ISO 13366-2:2006
(Main)Milk — Enumeration of somatic cells — Part 2: Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters
Milk — Enumeration of somatic cells — Part 2: Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters
ISO 13366-2|IDF 148-2:2006 gives guidance on the operating conditions for counting somatic cells, in both raw and chemically preserved milk, using fluoro-opto-electronic somatic cell counters in which either a rotating disc technique or flow cytometry is applied in the counting section. The guidance is applicable to the counting of somatic cells in raw cow milk. The guidance is also applicable to raw milk of other species, such as goat, sheep and buffalo, if the specified prerequisites are met.
Lait — Dénombrement des cellules somatiques — Partie 2: Lignes directrices pour la mise en oeuvre des compteurs fluoro-opto-électroniques
L'ISO 13366-2 | FIL 148-2:2006 indique des lignes directrices concernant les conditions opératoires pour le dénombrement des cellules somatiques dans le lait cru et le lait contenant des conservateurs chimiques, à l'aide de compteurs fluoro-opto-électroniques utilisant soit une méthode sur disque rotatif, soit la cytométrie en flux pour la partie comptage. Les présentes lignes directrices s'appliquent au dénombrement des cellules somatiques dans le lait cru de vache. Elles s'appliquent également au dénombrement dans le lait cru d'animaux d'autres espèces, telles que la chèvre, la brebis et la bufflesse, si les conditions préalables spécifiées sont remplies.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 13366-2
IDF
148-2
Second edition
2006-10-01
Milk — Enumeration of somatic cells —
Part 2:
Guidance on the operation
of fluoro-opto-electronic counters
Lait — Dénombrement des cellules somatiques —
Partie 2: Lignes directrices pour la mise en œuvre des compteurs
fluoro-opto-électroniques
Reference numbers
ISO 13366-2:2006(E)
IDF 148-2:2006(E)
©
ISO and IDF 2006
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ISO 13366-2:2006(E)
IDF 148-2:2006(E)
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IDF 148-2:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
Foreword. v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 2
5 Factors affecting the results of measurements. 2
5.1 Sample bottles . 2
5.2 Sampling. 2
5.3 Preservation . 3
5.4 Sample storage and transport. 3
5.5 Interfering substances . 3
5.6 Sample quality at analysis . 4
5.7 Applied chemicals . 4
5.8 Instrument condition . 4
5.9 Working factor. 5
5.10 Testing volumes. 5
6 Calibration . 5
6.1 Reference materials. 5
6.2 Calibration procedure. 6
7 Sampling. 8
8 Determination. 8
9 Checks on performance in routine operation. 8
9.1 Blank checks . 8
9.2 Carry-over effect . 8
9.3 Ratio of reagent volume and test sample volume. 9
9.4 Pilot checks . 9
9.5 Additional instrument surveillance. 9
9.6 Repeatability. 9
9.7 Intralaboratory reproducibility . 10
9.8 External comparisons . 10
10 Specific remarks for the use with milk from different species . 10
10.1 General. 10
10.2 Cow milk . 10
10.3 Goat milk. 10
10.4 Sheep milk . 11
10.5 Buffalo milk . 11
11 Precision. 11
11.1 Repeatability. 11
11.2 Intralaboratory reproducibility . 11
11.3 Reproducibility. 12
12 Test report . 12
Bibliography . 13
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IDF 148-2:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 13366-2⎪IDF 148-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee
SC 5, Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO
and IDF.
This edition of ISO 13366-2⎪IDF 148-2 cancels and replaces ISO 13366-2:1997 and ISO 13366-3:1997, which
have been technically revised.
ISO 13366 consists of the following parts, under the general title Milk — Enumeration of somatic cells:
— Part 1: Microscopic method (Reference method)
— Part 2: Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters
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ISO 13366-2:2006(E)
IDF 148-2:2006(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a worldwide federation of the dairy sector with a National
Committee in every member country. Every National Committee has the right to be represented on the IDF
Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in the development of
standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
Draft International Standards adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the
National Committees for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 50 % of
the IDF National Committees casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 13366-2⎪IDF 148-2 was prepared by the International Dairy Federation (IDF) and Technical Committee
ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published jointly by IDF
and ISO.
All work was carried out by the Joint ISO-IDF Action Team on Automated methods, of the Standing
Committee on Quality assurance, statistics of analytical data and sampling, under the aegis of its project
leaders, Mrs S. Orlandini (IT) and Mr H.J.C.M. van den Bijgaart (NL).
This edition of ISO 13366-2⎪IDF 148-2 cancels and replaces IDF 148A:1995, methods B and C of which have
been technically revised.
ISO 13366 consists of the following parts, under the general title Milk — Enumeration of somatic cells:
— Part 1: Microscopic method (Reference method)
— Part 2: Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters
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ISO 13366-2:2006(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 148-2:2006(E)
Milk — Enumeration of somatic cells —
Part 2:
Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters
1 Scope
This part of ISO 13366⎪IDF 148 gives guidance on the operating conditions for counting somatic cells, in both
raw and chemically preserved milk, using fluoro-opto-electronic somatic cell counters in which either a rotating
disc technique or flow cytometry is applied in the counting section.
The guidance is applicable to the counting of somatic cells in raw cow milk. The guidance is also applicable to
raw milk of other species, such as goat, sheep and buffalo, if the specified prerequisites are met.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 8196-1⎪IDF 128-1, Milk — Definition and evaluation of the overall accuracy of indirect methods of milk
analysis — Part 1: Analytical attributes of indirect methods
ISO 8196-2⎪IDF 128-2, Milk — Definition and evaluation of the overall accuracy of indirect methods of milk
analysis — Part 2: Calibration and quality control in the dairy laboratory
ISO 13366-1⎪IDF 148-1, Milk — Enumeration of somatic cells — Part 1: Microscopic method (Reference
method)
ISO Guide 34, General requirements for the competence of reference material producers
ISO Guide 43-1, Proficiency testing by interlaboratory comparisons — Part 1: Development and operation of
proficiency testing schemes
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 8196-1⎪IDF 128-1,
ISO 8196-2⎪IDF 128-2 and the following apply.
3.1
reference method
method described in ISO 13366-1⎪IDF 148-1 for the counting of somatic cells
3.2
somatic cells
those cells that show more than a threshold intensity of fluorescence due to the staining of DNA in their nuclei
NOTE The number of somatic cells is expressed in cells per millilitre.
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IDF 148-2:2006(E)
4 Principle
Fluoro-opto-electronic counters contain functions for the uptake of reagents and test sample, a mixing section
and a counting section. In the mixing section, the test sample is mixed with a buffer and a stain solution. Part
of the resulting mixture is transferred to the counting section and put onto an object plane. Each stained
particle observed with a fluorescence microscope produces an electrical pulse that is filtered, amplified and
recorded. The resulting pulse height distribution is electronically processed, whereby discrimination is made
between noise signals and pulses that are attributed to stained somatic cells. The discriminator level can
either be fixed or dynamic.
In the mixing section, closely controlled volumes of test sample and buffer/stain solutions are dosed and
mixed. Mixing can take place in a cup, a mixing chamber, a centrifuge, a sample loop or in the tubing leading
to a flow cell.
In the counting section, either disc cytometry or flow cytometry can be applied. In the case of disc cytometry, a
thin film of the mixture is brought through a nozzle to the top of a vertical rotating disc. This rotating surface
acts as a moving object plane for a fluorescence microscope. When using flow cytometry, part of the mixture
is placed in the high-speed flow of a surrounding sheath liquid in a capillary flow cell. Through acceleration,
the mixture forms a thin string in which the somatic cells are dynamically focused and aligned. This string then
passes the objective of a fluorescence microscope.
Some instruments contain two channels in the counting section. In terms of analytical quality assurance, such
a situation should be considered equivalent to working with two separate units, so the performance should be
evaluated separately for each channel.
5 Factors affecting the results of measurements
5.1 Sample bottles
Sample bottles should be fit for use; i.e. to transfer test samples from the point of sampling to the laboratory
without loss or damage.
Care is to be exercised that sample bottles are leak-proof and that a proper empty volume is left. Too large an
empty volume can facilitate churning; too small an empty volume can cause problems with mixing.
5.2 Sampling
5.2.1 General
Sampling materials (i.e. sample bottles, beakers and sampling devices) should be clean and dry. Where
automatic samplers are used, these should have been properly validated.
Test samples should preferably be cooled immediately after sampling to between 0 °C and 6 °C and be kept
at that temperature until counting (see 5.4) rather than being preserved. Freezing should be avoided. If
preservation is necessary, suitable means for chemical preservation of test samples are described in 5.3.
5.2.2 Bulk milk samples
Thorough mixing of the raw bulk milk to be sampled is essential. Somatic cells will concentrate in the upper
and lower layers in the case of insufficient stirring.
5.2.3 Milk samples from individual animals
The release of somatic cells in the milk during milking is uneven. When the aim is to produce a representative
counting result for a whole milking, it is essential that a representative sample of the whole milking be
obtained. For diagnostic purposes, a sample of a partial milking may suffice.
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IDF 148-2:2006(E)
5.3 Preservation
If chemical preservation is considered necessary, the test sample (5.2.1) should be preserved as soon as
possible, but in any case within 24 h after sampling. In all cases, the test sample should be kept cool (0 °C to
6 °C) until the addition of the preservative.
Suitable preservatives are the following.
a) Boric acid: its final concentration in the test sample should not exceed 0,6 g/100 ml. Such preserved
samples may be stored at between 6 °C and 12 °C for up to a further 24 h.
b) Sodium azide: its final concentration in the test sample should not exceed 0,024 g/100 ml. Such
preserved samples may be stored at between 2 °C and 10 °C for up to a further 72 h.
c) Bronopol (2-bromo-2-nitro-1,3-propanediol): its final concentration in the test sample should not exceed
0,05 g/100 ml. Such preserved samples may be stored at between 2 °C and 12 °C for up to a further 6 d.
d) Potassium dichromate: its final concentration in the test sample should not exceed 0,2 g/100 ml. Such
preserved samples may be stored at between 2 °C and 12 °C for up to a further 6 d.
Accompanying colour tracers found to be suitable are
⎯ Patent Blue V with a final concentration in the test sample of up to 0,15 mg/100 ml,
⎯ Yellow Orange S (E110) with a final concentration in the test sample of up to 1 mg/100 ml, and
⎯ a mixture of Patent Blue V and Eosin B with a final concentration in the test sample of up to 0,03 mg and
0,45 mg/100 ml, respectively.
Other preservatives and colour tracers may be used provided that their effectiveness and conditions for use
have been soundly validated.
In all cases, properly validate the absence of interference for the counting equipment concerned before
application.
In cases where fluoro-opto-electronic cell counters are combined with milk analysers for the measurement of
other test sample components, care should be taken that the applied preservatives and colour tracers do not
affect the counting result.
5.4 Sample storage and transport
Unpreserved test samples should be stored at between 0 °C and 6 °C and should be counted within 96 h after
the completion of sampling. Avoid freezing the test samples. Storage at higher temperatures and/or over
longer time scales may result in non-representative counts. The measurement of samples after freezing and
thawing may result in lower counts (by 10 % to 20 %). The age of the samples at freezing and the type of
thawing process can influence the counting result.
5.5 Interfering substances
The use of substances that interfere in the counting should be avoided. Substances known to influence the
instrument read-out are
a) preservatives and colour tracers at higher concentrations than specified in 5.3, and
b) Methylene blue at higher concentrations, i.e. > 0,06 mg/100 ml.
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IDF 148-2:2006(E)
5.6 Sample quality at analysis
Breakdown of somatic cells (lysis) will result in an increase of smaller cell fragments. The lower intensity of
fluorescence after staining of these particles causes a shift in the pulse height distribution to the left. This will
hamper proper differentiation from noise pulses and therefore result in a lower count.
NOTE In several types of instruments, features are available for evaluating the position and the shape of the pulse
height distribution. See the relevant instructions and guidance from the instrument manufacturer.
After the processing of problematic samples, the flow path should be checked and possible cleaned. The
proper functioning of the instrument should be tested before further use. Possible problematic test samples
are
a) milk samples from severely infected udders, i.e. with clots,
b) milk samples with impurities,
c) milk samples with high numbers of erythrocytes,
d) colostrum,
e) late lactation milk, and
f) sour milk.
Where possible, analysis of problematic test samples should be avoided.
5.7 Chemicals used
All reagents used should be of recognized analytical and bacteriological quality. Water used should be
demineralized (remaining conductivity < 10 µS/cm) or water of at least equivalent purity. Follow the
manufacturer's instructions for the preparation of the working solutions, the maximum storage time and
storage requirements.
Local conditions regarding the use and discharge of applied chemicals and effluents should be observed.
5.8 Instrument condition
5.8.1 General points of attention are
a) the functioning of the mixing device and the stirrer,
b) possible disturbances at sample intake and in the flow system due to blocking by impurities, clots or
fouling in the mixing and incubation units, and
c) the condition and the functioning of the light source and the photo multiplier, the gain setting and the
signal quality.
5.8.2 Specific points of attention with disc cytometric counters are
a) the positioning of the film on the rotating disc,
b) the cleanliness of the object plane and the functioning of the cleaning sponge; timely replacement of the
sponge is essential, and
c) proper emptying of the collection vessel for the rinsing liquid.
5.8.3 A specific point of attention with flow cytometric counters is the variation in the behaviour of the
sample string in the flow cell and the sheath liquid flow. Some instrument manufacturers offer special
programme features for checking this, thereby indicating possible solutions in the case of deviations.
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ISO 13366-2:2006(E)
IDF 148-2:2006(E)
5.9 Working factor
The working factor is the number by which the actual number of somatic cells counted by an instrument is
multiplied in order to arrive at the somatic cell count of the test sample. In theory, precision characteristics and
accuracy should benefit from a lower working factor.
5.10 Testing volumes
A proper ratio between the volume of buffer/stain solution and that of the test sample is essential for correct
counting.
6 Calibration
6.1 Reference materials
6.1.1 General
Reference materials should be produced under closely controlled conditions; i.e. working with a quality
assurance system and fulfilling the requirements as listed in ISO Guide 34.
Reference materials may be
a) certified reference materials (CRMs) as produced by a recognized official organization,
b) secondary reference materials (SRMs) as prepared by an external supplier, or
c) in-house reference materials (IRMs) as prepared by the laboratory itself, whereby traceability is kept with
CRMs, SRMs or via interlaboratory proficiency studies.
NOTE CRMs for somatic cell counting are not available. Examples of suitable procedures for the preparation of IRMs
are listed below. IRMs with a composition as close as possible to natural milk are preferable.
6.1.2 Preparation of calibration samples
6.1.2.1 Preparation by addition of a bovine leucocyte suspension
a) Mix 1 000 ml of sterilized or UHT milk with low somatic cell count with 1 ml of polypropylene 2000 and
0,4 g of bronopol.
b) Add the required amount of a suitable leucocyte suspension to different portions of the mixture in order to
obtain a suitable range of cell counts.
6.1.2.2 Preparation by microfiltration
a) Collect fresh bulk milk and add bronopol to a final mass fraction of 0,02 %.
b) Skim the milk in a cream separator to a mass fraction of fat of below 0,1 %.
c) Concentrate the skimmed milk 20-fold by applying tangential microfiltration over a membrane with a pore
size of 0,8 µm, resulting in a portion with a high cell content (HCM) and a portion with a low cell content
(LCM).
d) Mix cream, HCM and LCM in the required quantities so as to obtain 5 to 8 milk portions with a mass
fraction of fat of 3,5 % and different levels of cell counts covering the range of interest.
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ISO 13366-2:2006(E)
IDF 148-2:2006(E)
6.1.2.3 Preparation by centrifugation
a) Collect fresh bulk milk and add bronopol to a final mass fraction of 0,02 %.
b) Filter the thus-prepared milk over a metal filter with a pore size of 0,5 mm.
c) Skim the filtered milk by centrifuging at a radial acceleration of 40 g for 10 min so as to obtain cream,
skimmed milk and a pellet.
d) Mix the skimmed milk and pellet material in the required quantities so as to obtain 5 to 8 milk portions with
different cell count levels covering the range of interest.
e) If necessary, add cream so as to obtain portions with a mass fraction of fat of 3,3 % ± 0,3 %.
5
f) Split the obtained portions into individual samples and heat these at 120 °C and 10 Pa for 3 min.
6.1.3 Assignment of reference values
Reference values should be determined by replicate analysis with the reference method described in
ISO 13366-1⎪IDF 148-1, preferably in at least two different laboratories.
Parallel replicate counting of calibration samples by instrumental methodology, accurately calibrated with a
still valid former set of calibration samples, can play a valuable supportive role in suppressing fluctuations in
counting levels over time.
Sound congruence should normally be found; that is a maximum difference between reference method results
and instrumental countings for individual calibration samples of less than 10 %. In such cases, the obtained
reference method values and instrumental countings may be combined, whereby the result of the reference
method should be included with a weighting factor of at least 0,5 in the assigned reference value.
In cases where the results from counting in test samples are to be used for checking against official limits,
approval from competent authorities should be sought for the procedure on the assignment of reference
values.
6.1.4 Storage conditions and keeping time
The storage conditions and the keeping time of the prepared reference materials should be properly validated.
A shelf life of one month is considered to be a minimum.
When chemical preservation is used, alignment should be sought with the type and concentration of the
preservative applied to the test samples (see 5.3).
6.2 Calibration procedure
6.2.1 Calibration
Before calibration, it should be ascertained that the instrument is properly functioning and fulfilling the
requirements with regard to blank checks (9.1), carry-over effect (9.2), volume ratio (9.3) and repeatability
(9.6).
It is assumed that linear regression can be applied for calibration purposes.
Apply a calibration procedure according to ISO 8196-2⎪IDF 128-2 using at least five calibration samples that
cover the relevant range of somatic cell counts.
Indicative values for the relevant ranges of somatic cell counts of calibration samples are shown in Table 1.
6 © ISO and IDF 2006 – All rights reserved
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ISO 13366-2:2006(E)
IDF 148-2:2006(E)
Table 1 — Indicative values for relevant calibration ranges
Range
Type of milk
cells/ml
Cow milk (herd bulk) 100 000 to 1 000 000
Cow milk (individual animals) 100 000 to 2 000 000
Goat milk 200 000 to 2 000 000
Sheep milk 100 000 to 2 000 000
Buffalo milk 100 000 to 2 000 000
The calibration should be checked at least once a month.
6.2.2 Check on linear
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 13366-2
FIL
148-2
Deuxième édition
2006-10-01
Lait — Dénombrement des cellules
somatiques —
Partie 2:
Lignes directrices pour la mise en œuvre
des compteurs fluoro-opto-électroniques
Milk — Enumeration of somatic cells —
Part 2: Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters
Numéros de référence
ISO 13366-2:2006(F)
FIL 148-2:2006(F)
©
ISO et FIL 2006
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ISO 13366-2:2006(F)
FIL 148-2:2006(F)
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ISO 13366-2:2006(F)
FIL 148-2:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Avant-propos. v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe. 2
5 Facteurs ayant une incidence sur les résultats des mesurages . 2
5.1 Flacons à échantillons . 2
5.2 Échantillonnage . 2
5.3 Conservation . 3
5.4 Conservation et transport des échantillons .4
5.5 Substances interférentes. 4
5.6 Qualité de l'échantillon lors de l'analyse. 4
5.7 Produits chimiques utilisés . 4
5.8 État des instruments . 5
5.9 Facteur de travail . 5
5.10 Volumes d'essai. 5
6 Étalonnage. 5
6.1 Matériaux de référence. 5
6.2 Mode opératoire de l'étalonnage. 7
7 Échantillonnage . 8
8 Détermination. 9
9 Contrôles de fonctionnement en routine . 9
9.1 Contrôles du blanc . 9
9.2 Contamination d'un échantillon sur l'autre. 9
9.3 Rapport de volume entre réactifs et échantillon . 10
9.4 Contrôles pilotes. 10
9.5 Surveillance supplémentaire de l'instrument . 10
9.6 Répétabilité. 10
9.7 Reproductibilité intralaboratoire . 11
9.8 Comparaisons externes . 11
10 Remarques spécifiques pour l'utilisation de lait d'espèces différentes . 11
10.1 Généralités . 11
10.2 Lait de vache . 12
10.3 Lait de chèvre. 12
10.4 Lait de brebis. 12
10.5 Lait de bufflesse. 12
11 Fidélité . 12
11.1 Répétabilité. 12
11.2 Reproductibilité intralaboratoire . 13
11.3 Reproductibilité. 13
12 Rapport d'essai . 14
Bibliographie . 15
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ISO 13366-2:2006(F)
FIL 148-2:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 13366-2⎪FIL 148-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL). Elle est publiée
conjointement par l'ISO et la FIL.
Cette édition de l'ISO 13366-2⎪FIL 148-2 annule et remplace l'ISO 13366-2:1997 et l'ISO 13366-3:1997, qui
ont fait l'objet d'une révision technique.
L'ISO 13366 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Lait — Dénombrement des
cellules somatiques:
— Partie 1: Méthode au microscope (Méthode de référence)
— Partie 2: Lignes directrices pour la mise en œuvre des compteurs fluoro-opto-électroniques
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ISO 13366-2:2006(F)
FIL 148-2:2006(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération internationale de laiterie) est une fédération mondiale du secteur laitier avec un Comité
National dans chacun de ses pays membres. Chaque Comité National a le droit de faire partie des Comités
permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux techniques. La FIL collabore avec l'ISO pour
l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et d'échantillonnage pour le lait et les produits laitiers.
Les projets de Normes internationales adoptés par les Équipes d'Action et les Comités permanents sont
soumis aux Comités Nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert
l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux de la FIL votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 13366-2⎪FIL 148-2 a été élaborée par la Fédération internationale de laiterie (FIL) et le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Elle est publiée
conjointement par la FIL et l'ISO.
L'ensemble des travaux a été confié à l'Équipe d'Action mixte ISO-FIL, Méthodes automatisées, du Comité
permanent chargé de l'Assurance de la qualité, des statistiques des résultats d'analyse et de l'échantillonnage,
sous la conduite de ses chefs de projet, Madame S. Orlandini (IT) et Monsieur H.J.C.M. van den Bijgaart (NL).
Cette édition de l'ISO 13366-2⎪FIL 148-2 annule et remplace la FIL 148A:1995, dont les méthodes B et C ont
fait l'objet d'une révision technique.
L'ISO 13366 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Lait — Dénombrement des
cellules somatiques:
— Partie 1: Méthode au microscope (Méthode de référence)
— Partie 2: Lignes directrices pour la mise en œuvre des compteurs fluoro-opto-électroniques
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ISO 13366-2:2006(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 148-2:2006(F)
Lait — Dénombrement des cellules somatiques —
Partie 2:
Lignes directrices pour la mise en œuvre des compteurs
fluoro-opto-électroniques
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 13366⎪FIL 148 indique des lignes directrices concernant les conditions
opératoires pour le dénombrement des cellules somatiques dans le lait cru et le lait contenant des
conservateurs chimiques, à l'aide de compteurs fluoro-opto-électroniques utilisant soit une méthode sur
disque rotatif, soit la cytométrie en flux pour la partie comptage.
Les présentes lignes directrices s'appliquent au dénombrement des cellules somatiques dans le lait cru de
vache. Elles s'appliquent également au dénombrement dans le lait cru d'animaux d'autres espèces, telles que
la chèvre, la brebis et la bufflesse, si les conditions préalables spécifiées sont remplies.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 8196-1⎪FIL 128-1, Lait — Définition et évaluation de la précision globale de méthodes indirectes
d'analyse du lait — Partie 1: Attributs d'analyse de méthodes indirectes
ISO 8196-2⎪FIL 128-2, Lait — Définition et évaluation de la précision globale de méthodes indirectes
d'analyse du lait — Partie 2: Étalonnage et contrôle de la qualité dans les laboratoires laitiers
ISO 13366-1⎪FIL 148-1, Lait — Dénombrement des cellules somatiques — Partie 1: Méthode au microscope
(Méthode de référence)
ISO Guide 34, Exigences générales pour la compétence des producteurs de matériaux de référence
ISO Guide 43-1, Essais d'aptitude des laboratoires par intercomparaison — Partie 1: Développement et mise
en œuvre de systèmes d'essais d'aptitude
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l'ISO 8196-1⎪FIL 128-1,
l'ISO 8196-2⎪FIL 128-2 ainsi que les suivants s'appliquent.
3.1
méthode de référence
méthode décrite dans l'ISO 13366-1⎪FIL 148-1 pour le dénombrement des cellules somatiques
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3.2
cellules somatiques
cellules dont l'intensité de fluorescence résultant de la coloration de l'ADN de leurs noyaux est supérieure à
un certain seuil
NOTE Le nombre de cellules somatiques est exprimé en cellules par millilitre.
4 Principe
Les compteurs fluoro-opto-électroniques comportent des fonctions dédiées à l'alimentation en réactifs et à la
prise d'échantillon pour essai, une partie mélange et une partie comptage. Dans la partie mélange,
l'échantillon est mélangé à une solution tampon et une solution colorante. Une partie du mélange ainsi obtenu
est transférée dans la partie comptage et placée sur un support. Chaque particule colorée observée au
microscope à fluorescence produit une impulsion électrique qui est filtrée, amplifiée et enregistrée. La
distribution des intensités des impulsions ainsi obtenue est traitée électroniquement, ce qui permet de
différencier les signaux résultant du bruit de fond et les impulsions qui sont attribuées aux cellules somatiques
colorées. Le niveau de discrimination peut être fixe ou dynamique.
Dans la partie mélange sont dosés et mélangés des volumes bien maîtrisés d'échantillon et de solutions
tampon/colorante. Le mélange peut être effectué dans une coupelle, une chambre de mélange, une
centrifugeuse, une boucle d'échantillonnage ou dans le tuyau menant à une cellule à circulation.
Dans la partie comptage, il est possible d'appliquer soit la cytométrie sur disque, soit la cytométrie en flux.
Dans le cas de la cytométrie sur disque, le mélange est transféré sous forme d'un film mince, via une buse,
sur le sommet d'un disque rotatif vertical, cette surface rotative servant de support mobile à un microscope à
fluorescence. Dans le cas de la cytométrie en flux, une partie du mélange est injectée au centre d'un liquide
de gainage à écoulement rapide à l'intérieur d'une cellule à circulation capillaire. Sous l'effet de l'accélération,
le mélange forme une mince veine liquide au centre de laquelle les cellules somatiques sont alignées et
espacées de façon dynamique. La veine croise ensuite l'objectif d'un microscope à fluorescence.
Certains instruments sont munis de deux canaux à l'intérieur de la partie comptage. Dans ce cas, en termes
d'assurance qualité des analyses, il convient de considérer que cela revient à travailler avec deux unités
indépendantes et dès lors d'évaluer séparément le fonctionnement de chacun des canaux.
5 Facteurs ayant une incidence sur les résultats des mesurages
5.1 Flacons à échantillons
Il convient d'utiliser des flacons à échantillons appropriés à la présente méthode, c'est-à-dire adaptés au
transfert des échantillons d'analyse du point de prélèvement vers le laboratoire, sans perte ni dommage.
On veillera à ce que les flacons à échantillons soient étanches et que le volume vide restant soit approprié; un
volume vide trop important est susceptible de faciliter le barattage, tandis qu'un volume vide trop petit peut
poser des problèmes de mélange.
5.2 Échantillonnage
5.2.1 Généralités
Il convient que les instruments d'échantillonnage, c'est-à-dire les flacons à échantillons, les béchers et les
instruments de prélèvement soient propres et secs. Si des préleveurs automatiques sont utilisés, il convient
qu'ils aient fait l'objet d'une validation appropriée.
Il convient de refroidir les échantillons pour essai de préférence immédiatement après le prélèvement, à une
température comprise entre 0 °C et 6 °C, et de les stocker à cette température jusqu'au dénombrement
(voir 5.4), plutôt que de les conserver. Il convient d'éviter la congélation. Si malgré tout il est nécessaire de
conserver les échantillons pour essai, des moyens de conservation chimique appropriés sont décrits en 5.3.
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5.2.2 Échantillons de lait de grand mélange
Il est essentiel de mélanger correctement le lait de grand mélange à échantillonner car, si le lait n'est pas
suffisamment remué, les cellules somatiques se concentrent dans les couches supérieures et inférieures.
5.2.3 Échantillons de lait d'animaux individuels
La libération des cellules somatiques dans le lait pendant la traite est inégale. Par conséquent, si l'on cherche
à réaliser un dénombrement représentatif de toute une traite, il est essentiel d'obtenir un échantillon qui soit
véritablement représentatif de toute la traite. Si en revanche l'objectif est d'établir un diagnostic, un échantillon
d'une partie seulement de la traite peut suffire.
5.3 Conservation
Si la conservation chimique est jugée nécessaire, il convient que l'échantillon pour essai (5.2.1) soit
additionné d'un conservateur dès que possible après le prélèvement, et impérativement dans les 24 h. Dans
tous les cas, il convient de maintenir au frais l'échantillon pour essai (à une température comprise entre 0 °C
et 6 °C) avant l'ajout du conservateur.
Les conservateurs appropriés sont les suivants.
a) Acide borique: il convient que sa concentration finale dans l'échantillon pour essai ne dépasse pas 0,6 g
pour 100 ml. Les échantillons ainsi conservés peuvent être gardés pendant une durée supplémentaire
pouvant aller jusqu'à 24 h, à une température comprise entre 6 °C et 12 °C.
b) Azide de sodium: il convient que sa concentration finale dans l'échantillon pour essai ne dépasse pas
0,024 g pour 100 ml. Les échantillons ainsi conservés peuvent être gardés pendant une durée
supplémentaire pouvant aller jusqu'à 72 h, à une température comprise entre 2 °C et 10 °C.
c) Bronopol (bromo-2 nitro-2 propane diol-1,3): il convient que sa concentration finale dans l'échantillon pour
essai ne dépasse pas 0,05 g pour 100 ml. Les échantillons ainsi conservés peuvent être gardés pendant
une durée supplémentaire pouvant aller jusqu'à six jours, à une température comprise entre 2 °C et 12 °C.
d) Dichromate de potassium: il convient que sa concentration finale dans l'échantillon pour essai ne
dépasse pas 0,2 g pour 100 ml. Les échantillons ainsi conservés peuvent être gardés pendant une durée
supplémentaire pouvant aller jusqu'à six jours, à une température comprise entre 2 °C et 12 °C.
Les traceurs de couleur associés considérés comme appropriés sont
⎯ le bleu patenté V, avec une concentration finale dans l'échantillon pour essai pouvant aller jusqu'à
0,15 mg pour 100 ml,
⎯ le jaune orange S (E110), avec une concentration finale dans l'échantillon pour essai pouvant aller
jusqu'à 1 mg pour 100 ml, et
⎯ un mélange de bleu patenté V et d'éosine B, avec une concentration finale dans l'échantillon pour essai
pouvant aller respectivement jusqu'à 0,03 mg et 0,45 mg pour 100 ml.
D'autres conservateurs et traceurs de couleur peuvent être utilisés sous réserve que leur efficacité et leurs
conditions d'utilisation aient été correctement validées.
Dans tous les cas, valider correctement l'absence d'interférence pour l'instrument de dénombrement concerné
avant mise en application.
Dans les cas où les compteurs fluoro-opto-électroniques sont associés à des analyseurs de lait pour le
mesurage d'autres composants des échantillons pour essai, il convient de veiller à ce que les conservateurs
et traceurs de couleur utilisés n'influencent en aucune manière le résultat du dénombrement.
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5.4 Conservation et transport des échantillons
Il convient de stocker les échantillons sans conservateur à une température comprise entre 0 °C et 6 °C et de
procéder au dénombrement des cellules somatiques dans les 96 h suivant la fin de l'échantillonnage. Éviter
de congeler les échantillons pour essai. La conservation à des températures supérieures et/ou pendant des
périodes plus longues peut générer des résultats non représentatifs dans le dénombrement. Le mesurage des
échantillons après congélation et décongélation peut engendrer des comptages inférieurs (entre 10 % et
20 %). L'âge des échantillons au moment de la congélation et le type de processus de décongélation peuvent
également influencer le résultat du dénombrement.
5.5 Substances interférentes
Il convient d'éviter d'utiliser des substances qui interfèrent avec le dénombrement. Les substances connues
pour avoir une influence sur la lecture des résultats des instruments sont
a) les conservateurs et les traceurs de couleur à des concentrations supérieures aux valeurs indiquées
en 5.3;
b) le bleu de méthylène à des concentrations supérieures à 0,06 mg pour 100 ml.
5.6 Qualité de l'échantillon lors de l'analyse
La désagrégation des cellules somatiques (lyse) engendre une augmentation du nombre des fragments de
cellules de plus petite taille. L'intensité inférieure de fluorescence après coloration de ces particules provoque
un décalage vers la gauche de la distribution des intensités d'impulsion. La différenciation appropriée des
impulsions du bruit de fond en est entravée, ce qui conduit à des résultats de comptages plus faibles.
NOTE Plusieurs appareils présentent des fonctionnalités permettant d'évaluer la position et la forme de la distribution
des intensités d'impulsion. Se reporter aux instructions et aux recommandations du fabricant pour les instruments
concernés.
Après traitement d'un échantillon problématique, il convient de contrôler et éventuellement de nettoyer
l'instrument le long de la trajectoire du flux. Avant de procéder à toute nouvelle utilisation, il convient de
vérifier son fonctionnement correct. Les échantillons pouvant être problématiques sont
a) les échantillons de lait issus de mamelles gravement infectées, c'est-à-dire présentant des caillots,
b) les échantillons de lait contenant des impuretés,
c) les échantillons de lait comportant un grand nombre d'érythrocytes,
d) le colostrum,
e) le lait de fin de lactation, et
f) le lait caillé.
Si possible, il convient d'éviter d'analyser de tels échantillons.
5.7 Produits chimiques utilisés
Il convient que tous les réactifs utilisés soient de qualité analytique et bactériologique reconnue. Il convient
que l'eau utilisée soit déminéralisée (conductivité résiduelle inférieure à 10 µS par cm) ou d'une pureté au
moins équivalente. Se conformer aux instructions du fabricant relatives à la préparation des solutions de
travail, à la période de conservation maximale et aux exigences en matière de conservation.
Il convient de respecter les réglementations locales en vigueur en matière d'utilisation et d'évacuation des
produits chimiques employés et des effluents.
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5.8 État des instruments
5.8.1 Les points généraux auxquels il faut porter attention sont
a) le fonctionnement du dispositif de mélange et de l'agitateur,
b) les perturbations possibles à la prise d'échantillon et dans le système de circulation des fluides dues au
blocage par des impuretés ou des caillots ou à l'encrassement dans les unités de mélange et d'incubation,
c) l'état et le fonctionnement de la source lumineuse et du tube photomultiplicateur, définition du grain et
qualité du signal.
5.8.2 Les points spécifiques aux compteurs cytométriques à disque auxquels il faut porter attention sont
a) le positionnement du film sur le disque rotatif,
b) la propreté du support et le fonctionnement de l'éponge nettoyante; le remplacement au moment
opportun de l'éponge nettoyante est indispensable, et
c) le vidage correct du récipient collectant le liquide de rinçage.
5.8.3 Un point spécifique aux compteurs cytométriques en flux auquel il faut porter attention est la variation
de comportement entre la veine de l'échantillon dans la cellule à circulation et le flux du liquide de gaine.
Certains fabricants d'instruments proposent des programmes spéciaux qui permettent de vérifier ces
variations, en indiquant des solutions possibles en cas d'écart.
5.9 Facteur de travail
Le facteur de travail correspond au coefficient par lequel est multiplié le nombre effectif de cellules
somatiques comptées par un instrument pour obtenir le dénombrement de cellules somatiques dans
l'échantillon pour essai. En théorie, un facteur de travail peu élevé est avantageux pour la fidélité et
l'exactitude des résultats.
5.10 Volumes d'essai
Il est indispensable de respecter un rapport approprié entre le volume de la solution tampon/colorant et le
volume d'échantillon pour garantir un dénombrement correct.
6 Étalonnage
6.1 Matériaux de référence
6.1.1 Généralités
Il convient de produire des matériaux de référence dans des conditions strictement maîtrisées, c'est-à-dire en
travaillant avec un système d'assurance qualité et en se conformant aux exigences indiquées dans le
Guide ISO 34.
Les matériaux de référence peuvent être
a) des matériaux de référence certifiés (MRC) tels que produits par une organisme officiel reconnu,
b) des matériaux de référence secondaires (MRS) tels que préparés par un fournisseur externe, ou
c) des matériaux de référence internes (MRI) tels que préparés par le laboratoire lui-même, qui permettent
de conserver la traçabilité avec les MRC, les MRS ou via les essais interlaboratoires d'aptitude.
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ISO 13366-2:2006(F)
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NOTE Aucun MRC n'est disponible pour le dénombrement des cellules. Des exemples de modes opératoires
appropriés pour la préparation des MRI sont donnés ci-après. Préférer des MRI ayant une composition aussi proche que
possible de celle du lait naturel.
6.1.2 Préparation des échantillons pour étalonnage
6.1.2.1 Préparation par addition d'une suspension de leucocytes bovins
a) Mélanger 1 000 ml de lait stérilisé ou de lait U.H.T. présentant un faible compte de cellules somatiques à
1 ml de p
...
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