ISO 20743:2021

NORME ISO
INTERNATIONALE 20743
Troisième édition
2021-06
Textiles — Détermination de l'activité
antibactérienne des produits textiles
Textiles — Determination of antibacterial activity of textile products
Numéro de référence
©
ISO 2021
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2021
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2021 – Tous droits réservés

Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Mesures de sécurité . 2
5 Appareillage . 2
6 Réactifs et milieux de culture . 4
6.1 Eau . 4
6.2 Bouillon tryptone soja (TSB) . 4
6.3 Gélose tryptone soja (TSA) . 5
6.4 Gélose pour transfert . 5
6.5 Bouillon nutritif . 5
6.6 Eau peptonée saline . 5
6.7 Solution physiologique saline . 5
6.8 Milieu de culture aux digestats de caséine et de soja avec lécithine et
polysorbate 80 (SCDLP) . 6
6.9 Tampon de dilution pour la suspension bactérienne d’extraction . 6
6.10 Solution neutralisante . 6
6.11 Gélose de dénombrement . 7
6.12 Gélose pour impression . . 7
6.13 Solution cryoprotectrice pour espèces bactériennes . 7
6.14 Solution mère du réactif standard d’ATP . 7
6.15 Solution tampon pour le réactif luminescent à l’ATP . 8
6.16 Réactif luminescent à l’ATP . 8
6.17 Réactif d’extraction de l’ATP . 8
6.18 Réactif d’élimination de l’ATP . 8
6.19 Milieu SCDLP ou autre milieu pour la préparation de la solution de référence d’ATP . 9
6.20 Solution physiologique saline d’extraction. 9
7 Souches de référence . 9
7.1 Souches . 9
7.2 Reconstitution et conservation des souches .10
7.2.1 Généralités .10
7.2.2 Méthode des billes en céramique .10
7.2.3 Méthode par suspension de glycérol .10
8 Modes opératoires d’essai .11
8.1 Méthode par absorption (voir Annexe E) .11
8.1.1 Incubation de la souche d’essai .11
8.1.2 Préparation de l’inoculum d’essai .12
8.1.3 Préparation des éprouvettes .12
8.1.4 Réalisation de l’essai.13
8.1.5 Résultats d’essai .14
8.2 Méthode par transfert (voir Annexe E) .15
8.2.1 Préparation de l’inoculum d’essai .15
8.2.2 Préparation des éprouvettes .16
8.2.3 Réalisation de l’essai.16
8.2.4 Résultats d’essai .17
8.3 Méthode par impression (voir Annexe E).19
8.3.1 Incubation de la souche d’essai .19
8.3.2 Préparation de l’inoculum d’essai .19
8.3.3 Prétraitement de l’éprouvette .19
8.3.4 Réalisation de l’essai.20
8.3.5 Résultats d’essai .22
9 Jugement de l’efficacité de l’activité antibactérienne .23
10 Rapport d’essai .23
Annexe A (normative) Numéros de souches .24
Annexe B (normative) Méthode d’agitation .25
Annexe C (normative) Mesurage quantitatif avec la méthode par comptage sur plaque.26
Annexe D (normative) Mesurage quantitatif avec la méthode par luminescence .27
Annexe E (informative) Exemples d’essais .29
Annexe F (informative) Efficacité de l’activité antibactérienne .32
Bibliographie .33
iv © ISO 2021 – Tous droits réservés

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 38, Textiles, en collaboration avec le
comité technique CEN/TC 248, Textiles et produits textiles, du Comité européen de normalisation (CEN),
conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 20743:2013), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes:
— mise à jour de l’Article 2;
— intégration de certaines notes au corps du texte;
— mise à jour de l’Annexe F.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
Introduction
Des produits textiles antibactériens spécialisés ont été introduits sur le marché et leur utilisation
s’étend chaque année à diverses applications. Ces textiles satisfont aux exigences des consommateurs
en matière de prévention et de protection contre les effets négatifs des bactéries, ce qui contribue à
garantir une certaine qualité de vie.
Il en résulte un besoin réel de disposer d’une Norme internationale traitant de méthodes d’essai visant
à déterminer l’activité antibactérienne des produits textiles antibactériens.
Une méthode d’essai qualitative pour l’activité antibactérienne a été élaborée dans le cadre de
l’ISO 20645. Il n’existait alors pas de norme d’essai pour la méthode quantitative, qui donne des
informations plus objectives concernant l’activité antibactérienne des produits textiles.
Bien qu’il existe six manières de combiner les méthodes d’ensemencement et de mesurage quantitatif
pour réaliser cet essai, le choix de ces manières dépend des pratiques des utilisateurs et résulte d’un
consensus entre les parties intéressées.
vi © ISO 2021 – Tous droits réservés

NORME INTERNATIONALE ISO 20743:2021(F)
Textiles — Détermination de l'activité antibactérienne des
produits textiles
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie des méthodes d’essai quantitatives permettant de déterminer l’activité
antibactérienne de tous les produits textiles antibactériens, y compris les nontissés.
Le présent document s’applique à tous les produits textiles, y compris l’étoffe, le rembourrage, le fil et
les matériaux utilisés pour les vêtements, la literie, l’ameublement et divers articles, quel que soit le
type d’agent antibactérien utilisé (organique, inorganique, naturel ou synthétique) ou quelle que soit la
méthode d’application (intégration, post-traitement ou greffage).
Le présent document traite de trois méthodes d’ensemencement pour la détermination de l’activité
antibactérienne:
a) la méthode par absorption (méthode d’évaluation dans laquelle la suspension bactérienne d’essai
est ensemencée directement sur des éprouvettes);
b) la méthode par transfert (méthode d’évaluation dans laquelle les bactéries d’essai sont placées sur
une boîte de milieu gélosé et transférées sur des éprouvettes);
c) la méthode par impression (méthode d’évaluation dans laquelle les bactéries d’essai sont placées
sur un filtre et imprimées sur des éprouvettes).
NOTE En tenant compte de l’application prévue et de l’environnement dans lequel le produit textile est
destiné à être utilisé, et également des propriétés de surface du textile, l’utilisateur peut choisir la méthode
d’ensemencement la plus adaptée.
Le présent document spécifie également la méthode par comptage sur plaque et la méthode par
luminescence de l’adénosine triphosphate (ATP) pour le dénombrement des bactéries.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 6330, Textiles — Méthodes de lavage et de séchage domestiques en vue des essais des textiles
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
3.1
étoffe témoin
étoffe utilisée pour valider les conditions de croissance des bactéries d’essai et valider l’essai
Note 1 à l'article: Il est possible d’utiliser une étoffe identique à celle devant être soumise à essai, mais n’ayant
subi aucun traitement antibactérien, ou une étoffe de coton 100 % sans azurage optique ni autre apprêt.
3.2
agent antibactérien
produit conçu pour empêcher ou atténuer la croissance des bactéries, pour réduire le nombre de
bactéries ou pour tuer les bactéries
3.3
apprêt antibactérien
traitement conçu pour empêcher ou atténuer la croissance des bactéries, pour réduire le nombre de
bactéries ou pour tuer les bactéries
3.4
activité antibactérienne
activité d’un apprêt antibactérien (3.3) dont l’utilisation vise à empêcher ou à atténuer la croissance des
bactéries, à réduire le nombre de bactéries ou à tuer les bactéries
3.5
méthode par comptage sur plaque
méthode dans laquelle le nombre de bactéries présentes après incubation est calculé en comptant le
nombre de colonies selon une méthode de dilution au dixième
Note 1 à l'article: Les résultats sont exprimés en UFC (unité formant colonie).
3.6
méthode par luminescence
méthode par laquelle la quantité d’ATP présente dans les cellules bactériennes est mesurée
Note 1 à l'article: Les résultats sont exprimés en moles d’ATP.
3.7
neutralisant
agent chimique utilisé pour désactiver, neutraliser ou atténuer les propriétés antibactériennes des
agents antibactériens (3.2)
4 Mesures de sécurité
Les méthodes d’essai spécifiées dans le présent document impliquent l’utilisation de bactéries.
Il convient que ces essais soient réalisés par des personnes formées et expérimentées dans la mise en
œuvre des techniques microbiologiques.
Il convient d’observer les mesures de sécurité appropriées en prenant en considération la réglementation
propre à chaque pays.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1 Spectrophotomètre, permettant de mesurer à une longueur d’onde comprise entre 620 nm
et 660 nm, ou néphélomètre de McFarland.
5.2 Incubateur, pouvant maintenir une température constante de (37 ± 2) °C.
2 © ISO 2021 – Tous droits réservés

5.3 Bains-marie, pouvant l’un maintenir une température constante de (46 ± 2) °C et l’autre une
température comprise entre 70 °C et 90 °C.
5.4 Agitateur, produisant une agitation de type vortex.
5.5 Machine stomacher, pouvant atteindre des vitesses comprises entre 6 coups par seconde
et 8 coups par seconde, munie des sacs jetables correspondants.
5.6 Paillasse propre, pour l’essai microbien.
5.7 Machine à laver, conforme aux spécifications de l’ISO 6330.
5.8 Chambre d’humidité, chambre tropicale ou autre enceinte pouvant maintenir des conditions
atmosphériques d’humidité élevée, supérieures à 70 % HR (humidité relative).
5.9 Photomètre de luminescence, permettant de mesurer l’ATP à une concentration comprise
−12 −7
entre 10 mol/l et 10 mol/l à une longueur d’onde comprise entre 300 nm et 650 nm avec un réactif
de mesurage de la luminescence.
5.10 Appareil d’impression, permettant d’appliquer une charge de 4 N sur une éprouvette et de faire
tourner cette éprouvette de 180° dans un sens pendant 3,0 s.
5.11 Réfrigérateur, pouvant maintenir une température comprise entre 2 °C et 8 °C.
5.12 Congélateurs, pouvant être réglés l’un à une température inférieure à −70 °C et l’autre à une
température inférieure à −20 °C.
5.13 Balance, de résolution égale à 0,01 g ou supérieure ainsi qu’à 0,1 mg ou supérieure.
5.14 Appareil de filtration, constitué d’un récipient supérieur muni d’une membrane filtrante et d’un
récipient inférieur muni d’un orifice d’aspiration.
5.15 Pipette, présentant le volume le mieux adapté pour chaque utilisation, munie d’un embout en
verre ou en matière plastique et ayant une tolérance inférieure ou égale à 0,5 %.
5.16 Flacons, contenants en verre d’une capacité de 30 ml, à ouverture vissée, munis d’un joint en
polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou en silicone et d’un couvercle en polypropylène, en polycarbonate ou
autre matériau approprié.
5.17 Boîtes de Petri, en verre ou en matière plastique, stérilisées et dont le diamètre est compris
entre 90 mm et 100 mm ou entre 55 mm et 60 mm.
5.18 Tige en verre, de 18 mm de diamètre environ.
5.19 Régulateurs d’ébullition (billes en verre), dont le diamètre est compris entre 3 mm et 4 mm.
5.20 Fiole Erlenmeyer, d’une capacité de 100 ml.
5.21 Gabarits de découpage, en matériau stérilisable (acier inoxydable ou verre), l’un de (38 ± 1) mm
de diamètre et l’autre de (60 ± 1) mm de diamètre.
5.22 Sachets plastiques jetables, sacs stériles appropriés pour une utilisation alimentaire, à utiliser
pour l’une des méthodes d’agitation des éprouvettes.
5.23 Brucelles, en matériau stérilisable.
5.24 Cylindre en acier inoxydable, d’une masse de (200 ± 10) g et d’un diamètre de (35 ± 1) mm.
5.25 Corbeille en fil métallique, pour l’autoclavage.
5.26 Feuille d’aluminium.
5.27 Agitateur-incubateur à agitation va-et-vient.
5.28 Autoclave, permettant d’effectuer une stérilisation à (121 ± 2) °C et à (103 ± 5) kPa.
5.29 pH-mètre, à électrode de verre.
6 Réactifs et milieux de culture
Les réactifs utilisés lors des essais doivent être de qualité analytique et/ou adaptés à des fins
microbiologiques.
Les produits déshydratés disponibles dans le commerce sont préconisés pour la préparation des milieux
de culture. Il convient de suivre rigoureusement les instructions du fabricant relatives à la préparation
de ces produits.
6.1 Eau
L’eau utilisée lors des essais doit être de qualité analytique pour la préparation des milieux
microbiologiques; cette eau est fraîchement distillée et/ou déionisée et/ou ultrafiltrée et/ou filtrée par
osmose inverse. Elle doit être exempte de toute substance toxique ou inhibitrice de bactéries.
6.2 Bouillon tryptone soja (TSB)
Tryptone, digestat pancréatique de caséine 17 g
Peptone de soja, digestion papaïnique de soja 3 g
Chlorure de sodium (NaCl) 5 g
Glucose 2,5 g
Hydrogénophosphate de potassium 2,5 g
Eau 1 000 ml
Bien mélanger et ajuster le pH, 7,2 ± 0,2
et stériliser par autoclavage (5.28).
4 © ISO 2021 – Tous droits réservés

6.3 Gélose tryptone soja (TSA)
Tryptone, digestat pancréatique de caséine 15 g
Peptone de soja, digestion papaïnique de soja 5 g
Chlorure de sodium (NaCl) 5 g
Agar-agar 15 g
Eau 1 000 ml
Bien mélanger et ajuster le pH, 7,2 ± 0,2
et stériliser par autoclavage (5.28).
6.4 Gélose pour transfert
Tryptone, digestat pancréatique de caséine 0,75 g
Peptone de soja, digestion papaïnique de soja 0,25 g
Chlorure de sodium (NaCl) 5 g
Agar-agar 15 g
Eau 1 000 ml
Bien mélanger et ajuster le pH, 7,2 ± 0,2
et stériliser par autoclavage (5.28).
6.5 Bouillon nutritif
Extrait de bœuf 3 g
Peptone 5 g
Eau 1 000 ml
Bien mélanger et ajuster le pH, 6,9 ± 0,2
et stériliser par autoclavage (5.28).
6.6 Eau peptonée saline
Peptone, digestat pancréatique de caséine 1 g
Chlorure de sodium (NaCl) 8,5 g
Eau 1 000 ml
Bien mélanger et ajuster le pH, 6,9 ± 0,2
et stériliser par autoclavage (5.28).
6.7 Solution physiologique saline
Chlorure de sodium (NaCl) 8,5 g
Eau 1 000 ml
Bien mélanger et stériliser par autoclavage (5.28).
6.8 Milieu de culture aux digestats de caséine et de soja avec lécithine et polysorbate 80
(SCDLP)
Peptone, digestat de caséine 17 g
Peptone, digestat de soja 3 g
Chlorure de sodium (NaCl) 5 g
Hydrogénophosphate de potassium 2,5 g
Glucose 2,5 g
Lécithine 1 g
Polysorbate 80 7 g
Eau 1 000 ml
Bien mélanger et ajuster le pH, 7,2 ± 0,2
et stériliser par autoclavage (5.28).
Si le pouvoir neutralisant est insuffisant, la teneur en monooléate de polyoxyéthylène (20) sorbitane –
ou polysorbate 80 – ou en lécithine peut être ajustée ou un autre agent de neutralisation peut être
ajouté. Toute utilisation d’un neutralisant non spécifié doit être consignée, en indiquant son nom et sa
concentration.
6.9 Tampon de dilution pour la suspension bactérienne d’extraction
Solution tampon à 0,005 mol/l de dihydrogénophosphate de sodium contenant 0,037 % de saccharose.
pH 7,2 ± 0,2
6.10 Solution neutralisante
La composition de la solution neutralisante standard doit être la suivante.
Polysorbate 80 30 g
Lécithine de jaune d’œuf 3 g
Chlorhydrate d’histidine 1 g
Peptone de viande ou de caséine 1 g
Chlorure de sodium (NaCl) 4,3 g
Phosphate monopotassique 3,6 g
Phosphate disodique dihydraté 7,2 g
Eau 1 000 ml
Bien mélanger et stériliser par autoclavage (5.28).
Si le pouvoir neutralisant est insuffisant, la teneur en monooléate de polyoxyéthylène (20) sorbitane –
ou polysorbate 80 – ou en lécithine peut être ajustée ou un autre agent de neutralisation peut être
ajouté. Toute utilisation d’un neutralisant non spécifié doit être consignée, en indiquant son nom et sa
concentration.
6 © ISO 2021 – Tous droits réservés

6.11 Gélose de dénombrement
Extrait de levure déshydraté 2,5 g
Peptone trypsique de caséine 5,0 g
Glucose 1,0 g
Agar-agar 12 g à 18 g (en fonction du pouvoir
gélifiant du produit)
Eau 1 000 ml
Bien mélanger et ajuster le pH, 7,2 ± 0,2
et stériliser par autoclavage (5.28).
6.12 Gélose pour impression
Agar-agar 20 g
Eau 1 000 ml
Bien mélanger et stériliser par autoclavage (5.28).
6.13 Solution cryoprotectrice pour espèces bactériennes
Pour la congélation, une solution cryoprotectrice contenant 150 g/l de glycérol ou 100 g/l de
diméthylsulfoxyde doit être utilisée. Elle est préparée comme suit.
TSB (6.2) ou bouillon nutritif (6.5): 1 000 ml
Ajouter du
glycérol: 150 g
ou
diméthylsulfoxyde: 100 g
Bien mélanger et stériliser par autoclavage (5.28).
Pour les solutions contenant du glycérol, stériliser la solution mélangée par autoclavage (5.28). Pour les
solutions contenant du diméthylsulfoxyde, stériliser la solution mélangée en utilisant une membrane
filtrante de porosité 0,22 µm.
Tout produit disponible dans le commerce peut être utilisé, à condition qu’il s’agisse d’une solution
cryoprotectrice ou d’un système de conservation contenant du glycérol ou du diméthylsulfoxyde et
permettant la conservation des souches de la même manière que les solutions spécifiées.
6.14 Solution mère du réactif standard d’ATP
−4
La concentration du réactif standard d’ATP est de 1 × 10 mol/l, que l’on obtient par le mélange suivant.
Adénosine 5’-triphosphate 60,5 mg
disodique trihydraté
Eau 1 000 ml (volume final)
Après préparation, la solution doit être placée dans un récipient fermé hermétiquement et cryoconservée
à une température inférieure ou égale à −20 °C. La solution doit être utilisée dans les six mois suivant la
date de préparation.
La quantité adéquate d’adénosine 5’-triphosphate disodique trihydraté peut être calculée à partir de la
teneur en ATP de chaque produit commercial.
6.15 Solution tampon pour le réactif luminescent à l’ATP
N-[Tris (hydroxyméthyl) méthyl] 1 117 mg
glycine
Sel disodique de l’acide 183 mg
éthylènediaminetétraacétique dihydraté
Acétate de magnésium tétrahydraté 808 mg
DL-Dithio-1,4 thréitol 6,7 mg
Dextrine 25 000 mg
Saccharose 925 mg
Eau 250 ml (volume final)
pH 7,5 ± 0,2
6.16 Réactif luminescent à l’ATP
Luciférase (EC 1.13.12.7) 16,0 mg
D-Luciférine 12,6 mg
Albumine sérique bovine 56 mg
Solution tampon (6.15) 30 ml
Après dissolution totale, laisser reposer 15 min à température ambiante avant utilisation. Utiliser le
produit dans les 3 h suivant sa préparation.
Lorsqu’un réactif luminescent à l’ATP différent est utilisé, sa composition doit être consignée.
6.17 Réactif d’extraction de l’ATP
N-[Tris (hydroxyméthyl) méthyl] glycine 45 mg
Solution aqueuse à 10 % de chlorure de benzalkonium 0,2 ml
Eau 9,8 ml
pH 12,0 ± 0,5
Lorsqu’un réactif d’extraction de l’ATP différent est utilisé, sa composition doit être consignée.
6.18 Réactif d’élimination de l’ATP
−13
Agent permettant de réduire la teneur en ATP dans le bouillon nutritif (6.5) à moins de 10 mol/l
en 15 min.
Utiliser le produit dans les 8 h suivant sa préparation.
8 © ISO 2021 – Tous droits réservés

Apyrase (EC 3.6.1.5) 4,6 unités internationales/ml
Adénosine-phosphate-désaminase 46 unités internationales/ml
(EC 3.5.4.6 ou EC 3.5.4.17)
Saccharose 37 mg
Albumine sérique bovine 20 mg
Solution tampon à 0,05 mol/l 10 ml
d’acide 2-morpholino éthanesulfonique
monohydraté
pH 6,0 ± 0,5
Lorsqu’un réactif d’élimination de l’ATP différent est utilisé, sa composition doit être consignée.
NOTE Réactif disponible dans le commerce.
6.19 Milieu SCDLP ou autre milieu pour la préparation de la solution de référence d’ATP
Milieu SCDLP (6.8) ou autre milieu 10 ml
Réactif d’élimination de l’ATP (6.18) 1 ml
Après mélange, maintenir à une température comprise entre 30 °C et 37 °C pendant 1 h afin d’éviter une
contamination microbiologique.
Ensuite, transférer dans un bain-marie chauffé à une température comprise entre 70 °C et 90 °C
pendant 1 h et laisser refroidir à température ambiante.
Conserver la solution au réfrigérateur et l’utiliser dans les 24 h.
Il convient de préparer une solution de référence d’ATP si l’ajout d’agents neutralisants entraîne un
−11
dépassement au-delà de 10 mol/l de la teneur en ATP dans la solution d’extraction.
6.20 Solution physiologique saline d’extraction
Chlorure de sodium (NaCl) 8,5 g
Polysorbate 80 2,0 g
Eau 1 000 ml
Bien mélanger et stériliser par autoclavage (5.28).
7 Souches de référence
7.1 Souches
Les souches suivantes doivent être utilisées dans tous les essais d’activité antibactérienne. Les numéros
de souche doivent correspondre à ceux décrits à l’Annexe A.
— Staphylococcus aureus
— Klebsiella pneumoniae
7.2 Reconstitution et conservation des souches
7.2.1 Généralités
Les souches doivent être reconstituées et conservées conformément aux recommandations du
fournisseur.
Il est également possible de recourir à la méthode de conservation décrite dans l’EN 12353.
7.2.2 Méthode des billes en céramique
Remettre en suspension, dans 5 ml de TSB (6.2), un échantillon de la souche bactérienne lyophilisée,
en suivant les recommandations fournies avec la culture. Prélever un échantillon de la suspension et
l’isoler dans une boîte de Petri (5.17) contenant de la TSA (6.3). Incuber les cultures pendant 18 h à 24 h
à (37 ± 2) °C.
Après incubation, utiliser la culture isolée dans la boîte de Petri pour vérifier la pureté de la souche.
Après vérification, préparer les cultures mères.
Prélever 0,7 ml du bouillon de culture et l’étaler sur la surface de la boîte de Petri contenant la TSA.
Incuber les cultures sur des plaques pendant 18 h à 24 h à (37 ± 2) °C.
Ajouter 10 ml de solution cryoprotectrice (6.13) sur la surface de la culture sur plaque avec TSA et
remettre en suspension les cellules en se servant d’un étaleur en verre stérilisé. Prélever les cellules en
suspension de la surface de la gélose, les diluer dans 100 ml de solution cryoprotectrice et les incuber
pendant 30 min à 20 °C.
À l’aide d’une pipette (5.15), prélever 1 ml de la suspension et le transférer dans un flacon
cryogénique (5.16) contenant les billes (5.19). Agiter le flacon afin de répandre les cellules en suspension
autour des billes.
— Lors de l’utilisation d’une solution cryoprotectrice contenant du diméthylsulfoxyde, ne pas laisser
reposer au-delà de 1 min à température ambiante.
— Lors de l’utilisation d’une solution cryoprotectrice contenant du glycérol, laisser reposer
pendant 30 min à 20 °C.
— Retirer l’excès de solution cryoprotectrice avec une pipette stérile. Placer les flacons cryogéniques
dans un congélateur (5.12) réglé à une température égale ou inférieure à −70 °C.
−6 −7
Préparer des dilutions à 10 et 10 de la suspension en utilisant la méthode de dilution en série.
Prélever un échantillon de 1,0 ml de chaque dilution et le transférer dans des boîtes de Petri séparées.
Ajouter 12 ml à 15 ml de solution nutritive, refroidie à (45 ± 1) °C. Incuber pendant 18 h à 24 h dans les
conditions spécifiées pour la souche. Dénombrer les cultures sur plaque et confirmer que la suspension
contient moins de 5 × 10 UFC/ml.
Conserver les flacons cryogéniques dans un congélateur à une température inférieure à −70 °C.
7.2.3 Méthode par suspension de glycérol
Ensemencer un tube à culture de 15 ml contenant 5 ml de milieu approprié avec une colonie isolée
fraîchement cultivée. Incuber, pour une durée généralement comprise entre 5 h et toute une nuit, à 37 °C
jusqu’à ce que la culture de bactéries ait l’air de se trouver en phase logarithmique tardive ou en phase
stationnaire sur la courbe de croissance.
Pour chaque souche à conserver à une température inférieure à −70 °C, préparer pour les archives
un flacon cryogénique stérile étiqueté. Introduire 225 μl de glycérol stérile à 80 % dans le flacon
cryogénique. Ajouter 1,0 ml de culture bactérienne (la solution mère congelée doit être du glycérol
à 15 %). Bien mélanger à l’aide d’un agitateur de type vortex (5.4) et conserver dans un tube à une
température égale ou inférieure à −70 °C.
10 © ISO 2021 – Tous droits réservés

Pour chaque souche à conserver à −20 °C, en tant que solution mère de travail de glycérol liquide, pipeter
des volumes équivalents de glycérol à 80 % et de culture bactérienne dans un tube en polypropylène
étiqueté. Bien mélanger le contenu afin d’éviter la formation de cristaux de glace qui diminueraient la
viabilité des cellules. Placer le tube dans un congélateur à −20 °C. Si possible, vérifier la viabilité des
cellules après une semaine.
Pour récupérer une souche à partir de la solution mère de glycérol conservée à une température
inférieure à −70 °C, utiliser un cure-dent stérile pour gratter des morceaux de la substance solide et
ensemencer en stries les cellules sur le milieu approprié. La solution mère congelée ne doit pas être
dégelée, car chaque cycle de gel-dégel entraînera une perte de viabilité des cellules de 50 %.
Pour utiliser la solution mère de travail à −20 °C, pipeter entre 50 μl et 100 μl comme inoculum pour
une culture de 5 ml pendant une nuit.
8 Modes opératoires d’essai
8.1 Méthode par absorption (voir Annexe E)
8.1.1 Incubation de la souche d’essai
8.1.1.1 Prélever la souche conservée sous forme de culture mère à l’aide d’une anse d’inoculation,
ensemencer en stries sur la boîte de gélose de dénombrement (6.11) ou de TSA (6.3) et incuber
à (37 ± 2) °C pendant 24 h à 48 h.
La boîte est maintenue à une température comprise entre 5 °C et 10 °C et il convient de l’utiliser dans la
semaine suivant sa préparation.
8.1.1.2 Verser 20 ml du bouillon nutritif (6.5) ou de TSB (6.2) dans une fiole Erlenmeyer de
capacité 100 ml. À l’aide d’une anse d’inoculation, recueillir une colonie à partir de l’incubation spécifiée
en 8.1.1.1 et l’ensemencer dans le bouillon. Incuber dans les conditions suivantes:
Température: (37 ± 2) °C
−1
Vitesse d’agitation: 110 min et 3 cm d’amplitude avec l’agitateur-incubateur à agitation va-et-vient
(5.27)
Durée d’incubation: 18 h à 24 h
8.1.1.3 Verser 20 ml du bouillon nutritif (6.5) ou de TSB (6.2) dans une fiole Erlenmeyer de
capacité 100 ml. Y ajouter 0,4 ml de l’inoculum provenant de l’incubation spécifiée en 8.1.1.2 présentant
8 8
une concentration en bactéries comprise entre 1 × 10 UFC/ml et 3 × 10 UFC/ml ou une concentration
−6 −6
en ATP comprise entre 1 × 10 mol/l et 3 × 10 mol/l et incuber dans les conditions suivantes:
Température: (37 ± 2) °C
−1
Vitesse d’agitation: 110 min et 3 cm d’amplitude avec l’agitateur-incubateur à agitation va-et-vient
(5.27)
Durée d’incubation: (3 ± 1) h
7 −7
UFC ou concentration en ATP cible après incubation: 10 UFC/ml ou 10 mol/l.
L’inoculum préparé doit être conservé sur glace et utilisé dans les 8 h.
8.1.2 Préparation de l’inoculum d’essai
5 5
Ajuster la concentration en bactéries à une valeur comprise entre 1 × 10 UFC/ml et 3 × 10 UFC/ml à
l’aide d’un spectrophotomètre ou d’un néphélomètre de McFarland (5.1);
ou
−9 −9
ajuster la concentration en ATP à une valeur comprise entre 1 × 10 mol/l et 3 × 10 mol/l à l’aide de la
méthode par luminescence, en utilisant le bouillon nutritif (6.5) ou le TSB (6.2) après l’avoir dilué 20 fois
avec de l’eau à température ambiante.
L’inoculum préparé doit être conservé sur glace et utilisé dans les 4 h.
8.1.3 Préparation des éprouvettes
8.1.3.1 Masse et forme des éprouvettes
8.1.3.1.1 Préparer des éprouvettes d’une masse de (0,40 ± 0,05) g et les découper à une taille adaptée
pour des éprouvettes.
8.1.3.1.2 Préparer six éprouvettes à partir de l’échantillon soumis à essai antibactérien et six
éprouvettes à partir d’étoffe témoin ou d’étoffe non traitée, si disponible.
Trois des éprouvettes témoins et trois des éprouvettes soumises à essai antibactérien sont utilisées
pour un temps zéro immédiatement après ensemencement. Les six éprouvettes restantes sont utilisées
pour le temps de contact, après une période d’incubation comprise entre 18 h et 24 h.
8.1.3.2 Montage des éprouvettes
Placer chacune des éprouvettes dans des flacons individuels en choisissant la méthode adaptée, selon la
nature de l’échantillon pour essai.
a) Si les éprouvettes ont tendance à s’enrouler facilement ou si elles contiennent du rembourrage ou
du duvet, introduire une tige en verre (5.18) sur l’éprouvette présente dans le flacon. Autrement,
attacher les deux extrémités de l’éprouvette avec du fil.
b) Si l’éprouvette est du fil, disposer celui-ci en petite échevette et introduire une tige en verre sur
l’éprouvette présente dans le flacon.
c) Si l’éprouvette provient d’une moquette ou d’un produit de structure similaire, couper le velours et
introduire une tige en verre sur l’éprouvette présente dans le flacon.
Lorsque cela est nécessaire, les échantillons pour essai peuvent être lavés conformément à l’ISO 6330
ou par une autre méthode appropriée et, après le lavage final, les échantillons sont rincés avec de l’eau
afin d’éliminer le détergent de lavage. Toute utilisation d’une méthode non spécifiée doit être consignée.
8.1.3.3 Stérilisation
8.1.3.3.1 Généralités
Lorsqu’une contamination est présente ou suspectée, stériliser les éprouvettes par autoclavage (5.28)
selon le mode opératoire suivant.
8.1.3.3.2 Mode opératoire
8.1.3.3.2.1 Envelopper l’ouverture des flacons contenant les éprouvettes avec une feuille
d’aluminium (5.26).
12 © ISO 2021 – Tous droits réservés

8.1.3.3.2.2 Placer les flacons enveloppés dans une corbeille en fil métallique (5.25) pour autoclavage.
8.1.3.3.2.3 Envelopper les couvercles des flacons d’une feuille d’aluminium et les placer dans la
corbeille en fil métallique.
8.1.3.3.2.4 Stériliser les couvercles et les flacons contenant les éprouvettes par autoclavage
pendant 15 min à 20 min.
8.1.3.3.2.5 Après stérilisation, retirer la feuille d’aluminium et laisser sécher les éprouvettes dans les
flacons pendant une durée égale ou supérieure à 60 min, en les plaçant sur une paillasse propre (5.6) ou
à tout autre endroit où il n’existe aucun risque de contamination aérienne.
8.1.3.3.2.6 Fermer hermétiquement les flacons.
Lorsqu’il n’est pas possible de passer à l’autoclave, la stérilisation peut être réalisée par un traitement
à l’oxyde d’éthylène gazeux, aux rayons gamma ou par une autre méthode appropriée. Toute utilisation
d’autres méthodes doit être consignée.
8.1.4 Réalisation de l’essai
8.1.4.1 Ensemencement des éprouvettes
Pipeter avec exactitude 0,2 ml de l’inoculum préparé en 8.1.2 en plusieurs endroits sur chaque
éprouvette préparée en 8.1.3.2, afin de s’assurer que l’inoculum ne touche pas la surface du flacon, et
fermer les flacons.
8.1.4.2 Extraction après ensemencement
Immédiatement après l’ensemencement décrit en 8.1.4.1, introduire 20 ml du milieu de culture
SCDLP (6.8) ou de solution neutralisante (6.10) ou de solution physiologique saline d’extraction (6.20)
dans chacun des six flacons dans lesquels ont été placés une éprouvette témoin et une éprouvette
soumise à essai antibactérien. Fermer les flacons et procéder à l’extraction de la manière spécifiée à
l’Annexe B, manuellement ou à l’aide d’un agitateur (5.4) ou d’une machine stomacher (5.5) en plaçant
l’éprouvette dans un sac stérile (5.22).
8.1.4.3 Incubation
Incuber les six flacons (trois éprouvettes témoins, trois éprouvettes soumises à essai) à (37 ± 2) °C
pendant 18 h à 24 h.
8.1.4.4 Extraction après incubation
Après l’incubation décrite en 8.1.4.3, introduire 20 ml du milieu de culture SCDLP (6.8) ou de
...