ISO/TS 4985:2023

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 4985
FIL/MR 255
Première édition
2023-07
Lait et produits laitiers —
Détermination de l’activité de la
phosphatase alcaline — Méthode
fluorimétrique sur microplaque
Milk and milk products — Determination of alkaline phosphatase
activity — Fluorimetric microplate method
Numéros de référence
FIL/MR 255:2023(F)
© ISO et FIL 2023
FIL/MR 255:2023(F)
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Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 1
5 Réactifs . 2
6 Appareillage et matériel .3
7 Échantillonnage .4
8 Préparation . 5
8.1 Préparation de l’échantillon sans phosphatase alcaline . 5
8.1.1 Généralités . 5
8.1.2 Lait sans phosphatase alcaline . 5
8.1.3 Fromage sans phosphatase alcaline . 5
8.2 Préparation de l’échantillon pour essai . 5
8.2.1 Échantillons de lait . 5
8.2.2 Échantillons de fromage . 5
9 Mode opératoire . 6
9.1 Instrument . 6
9.1.1 Réglages de l’instrument . 6
9.1.2 Vérification de la plage de linéarité de l’instrument . 6
9.1.3 Contrôle de la qualité . 6
9.2 Étalonnage . 7
9.2.1 Généralités . 7
9.2.2 Préparation des solutions étalons de travail . 7
9.2.3 Réalisation de la courbe d’étalonnage . 7
9.3 Détermination . 8
9.3.1 Échantillons de lait . 8
9.3.2 Échantillons de fromage . 8
9.3.3 Disposition sur la microplaque et mesurage de la fluorescence . 9
9.4 Témoins relatifs aux échantillons pour essai . 10
9.4.1 Témoins négatifs et positifs recommandés . 10
9.4.2 Essai de la substance interférente . 10
9.4.3 Témoin de la phosphatase alcaline microbienne stable à la chaleur . 10
10 Calcul et expression des résultats .11
10.1 Courbe d’étalonnage . 11
10.2 Calcul de l’activité ALP d’échantillons inconnus .12
10.2.1 Échantillons de lait .12
10.2.2 Échantillons de fromage . 13
10.2.3 Exemple de calcul .13
10.3 Expression des résultats . 15
11 Fidélité .15
11.1 Essai interlaboratoires .15
11.2 Répétabilité . 15
11.3 Reproductibilité . .15
12 Rapport d’essai .16
Annexe A (informative) Résultats de fidélité .17
Annexe B (informative) Comparaison des méthodes .18
Annexe C (informative) Exemples de préparation d’échantillons pour essai .20
iii
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Bibliographie .22
iv
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner
l’utilisation d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité
et à l’applicabilité de tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent
document, l’ISO n'avait pas reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa
mise en application. Toutefois, il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent
document que des informations plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de
brevets, disponible à l'adresse www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié tout ou partie de tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale du Lait (FIL). Il est publié conjointement par
l’ISO et la FIL.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
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La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente
les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont
organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de
groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des
acteurs de l’industrie de transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des
universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL collaborent étroitement sur toutes les activités de normalisation concernant les méthodes
d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient
conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux
organisations.
La FIL attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner
l’utilisation d’un ou de plusieurs brevets. La FIL ne prend pas position quant à la preuve, à la validité
et à l’applicabilité de tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent
document, la FIL n'avait pas reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa
mise en application. Toutefois, il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent
document que des informations plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de
brevets, disponible à l'adresse www.iso.org/brevets. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié tout ou partie de tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Le présent document a été élaboré par le Comité permanent de la FIL chargé des Méthodes d’analyse pour
les auxiliaires technologiques et indicateurs et par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Il est publié conjointement par l’ISO et la FIL.
La présente Méthode révisée FIL est équivalente à une ISO/PAS (Spécification publiquement disponible)
ou à une ISO/TS (Spécification technique) et est donc publiée conjointement selon les conditions ISO.
L’ensemble des travaux a été confié au groupe de travail mixte ISO/FIL P20 du Comité permanent chargé
des Méthodes d’analyse pour les auxiliaires technologiques et indicateurs, sous la conduite de son chef de
projet, M. C. Egger (CH).
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE
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Lait et produits laitiers — Détermination de l’activité de
la phosphatase alcaline — Méthode fluorimétrique sur
microplaque
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode fluorimétrique sur microplaque pour la détermination de
[5]
l’activité de la phosphatase alcaline (ALP, EC 3.1.3.1) dans les laits crus et traités thermiquement
entiers, demi-écrémés, écrémés, dans la crème, les laits aromatisés et les fromages.
La méthode est applicable au lait et aux boissons à base de lait de vache, de brebis et de chèvre. Bien
que la méthode n’ait pas été testée sur le lait d’autres espèces, elle peut également s’appliquer au lait
d’espèces dont la composition est semblable à celle du lait de vache, de brebis ou de chèvre, tel que le lait
de bufflonne ou de camélidés. Elle est également applicable au lait en poudre après reconstitution et aux
fromages à pâte molle, à pâte pressée non cuite et à pâte pressée cuite, à condition que la moisissure ne
soit présente que sur la surface du fromage et ne se soit pas propagée à l’intérieur, comme dans le cas
des fromages veinés de bleu, par exemple. Pour les gros fromages à pâte pressée cuite, des conditions
spécifiques d’échantillonnage s’appliquent (voir Article 7).
NOTE Cette méthode a été adaptée de la Référence [6].
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
activité de la phosphatase alcaline
activité ALP
quantité d’enzyme capable de catalyser la transformation de 1 μmol de substrat par minute dans les
conditions du mode opératoire spécifié
Note 1 à l'article: L’activité de la phosphatase alcaline est exprimée en milliunités d’activité enzymatique par litre
d’échantillon (mU/l) dans le cas du lait et en milliunités d’activité enzymatique par gramme d’échantillon (mU/g)
dans le cas du fromage.
4 Principe
L’activité ALP de l’échantillon se mesure en effectuant un essai direct fluorimétrique continu en
cinétique. Un substrat monophosphorique aromatique non fluorescent, 4-méthylumbelliferone
phosphate (4-MUP), en présence de phosphatase alcaline issue de l’échantillon, subit une hydrolyse
de son phosphate et produit le composé 4-méthylumbelliferone (4-MU) hautement fluorescent. Le
mesurage fluorimétrique de l’activité ALP est effectué à 37 °C sur une période de 15 min.
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La fluorescence mesurée est proportionnelle à la concentration du composé fluorescent émis et est
utilisée pour le calcul de l’activité enzymatique.
5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
5.1 Solution de chlorure de magnésium, concentration c(MgCl ) = 1 mol/l.
Peser 50,8 g de chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl · 6 H O, masse moléculaire 203,3 g/mol)
2 2
dans un bécher en verre de 50 ml (6.17), dissoudre avec de l’eau distillée et transférer dans une fiole
jaugée de 250 ml (6.18). Ajuster le volume avec de l’eau jusqu’au trait de jauge.
Cette solution peut être stockée en parties aliquotes (par exemple, 10 ml) à une température inférieure
à −20 °C pendant un an.
TM ®1) 2)
5.2 Solution de Tergitol 15-S-9 (numéro de registre CAS 84133-50-6) , c = 100 g/l.
TM
Peser 25,0 g de Tergitol 15-S-9 dans un bécher en verre de 150 ml (6.17), dissoudre, en agitant
doucement, avec de l’eau distillée à 25 °C ± 2 °C et transférer dans une fiole jaugée de 250 ml (6.18).
Ajuster le volume avec de l’eau jusqu’au trait de jauge.
Cette solution peut être stockée en parties aliquotes (par exemple, 15 ml) à une température comprise
entre 2 °C et 8 °C pendant un an.
5.3 Solution tampon de 2-amino-2-méthyl-1-propanol (AMP), c = 0,11 mol/l, pH = 10,1.
Peser 9,8 g d’AMP, de pureté > 95 % et de masse moléculaire 89,14 g/mol, dans un bécher en verre de
600 ml (6.17), ajouter 500 ml d’eau distillée sur un agitateur et ajuster le pH à 10,1 avec une solution
d’acide chlorhydrique de concentration c(HCl) = 5 mol/l. Transférer dans une fiole jaugée de 1 000 ml
(6.18) et ajuster avec de l’eau jusqu’au trait de jauge.
Cette solution peut être stockée en parties aliquotes (par exemple, 30 ml) à une température inférieure
à −20 °C pendant un an.
2+
5.4 Solution tampon de diéthanolamine (DEA), c = 2 mol/l, pH = 9,8, c(Mg ) = 0,5 mmol/l.
Peser 210,3 g de DEA, de masse moléculaire 105,14 g/mol, dans un bécher en verre de 1 000 ml (6.17),
ajouter 700 ml d’eau distillée en agitant et ajuster le pH à 9,8 avec une solution d’acide chlorhydrique
c(HCl) = 5 mol/l. Ajouter 0,5 ml de solution de chlorure de magnésium (5.1). Transférer dans une fiole
jaugée de 1 000 ml (6.18) et ajuster avec de l’eau jusqu’au trait de jauge.
Cette solution peut être stockée en parties aliquotes (par exemple, 50 ml) à une température inférieure
à −20 °C pendant un an.
2+ TM
5.5 Tampon d’extraction de DEA, c = 1,5 mol/l, pH = 9,8, c(Mg ) = 1,5 mmol/l, c(Tergitol ) = 0,1 %.
Peser 157,7 g de DEA dans un bécher en verre de 600 ml (6.17), ajouter 500 ml d’eau distillée sur un
agitateur et ajuster le pH à 9,8 avec une solution d’acide chlorhydrique de concentration c(HCl) = 5 mol/l. ®
1) Le numéro de registre du Chemical Abstracts Service (CAS) est une marque de l’American Chemical Society
(ACS). Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que
l’ISO approuve l’emploi du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré
qu’ils aboutissent aux mêmes résultats.
2) Il s’agit d’un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention
des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la FIL approuve l’emploi du produit ainsi
désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils aboutissent aux mêmes résultats.
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TM
Ajouter 1,5 ml de solution de chlorure de magnésium (5.1) et 10 ml de solution de Tergitol 15-S-9
(5.2). Transférer dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.18) et ajuster avec de l’eau jusqu’au trait de jauge.
Cette solution peut être stockée en parties aliquotes (par exemple, 200 ml) à une température inférieure
à −20 °C pendant un an.
5.6 Solution mère étalon de sel sodique de 4-méthylumbelliferone (4-MU), c = 2,5 mmol/l.
Peser 9,9 mg de 4-MU, de pureté > 98 % et de masse moléculaire 198,16 g/mol, dans un bécher en verre
de 25 ml (6.17), solubiliser et bien rincer avec la solution tampon d’AMP (5.3), transférer dans une fiole
jaugée de 20 ml (6.18) et compléter jusqu’au trait de jauge avec le même tampon. Conserver la solution
à l’abri de la lumière.
Cette solution peut être stockée en parties aliquotes (par exemple, 200 µl) à une température inférieure
à −20 °C pendant un an.
5.7 Solution substrat de 4-méthylumbelliferone phosphate (4-MUP), c = 2,5 mmol/l.
Peser 12,8 mg de 4-MUP, de masse moléculaire 256,15 g/mol, dans un bécher en verre de 25 ml (6.17),
solubiliser et bien rincer avec la solution tampon de DEA (5.4), transférer dans une fiole jaugée de 20 ml
(6.18) et compléter jusqu’au trait de jauge avec le même tampon.
Préparer la solution juste avant utilisation et la conserver à l’abri de la lumière.
6 Appareillage et matériel
Utiliser le matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Lecteur de microplaques à fluorescence, capable de lire des microplaques à 96 puits à une
longueur d’onde d’excitation de 365 nm et une longueur d’onde d’émission de 450 nm. Capable de
contrôler la température à 37 °C ± 1 °C et permettant des mesurages en cinétique (par exemple, un
relevé par minute pendant 15 min).
6.2 Microplaques, noires, fond plat, 96 puits.
6.3 Pipette, de capacité 20 µl à 100 µl.
6.4 Pipette, de capacité 100 µl à 1 000 µl.
6.5 Pipeteur multicanaux, capable de distribuer 20 µl à 100 µl.
6.6 Pipette à piston, de capacité 5 ml.
Une pipette en verre peut également être utilisée.
6.7 Microtubes, de capacité 2 ml.
6.8 Tubes, de capacité 15 ml et 50 ml.
6.9 Tube à essai en verre, de diamètre 12 mm et de longueur 10 cm environ.
6.10 Bain-marie, bloc chauffant ou incubateur capable de maintenir des températures de
37 °C ± 1 °C, 63 °C ± 1 °C et 95 °C ± 1 °C.
6.11 Agitateur vortex.
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®3)
6.12 Parafilm , ou autre film adéquat pour laboratoire.
6.13 Feuille d’aluminium.
6.14 Broyeur.
®4)
6.15 ULTRA-TURRAX , ou autre homogénéisateur équipé d’une tige de diamètre 6 mm à 8 mm
environ.
6.16 Centrifugeuse, capable de centrifuger à 1 000 g à 4 °C pour des tubes de 10 ml ou de 15 ml, et des
tubes de 50 ml.
6.17 Béchers en verre, de capacité 5 ml (environ 20 mm de diamètre et 30 mm de hauteur), 10 ml
(environ 25 mm de diamètre et 30 mm de hauteur), 25 ml, 50 ml, 150 ml, 600 ml et 1 000 ml.
6.18 Fioles jauges à un trait, de capacité 20 ml, 25 ml, 250 ml et 1 000 ml.
6.19 Balance analytique.
6.20 pH-mètre.
7 Échantillonnage
Il convient qu’un échantillon représentatif ait été envoyé au laboratoire. Il convient qu’il n’ait été ni
endommagé ni modifié au cours du transport ou du stockage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Une méthode
[1]
d’échantillonnage recommandée est indiquée dans l’ISO 707 | FIL 50 .
[1]
Toutefois, l’ISO 707 | FIL 50 ne convient pas aux gros fromages à pâte pressée cuite pour lesquels
le mélange lactosérum-caillé a été chauffé à des températures supérieures à 50 °C. Si le fromage est
constitué de lait cru, l’activité ALP n’est pas distribuée de manière homogène dans ces fromages.
L’activité est élevée dans la couche externe de la meule, entre 0 cm et 4 cm sous la croûte du bord
arrondi, mais très faible ou même indétectable au centre.
Par conséquent, les échantillons de gros fromages à pâte pressée cuite doivent être recueillis en
prélevant une portion de 1 cm à 0,5 cm sous la croûte du bord arrondi (voir Figure C.1).
En cas de doute concernant le type de fromage (fromage à pâte pressée cuite ou fromage à pâte pressée
non cuite), procéder à l’échantillonnage décrit pour les gros fromages à pâte pressée cuite. ®
3) Parafilm est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la FIL approuve l’emploi du
produit ainsi désigné. ®
4) ULTRA-TURRAX est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la FIL approuve l’emploi du
produit ainsi désigné.
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8 Préparation
8.1 Préparation de l’échantillon sans phosphatase alcaline
8.1.1 Généralités
L’échantillon sans ALP est utilisé comme un échantillon à blanc, pour l’étalonnage et, éventuellement, la
dilution des échantillons.
8.1.2 Lait sans phosphatase alcaline
Préparer du lait sans phosphatase du type à soumettre à l’essai en versant soigneusement la quantité
souhaitée de lait dans un tube à essai ou un récipient adapté, en veillant à ce que le lait ne soit pas
en contact avec le bord ou les côtés du récipient. Couvrir le tube ou le récipient contenant le lait et le
placer dans le bain-marie ou le bloc chauffant (6.10) réglé à 95 °C. Amener le lait à 95 °C avant de le
chauffer à cette température pendant 5 min. Vérifier la température en utilisant un thermomètre ou
une sonde de thermistance placé(e) au centre du tube ou du récipient. Lorsque la température du lait
atteint 95 °C, démarrer immédiatement son temps de chauffage de 5 min. Refroidir rapidement le lait à
la fin du temps de chauffage.
8.1.3 Fromage sans phosphatase alcaline
Pour chaque type de fromage à soumettre à l’essai, préparer un fromage sans phosphatase à partir du
surnageant du fromage (voir 9.3.2.6) en chauffant une portion du surnageant comme décrit en 8.1.2, en
remplaçant le lait par le surnageant.
8.2 Préparation de l’échantillon pour essai
8.2.1 Échantillons de lait
8.2.1.1 Généralités
Mélanger soigneusement tous les échantillons pour essai avant utilisation.
NOTE Il n’est généralement pas nécessaire de préchauffer les échantillons pour essai.
8.2.1.2 Échantillons pour essai pasteurisés
Utiliser des échantillons pour essai pasteurisés tels qu’ils sont fournis, dans les quantités requises.
8.2.1.3 Dilution des échantillons pour essai présentant des valeurs ALP élevées
Préparer les dilutions des échantillons de lait pour essai en utilisant du lait sans phosphatase (voir 8.1.2)
afin d’amener leur nivea
...