, les locaux suivants:
- les accès, couloirs, escaliers, monte-charges ou ascenseurs;
- les locaux administratifs (secrétariat, bureaux, salles de documentation, etc.);
- les vestiaires et les sanitaires;
- les salles d'archives;
- les magasins.
3.3 Implantation des locaux
L'environnement dans lequel les analyses microbiolsgiques sont effectuées ne doit pas affecter
leur fiabilité.
Les locaux doivent être implantés de faSon à éviter les risques de contamination croisée.
L'application du principe de la ((marche en avant» peut aider à l'obtention d'un tel résultat.
Une protection contre les conditions extrêmes telles que l'excès de température, de poussière,
d'humidité, de vapeur, de bruit, de vibration, d'exposition aux rayonnements solaires, etc. doit être
assurée.
La surface doit être suffisante pour maintenir les zones de travail propres et en ordre. Il est
/
recommandé de compter environ 20 m* par analyste pour l'ensemble des locaux d'essais.
Au cours des essais, l'accès aux locaux d'essais doit être limité aux seules personnes nécessaires
O I
I
à la réalisation de ces derniers.
I
Des salles indépendantes et/ou des zones séparées et/ou des enceintes spécifiques doivent être
prévues pour:
I
l
- la réception et le stockage des échantillons;
I
I
- la préparation des échantillons, en particulier dans le cas des matières premières (par
exemple les produits en poudre contenant un nombre élevé de microorganismes);
- la manipulation des germes pathogènes (par exemple Salmonella, Listeria monocyfogenes);
- la préparation et la stérilisation des milieux de culture et du matériel;
- le nettoyage de la verrerie et des autres matériels ainsi que la décontamination du matériel et
des milieux de culture contaminés;
0 IS0 IS0 721 8:1996(F)
- le contrôle de la stérilité des produits alimentaires.
II convient d'envisager également la séparation des locaux suivants:
- les locaux de préparation des milieux de culture et le local de stérilisation des milieux de
culture et du matériel; et
- la zone de décontamination et la zone de lavage.
Les étuves, réfrigérateurs et congélateurs peuvent être placés dans des locaux spécifiques et
spécialement adaptés.
3.4 Aménagement des locaux
3.4.1 Les locaux d'essais doivent être amen gés de fagon à réduire les risques de contamination
par la poussière et donc par les microorganismes:
O
- les murs, plafonds et sols devraient être lisses, faciles à nettoyer, résistants aux produits
détergents et aux désinfectants utilisés au laboratoire;
- à moins d'être hermétiquement enfermées, les conduites de fluides ne devraient pas traverser
les locaux en hauteur;
- des systèmes de protection contre les rayonnements solaires doivent être installés à
l'extérieur des fenêtres sauf cas exceptionnel;
- les fenêtres et les portes doivent pouvoir être fermées de fagon hermétique lors des essais
afin de minimiser tout courant d'air; d'autre part, leur conception doit permettre d'éviter les nids
à poussière et de faciliter ainsi leur nettoyage.
3.4.2 La température ambiante et la qualité de l'air (teneur en microorganismes, hygrométrie, taux
d'empoussièrement, etc.) doivent être compatibles avec la réalisation des essais. Dans ce but, il
est recommandé d'installer un système de ventilation à filtre pour l'air aspiré.
O
Si des essais doivent être réalisés en atmosphère très peu contaminée, le local doit être
spécialement équipé d'une hotte à flux d'air laminaire, horizontal ou vertical et/ou d'une hotte de
sécurité.
Cet équipement doit respecter la réglementation en vigueur.
3.4.3 Les paillasses et les mobiliers de laboratoire doivent être constitués de matériaux lisses,
imperméables, faciles à nettoyer et à désinfecter. Afin d'éviter l'accumulation de poussière, les
armoires doivent, si possible, atteindre le plafond.
Les mobiliers de laboratoire doivent être conGus pour faciliter le nettoyage des sols (par exemple
meubles mobiles).
Des meubles fermés doivent être mis à disposition pour le rangement des documents utilisés lors
des manipulations des échantillons, des milieux de culture, des réactifs, etc.
IS0 721 8: 1 996( F) 0 IS0
NOTE - II est souhaitable que les documents ou livres qui ne sont pas fréquemment utilisés
soient placés à l'extérieur des locaux d'essais.
3.4.4 Les locaux doivent être bien éclairés en évitant la création de reflets gênants. II convient
d'éviter au maximum l'exposition directe au soleil des espaces de travail et du matériel sensible
(étuves en particulier).
3.5 Entretien et contrôle
Les sols, murs, plafonds, paillasses et mobiliers de laboratoire doivent être régulièrement
entretenus afin d'éviter l'apparition de défauts de continuité qui créent des zones d'encrassement
privilégiées et sont donc sources de contamination.
Un nettoyage et une désinfection doivent être effectués régulièrement afin de maintenir les locaux
dans un état compatible avec la réalisation des essais.
Les systèmes de ventilation et leurs filtres doivent être régulièrement entretenus et les filtres
changés autant que nécessaire.
La qualité microbiologique des surfaces et de l'air doit être régulièrement vérifiée et maîtrisée.
La contamination des surfaces peut être estimée par l'application directe d'un milieu de culture
gélosé contenant des agents neutralisants appropriés. La qualité de l'air peut être examinée par
exposition pendant 15 min d'une boÎte de Petri ouverte contenant un milieu de cuiture gélosé non
sélectif [par exemple "plate count agar'' (PCA)].
NOTE - D'autres méthodes peuvent également être utilisées pour estimer la contamination
des surfaces et de l'air.
4 Matériels et équipement
De façon générale, tous les matériels et équipement doivent être maintenus propres et en bon état
de fonctionnement. II convient d'assurer un suivi des opérations de maintenance. Les instruments
de mesure doivent être vérifiés régulièrement.
4.1 Hottes microbiologiques
4.1 .I Description
Une hotte est un poste de travail dépoussiéré à écoulement d'air laminaire horizontal ou vertical.
En microbiologie, une hotte de sécurité est utilisée pour retenir les microorganismes sur des filtres.
Conventionnellement, le nombre maximal tolérable de particules de dimension supérieure à
0,5 pm par mètre cube représente la classe d'empoussièrement d'une hotte de sécurité. Pour les
hottes utilisées en microbiologie alimentaire, le nombre de particules ne doit pas dépasser 4 O00
par mètres cubes.
@ IS0 IS0 721 8: 1 996( F)
Les hottes sont de deux types:
a) hottes à flux laminaire, qui ont pour but de protéger le produit des contaminations extérieures
et de minimiser les contaminations dues à l'opérateur;
b) hottes de sécurité, qui ont pour but de protéger le produit des contaminations extérieures et
également de protéger l'opérateur et l'environnement.
II convient d'utiliser les hottes de sécurité pour tout travail présentant un risque pathogène.
4.1.2 Entretien et contrôle
L'efficacité d'une hotte de sécurité doit être contrôlée lors de sa réception et à intervalles réguliers
par une personne habilitée (une fréquence annuelle est recommandée). Dans le cas des hottes
avec préfiltres, ceux-ci doivent être changés régulièrement.
II y a lieu de nettoyer et de désinfecter les hottes après utilisation. II convient de réaliser des
vérifications périodiques des contaminations microbiennes par des contrôles de la surface de la
zone de travail et des parois.
Une vérification périodique du taux de microorganismes présents doit être effectuée en utilisant
t'équipement habituel. Par exemple en exposant plusieurs boîtes de Petri ouvertes contenant un
milieu gélosé non sélectif (par exemple PCA) pendant 30 min sous chaque hotte. D'autres
méthodes peuvent également être utilisées.
4.2 Balance
4.2.1 Utilisation
Un laboratoire de microbiologie alimentaire doit être équipé de balances adaptées en portée et en
précision aux différents produits à peser. Deux sensibilités sont en général nécessaires: +_ 0,Ol g
et+0,0001 g.
O
Ces balances sont principalement utilisées pour la pesée de la prise d'essai de l'échantillon à
analyser et celle des composants des milieux de culture et des réactifs. Elles servent
éventuellement à effectuer des mesurages pondéraux de volume de diluant.
4.2.2 Entretien et contrôle
La balance doit être posée sur un support horizontal stable, à l'abri des vibrations.
Elle doit être vérifiée régulièrement avec des masses étalons de travail (de préférence chaque jour
d'utilisation). Elle doit être vérifiée sur l'ensemble de sa portée par une personne habilitée au
moins une fois par an.
Le plateau de la balance doit être nettoyé, si nécessaire, après chaque utilisation et au moins une
fois par jour. Un nettoyage et un contrôle du mécanisme doivent être effectués par une personne
habilitée au moins une fois par an.
IS0 721 8:1996(F) @ IS0
4.3 Appareil pour l'homogénéisation
4.3.1 Description
Cet appareil est utilisé pour préparer la suspension mère à partir de l'échantillon pour essai des
produits autres que les produits liquides.
L'un ou l'autre des appareils suivants peut être utilisé:
- homogénéisateur de type péristaltique avec des sacs stériles en plastique et comportant
éventuellement un variateur de vitesse et un minuteur;
- homogénéisateur de type rotatif, dont la vitesse de rotation est comprise entre 8 O00 tr/min et
45 O00 tr/min, avec des bols en verre ou en métal stérilisables et munis de couvercles.
Dans certains cas particuliers, l'homogénéisation peut être réalisée avec des billes de verre
stérilisables de diamètre approprié (environ 6 mm; voir normes spécifiques).
4.3.2 Utilisation
La durée habituelle de fonctionnement d'un homogénéisateur péristaltique est de 1 min à 2 min.
Ce type d'appareil ne doit pas être utilisé pour certains produits alimentaires, tels que:
- les produits risquant d'entraîner des perforations du sac (présence de particules pointues,
dures ou sèches); ou
- les produits difficiles à homogénéiser de part leur texture (par exemple saucisson sec).
L'homogénéisateur rotatif doit fonctionner pendant une durée telle que le nombre total de tours
soit compris entre 15 O00 et 20 000. Même avec I'homogénéisateur le plus lent, cette durée ne
doit pas excéder 2,5 min.
Les billes de verre peuvent être utilisées pour la préparation, par agitation, des suspensions mères
de certains produits visqueux ou épais, notamment certains produits laitiers (voir normes
spécifiques).
4.3.3 Entretien et contrôle
Ces différents appareils doivent être contrôlés et entretenus selon les instructions du fabricant.
I 0 IS0 IS0 721 8: 1 996( F)
4.4 pH-mètre
4.4.1 Description
Le pH-mètre est utilisé pour mesurer la différence de potentiel, à une température déterminée,
entre une électrode de mesure et une électrode de référence, toutes deux étant introduites dans le
produit. II doit être capable de réaliser des mesures à &0,1 unité pH près, et son seuil minimal de
mesure doit être de 0,Ol unité pH. Le pH-mètre doit être équipé d'un système de compensation de
température soit manuel soit automatique.
NOTE - L'électrode de mesure et l'électrode de référence sont généralement réunies en un
système d'électrodes com bi nées.
4.4.2 Utilisation
i
I
Le pH-mètre sert à mesurer le pH de chaque fabrication de milieu de culture et de réactif (7.2)
pour vérifier si un ajustement du pH est nécessaire. II peut également servir à mesurer eüou à
ajuster le pH de l'échantillon pour essai ou de la suspension mère. L'utilisation d'un pH-mètre est
mentionnée dans la norme spécifique du produit à analyser qui précisera les conditions de la
détermination du pH, de l'ajustement du pH ainsi que la méthode de nettoyage et de
décontamination des électrodes.
4.4.3 Entretien et contrôle
Le pH-mètre doit être étalonné, selon les instructions du fabricant, avec au moins deux solutions
tampons étalons, au moins chaque jour avant l'utilisation. Les solutions étalons ont des valeurs de
pH connues, à la seconde décimale près, à la température du mesurage (en général, pH 4,OO et
pH 7,OO à 20 OC). Elles doivent encadrer les valeurs de pH mesurés.
Les électrodes doivent être vérifiées et entretenues selon les instructions du fabricant. II est
nécessaire, en particulier, de surveiller régulièrement:
- le vieillissement et l'encrassement des électrodes;
O
- le temps de réponse et la stabilité.
Avant chaque utilisation, vérifier que le bulbe de mesure des électrodes trempe entièrement dans
l'eau distillée ou tout autre liquide, selon les instructions du fabricant; sinon, le faire tremper 24 h
avant d'effectuer tout mesurage.
Nettoyer les électrodes après chaque utilisation. Pour tenir compte de l'encrassement et du
vieillissement des électrodes, procéder à un nettoyage périodique plus soigneux, selon les
instructions du fabricant.
Conserver les électrodes selon les instructions du fabricant.
IS0 721 8:1996(F)
0 IS0
4.5 Autoclave
4.5.1 Description
Un autoclave est appareil permettant d'obtenir une vapeur saturée à une température minimale de
121 OC, en vue de détruire les microorganismes.
4.5.2 Utilisation
Lors du même cycle de stérilisation, l'autoclave ne doit pas être utilisé pour stériliser un matériel
propre (et/ou un milieu de culture) et pour décontaminer un matériel déjà utilisé (euou un milieu de
culture déjà utilisé). II est préférable d'utiliser des autoclaves séparés pour réaliser ces deux
opérations.
L'autoclave doit être muni :
- d'au moins une soupape de sécur té;
- d'un manomètre;
- d'un robinet de purge;
- d'un dispositif de régulation permettant le maintien de la température à k 1 OC de la valeur
prévue;
- d'un thermomètre ou d'un thermomètre enregistreur.
II est également préférable de munir l'autoclave d'un indicateur de durée ou d'un
programmeur-minuteur.
La stérilisation à la vapeur comporte l'obligation d'expulser tout l'air avant la montée en pression.
Si l'autoclave n'est pas muni d'un dispositif d'évacuation automatique, il est nécessaire de le
purger de son air jusqu'à émission d'un jet continu de vapeur.
4.5.3 Entretien et contrôle
L'autoclave doit être maintenu en parfait état de fonctionnement et doit être régulièrement contrôl6
par les services compétents selon les instructions du fabricant.
Tous les instruments de contrôle doivent être maintenus en parfait état et doivent être
régulièrement vérifiés.
Les opérations de détartrage, si besoin est, et de vidange doivent être régulièrement effectuées.
0 IS0 IS0 721 8: 1 996( F)
4.6 Étuve
4.6.1 Description
Une étuve est une enceinte permettant de maintenir une température stable et uniforme à k 1 OC
près, sauf spécification contraire.
4.6.2 Utilisation
Les étuves doivent être équipées d'un système de régulation permettant de maintenir une
température uniforme et stable dans l'ensemble de leur volume utile.
Si la température ambiante est proche ou supérieure à la température de l'étuve, il est nécessaire
de munir l'enceinte d'un système de refroidissement.
II convient de protéger les parois de l'étuve de la lumière solaire directe.
II est recommandé de ne pas remplir complètement l'étuve en une seule opération car le temps
d'équilibrage de la température dans le milieu de culture gélosé sera très long, quel que soit le
type d'étuve utilisé (convection d'air forcé ou autre).
Lors du chargement des étuves, il y a lieu de veiller à faciliter la circulation d'air; en aucun cas les
boîtes de Petri ou les tubes ne doivent être placés à moins de 25 mm des parois internes de
l'étuve. Les piles, d'au maximum 6 boîtes, doivent être espacées d'au moins 25 mm les unes des
autres.
4.6.3 Entretien et contrôle
L'homogénéité de la température à l'intérieur du volume utile doit être contrôlée à l'aide de
plusieurs thermomètres ou sondes.
II convient que la précision de mesure soit quatre fois meilleure que la précision demandée (par
exemple pour une précision demandée de -f: 2 OC, la précision devrait être de k 0,5 OC).
La stabilité de la température doit être contrôlée, par exemple avec un ou plusieurs thermomètres
O
à min ima-maxima.
La température de l'étuve doit être contrôlée au moins tous les jours d'utilisation. Dans ce but,
chaque étuve doit contenir au moins un thermomètre dont le réservoir est immergé dans du
glycérol placé dans un flacon fermé. D'autres systèmes de vérification d'efficacité équivalente
peuvent également être utilisés.
Les parois internes et externes doivent être nettoyées et désinfectées régulièrement et, s'il y a
lieu, le système de ventilation doit être dépoussiéré.
IS0 721 8: 1 996( F) @ IS0
4.7 Réfrigérateur, chambre froide
4.7.1 Description
Un réfrigérateur et une chambre froide sont des enceintes permettant de garantir une
conservation en froid positif. La température, sauf spécification contraire, doit être de
+ 3 OC It 2 OC sauf pour la conservation des échantillons pour analyse, où la température doit être
de + 2 OC It 2 OC.
4.7.2 Utilisation
II est nécessaire de disposer d'enceintes différentes pour la conservation:
- des milieux de culture non ensemencés et des réactifs;
- des échantillons pour analyse;
- des souches de microorganismes et des milieux incubés.
Les réfrigérateurs et chambres froides doivent être chargés en veillant à maintenir une circulation
d'air appropriée.
4.7.3 Entretien et contrôle
La température de chacune des enceintes doit ê,;e vérifiée chaque jour de travail à l'aide d'un
thermomètre ou d'une sonde placée à demeure. (Voir 4.6.3 pour la précision de l'appareil.)
Les opérations d'entretien suivantes doivent être régulièrement effectuées:
- dépoussiérage des ailettes ou des plaques d'échange thermique externes;
- dégivrage;
- nettoyage et désinfection de l'intérieur des enceintes.
4.8 Congélateur
4.8.1 Description
Un congélateur est une enceinte permettant de garantir une conservation en froid négatif. La
température, sauf spécification contraire, doit être inférieure à - 18 OC, de préférence égale à
- 24 OC k 2 OC.
4.8.2 Utilisation
II est nécessaire de disposer d'enceintes différentes pour la conservation:
- de certains milieux de culture non ensemencés et des réactifs;
@ IS0 IS0 721 8: 1 996( F)
- des échantillons pour analyse;
- des souches de microorganismes.
Le congélateur doit être chargé en veillant à maintenir une température suffisamment basse et ce,
particulièrement lorsque sont introduits des produits non congelés.
4.8.3 Entretien et contrôle
La température de chacune des enceintes doit être vérifiée chaque jour de travail à l'aide d'un
thermomètre ou d'une sonde placée à demeure.(Voir 4.6.3 pour la précision de l'appareil.)
Les opérations d'entretien suivantes doivent être régulièrement effectuées:
- dépoussiérage des ailettes ou des plaques d'échange thermique externes;
- dégivrage;
O
- nettoyage et désinfection de l'intérieur des enceintes.
4.9 Bain thermostaté
4.9.1 Description
Un bain thermostaté est un bain permettant de maintenir de façon stable une température
spécifiée. La précision, sauf spécification contraire, doit être de f 0,5 OC. Les températures
d'utilisation sont précisées dans chaque méthode d'application.
4.9.2 Utilisation
Les principales utilisations sont:
O - le maintien en surfusion des milieux gélosés à 47 OC +_ 2 OC;
- l'incubation de milieux de culture ensemencés à une température constante;
- la préparation de suspensions mères à une température maintenue constante (par exemple la
préparation des suspensions mères de caséinates nécessite leur maintien pendant 15 min
dans un bain d'eau à 37 OC);
- le traitement thermique de suspensions mères à une température maintenue constante (par
exemple le dénombrement des spores peut nécessiter la destruction des cellules végétatives).
Pour un réglage précis de la température, le bain thermostaté doit être équipé d'une pompe à
circulation d'eau et d'un système de réglage automatique du chauffage. L'agitation du liquide ne
doit pas provoquer la projection de gouttes.
IS0 721 8:1996(F) @ IS0
4.9.3 Entretien et contrôle
Chaque bain doit être muni d'un thermomètre ou d'une sonde indépendant du système de
régulation (voir 4.6.3 pour la précision de l'appareil).
La température du bain doit être contrôlée lors de chaque utilisation et, de préférence, une fois par
jour.
Le niveau du liquide du bain (eau, éthylène glycol, etc.) doit être régulièrement contrôlé.
Pour éviter toute prolifération microbienne, le liquide doit être changé fréquemment.
4.10 Four a steriliser
4.1 0.1 Description
Un four à stériliser est une enceinte permettant d'atteindre une température de 170 OC à 180 OC,
en vue de détruire les microorganismes par chaleur sèche.
4.1 0.2 Utilisation
Seuls les matériels métalliques ou en verre sont stérilisés au four à stériliser. La durée de
stérilisation est d'au moins 1 h lorsque la température correcte est atteinte.
AVERTISSEMENT - Aucune verrerie graduée ne doit être st6rilisée dans un four a steriliser.
La répartition de la température dans l'enceinte doit être homogène.
Le four doit être muni:
- d'un dispositif de régulation (thermostat);
- d'un thermomètre ou d'un thermomètre enregistreur.
II est également préférable que le four soit muni d'un indicateur de durée ou d'un programr ieur-
minuteur.
4.1 0.3 Entretien et contrôle
L'homogénéité de la température à l'intérieur du volume utile doit être contrôlée.
Le four doit être maintenu en parfait état de fonctionnement et les instruments de contrôle doivent
être vérifiés régulièrement.
Un nettoyage régulier est recommandé.
@ IS0 IS0 721 8:1996(F)
a micro-ondes
4.11 Four
4.1 1 .I Description
Un four à micro-ondes est un appareil permettant de chauffer un produit par l'utilisation de micro-
ondes.
4.1 1.2 Utilisation
En l'état actuel de nos connaissances, seule l'utilisation pour la fusion des milieux de culture
gélosés est possible.
L'appareil utilisé fonctionne sous pression atmosphérique. II doit pouvoir chauffer les milieux de
culture de façon contrôlée par un cycle d'émissions micro-ondes. La répartition des micro-ondes
doit être homogène à l'intérieur du produit afin d'éviter les points de surchauffe. Pour une
meitleure distribution de la chaleur, il convient de munir l'appareil d'un plateau tournant.
ATTENTION - Manipuler avec soin ! Le chauffage des milieux de culture géloses dans un
O
four a micro-ondes peut entraîner un retard d'ébullition.
NOTE - En l'absence de démonstration suffisante de l'efficacité des micro-ondes pour la
stérilisation des milieux de culture, cette utilisation ne peut actuellement pas être prévue
dans le cadre de la présente Norme internationale.
4.1 2 Microscope optique
4.1 2.1 Utilisation
Un microscope optique présente des objectifs à différents grossissements. À fort grossissement et
à l'immersion, il permet d'observer la morphologie des microorganismes en suspension aqueuse
ou après coloration. II est préférable que le microscope soit équipé d'un dispositif à contraste de
phase pour améliorer les observations à l'état frais.
NOTE - Des appareils (microscopes a lame) à faible grossissement et idéalement
stéréoscopiques sont disponibles pour l'examen des colonies de bactéries sur ou dans les
milieux de culture gélosés.
4.1 2.2 Entretien et contrôle
Après utilisation à l'immersion, l'objectif doit être nettoyé de manière à ne pas altérer la qualité de
l'optique et afin d'éliminer le produit utilisé pour l'immersion.
Au moins une fois par an, le microscope doit subir un nettoyage général, un contrôle du
mécanisme et de l'optique par une personne habilitée.
4.13 Brûleur a gaz, incinérateur a fil
Un brûleur à gaz est utilisé pour créer et maintenir une zone de protection autour d'un point chaud.
Il sert à stériliser les fils et les anses en métal, en les portant A incandescence.
IS0 7218:1996(F) @ IS0
II est préférable d'utiliser l'incinérateur à fil pour la stérilisation des fils et des anses en métal après
la manipulation des bactéries pathogènes.
4.14 Répartiteur de milieux de culture et de réactifs
4.14.1 Description
C'est un instrument ou appareil permettant de répartir les milieux de culture et réactifs dans les
tubes, flacons ou boîtes de Petri (par exemple éprouvette graduée, seringue manuelle, seringue
automatique, pompe péristaltique ou distributeur automatique de milieux).
4.1 4.2 Utilisation
Dans le cas de répartition aseptique de milieux de culture et de réactifs stériles, toutes les parties
de l'instrument ou de l'appareil en contact avec le produit à répartir doivent être stériles (voir 6.2).
O
La précision de l'instrument ou de l'appareil doit être adaptée à la précision du volume à répartir.
En particulier, la précision demandée sur les volumes de diluants utilisés pour effectuer les
dilutions décimales est de f 2 %.
4.14.3 Entretien et contrôle
Ces instruments et appareils doivent être maintenus en parfait état, selon les instructions du
fabricant .
Les volumes délivrés doivent être régulièrement contrôlés.
4.1 5 Agitateur mécanique
Un agitateur mécanique permet de mélanger de faSon homogène divers milieux liquides (par
exemple les dilutions décimales et les échantillons pour essai liquides) ou mettre en suspension
des cellules bactériennes dans un liquide.
Son principe est fondé sur un mouvement de rotation excentrée du contenu des tubes à essai
(vortex).
4.16 Dispositif de comptage des colonies
II est préférable que l'appareil soit muni d'un système d'éclairage avec fond noir, d'une loupe de
x 1,5 et d'un compteur numérique mécanique ou électronique. Tout autre
grossissement minimal
système de comptage automatisé d'efficacité équivalente peut être utilisé (par exemple compteur
laser).
I
0 IS0 IS0 721 8:1996( F)
4.1 7 Matériel pour culture en atmosphère modifiée
4.1 7.1 Description
C'est une jarre à fermeture étanche ou tout autre appareillage approprié permettant d'obtenir et de
maintenir des conditions d'atmosphère modifiée (par exemple anaérobiose) pendant toute la
durée de l'incubation du milieu de culture. D'autres systèmes de performance équivalente, par
exemple chambres anaérobies, peuvent être utilisés. Les instructions du fabricant doivent être
suivies pour l'installation et la maintenance.
4.1 7.2 Utilisation
La composition de l'atmosphère obtenue par un mélange gazeux (par exemple d'une bouteille de
gaz) ou par tout autre moyen approprié (par exemple des systèmes gazeux disponibles dans le
commerce) sera précisée dans la Norme internationale spécifique.
O
4.1 7.3 Entretien et contrôle
Un indicateur de contrôle de la nature de l'atmosphère doit être placé dans chaque enceinte
pendant chaque utilisation.
Quand un système catalytique est employé, il doit être régénéré selon les instructions du
fa brican t.
Un nettoyage et une désinfection de ce matériel doivent être effectués régulièrement.
4.1 8 Autres materiels
D'autres matériels et équipement sont d'utilisation courante, dont les suivants: appareils de
filtration, récipients (tubes à essais, flacons, bouteilles, etc.) en verre ou en matière plastique,
boîtes de Petri'en verre ou en matière plastique (les plus courants ayant entre 90 mm à 100 mm
de diamètre), pipettes en verre ou en matière plastique (de 10 ml, 2 ml, 1 ml, etc.), instruments
pour prélèvement d'échantillon, fils et anses (en nickekhrome, en platine iridié ou en matière
O
plastique à usage unique, etc.).
5 Personnel
5.1 Competence
Tout personnel intervenant dans un laboratoire de microbiologie doit avoir reGu la formation
indispensable à la bonne réalisation des opérations qui lui sont confiées.
Le personnel chargé de la réalisation des essais doit avoir une bonne connaissance et une
pratique suffisante des techniques microbiologiques et des microorganismes recherchés. II doit
également pouvoir interpréter les notions de précision et de fidélité requises pour obtenir des
résultats acceptables. Pour cela, il pourra, par exemple, participer à des essais circulaires, utiliser
des matériaux de référence, ou effectuer des essais d'auto-évaluation pour le dénombrement des
microorganismes (se référer en particulier aux travaux de la FIL).
IS0 7218:1996(F) @ IS0
L'ensemble du personnel doit recevoir une information continue et adaptée en matière d'hygiène
et de sécurité.
5.2 Hygiene
Dans le domaine de l'hygiène personnelle, les précautions suivantes doivent être prises pour
éviter la contamination des échantillons et des milieux de culture, mais égaiement pour éviter des
risques d'infection du personnel:
- porter des vêtements de laboratoire de couleur claire, propres et en bon état, réalisés dans un
tissu limitant les risques d'inflammabilité; ces vêtements ne doivent
...

NORME
INTERNATIONALE
Deuxième édition
1996-OZ- 15
Microbiologie des aliments - Règles
générales pour les examens
microbiologiques
Microbiology of food and animal feeding stuffs - General rules for
microbiological examina fions
Numéro de référence
ISO 7218: 1996(F)
Sommaire
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 Domaine d’application
. . . . . . . . . .L.
2 Référence normative
.................................................................................................................................
3 Locaux
..................................................................................................................
3.1 Locaux d’essais
................................................................................................................. 2
3.2 Locaux annexes
...................................................................................................... 2
3.3 Implantation des locaux
.................................................................................................. 3
3.4 Aménagement des locaux
3.5 Entretien et contrôle .
.....................................................................................................
4 Matériels et équipement
.....................................................................................................
4.1 Hottes microbiologiques
..............................................................................................................................
4.2 Balance
........................................................................................ 6
4.3 Appareil pour l’homogénéisation
............................................................................................................................
4.4 pH-mètre
4.5 Autoclave .
4.6 Étuve .
............................................................................................
4.7 Réfrigérateur, chambre froide
.......................................................................................................................
4.8 Congélateur
................................................................................................................
4.9 Bain thermostaté
................................................................................................................
4.10 Four à stériliser
.......................................................................................................... 13
4.11 Four à micro-ondes
.......................................................................................................... 13
4.12 Microscope optique
......................................................................................... 13
4.13 Brûleur à gaz, incinérateur à fil
................................................................ 14
4.14 Répartiteur de milieux de culture et de réactifs
4.15 Agitateur mécanique .
................................................................................
4.16 Dispositif de comptage des colonies
.................................................................
4.17 Matériel pour culture en atmosphère modifiée
...............................................................................................................
4.18 Autres matériels
............................................................................................................................. 15
5 Personnel
.......................................................................................................................
5.1 Compétence
5.2 Hygiène .
6 Préparation du matériel .
........................................................................................................................
6.1 Préparation
........................................................................................................................
6.2 Stérilisation
.....................................................................................................
6.3 Matériel à usage unique
.................................................................................................
6.4 Gestion du matériel propre
6.5 Gestion du matériel stérile .
6.6 Décontamination .
6.7 Lavage .
0 ISO 1996
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par
aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les
microfilms, sans l’accord écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
ISO 72183 996(F)
@ ISO
.................................. 19
7 Préparation et stérilisation des milieux de culture et des réactifs
.......................................................................................................................
7.1 Eau distillée
.....................................................................................
7.2 Préparation des milieux de culture
........................................................................................................................
7.3 Stérilisation
......................................................................................................................
7.4 Conservation
................................................................................
7.5 Fusion des milieux de culture gélosés
....................................................................................
7.6 Désaération des milieux de culture
.................................................................
7.7 Préparation et conservation des boîtes de Petri
............................................................................................
8 Échantillons pour laboratoire
8.1 Échantillonnage .
...........................................................................................................................
8.2 Transport
.......................................................................................................
8.3 Réception et stockage
.....................................................................................................................
8.4 Prises d’essai
........................................... 25
8.5 Conservation et destruction des échantillons pour laboratoire
.......................................................... 25
9 Techniques d’examen et expression des résultats
.......................................................................
9.1 Précautions hygiéniques pendant l’examen
...........................................................
9.2 Préparation de la suspension mère et des dilutions
................................................................
9.3 Dénombrement par utilisation d’un milieu solide
9.4 Dénombrement par utilisation d’un milieu liquide : Technique du nombre le plus
probable (NPP) .
.......................................................................................................
9.5 Méthode de recherche
...................................................................................
9.6 Techniques de base d’identification
Annexes
A Limites de l’intervalle de confiance pour l’estimation des petits nombres . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
B Tables NPP
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .~.
C Bibliographie
. . .
III
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales
est en général confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations
internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec I’ISO participent
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique
également aux travaux.
internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux
comités membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert
l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
La Norme internationale ISO 7218 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Pro&&
agricoles alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 7218:1985), dont elle
constitue une révision technique.
Les annexes A et B font partie intégrante de la présente Norme internationale. L’annexe C est
donnée uniquement à titre d’information.
iv
ISO 7218: 1996(F)
0 ISO
Introduction
Lorsque des examens microbiologiques sont effectués, il est spécialement important:
- d’isoler ou de dénombrer seulement les microorganismes présents dans les échantillons, et
- que les microorganismes ne contaminent pas l’environnement.
Pour cela, il faut veiller à l’hygiène personnelle et utiliser des techniques de travail qui assurent
autant que possible l’absence de contamination étrangère (voir article 5).
Puisqu’il n’est possible de donner dans la présente Norme internationale que quelques exemples
des précautions à prendre pendant les examens microbiologiques, la connaissance approfondie
des techniques microbiologiques et des microorganismes en question est essentielle. II faut donc
que les analyses soient conduites avec la plus grande rigueur possible, de même que le calcul du
nombre de microorganismes, et qu’il soit tenu compte de la variabilité des résultats (dont une
partie est donnée par les limites de confiance; voir article 9).
C’est finalement au responsable du laboratoire de juger si les manipulations sont sûres et peuvent
être considérées comme étant de bonnes pratiques de laboratoire.
De nombreuses manipulations peuvent par exemple entraîner involontairement des
contaminations croisées et il convient que l’analyste vérifie toujours la précision des résultats
donnés par sa technique.
Afin d’exécuter les examens de façon correcte, il est nécessaire de prendre certaines précautions
lors de la construction et de l’installation du laboratoire (voir article 3).
Certaines précautions sont à prendre, non seulement pour des raisons hygiéniques, mais
également pour assurer une bonne reproductibilité des résultats. II n’est pas possible de spécifier
toutes les précautions à prendre selon les circonstances, mais la présente Norme internationale
décrit au moins les dispositions principales à prendre en compte lors de la préparation, la
stérilisation et la conservation des milieux et du matériel (voir articles 6 et 7).
Si les indications contenues dans la présente Norme internationale sont suivies, cela contribuera
également à la protection de la santé du personnel. De plus amples informations à ce sujet seront
trouvées dans la littérature mentionnée en annexe C.

Page blanche
NORME INTERNATIONALE o ISO
Microbiologie des aliments - Règles générales pour les
examens microbiologiques
Domaine d’application
La présente Norme internationale donne des règles générales pour la réalisation d’examens
microbiologiques effectués selon des normes spécifiques.
Le but de la présente Norme internationale est d’aider à garantir la validité des examens, à
s’assurer que les techniques générales utilisées pour effectuer ces examens sont les mêmes dans
tous les laboratoires, à participer ainsi à homogénéiser les résultats obtenus dans différents
laboratoires et à contribuer à la protection de la santé du personnel de laboratoire, en évitant les
risques d’infection.
La présente Norme internationale peut être utilisée dans son ensemble ou partiellement pour les
accréditations de laboratoire par les organismes nationaux.
2 Référence normative
La norme suivante contient des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente Norme internationale. Au moment de la
publication, les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les
parties prenantes des accords fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à
rechercher la possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes des normes indiquées ci-après.
Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur à
un moment donné.
ISO 6887:1983 Microbiologie - Directives générales pour la préparation des dilutions en vue de
l’examen microbiologique.
3 Locaux
3.1 Locaux d’essais
L’ensemble des locaux permettant de réaliser les diverses manipulations inhérentes à un
laboratoire de microbiologie sont:
- la réception, le stockage, la préparation et le traitement des échantillons;
- la préparation et la stérilisation des milieux de culture et du matériel;
- la réalisation des analyses: pesées, dilutions, ensemencements, repiquage, incubation,
conservation des souches, etc.;

ISO 7218: 1996(F) @ ISO
- la decontamination et le nettoyage des matériels d’analyse, ainsi que le traitement des
déchets d’analyse.
3.2 Locaux annexes
Sont considérés dans cette catégorie, par exemple, les locaux suivants:
- les accès, couloirs, escaliers, monte-charges ou ascenseurs;
- les locaux administratifs (secrétariat, bureaux, salles de documentation, etc.);
- les vestiaires et les sanitaires;
- les salles d’archives;
- les magasins.
3.3 Implantation des locaux
L’environnement dans lequel les analyses microbiologiques sont effectuées ne doit pas affecter
leur fiabilité.
Les locaux doivent être implantés de facon à éviter les risques de contamination croisée.
L’application du principe de la < peut aider à l’obtention d’un tel résultat.
Une protection contre les conditions extrêmes telles que l’excès de température, de poussière,
d’humidité, de vapeur, de bruit, de vibration, d’exposition aux rayonnements solaires, etc. doit être
assurée.
La surface doit être suffisante pour maintenir les zones de travail propres et en ordre. II est
recommandé de compter environ 20 m* par analyste pour l’ensemble des locaux d’essais.
Au cours des essais, l’accès aux locaux d’essais doit être limité aux seules personnes nécessaires
à la réalisation de ces derniers.
Des salles indépendantes et/ou des zones séparées et/ou des enceintes spécifiques doivent être
prévues pour:
- la réception et le stockage des échantillons;
- la préparation des échantillons, en particulier dans le cas des matières premières (par
exemple les produits en poudre contenant un nombre élevé de microorganismes);
- la manipulation des germes pathogènes (par exemple Salmonella, Listeria monocytogenes);
- la préparation et la stérilisation des milieux de culture et du matériel;
- le nettoyage de la verrerie et des autres matériels ainsi que la décontamination du matériel et
des milieux de culture contaminés;
@ ISO ISO 7218: 1996(F)
- le contrôle de la stérilité des produits alimentaires.
Il convient d’envisaaer éaalement la séparation des locaux suivants:
w v
- les locaux de préparation des mi I ieux de culture e t le local de stérilisation des milieux de
culture et du matériel; et
- la zone de décontamination et la zone de lavage.
Les étuves, réfrigérateurs et congélateurs peuvent être placés dans des locaux spécifiques et
spécialement adaptés.
3.4 Aménagement des locaux
3.4.1 Les locaux d’essais doivent être aménagés de façon à réduire les risques de contamination
par la poussière et donc par les microorganismes:
- les murs, plafonds et sols devraient être lisses, faciles à nettoyer, résistants aux produits
détergents et aux désinfectants utilisés au laboratoire;
- à moins d’être hermétiquement enfermées, les conduites de fluides ne devraient pas traverser
les locaux en hauteur;
- des systèmes de protection contre les rayonnements solaires doivent être installés à
l’extérieur des fenêtres sauf cas exceptionnel;
- les fenêtres et les portes doivent pouvoir être fermées de facon hermétique lors des essais
afin de minimiser tout courant d’air; d’autre part, leur conception doit permettre d’éviter les nids
à poussière et de faciliter ainsi leur nettoyage.
3.4.2 La température ambiante et la qualité de l’air (teneur en microorganismes, hygrométrie, taux
d’empoussièrement, etc.) doivent être compatibles avec la réalisation des essais. Dans ce but, il
est recommandé d’installer un système de ventilation à filtre pour l’air aspiré.
Si des essais doivent être réalisés en atmosphère très peu contaminée, le local doit être
spécialement équipé d’une hotte à flux d’air laminaire, horizontal ou vertical et/ou d’une hotte de
sécurité.
Cet équipement doit respecter la réglementation en vigueur.
3.4.3 Les paillasses et les mobiliers de laboratoire doivent être constitués de matériaux lisses,
imperméables, faciles à nettoyer et à désinfecter. Afin d’éviter l’accumulation de poussière, les
armoires doivent, si possible, atteindre le plafond.
Les mobiliers de laboratoire doivent être conçus pour faciliter le nettoyage des sols (par exemple
meubles mobiles).
Des meubles fermés doivent être mis à disposition pour le rangement des documents utilisés lors
des manipulations des échantillons, des milieux de culture, des réactifs, etc.

NOTE - II est souhaitable que les documents ou livres qui ne sont pas fréquemment utilisés
soient placés à l’extérieur des locaux d’essais.
3.4.4 Les locaux doivent être bien éclairés en évitant la création de reflets gênants. Il convient
d’éviter au maximum l’exposition directe au soleil des espaces de travail et du matériel sensible
(étuves en particulier).
3.5 Entretien et contrôle
Les sols, murs, plafonds, paillasses et mobiliers de laboratoire doivent être régulièrement
entretenus afin d’éviter l’apparition de défauts de continuité qui créent des zones d’encrassement
privilégiées et sont donc sources de contamination.
Un nettoyage et une désinfection doivent être effectués régulièrement afin de maintenir les locaux
dans un état compatible avec la réalisation des essais.
Les systèmes de ventilation et leurs filtres doivent être régulièrement entretenus et les filtres
changés autant que nécessaire.
La qualité microbiologique des surfaces et de l’air doit être régulièrement vérifiée et maîtrisée.
La contamination des surfaces peut être estimée par l’application directe d’un milieu de culture
gélosé contenant des agents neutralisants appropriés. La qualité de l’air peut être examinée par
exposition pendant 15 min d’une boîte de Petri ouverte contenant un milieu de culture gélosé non
sélectif [par exemple “plate Count agar” (PCA)].
NOTE - D’autres méthodes peuvent également être utilisées pour estimer la contamination
des surfaces et de l’air.
4 Matériels et équipement
De facon générale, tous les matériels et équipement doivent être maintenus propres et en bon état
de fonctionnement. II convient d’assurer un suivi des opérations de maintenance. Les instruments
de mesure doivent être vérifiés régulièrement.
4.1 Hottes microbiologiques
4.1 .l Description
Une hotte est un poste de travail dépoussiéré à écoulement d’air laminaire horizontal ou vertical.
En microbiologie, une hotte de sécurité est utilisée pour retenir les microorganismes sur des filtres.
Conventionnellement, le nombre maximal tolérable de particules de dimension supérieure à
0,s prn par mètre cube représente la classe d’empoussièrement d’une hotte de sécurité. Pour les
hottes utilisées en microbiologie alimentaire, le nombre de particules ne doit pas dépasser 4 000
par mètres cubes.
ISO 7218: 1996(F)
OISO
Les hottes sont de deux types:
a) hottes à flux laminaire, qui ont pour but de protéger le produit des contaminations extérieures
et de minimiser les contaminations dues à l’opérateur;
b) hottes de sécurité, qui ont pour but de protéger le produit des contaminations extérieures et
également de protéger l’opérateur et l’environnement.
II convient d’utiliser les hottes de sécurité pour tout travail présentant un risque pathogène.
4.1.2 Entretien et contrôle
L’efficacité d’une hotte de sécurité doit être contrôlée lors de sa réception et à intervalles réguliers
par une personne habilitée (une fréquence annuelle est recommandée). Dans le cas des hottes
avec préfiltres, ceux-ci doivent être changés régulièrement.
II y a lieu de nettoyer et de désinfecter les hottes après utilisation. II convient de réaliser des
vérifications périodiques des contaminations microbiennes par des contrôles de la surface de la
zone de travail et des parois.
Une vérification périodique du taux de microorganismes présents doit être effectuée en utilisant
l’équipement habituel. Par exemple en exposant plusieurs boîtes de Petri ouvertes contenant un
milieu gélosé non sélectif (par exemple PCA) pendant 30 min sous chaque hotte. D’autres
méthodes peuvent également être utilisées.
4.2 Balance
4.2.1 Utilisation
Un laboratoire de microbiologie alimentaire doit être équipé de balances adaptées en portée et en
précision aux différents produits à peser. Deux sensibilités sont en général nécessaires: + 0,Ol g
et k 0,OOOl g.
Ces balances sont principalement utilisées pour la pesée de la prise d’essai de l’échantillon à
analyser et celle des composants des milieux de culture et des réactifs. Elles servent
éventuellement à effectuer des mesurages pondéraux de volume de diluant.
4.2.2 Entretien et contrôle
La balance doit être posée sur un support horizontal stable, à l’abri des vibrations.
Elle doit être vérifiée régulièrement avec des masses étalons de travail (de préférence chaque jour
d’utilisation). Elle doit être vérifiée sur l’ensemble de sa portée par une personne habilitée au
moins une fois par an.
Le plateau de la balance doit être nettoyé, si nécessaire, après chaque utilisation et au moins une
fois par jour. Un nettoyage et un contrôle du mécanisme doivent être effectués par une personne
habilitée au moins une fois par an.

4.3 Appareil pour l’homogénéisation
4.3.1 Description
Cet appareil est utilisé pour préparer la suspension mère à partir de l’échantillon pour essai des
produits autres que les produits liquides.
L’un ou l’autre des appareils suivants peut être utilisé:
- homogénéisateur de type péristaltique avec des sacs stériles en plastique et comportant
éventuellement un variateur de vitesse et un minuteur;
- homogénéisateur de type rotatif, dont la vitesse de rotation est comprise entre 8 000 tr/min et
45 000 tr/min, avec des bols en verre ou en métal stérilisables et munis de couvercles.
Dans certains cas particuliers, l’homogénéisation peut être réalisée avec des billes de verre
stérilisables de diamètre approprié (environ 6 mm; voir normes spécifiques).
4.3.2 Utilisation
La durée habituelle de fonctionnement d’un homogénéisateur péristaltique est de 1 min à 2 min.
Ce type d’appareil ne doit pas être utilisé pour certains produits alimentaires, tels que:
- les produits risquant d’entraîner des perforations du sac (présence de particules pointues,
dures ou sèches); ou
- les produits difficiles à homogénéiser de part leur texture (par exemple saucisson sec).
L’homogénéisateur rotatif doit fonctionner pendant une durée telle que le nombre total de tours
soit compris entre 15 000 et 20 000. Même avec I’homogénéisateur le plus lent, cette durée ne
doit pas excéder 2,5 min.
Les billes de verre peuvent être utilisées pour la préparation, par agitation, des suspensions mères
de certains produits visqueux ou épais, notamment certains produits laitiers (voir normes
spécifiques).
4.3.3 Entretien et contrôle
Ces différents appareils doivent être contrôlés et entretenus selon les instructions du fabricant.
@ ISO ISO 7218:1996(F)
4.4 pH-mètre
4.4.1 Description
Le pH-mètre est utilisé pour mesurer la différence de potentiel, à une température déterminée,
entre une électrode de mesure et une électrode de référence, toutes deux étant introduites dans le
produit. II doit être capable de réaliser des mesures à + 0,l unité pH près, et son seuil minimal de
mesure doit être de 0,Ol unité pH. Le pH-mètre doit être équipé d’un système de compensation de
température soit manuel soit automatique.
NOTE - L’électrode de mesure et l’électrode de référence sont généralement réunies en un
système d’électrodes combinées.
4.4.2 Utilisation
Le pH-mètre sert à mesurer le pH de chaque fabrication de milieu de culture et de réactif (7.2)
pour vérifier si un ajustement du pH est nécessaire. Il peut également servir à mesurer et/ou à
ajuster le pH de l’échantillon pour essai ou de la suspension mère. L’utilisation d’un pH-mètre est
mentionnée dans la norme spécifique du produit à analyser qui précisera les conditions de la
détermination du pH, de l’ajustement du pH ainsi que la méthode de nettoyage et de
décontamination des électrodes.
4.4.3 Entretien et contrôle
Le pH-mètre doit être étalonné, selon les instructions du fabricant, avec au moins deux solutions
tampons étalons, au moins chaque jour avant l’utilisation. Les solutions étalons ont des valeurs de
pH connues, à la seconde décimale près, à la température du mesurage (en général, pH 4,00 et
pH 7,00 à 20 OC). Elles doivent encadrer les valeurs de pH mesurés.
Les électrodes doivent être vérifiées et entretenues selon les instructions du fabricant. II est
nécessaire, en particulier, de surveiller régulièrement:
- le vieillissement et l’encrassement des électrodes;
- le temps de réponse et la stabilité.
Avant chaque utilisation, vérifier que le bulbe de mesure des électrodes trempe entièrement dans
l’eau distillée ou tout autre liquide, selon les instructions du fabricant; sinon, le faire tremper 24 h
avant d’effectuer tout mesurage.
Nettoyer les électrodes après chaque utilisation. Pour tenir compte de l’encrassement et du
vieillissement des électrodes, procéder à un nettoyage périodique plus soigneux, selon les
instructions du fabricant.
Conserver les électrodes selon les instructions du fabricant.

4.5 Autoclave
4.5.1 Description
Un autoclave est appareil permettant d’obtenir une vapeur saturée à une température minimale de
121 “C, en vue de détruire les microorganismes.
4.5.2 Utilisation
Lors du même cycle de stérilisation, l’autoclave ne doit pas être utilisé pour stériliser un matériel
propre (et/ou un milieu de culture) et pour décontaminer un matériel déjà utilisé (et/ou un milieu de
culture déjà utilisé). Il est préférable d’utiliser des autoclaves séparés pour réaliser ces deux
opérations,
L’autoclave doit être muni :
- d’au moins une soupape de sécurité;
- d’un manomètre;
- d’un robinet de purge;
- d’un dispositif de régulation permettant le maintien de la température à + 1 OC de la valeur
prévue;
- d’un thermomètre ou d’un thermomètre enregistreur.
II est également préférable de munir l’autoclave d’un indicateur de durée ou d’un
programmeur-minuteur.
La stérilisation à la vapeur comporte l’obligation d’expulser tout l’air avant la montée en pression.
Si l’autoclave n’est pas muni d’un dispositif d’évacuation automatique, il est nécessaire de le
purger de son air jusqu’à émission d’un jet continu de vapeur.
4.5.3 Entretien et contrôle
L’autoclave doit être maintenu en parfait état de fonctionnement et doit être régulièrement contrôlé
par les services compétents selon les instructions du fabricant.
Tous les instruments de contrôle doivent être maintenus en parfait état et doivent être
régulièrement vérifiés.
Les opérations de détartrage, si besoin est, et de vidange doivent être régulièrement effectuées.
0 ISO ISO 7218:1996(F)
4.6 Étuve
4.6.1 Description
Une étuve est une enceinte permettant de maintenir une température stable et uniforme à + 1 OC
près, sauf spécification contraire.
4.6.2 Utilisation
Les étuves doivent être équipées d’un système de régulation permettant de maintenir une
température uniforme et stable dans l’ensemble de leur volume utile.
Si la température ambiante est proche ou supérieure à la température de l’étuve, il est nécessaire
de munir l’enceinte d’un système de refroidissement.
Il convient de protéger les parois de l’étuve de la lumière solaire directe.
Il est recommandé de ne pas remplir complètement l’étuve en une seule opération car le temps
d’équilibrage de la température dans le milieu de culture gélosé sera très long, quel que soit le
type d’étuve utilisé (convection d’air forcé ou autre).
Lors du chargement des étuves, il y a lieu de veiller à faciliter la circulation d’air; en aucun cas les
boîtes de Petri ou les tubes ne doivent être placés à moins de 25 mm des parois internes de
l’étuve. Les piles, d’au maximum 6 boîtes, doivent être espacées d’au moins 25 mm les unes des
autres.
4.6.3 Entretien et contrôle
L’homogénéité de la température à l’intérieur du volume utile doit être contrôlée à l’aide de
plusieurs thermomètres ou sondes.
II convient que la précision de mesure soit quatre fois meilleure que la précision demandée (par
exemple pour une précision demandée de + 2 OC, la précision devrait être de + 0,5 OC).
La stabilité de la température doit être contrôlée, par exemple avec un ou plusieurs thermomètres
à minima-maxima.
La température de l’étuve doit être contrôlée au moins tous les jours d’utilisation. Dans ce but,
chaque étuve doit contenir au moins un thermomètre dont le réservoir est immergé dans du
glycérol placé dans un flacon fermé. D’autres systèmes de vérification d’efficacité équivalente
peuvent également être utilisés.
Les parois internes et externes doivent être nettoyées et désinfectées régulièrement et, s’il y a
lieu, le système de ventilation doit être dépoussiéré.

4.7 Réfrigérateur, chambre froide
4.7.1 Description
Un réfrigérateur et une chambre froide sont des enceintes permettant de garantir une
conservation en froid positif. La température, sauf spécification contraire, doit être de
+ 3 OC + 2 OC sauf pour la conservation des échantillons pour analyse, où la température doit être
de + 2 “C + 2 OC.
4.7.2 Utilisation
II est nécessaire de disposer d’enceintes différentes pour la conservation:
- des milieux de culture non ensemencés et des réactifs;
- des échantillons pour analyse;
- des souches de microorganismes et des milieux incubés.
Les réfrigérateurs et chambres froides doivent être chargés en veillant à maintenir une circulation
d’air appropriée.
4.7.3 Entretien et contrôle
La température de chacune des enceintes doit être vérifiée chaque jour de travail à l’aide d’un
thermomètre ou d’une sonde placée à demeure. (Voir 4.6.3 pour la précision de l’appareil.)
Les opérations d’entretien suivantes doivent être régulièrement effectuées:
- dépoussiérage des ailettes ou des plaques d’échange thermique externes;
- dégivrage;
- nettoyage et désinfection de l’intérieur des enceintes.
4.8 Congélateur
4.8.1 Description
Un congélateur est une enceinte permettant de garantir une conservation en froid négatif. La
température, sauf spécification contraire, doit être inférieure à - 18 OC, de préférence égale à
- 24 “C k 2 “C.
4.8.2 Utilisation
Il est nécessaire de disposer d’enceintes différentes pour la conservation:
- de certains milieux de culture non ensemencés et des réactifs;
@ ISO ISO 7218: 1996(F)
- des échantillons pour analyse;
- des souches de microorganismes.
Le congélateur doit être chargé en veillant à maintenir une température suffisamment basse et ce,
particulièrement lorsque sont introduits des produits non congelés.
4.8.3 Entretien et contrôle
La température de chacune des enceintes doit être vérifiée chaque jour de travail à l’aide d’un
thermomètre ou d’une sonde placée à demeure.(Voir 4.6.3 pour la précision de l’appareil.)
Les opérations d’entretien suivantes doivent être régulièrement effectuées:
- dépoussiérage des ailettes ou des plaques d’échange thermique externes;
- dégivrage;
- nettoyage et désinfection de l’intérieur des enceintes.
4.9 Bain thermostaté
4.9.1 Description
Un bain thermostaté est un bain permettant de maintenir de façon stable une température
spécifiée. La précision, sauf spécification contraire, doit être de k 0,5 OC. Les températures
d’utilisation sont précisées dans chaque méthode d’application.
4.9.2 Utilisation
Les principales utilisations sont:
- le maintien en surfusion des milieux gélosés à 47 OC + 2 OC;
- l’incubation de milieux de culture ensemencés à une température constante;
- la préparation de suspensions mères à une température maintenue constante (par exemple la
préparation des suspensions mères de caséinates nécessite leur maintien pendant 15 min
dans un bain d’eau à 37 OC);
- le traitement thermique de suspensions mères à une température maintenue constante (par
exemple le dénombrement des spores peut nécessiter la destruction des cellules végétatives).
Pour un réglage précis de la température, le bain thermostaté doit être équipé d’une pompe à
circulation d’eau et d’un système de réglage automatique du chauffage. L’agitation du liquide ne
doit pas provoquer la projection de gouttes.
4.9.3 Entretien et contrôle
Chaque bain doit être muni d’un thermomètre ou d’une sonde indépendant du système de
régulation (voir 4.63 pour la précision de l’appareil).
La température du bain doit être contrôlée lors de chaque utilisation et, de préférence, une fois par
jour .
Le niveau du liquide du bain (eau, éthylène glycol, etc.) doit être régulièrement contrôlé.
Pour éviter toute prolifération microbienne, le liquide doit être changé fréquemment.
4.10 Four à stériliser
4.10.1 Description
Un four à stériliser est une enceinte permettant d’atteindre une température de 170 OC à 180 OC,
en vue de détruire les microorganismes par chaleur sèche.
4.10.2 Utilisation
Seuls les matériels métalliques ou en verre sont stérilisés au four à stériliser. La durée de
stérilisation est d’au moins 1 h lorsque la température correcte est atteinte.
AVERTISSEMENT - Aucune verrerie graduée ne doit être stérilisée dans un four à stériliser.
La répartition de la température dans l’enceinte doit être homogène.
Le four doit être muni:
- d’un dispositif de régulation (thermostat);
- d’un thermomètre ou d’un thermomètre enregistreur.
II est également préférable que le four soit muni d’un indicateur de durée ou d’un programmeur-
minuteur.
4.10.3 Entretien et contrôle
L’homogénéité de la température à l’intérieur du volume utile doit être contrôlée.
Le four doit être maintenu en parfait état de fonctionnement et les instruments de contrôle doivent
être vérifiés régulièrement.
Un nettoyage régulier est recommandé.
@ ISO
4.11 Four à micro-ondes
4.11 .l Description
Un four à micro-ondes est un appareil permettant de chauffer un produit par l’utilisation de micro-
ondes.
4.11.2 Utilisation
En l’état actuel de nos connaissances, seule l’utilisation pour la fusion des milieux de culture
gélosés est possible.
L’appareil utilisé fonctionne sous pression atmosphérique. II doit pouvoir chauffer les milieux de
culture de facon contrôlée par un cycle d’émissions micro-ondes. La répartition des micro-ondes
doit être homogène à l’intérieur du produit afin d’éviter les points de surchauffe. Pour une
meilleure distribution de la chaleur, il convient de munir l’appareil d’un plateau tournant.
ATTENTION - Manipuler avec soin ! Le chauffage des milieux de culture gélosés dans un
four à micro-ondes peut entraîner un retard d’ébullition.
NOTE - En l’absence de démonstration suffisante de I’eff icacité des micro-ondes pour la
stérilisation des milieux de culture, cette utilisation ne peut actuellement pas être prévue
dans le cadre de la présente Norme internationale.
4.12 Microscope optique
4.12.1 Utilisation
Un microscope optique présente des objectifs à différents grossissements. À fort grossissement et
à l’immersion, il permet d’observer la morphologie des microorganismes en suspension aqueuse
ou après coloration. II est préférable que le microscope soit équipé d’un dispositif à contraste de
phase pour améliorer les observations à l’état frais.
NOTE - Des appareils (microscopes à lame) à faible grossissement et idéalement
stéréoscopiques sont disponibles pour l’examen des colonies de bactéries sur ou dans les
milieux de culture gélosés.
4.12.2 Entretien et contrôle
Après utilisation à l’immersion, l’objectif doit être nettoyé de manière à ne pas altérer la qualité de
l’optique et afin d’éliminer le produit utilisé pour l’immersion.
Au moins une fois par an, le microscope doit subir un nettoyage général, un contrôle du
mécanisme et de l’optique par une personne habilitée.
4.13 Brûleur à gaz, incinérateur à fil
Un brûleur à gaz est utilisé pour créer et maintenir une zone de protection autour d’un point chaud.
Il sert à stériliser les fils et les anses en métal, en les portant à incandescence.
II est préférable d’utiliser I’incinérateur à fil pour la stérilisation des fils et des anses en métal après
la manipulation des bactéries pathogènes.
4.14 Répartiteur de milieux de culture et de réactifs
4.14.1 Description
C’est un instrument ou appareil permettant de répartir les milieux de culture et réactifs dans les
tubes, flacons ou boîtes de Petri (par exemple éprouvette graduée, seringue manuelle, seringue
automatique, pompe péristaltique ou distributeur automatique de milieux).
4.14.2 Utilisation
Dans le cas de répartition aseptique de milieux de culture et de réactifs stériles, toutes les parties
de l’instrument ou de l’appareil en contact avec le produit à répartir doivent être stériles (voir 6.2).
La précision de l’instrument ou de l’appareil doit être adaptée à la précision du volume à répartir.
En particulier, la précision demandée sur les volumes de diluants utilisés pour effectuer les
dilutions décimales est de + 2 %.
4.14.3 Entretien et contrôle
Ces instruments et appareils doivent être maintenus en parfait état, selon les instructions du
fabricant.
Les volumes dé ivrés doivent être régulièrement contrôlés.
4.15 Agitateur mécanique
Un agitateur mécanique permet de mélanger de façon homogène divers milieux liquides (par
exemple les dilutions décimales et les échantillons pour essai liquides) ou mettre en suspension
des cellules bactériennes dans un liquide.
Son principe est fondé sur un mouvement de rotation excentrée du contenu des tubes à essai
(vortex).
4.16 Dispositif de comptage des colonies
II est préférable que l’appareil soit muni d’un système d’éclairage avec fond noir, d’une loupe de
grossissement minimal x 1,5 et d’un compteur numérique mécanique ou électronique. Tout autre
système de comptage automatisé d’efficacité équivalente peut être utilisé (par exemple compteur
laser).
@ ISO ISO 7218: 1996(F)
4.17 Matériel pour culture en atmosphère modifiée
4.17.1 Description
C’est une jarre à fermeture étanche ou tout autre appareillage approprié permettant d’obtenir et de
maintenir des conditions d’atmosphère modifiée (par exemple anaérobiose) pendant toute la
durée de l’incubation du milieu de culture. D’autres systèmes de performance équivalente, par
exemple chambres anaérobies, peuvent être utilisés. Les instructions du fabricant doivent être
suivies pour l’installation et la maintenance.
4.17.2 Utilisation
La composition de l’atmosphère obtenue par un mélange gazeux (par exemple d’une bouteille de
gaz) ou par tout autre moyen approprié (par exemple des systèmes gazeux disponibles dans le
commerce) sera précisée dans la Norme internationale spécifique.
4.17.3 Entretien et contrôle
Un indicateur de contrôle de la nature de l’atmosphère doit être placé dans chaque enceinte
pendant chaque utilisation.
Quand un système catalytique est employé, il doit être régénéré selon les instructions du
fabricant.
Un nettoyage et une désinfection de ce matériel doivent être effectués régulièrement.
4.18 Autres matériels
D’autres matériels et équipement sont d’utilisation courante, dont les suivants: appareils de
filtration, récipients (tubes à essais, flacons, bouteilles, etc.) en verre ou en matière plastique,
boîtes de Petri en verre ou en matière plastique (les plus courants ayant entre 90 mm à 100 mm
de diamètre), pipettes en verre ou en matière plastique (de 10 ml, 2 ml, 1 ml, etc.), instruments
pour prélèvement d’échantillon, fils et anses (en nickel/chrome, en platine iridié ou en matière
plastique à usage unique, etc.).
5 Personnel
5.1 Compétence
Tout personnel intervenant dans un laboratoire de microbiologie doit avoir reçu la formation
indispensable à la bonne réalisation des opérations qui lui sont confiées.
Le personnel chargé de la réalisation des essais doit avoir une bonne connaissance et une
pratique suffisante des techniques microbiologiques et des microorganismes recherchés. II doit
également pouvoir interpréter les notions de précision et de fidélité requises pour obtenir des
résultats acceptables. Pour cela, il pourra, par exemple, participer à des essais circulaires, utiliser
des matériaux de référence, ou effectuer des essais d’auto-évaluation pour le dénombrement des
microorganismes (se référer en particulier aux travaux de la FIL).
@ ISO
L’ensemble du personnel doit recevoir une information continue et adaptée en matière d’hygiène
et de sécurité.
5.2 Hygiène
Dans le domaine de l’hygiène personnelle, les précautions suivantes doiven
...