ISO 16050:2003
(Main)Foodstuffs — Determination of aflatoxin B1, and the total content of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in cereals, nuts and derived products — High-performance liquid chromatographic method
Foodstuffs — Determination of aflatoxin B1, and the total content of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in cereals, nuts and derived products — High-performance liquid chromatographic method
ISO 16050:2003 specifies a reverse-phase high-performance liquid chromatographic method, with immunoaffinity column clean-up and post-column derivatization, for the determination of aflatoxins in cereals, nuts and derived products. The limit of quantification for aflatoxin B1, and for the sum of aflatoxins B1, B2, G1 and G2, is 8 micrograms per kilogram. The method has been validated for maize containing 24,5 micrograms per kilogram, for peanut butter containing 8,4 micrograms per kilogram, and for raw peanuts containing 16 micrograms per kilogram of total aflatoxins. It has also been shown that this method can be used for oilseed products, dried fruits and derived products.
Produits alimentaires — Dosage de l'aflatoxine B1 et détermination de la teneur totale en aflatoxines B1, B2, G1 et G2 dans les céréales, les fruits à coque et les produits dérivés — Méthode par chromatographie liquide à haute performance
L'ISO 16050:2003 spécifie une méthode par chromatographie liquide à haute performance en phase inversée, avec purification sur colonne d'immunoaffinité et dérivation post-colonne, pour le dosage des aflatoxines dans les céréales, les fruits à coque et les produits dérivés. La limite de quantification de l'aflatoxine B1 et de la somme des aflatoxines B1, B2, G1 et G2 est de 8 µg/kg. Cette méthode a été validée sur du maïs, du beurre d'arachide et des arachides brutes ayant respectivement une teneur en aflatoxines totales de 24,5 µg/kg, 8,4 µg/kg et 16 µg/kg. Il a également été démontré que la présente méthode peut être utilisée pour les produits oléagineux, les fruits secs et les produits dérivés.
General Information
Buy Standard
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16050
First edition
2003-09-01
Foodstuffs — Determination of aflatoxin
B , and the total content of aflatoxins B ,
1 1
B , G and G in cereals, nuts and
2 1 2
derived products — High-performance
liquid chromatographic method
Produits alimentaires — Dosage de l'aflatoxine B et détermination de
1
la teneur totale en aflatoxines B , B , G et G dans les céréales, les
1 2 1 2
fruits à coque et les produits dérivés — Méthode par chromatographie
liquide à haute performance
Reference number
ISO 16050:2003(E)
©
ISO 2003
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 16050:2003(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
© ISO 2003
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2003 — All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 16050:2003(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope. 1
2 Normative references. 1
3 Principle. 1
4 Reagents. 1
5 Apparatus. 4
6 Procedure. 5
6.1 General. 5
6.2 Extraction. 5
6.3 Clean-up. 6
6.4 HPLC operating conditions. 6
6.5 Identification. 6
6.6 Calibration graph. 6
6.7 Determination. 7
7 Calculation of results. 7
8 Precision. 8
8.1 Interlaboratory test. 8
8.2 Repeatability. 8
8.3 Reproducibility. 9
9 Test report. 9
Annex A (informative) Results of interlaboratory test . 10
Bibliography . 12
© ISO 2003 — All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 16050:2003(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 16050 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products. It is based on EN 12955:1999
elaborated by CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods.
iv © ISO 2003 — All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16050:2003(E)
Foodstuffs — Determination of aflatoxin B , and the total
1
content of aflatoxins B , B , G and G in cereals, nuts and
1 2 1 2
derived products — High-performance liquid chromatographic
method
WARNING — The use of this standard involves hazardous materials and operations. This standard
does not purport to address all the safety problems associated with its use. It is the responsibility of
the user of this standard to establish appropriate safety and health practice and to determine the
applicability of regulatory limitations prior to use.
1 Scope
This International Standard specifies a reverse-phase high-performance liquid chromatographic method, with
immunoaffinity column clean-up and post-column derivatization, for the determination of aflatoxins in cereals,
nuts and derived products. The limit of quantification for aflatoxin B , and for the sum of aflatoxins B , B , G
1 1 2 1
and G , is 8 µg/kg.
2
The method has been validated for maize containing 24,5 µg/kg, for peanut butter containing 8,4 µg/kg, and
for raw peanuts containing 16 µg/kg of total aflatoxins. It has also been shown that this method can be used
for oilseed products, dried fruits and derived products.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Principle
The test sample is extracted with a mixture of methanol and water. The sample extract is filtered, diluted with
water, and applied to an affinity column containing antibodies specific for aflatoxins B , B , G and G . The
1 2 1 2
aflatoxins are isolated, purified and concentrated on the column then removed from the antibodies with
methanol. The aflatoxins are quantified by reverse-phase high-performance liquid chromatography (HPLC)
with fluorescence detection and post-column derivatization.
4 Reagents
Use only reagents recognized analytical grade, unless otherwise stated.
4.1 Water, according to grade 1 of ISO 3696:1987.
4.2 Sodium chloride.
© ISO 2003 — All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 16050:2003(E)
1)
4.3 Iodine, crystalline, or as an alternative, pyridinium hydrobromide perbromide (PBPB) .
4.4 Aflatoxin, in crystal form or as a film ampoule.
WARNING — Aflatoxins are carcinogenic to human subjects. Attention is drawn to the statement
made by the International Agencies for Research on Cancer (WHO) (see [1], [2]).
Adequately protect from daylight the laboratory where the analyses are carried out. This may be
achieved effectively by using ultraviolet (UV) absorbing foil on the windows in combination with
subdued light (no direct sunlight), or curtains or blinds in combination with artificial light (fluorescent
tubes are acceptable).
4.5 Acetonitrile, HPCL grade.
4.6 Methanol, analytical grade.
4.7 Methanol, HPLC grade.
4.8 Toluene, analytical grade.
WARNING — Toluene is highly flammable and harmful. Standard preparation involving this solvent
shall be performed in a fume cupboard. Operations outside the fume cupboard, such as measurement
of standards by UV spectrometry, shall be performed with the standards in closed containers.
4.9 Toluene/acetonitrile mixture
Mix 98 parts per volume of toluene (4.8) with 2 parts per volume of acetonitrile (4.5) (see Warning in 4.8).
4.10 Extraction solvent
Mix 7 parts per volume of methanol (4.6) with 3 parts per volume of water (4.1).
Other extraction solvent mixtures which are compatible with the mobile phase may also be used if proved to
be more effective or recommended by the manufacturer of the immunoaffinity (IA) column.
4.11 Mobile phase
Mix 3 parts per volume of water (4.1) with 1 part per volume of acetonitrile (4.5) and 1 part per volume of
methanol (4.7). Degas the solution before use.
4.12 Post-column derivatization reagent
Dissolve 100 mg of iodine (4.3) in 2 ml of methanol (4.6). Add 200 ml of water (4.1), stir for 1 h, then filter
through a 0,45 µm membrane filter (5.8). Prepare the solution the week of use and store the solution in the
dark or in a brown glass bottle. Before use, stir the solution for 10 min.
As an alternative, dissolve 50 mg of PBPB (4.3) in 1 000 ml of water. This solution may be used for up to
4 days if stored in a dark place at room temperature.
4.13 Aflatoxin B , B , G and G stock solutions
1 2 1 2
WARNING — Protect solutions containing aflatoxin from light as far as possible (keep in the dark, use
aluminium foil or amber-coloured glassware).
1) CAS: 39416-48-3 (CAS = Chemical Abstract Service).
2 © ISO 2003 — All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 16050:2003(E)
Dissolve aflatoxin B , B , G and G separately in the toluene/acetonitrile mixture (4.9) to give separate
1 2 1 2
solutions containing 10 µg/ml.
To determine the exact concentration of aflatoxin in each stock solution, record the absorption curve at a
wavelength between 330 nm and 370 nm in 1 cm quartz glass cells (5.7) using a spectrometer (5.6) with a
toluene/acetonitrile mixture (4.9) as reference. Calculate the aflatoxin concentration of each aflatoxin, ρ , in
i
micrograms per millilitre, using Equation (1):
AM××1000
max i
ρ = (1)
i
ε ×d
i
where
A is the absorbance determined at the maximum of the absorption curve;
max
M is the molecular mass of each aflatoxin, in grams;
i
ε is the molar absorption coefficient of each aflatoxin in toluene/acetonitrile;
i
NOTE This value is determined in a solution that contains c = 1 mol/l of aflatoxin and in a cell with the optical
pathlength d = 1 cm. The molar absorption coefficient (ε) is usually given without a unit of measurement, but
−1 −1
from the equation A = ε × c × d, the following unit can be derived for it: l◊mol ◊cm .
d is the optical pathlength of the cell, in centimetres.
M and ε are given in Table 1.
i i
Table 1 — Molecular mass and molar absorption coefficient of aflatoxins B , B , G and G
1 2 1 2
Aflatoxin M ε
i i
B 312 19 300
1
B 314 20 400
2
G 328 16 600
1
G 330 17 900
2
NOTE A mixture of toluene and acetonitrile (98 + 2) is used as
solvent.
4.14 Stock solution of mixed aflatoxins
Prepare a stock solution containing 500 ng/ml of aflatoxin B , 125 ng/ml of aflatoxin B , 250 ng/ml of
1 2
aflatoxin G and 125 ng/ml of aflatoxin G in toluene/acetonitrile (4.9). If the solution has to be stored, weigh
1 2
the flask before storage. Wrap the flask tightly in aluminium foil and store it at approximately 4 °C. Immediately
before use, reweigh the flask and record any change in mass after storage.
NOTE Normal exposure to UV light during absorbance measurement results in no observable conversion to
photoproducts.
4.15 Standard solution of mixed aflatoxins
Transfer each quantity, as specified in Table 2, of mixed aflatoxin stock solution (4.14) into a series of four
2 ml volumetric flasks (5.5). Evaporate the solutions just to dryness under a stream of nitrogen at room
temperature. To each flask, add 1 ml of methanol (4.6). Dissolve the dry residue in it, dilute the solution to the
mark with water (4.1) and mix. Prepare the solution freshly on the day of use.
© ISO 2003 — All rights reserved 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 16050:2003(E)
Table 2 — Preparation of standard solutions
Standard Volume taken Concentration of aflatoxin
solution from stock ng/ml
solution
µl B B G G
1 2 1 2
1 60 15,0 3,75 7,50 3,75
2 40 10,0 2,50 5,00 2,50
3 20 5,00 1,25 2,50 1,25
4 10 2,50 0,625 1,25 0,625
NOTE The values given are for guidance only. The standard range includes the concentrations of the samples.
4.16 Sulfuric acid, c(H SO ) = 2 mol/l.
2 4
5 Apparatus
Soak laboratory glassware coming into contact with aqueous solutions of aflatoxins in sulfuric acid (4.16) for
several hours, then rinse well (e.g. three times) with water to remove all traces of acid. Check the absence of
acid with pH paper.
NOTE This treatment is necessary because the use of non-acid washed glassware can cause losses of aflatoxins. In
practice, the treatment is necessary for round-bottomed flasks, volumetric flasks, measuring cylinders, vials or tubes used
for calibration solutions and final extracts (particularly autosampler vials), and Pasteur pipettes, if these are used to
transfer calibration solutions or extracts.
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
5.1 Immunoaffinity (IA) column
The IA column contains antibodies raised against aflatoxin B , B , G and G . The column shall have a
1 2 1 2
minimum binding capacity of not less than 100 ng of aflatoxin B . It shall give a recovery of not less than 80 %
1
for aflatoxin B , B , G , and not less than 60 % for aflatoxin G , when a standard solution in 15 ml of a
1 2 1 2
methanol/water mixture [1 part methanol (4.6) and 3,4 parts water (4.1) (by volume)] containing 5 ng of each
toxin is applied to the IA column. The IA column should be equipped with an appropriate solvent reservoir (e.g.
a syringe with adapter).
It is advisable to carry out recovery experiments for every matrix that the method is used for.
5.2 Blender, with 500 ml blender jar and cover.
The use of a high-speed blender is recommended.
5.3 Fluted filter paper, e.g. 24 cm diameter.
2)
5.4 Glass microfibre filter paper , e.g. 11 cm diameter.
5.5 Volumetric flasks, class A grade, of capacity 2 ml.
5.6 Spectrometer, capable measuring wavelengths between 200 nm and 400 nm.
2) For example, Whatman 934AH is appropriate for this purpose. This information is given for the convenience of users
of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product. Other products may be used
if they can be shown to give comparable results.
4 © ISO 2003 — All rights reserved
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 16050:2003(E)
5.7 Quartz glass cells, of optical path length 1 cm, and with no significant abso
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16050
Première édition
2003-09-01
Produits alimentaires — Dosage de
l'aflatoxine B et détermination de la
1
teneur totale en aflatoxines B , B , G et
1 2 1
G dans les céréales, les fruits à coque et
2
les produits dérivés — Méthode par
chromatographie liquide à haute
performance
Foodstuffs — Determination of aflatoxin B , and the total content of
1
aflatoxins B , B , G and G in cereals, nuts and derived products —
1 2 1 2
High-performance liquid chromatographic method
Numéro de référence
ISO 16050:2003(F)
©
ISO 2003
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 16050:2003(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2003
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Version française parue en 2011
Publié en Suisse
ii © ISO 2003 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 16050:2003(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives.1
3 Principe .1
4 Réactifs.1
5 Appareillage .4
6 Mode opératoire.5
6.1 Généralités .5
6.2 Extraction .6
6.3 Purification.6
6.4 Conditions de fonctionnement de la CLHP .6
6.5 Identification .7
6.6 Courbe d'étalonnage.7
6.7 Détermination .7
7 Calcul des résultats.7
8 Fidélité .8
8.1 Essai interlaboratoires.8
8.2 Répétabilité .8
8.3 Reproductibilité .9
9 Rapport d'essai.10
Annexe A (informative) Résultats de l'essai interlaboratoires.11
Bibliographie.13
© ISO 2003 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 16050:2003(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 16050 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires. Elle est basée sur
l'EN 12955:1999 élaborée par le comité technique CEN/TC 275, Analyse alimentaire — Méthodes
horizontales.
iv © ISO 2003 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 16050:2003(F)
Produits alimentaires — Dosage de l'aflatoxine B et
1
détermination de la teneur totale en aflatoxines B , B , G et G
1 2 1 2
dans les céréales, les fruits à coque et les produits dérivés —
Méthode par chromatographie liquide à haute performance
AVERTISSEMENT — L'utilisation de la présente Norme internationale peut impliquer l'emploi de
produits et la mise en œuvre de modes opératoires et d'appareillages à caractère dangereux. La
présente Norme internationale n'a pas pour but d'aborder tous les problèmes de sécurité liés à son
utilisation. Il incombe à l'utilisateur de la présente Norme internationale d'établir, avant de l'utiliser,
des pratiques d'hygiène et de sécurité appropriées et de déterminer l'applicabilité des restrictions
réglementaires.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode par chromatographie liquide à haute performance en
phase inversée, avec purification sur colonne d'immunoaffinité et dérivation post-colonne, pour le dosage des
aflatoxines dans les céréales, les fruits à coque et les produits dérivés. La limite de quantification de
l'aflatoxine B et de la somme des aflatoxines B , B , G et G est de 8 µg/kg.
1 1 2 1 2
Cette méthode a été validée sur du maïs, du beurre d’arachide et des arachides brutes ayant respectivement
une teneur en aflatoxines totales de 24,5 µg/kg, 8,4 µg/kg et 16 µg/kg. Il a également été démontré que la
présente méthode peut être utilisée pour les produits oléagineux, les fruits secs et les produits dérivés.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
3 Principe
L'échantillon pour essai est extrait avec un mélange d'eau et de méthanol. L'extrait d'échantillon est filtré,
dilué avec de l'eau et déposé sur une colonne d'immunoaffinité contenant des anticorps spécifiques des
aflatoxines B , B , G et G . Les aflatoxines sont isolées, purifiées et concentrées sur la colonne, puis
1 2 1 2
libérées des anticorps avec du méthanol. Les aflatoxines sont quantifiées par chromatographie liquide à haute
performance (CLHP) en phase inversée avec détection par fluorescence et dérivation post-colonne.
4 Réactifs
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
4.1 Eau, de qualité 1 selon l'ISO 3696:1987.
© ISO 2003 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 16050:2003(F)
4.2 Chlorure de sodium.
1)
4.3 Iode, cristalline, ou en alternative, hydrobromure perbromure de pyridium (PBPB) .
4.4 Aflatoxine, sous forme de cristaux ou de film en ampoule.
AVERTISSEMENT — Les aflatoxines sont cancérigènes pour l'homme. L'attention est attirée sur les
recommandations du Centre international de recherche sur le cancer de l'OMS (voir Références [1]
et [2]).
Protéger de manière adéquate le laboratoire où sont effectuées les analyses de la lumière du jour.
Pour y parvenir efficacement, il est possible d'utiliser une feuille absorbant les ultraviolets (UV) placée
sur les fenêtres, associée à une lumière tamisée (pas de lumière solaire directe), ou des rideaux ou
des stores associés à une lumière artificielle (les tubes fluorescents sont acceptables).
4.5 Acétonitrile, de qualité pour CLHP.
4.6 Méthanol, de qualité pour analyse.
4.7 Méthanol, de qualité pour CLHP.
4.8 Toluène, de qualité pour analyse.
AVERTISSEMENT — Le toluène est très inflammable et nocif. La préparation des étalons avec ce
solvant doit être effectuée sous une hotte aspirante. Les opérations réalisées hors de la hotte, telles
que le mesurage des étalons par spectrométrie UV, doivent se faire en plaçant les étalons dans des
récipients fermés.
4.9 Mélange toluène/acétonitrile
Mélanger 98 parties en volume de toluène (4.8) avec 2 parties en volume d'acétonitrile (4.5)
(voir l'Avertissement en 4.8).
4.10 Solvant d'extraction
Mélanger 7 parties en volume de méthanol (4.6) avec 3 parties en volume d'eau (4.1).
D'autres mélanges de solvant d'extraction, compatibles avec la phase mobile, peuvent également être utilisés
à condition qu'il ait été prouvé qu'ils sont plus efficaces ou qu'ils aient été recommandés par le fabricant de la
colonne d'immunoaffinité (IA).
4.11 Phase mobile
Mélanger 3 parties en volume d'eau (4.1) avec 1 partie en volume d'acétonitrile (4.5) et 1 partie en volume de
méthanol (4.7). Dégazer la solution avant de l'utiliser.
4.12 Réactif de dérivation post-colonne
Dissoudre 100 mg d'iode (4.3) dans 2 ml de méthanol (4.6). Ajouter 200 ml d'eau (4.1), agiter pendant 1 h
puis filtrer avec un filtre à membrane (5.8) de 0,45 µm de porosité. Préparer la solution la semaine même de
l'utilisation et la conserver à l'obscurité ou dans un flacon en verre brun. Agiter la solution pendant 10 min
avant utilisation.
En guise d'alternative, dissoudre 50 mg de PBPB (4.3) dans 1 000 ml d'eau. Cette solution peut être utilisée
pendant 4 jours si elle est conservée dans l'obscurité à température ambiante.
1) CAS: 39416-48-3 (CAS = Chemical Abstracts Service).
2 © ISO 2003 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 16050:2003(F)
4.13 Solutions mères d'aflatoxines B , B , G et G
1 2 1 2
AVERTISSEMENT — Dans la mesure du possible, protéger les solutions d'aflatoxines de la lumière
(les conserver dans l'obscurité, utiliser une feuille d'aluminium ou de la verrerie ambrée).
Dissoudre de l'aflatoxine B , B , G et G séparément dans le mélange toluène/acétonitrile (4.9) afin d'obtenir
1 2 1 2
des solutions séparées contenant 10 µg/ml.
Pour déterminer la concentration exacte d'aflatoxine dans chaque solution mère, enregistrer le spectre
d'absorption à une longueur d'onde comprise entre 330 nm et 370 nm dans des cuves en quartz de 1 cm (5.7)
au moyen d'un spectromètre (5.6), en utilisant le mélange toluène/acétonitrile (4.9) comme référence.
Calculer la concentration de chaque aflatoxine, ρ , en microgrammes par millilitre, à l'aide de l'Équation (1):
i
AM××1000
max i
ρ = (1)
i
ε × d
i
où
A est l'absorbance déterminée au maximum du spectre d'absorption;
max
M est la masse moléculaire de chaque aflatoxine, en grammes;
i
ε est le coefficient d'absorption molaire de chaque aflatoxine dans le mélange toluène/acétonitrile;
i
NOTE Cette valeur est déterminée dans une solution contenant c = 1 mol/l d'aflatoxine et dans une
cuve de trajet optique d = 1 cm. Le coefficient d'absorption molaire (ε) est généralement indiqué sans unité
−1 −1
de mesure, mais l'équation A = ε × c × d permet d'obtenir l'unité suivante: l⋅mol ⋅cm .
d est le trajet optique de la cuve, en centimètres.
M et ε sont indiqués dans le Tableau 1.
i i
Tableau 1 — Masse moléculaire et coefficient d'absorption molaire des aflatoxines B , B , G et G
1 2 1 2
Aflatoxine M ε
i i
B 312 19 300
1
B 314 20 400
2
G 328 16 600
1
G 330 17 900
2
NOTE Un mélange de toluène et d'acétonitrile (98 + 2) est utilisé
comme solvant.
4.14 Solution mère d'aflatoxines mélangées
Préparer une solution mère contenant 500 ng/ml d'aflatoxine B , 125 ng/ml d'aflatoxine B , 250 ng/ml
1 2
d'aflatoxine G et 125 ng/ml d'aflatoxine G dans le mélange toluène/acétonitrile (4.9). Lorsque la solution doit
1 2
être conservée, peser le récipient avant le stockage. Envelopper soigneusement le récipient avec une feuille
d'aluminium et le conserver à environ 4 °C. Immédiatement avant usage, peser à nouveau le récipient et
enregistrer toute variation de masse survenue après stockage.
NOTE Une exposition normale aux rayons UV lors du mesurage de l'absorbance n'entraîne pas de conversion
observable en photoproduits.
© ISO 2003 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 16050:2003(F)
4.15 Solution étalon d'aflatoxines mélangées
Transvaser chaque quantité spécifiée dans le Tableau 2 de la solution mère d'aflatoxines mélangées (4.14)
dans une série de quatre fioles jaugées de 2 ml (5.5). Évaporer les solutions jusqu'à siccité sous un flux
d'azote à température ambiante. Ajouter 1 ml de méthanol (4.6) dans chaque fiole. Dissoudre le résidu sec,
diluer la solution jusqu'au trait avec de l'eau (4.1) et mélanger. Préparer la solution le jour de l'utilisation.
Tableau 2 — Préparation des solutions étalons
Solution étalon Volume Concentration d'aflatoxine
prélevé sur la
ng/ml
solution mère
µl B B G G
1 2 1 2
1 60 15,0 3,75 7,50 3,75
2 40 10,0 2,50 5,00 2,50
3 20 5,00 1,25 2,50 1,25
4 10 2,50 0,625 1,25 0,625
NOTE Les valeurs indiquées sont données à titre indicatif. La gamme étalon couvre les concentrations des
échantillons.
4.16 Acide sulfurique, c(H SO ) = 2 mol/l.
2 4
5 Appareillage
Plonger la verrerie de laboratoire entrant en contact avec les solutions aqueuses d'aflatoxines dans de l'acide
sulfurique (4.16) pendant plusieurs heures, puis bien la rincer à l'eau (trois fois par exemple) afin d'éliminer
toute trace d'acide. Vérifier l'absence d'acide avec du papier pH.
NOTE Ce traitement est nécessaire car l'utilisation de verrerie n'ayant pas subi de lavage à l'acide peut occasionner
des pertes d'aflatoxines. En pratique, ce traitement est nécessaire pour les ballons à fond rond, les fioles jaugées, les
éprouvettes graduées à pied, les flacons ou les tubes utilisés pour les solutions d'étalonnage et les extraits finaux (en
particulier les passeurs automatiques d'échantillon), ainsi que pour les pipettes Pasteur lorsqu'elles sont utilisées pour
transvaser les solutions d'étalonnage ou les extraits.
Appareillage courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1 Colonne d'immunoaffinité (IA)
La colonne d'IA contient des anticorps dirigés contre les aflatoxines B , B , G et G . La capacité minimale de
1 2 1 2
liaison de la colonne ne doit pas être inférieure à 100 ng d'aflatoxine B . La récupération pour les aflatoxines
1
B , B et G ne doit pas être inférieure à 80 %, et à 60 % pour l'aflatoxine G , lorsqu'on applique sur la
1 2 1 2
colonne d'IA une solution étalon de 5 ng de chaque toxine dans 15 ml d'un mélange de méthanol et d'eau
[1 partie en volume de méthanol (4.6) et 3,4 parties en volume d'eau (4.1)]. Il convient que la colonne d'IA
comprenne un réservoir de solvant approprié (par exemple une seringue avec un adaptateur).
Il est conseillé de réaliser les expériences de récupération sur chaque matrice pour laquelle la méthode est
utilisée.
5.2 Broyeur, comprenant un bol de 500 ml et un couvercle.
L'utilisation d'un broyeur à grande vitesse est recommandée.
5.3 Papier-filtre plissé, par exemple de 24 cm de diamètre.
4 © ISO 2003 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 16050:2003(F)
2)
5.4 Papier-filtre à microfibres de verre , par exemple de 11 cm de diamètre.
5.5 Fioles jaugées, de classe A, d'une capacité de 2 ml.
5.6 Spectromètre, pouvant balayer des longueurs d'onde comprises entre 200 nm et 400 nm.
5.7 Cuves en quartz, avec un trajet optique de 1 cm et sans absorption sensible dans les longueurs
d'onde comprises entre 300 nm et 370 nm.
5.8 Filtre à membrane pour les solutions aqueuses, en polytétrafluoroéthylène (PTFE), de 4 mm de
diamètre et de 0,45 µm de porosité.
5.9 Appareillage CLHP, se composant des éléments suivants.
5.9.1 Pompe CLHP, pouvant produire un débit de 1 ml/min.
5.9.2 Système d'injection, vanne d'injection munie d'une boucle de 50 µl ou système équivalent.
5.9.3 Colonne analytique de séparation en phase
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.