ISO 4214:2022
(Main)Milk and milk products — Determination of amino acids in infant and adult/paediatric nutritional formulas and dairy products
Milk and milk products — Determination of amino acids in infant and adult/paediatric nutritional formulas and dairy products
This document specifies a method for the quantitative determination of total amino acids using 6-aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl carbamate (ACQ) derivatization followed by ultra-high-performance liquid chromatography (UHPLC) separation and ultraviolet (UV) detection. It specifies a method for the determination, in one single analysis, of the following amino acids: alanine, arginine, aspartic acid (combined with asparagine), cystine (dimer of cysteine, combined with cysteine), glutamic acid (combined with glutamine), glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tyrosine and valine. This method does not apply to the determination of tryptophan. This method is applicable to infant and adult/paediatric nutritional formulas, dairy products and other matrices such as cereals. It was validated in infant formulas (milk- and soy-based, including partially hydrolysed and elemental products), toddler formula, adult nutritional powder, UHT skimmed milk, whey powder, sodium caseinate, whole milk powder, bran pet food, dry pet food and breakfast cereal (see Annex A for details).
Lait et produits laitiers — Détermination des acides aminés dans les formules infantiles, les produits nutritionnels pour adultes/enfants et autres produits laitiers
Le présent document spécifie une méthode de détermination quantitative des acides aminés totaux en utilisant la dérivatisation du 6-aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl carbamate (ACQ) suivie d’une séparation de chromatographie en phase liquide à ultra haute performance (CLUHP) et d’une détection par ultraviolet (UV). Il spécifie une méthode pour la détermination, en une seule analyse, des acides aminés suivants: alanine, arginine, acide aspartique (combiné à l’asparagine), cystine (dimère de la cystéine, combiné à la cystéine), acide glutamique (combiné à la glutamine), glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, méthionine, phénylalanine, proline, sérine,thréonine, tyrosine et valine. Cette méthode ne s’applique pas à la détermination du tryptophane. Cette méthode s’applique aux formules infantiles, aux produits nutritionnels pour adultes/enfants, aux produits laitiers et à d’autres matrices telles que les céréales. Elle a été validée dans les formules infantiles (à base de lait et de soja, y compris les produits partiellement hydrolysés et les produits élémentaires), les préparations pour nourrissons, les poudres nutritionnelles pour adultes, le lait écrémé UHT, le lactosérum en poudre, le caséinate de sodium, le lait entier en poudre, les aliments pour animaux au son, les aliments secs pour animaux et les céréales pour petit-déjeuner (voir Annexe A pour plus de détails).
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 4214
IDF 254
First edition
2022-12
Milk and milk products —
Determination of amino acids in infant
and adult/paediatric nutritional
formulas and dairy products
Reference numbers
IDF 254:2022(E)
IDF 254:2022(E)
© ISO and IDF 2022
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on
the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below
or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office International Dairy Federation
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8 Silver Building • Bd Auguste Reyers 70/B
CH-1214 Vernier, Geneva B-1030 Brussels
Phone: +41 22 749 01 11 Phone: +32 2 325 67 40
Fax: +32 2 325 67 41
Email: copyright@iso.org Email: info@fil-idf.org
Website: www.iso.org Website: www.fil-idf.org
Published in Switzerland
ii
IDF 254:2022(E)
Contents Page
Forewords .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 2
6 Reagents and standard preparation . .3
6.1 General . 3
6.2 Norvaline (Nva) internal standards . 4
6.3 Cystine calibration standards . 4
6.4 Amino acid (AA) calibration standards (with exception of cystine) . 5
6.5 Chromatography solvents (mobile phases) . 5
7 Apparatus . 6
8 Sample analysis .6
8.1 Sample preparation . 6
8.2 Cystine calibration standards preparation . 7
8.3 Hydrolysis (of samples and cystine standards) . 7
8.4 Neutralization and dilution (of samples and cystine standards) . 7
8.5 Amino acids calibration standards preparation (not needed to be acid hydrolysed) . 8
8.6 Derivatization (of samples, cystine standards and amino acids standards) . 8
8.7 UHPLC separation . 8
8.8 Peak identification and integration . 9
9 Calculation and expression of results .10
9.1 Calibration curve . 10
9.2 Amino acid calculation . 10
10 Precision .11
10.1 General . 11
10.2 Repeatability . 11
10.3 Reproducibility . . 11
11 Test report .15
Annex A (informative) Precision data .16
Annex B (informative) Chromatogram examples .34
Bibliography .35
iii
IDF 254:2022(E)
Forewords
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part
in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with AOAC
INTERNATIONAL and ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 4, Cereals and pulses. It is being
published jointly by ISO and IDF, and separately by AOAC INTERNATIONAL.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
IDF 254:2022(E)
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national
interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and
governments/food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis
and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International
Standards using the logos and reference numbers of both organizations.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
This document was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Composition
and ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products, in
collaboration with AOAC INTERNATIONAL and ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 4, Cereals
and pulses. It is being published jointly by ISO and IDF, and separately by AOAC INTERNATIONAL.
The work was carried out by the IDF/ISO Action Team C51 of the Standing Committee on Analytical
Methods for Composition under the aegis of its project leader Mr C. Fuerer (CH).
v
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 254:2022(E)
Milk and milk products — Determination of amino acids in
infant and adult/paediatric nutritional formulas and dairy
products
1 Scope
This document specifies a method for the quantitative determination of total amino acids using
6-aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl carbamate (ACQ) derivatization followed by ultra-high-
performance liquid chromatography (UHPLC) separation and ultraviolet (UV) detection. It specifies a
method for the determination, in one single analysis, of the following amino acids: alanine, arginine,
aspartic acid (combined with asparagine), cystine (dimer of cysteine, combined with cysteine),
glutamic acid (combined with glutamine), glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine,
phenylalanine, proline, serine, threonine, tyrosine and valine.
This method does not apply to the determination of tryptophan.
This method is applicable to infant and adult/paediatric nutritional formulas, dairy products and other
matrices such as cereals. It was validated in infant formulas (milk- and soy-based, including partially
hydrolysed and elemental products), toddler formula, adult nutritional powder, UHT skimmed milk,
whey powder, sodium caseinate, whole milk powder, bran pet food, dry pet food and breakfast cereal
(see Annex A for details).
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
infant formula
breast-milk substitute specially manufactured to satisfy, by itself, the nutritional requirements of
infants during the first months of life up to the introduction of appropriate complementary feeding
[SOURCE: Codex Standard 72-1981]
3.2
adult/paediatric nutritional
nutritionally complete, specially formulated food, consumed in liquid form, which may constitute the
sole source of nourishment, made from any combination of milk, soy, rice, whey, hydrolysed protein,
starch and amino acids, with and without intact protein
4 Principle
Proteins are hydrolysed in 6 mol/l hydrochloric acid (HCl) for 24 h at 110 °C in the presence of phenol,
3-3′-dithiodipropionic acid (DDP) and norvaline. Phenol is added to prevent halogenation of tyrosine.
IDF 254:2022(E)
Norvaline is added as an internal standard. DDP is added to convert cystine and cysteine to S-2-
carboxyethylthiocysteine (XCys), as described in Reference [1], and the resulting derivative can be
separated from other amino acids for quantification.
After neutralization, amino acids and converted XCys are derivatized with AQC. Derivatized amino
acids are separated using reversed phase UHPLC with UV detection at 260 nm.
NOTE Fluorescence detection can be used provided equivalence has been demonstrated.
During acid hydrolysis, glutamine (Gln) and asparagine (Asn) are converted to glutamic acid (Glu) and
aspartic acid (Asp), respectively. Thus, Glu values represent the combined values of Glu and Gln, and
Asp values represent the combined values of Asp and Asn. Cys2 values represent the combined values
of cysteine and cystine since both are converted to XCys by DDP.
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade.
Commercial references are only a guideline. Equivalent chemicals or materials can be used provided
their equivalence has been demonstrated. Before using chemicals, refer to the safety data sheets and
ensure that the safety precautions are applied.
1)
5.1 AccQ·Tag™ Ultra Derivatization Kit (Waters 186003836 ).
As an alternative derivatizing buffer, di-sodium tetraborate decahydrate (CAS Registry
2)
Number© 1303-96-4) can be used.
As an alternative tagging reagent, 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (CAS 148757-
94-2) can be used.
1)
5.2 AccQ·Tag™ Ultra Eluent A concentrate (Waters 186003838 ).
As alternative reagents, acetonitrile, gradient grade for liquid chromatography (LC) (CAS 75-05-8), and
formic acid (CAS 64-18-6) can be used.
1)
5.3 AccQ·Tag™ Ultra Eluent B (Waters 186003839 ).
As alternative reagents, acetonitrile, gradient grade for LC (CAS 75-05-8), formic acid (CAS 64-18-6)
and ammonium formate (CAS 540-69-2) can be used.
5.4 Phenol (CAS 108-95-2).
5.5 3,3′-Dithiodipropionic acid (CAS 1119-62-6).
5.6 Amino acid standard solution, containing the following 17 amino acids at 2,5 µmol/ml each
(except l-cystine at 1,25 µmol/ml) in 0,1 mol/l HCl: l-alanine, l-arginine, l-aspartic acid, l-cystine,
l-glutamic acid, l-glycine, l-histidine, l-isoleucine, l-leucine, l-lysine, l-methionine, l-phenylalanine,
l-proline, l-serine, l-threonine, l-tyrosine and l-valine.
5.7 l-cystine (CAS 56-89-3).
1) This is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of the product named. The alternative
reagents listed in this document have been shown to lead to the same results.
2) CAS Registry Number® is a trademark of CAS corporation. This information is given for the convenience of
users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products
may be used if they can be shown to lead to the same results.
IDF 254:2022(E)
5.8 Norvaline (CAS 6600-40-4).
5.9 Sodium hydroxide pellets, reagent grade (CAS 1310-73-2).
5.10 Sodium hydroxide solution (CAS 1310-73-2), substance concentration c = 1 mol/l.
5.11 Sodium hydroxide solution (optional) (CAS 1310-73-2), c = 6 mol/l.
5.12 Hydrochloric acid fuming 37 % (CAS 7647-01-0), c = 12 mol/l, GR grade for analysis.
5.13 Hydrochloric acid solution (CAS 7647-01-0), c = 1 mol/l.
5.14 Hydrochloric acid solution (CAS 7647-01-0), c = 0,1 mol/l.
5.15 Laboratory water, with a resistivity of 18,2 MΩ-cm (ultra-pure water).
6 Reagents and standard preparation
6.1 General
6.1.1 Sodium hydroxide (NaOH) solutions, c = 6 mol/l, c = 0,2 mol/l and c = 0,05 mol/l.
For the c = 6 mol/l solution, weigh out 24 g of sodium hydroxide (5.9) into a 100 ml volumetric flask.
Dissolve in about 80 ml of water. Allow to cool down and dilute to the mark with water. Optional: use a
commercially available equivalent (5.11).
For the c = 0,2 mol/l solution, pipet 20 ml of 1 mol/l NaOH (5.10) into a 100 ml volumetric flask and
make up to the mark with water.
For the c = 0,05 mol/l solution, pipet 5 ml of 1 mol/l NaOH (5.10) into a 100 ml volumetric flask and
make up to the mark with water.
6.1.2 Hydrochloric acid (HCl) solution, c = 0,2 mol/l.
Pipet 20 ml of 1 mol/l HCl (5.13) into a 100 ml volumetric flask and make up to the mark with water.
6.1.3 DDP solution, mass concentration ρ = 10 g/l (in NaOH, c = 0,2 mol/l).
Into a 50 ml volumetric flask, weigh out 500 mg of DDP and make up to the mark with 0,2 mol/l NaOH
(6.1.1).
6.1.4 Phenol/HCl solution, ρ = 1 g/l (in HCl, c = 12 mol/l).
Into a 100 ml volumetric flask, weigh out 100 mg of phenol and make up to the mark with 12 mol/l HCl
(5.12).
1)
6.1.5 AccQ·Tag™ Ultra Derivatization kit.
Prepare the reagents included in the kit following the manufacturer’s instructions.
1)
6.1.6 AccQ·Tag™ Ultra Borate buffer (reagent 1).
Ready-to-use solution. An alternative reagent is sodium tetraborate in water solution (ρ = 50 g/l). Into
a 100 ml volumetric flask, weigh 5 g of sodium tetraborate decahydrate, dissolve and make up to the
mark with water.
IDF 254:2022(E)
1)
6.1.7 AccQ·Tag™ Ultra reagent (vial 2A and 2B).
Reconstitute AccQ·Tag™ Ultra reagent (vial 2A) according to the manufacturer’s instructions as follows:
a) Preheat a heating block to 55 °C.
TM
b) Tap vial 2A lightly before opening to ensure all AccQ·Tag Ultra reagent powder is at the bottom of
the vial.
TM
c) Rinse a clean micropipette by drawing and discarding 1 ml of AccQ·Tag Ultra reagent diluent
from vial 2B (ready-to-use solution). Repeat twice.
TM
d) Draw 1,0 ml from vial 2B and transfer it to the AccQ·Tag Ultra reagent powder in vial 2A. Cap the
vial tightly.
e) Vortex mix for approximately 10 s.
TM
f) Heat vial 2A on top of the preheated heating block until the AccQ·Tag Ultra reagent powder is
dissolved. Do not heat the reagent for longer than 10 min.
TM
Once reconstituted, the AccQ·Tag Ultra reagent concentration is approximately 10 mmol/l. Store the
TM
reconstituted AccQ·Tag Ultra reagent in a desiccator at room temperature for up to one week.
TM
CAUTION — AccQ·Tag Ultra reagent reacts with atmospheric moisture. Seal the container
tightly when not in use. Do not refrigerate. Do not use discoloured reagent, especially if it is
yellow or green.
The following alternative reagent can be used. Into a 4 ml vial, weigh out approximately 3,0 mg to
4,0 mg of 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate. Continue with step c) above using LC-
grade acetonitrile instead of the AccQ·Tag™ Ultra reagent diluent.
6.2 Norvaline (Nva) internal standards
6.2.1 Nva stock solution, c = 10 mmol/l.
Weigh 117,16 mg Nva into a 100 ml volumetric flask and make up to the mark with 0,1 mol/l HCl (5.14).
6.2.2 Nva solution, c = 2,5 mmol/l.
Pipet 2,5 ml of Nva stock solution (6.2.1) into a 10 ml volumetric flask and make up to the mark with
0,1 mol/l HCl (5.14).
Store both Nva solutions at −20 °C for up to six months as 2 ml aliquots.
6.3 Cystine calibration standards
6.3.1 Cystine stock solution, c = 10 mmol/l.
Weigh 240 mg cystine into a 100 ml volumetric flask and make up to the mark with 0,05 mol/l NaOH
(6.1.1). Store this solution at −20 °C for up to three months as 1 ml aliquots.
6.3.2 Cystine solution, c = 1 mmol/l.
Add 900 µl of 0,05 mol/l NaOH (6.1.1) to 100 µl of cystine stock solution (6.3.1). Prepare this solution
freshly for each analysis.
IDF 254:2022(E)
6.4 Amino acid (AA) calibration standards (with exception of cystine)
6.4.1 AA stock solution, c = 2,5 mmol/l.
Amino acid standard solution is ready-to-use and contains 2,5 mmol/l of each amino acid (although
present in this solution, cystine is not used for quantification and is prepared separately, see 6.3).
Store this calibration standard stock solution at −20 °C for up to six months as 250 µl aliquots.
6.4.2 AA solution 1, c = 0,5 mmol/l.
Add 600 μl of 0,1 mol/l HCl (5.14) to 150 μl of AA stock solution (6.4.1). Prepare this solution freshly for
each analysis.
6.4.3 AA solution 2, c = 0,05 mmol/l.
Add 900 μl of 0,1 mol/l HCl (5.14) to 100 μl of AA solution 1 (6.4.2). Prepare this solution freshly for
each analysis.
6.5 Chromatography solvents (mobile phases)
6.5.1 Eluent A (Solvent A).
Prepare Eluent A from AccQ·Tag™ Ultra Eluent A concentrate as follows:
a) Measure 850 ml of water into a 1 l graduated cylinder.
b) In a separate graduated cylinder, measure 150 ml of AccQ·Tag™ Ultra Eluent A concentrate.
c) Add the concentrate to the water and mix thoroughly.
Eluent A concentrate, once opened, shall be stored tightly capped at around 4 °C. Dilute Eluent A is
stable for one week at room temperature.
As an alternative for Eluent A concentrate, the following solution can be used. Mix 840 ml of 200 mmol/l
ammonium formate solution (12,61 g ammonium formate in 1 l of water), 110 ml of acetonitrile and
50 ml of formic acid. Prepare Eluent A from the concentrate as described above.
6.5.2 Eluent B (Solvent B).
AccQ·Tag™ Eluent B is supplied as a working solution. No additional preparation is required. Eluent B,
once opened, shall be stored tightly capped at around 4 °C for no longer than one month.
As an alternative for Eluent B, the following solution can be used. Add 13,2 ml formic acid to 1 l
acetonitrile.
6.5.3 Wash solvents.
a) The weak needle wash solvent is 50 ml/l acetonitrile in water.
b) The strong needle wash solvent is 950 ml/l acetonitrile in water.
c) The seal wash solvent is 500 ml/l acetonitrile in water.
IDF 254:2022(E)
7 Apparatus
7.1 UHPLC system that sustains a pressure of approximately 62 MPa and can achieve baseline
3)
separation of the amino acids .
7.2 Chromatography column, ACQUITY UPLC™ BEH C18 Column, 130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm × 150 mm
1)
(Waters 186002353 ) or equivalent, provided baseline separation of the amino acids is achieved.
7.3 Adjustable micropipettes, of volume 10 µl, 20 µl, 200 µl and 1 000 µl and tips.
7.4 Vortex mixer.
7.5 Analytical balance, with a precision of 0,1 mg.
7.6 Heating block, able to maintain a temperature of 55 °C ± 2 °C.
7.7 Laboratory oven, able to maintain a temperature of 110 °C ± 2 °C.
® 1)
7.8 Syringe filter, 0,45 µm Polyvinylidene fluoride (PVDF) Millex -HV (e.g. Millipore SLHV013NL
or equivalent).
7.9 Syringes, of 2 ml volume.
7.10 Borosilicate glass tubes (e.g. Pyrex), of 10 ml volume with screw cap.
7.11 Microtubes, of volume 1,5 ml and 2 ml.
7.12 Vial with screw cap, of volume 4 ml.
1)
7.12.1 Glass screw neck total recovery vial, 12 mm × 32 mm (Waters 186000384C or equivalent).
8 Sample analysis
8.1 Sample preparation
Prepare different sample types differently. Powder infant and adult/paediatric nutritional formulas
shall be reconstituted in water first. Other samples are used without reconstitution.
Reconstitute powder infant and adult/paediatric nutritional formula samples by adding 25 g powder to
200 g water and mix thoroughly. Weigh 220 mg ± 20 mg reconstituted powders into a 10 ml glass tube
with screw cap. Report the sample mass to 0,1 mg.
For ready-to-feed infant and adult/paediatric nutritional formula and liquid dairy samples, weigh
220 mg ± 20 mg liquid into a 10 ml glass tube with screw cap. Report the sample mass to 0,1 mg.
For dairy powder and cereals samples, weigh 50 mg ± 5 mg dairy powder samples or 100 mg ± 10 mg
cereals samples into a 10 ml glass tube with screw cap. Report the sample mass to 0,1 mg.
To each tube, add water, DDP, HCl, Nva and phenol/HCl according to Table 1.
1) 1) 1) 1)
3) Agilent 1260 Infinity II , Waters Acquity , Waters Acquity-I , Waters Acquity-H and Thermo Fisher Scientific
1)
3000 RS have been successfully used during the multi-laboratory study.
IDF 254:2022(E)
Add the phenol/HCl solution under the hood. Sparge the tube a minimum of approximately 5 s with a
stream of nitrogen to displace oxygen. Close tubes with screw caps and vortex. Make sure the caps are
perfectly clean (i.e. devoid of any particle) to ensure tightness and avoid evaporation during hydrolysis.
Table 1 — Preparation of the sample tubes
Solution Reconstituted infant formulas Dairy powders Cereals
and adult nutritionals, ready-
to-feed formulas and liquid
dairy samples
Sample, mg 220 50 100
Water, μl 880 750 1 000
DDP solution (6.1.3), μl 600 600 600
0,2 mol/l HCl (6.1.2), μl 600 600 600
Nva stock solution (6.2.1), μl 200 500 200
Phenol/HCl solution (6.1.4), μl 2 500 2 500 2 500
8.2 Cystine calibration standards preparation
Table 2 describes how to prepare calibration standards for converted cystine at 0 pmol/µl to 10 pmol/
µl with Nva at 10 pmol/µl (all are final concentrations after derivatization).
Add the phenol/HCl solution under the hood. Sparge the tube approximately 5 s with a stream of
nitrogen to displace oxygen. Close tubes with screw caps and vortex. Make sure the caps are perfectly
clean (i.e. devoid of any particle) to ensure tightness and avoid evaporation during hydrolysis.
Table 2 — Final cystine concentration after derivatization
Solution 10 pmol/µl 5 pmol/µl 2,5 pmol/µl 1 pmol/µl 0,5 pmol/µl 0 pmol/µl
a a a b b
Cystine solution, μl 200 100 50 200 100 0
Water, μl 900 1 000 1 050 900 1 000 1 100
DDP solution (6.1.3), μl 600 600 600 600 600 600
0,2 mol/l HCl (6.1.2), μl 600 600 600 600 600 600
Nva stock solution (6.2.1), μl 200 200 200 200 200 200
Phenol/HCl solution (6.1.4), μl 2 500 2 500 2 500 2 500 2 500 2 500
a
10 mmol/l cystine stock solution (6.3.1).
b
1 mmol/l cystine solution (6.3.2).
8.3 Hydrolysis (of samples and cystine standards)
Place tubes in an oven at 110 °C ± 2 °C for 24 h ± 0,5 h.
8.4 Neutralization and dilution (of samples and cystine standards)
Take the tubes out of the oven. Allow hydrolysates to cool down and particles to settle down prior to
taking an aliquot. When transferring aliquots, pipet about 1 cm below the top of the liquid. Perform
neutralization under the hood.
For infant formula, liquid dairy and cereal samples as well as converted cystine standards, transfer
0,2 ml of each hydrolysate (samples and converted cystine standards) into a 1,5 ml microtube, add
0,2 ml of 6 mol/l NaOH (6.1.1) and then 0,4 ml of 0,1 mol/l HCl (5.14). Mix well and filter through a
0,45 µm membrane filter into another 1,5 ml microtube.
IDF 254:2022(E)
For dairy powder samples, transfer 0,2 ml of the hydrolysate sample solution into a 2 ml microtube,
add 0,2 ml of 6 mol/l NaOH (6.1.1) and then 1,6 ml of 0,1 mol/l HCl (5.14). Mix well and filter through
0,45 µm membrane filter into another 2 ml microtube.
8.5 Amino acids calibration standards preparation (not needed to be acid hydrolysed)
Table 3 shows how to prepare 0,5 ml calibration standards at 0 pmol/µl to 25 pmol/µl and Nva at
10 pmol/µl (all are final concentration after derivatization).
The amino acid solutions are stable for one week when stored at 4 °C ± 2 °C.
Table 3 — Amino acid concentrations (each, final, after derivatization)
Solution 25 pmol/µl 10 pmol/µl 5 pmol/µl 1 pmol/µl 0,5 pmol/µl 0 pmol/µl
a b b c c
Amino acid solution, μl 50 100 50 100 50 0
Water, μl 50 100 50 100 50 0
Nva solution (6.2.2), μl 20 20 20 20 20 20
0,1 mol/l HCl (5.14), μl 380 280 380 280 380 480
a
2,5 mmol/l AA stock solution (6.4.1).
b
0,5 mmol/l AA solution 1 (6.4.2).
c
0,05 mmol/l AA solution 2 (6.4.3).
8.6 Derivatization (of samples, cystine standards and amino acids standards)
Derivatization converts free amino acids into highly stable derivatives. Standards and samples are
derivatized following the manufacturer’s instructions, as follows:
— Preheat a heating block to 55 °C.
— With a micropipette, add 70 μl of AccQ·Tag™ Ultra Borate buffer (reagent 1, see 6.1.6) to a clean
12 mm × 32 mm glass screw neck total recovery vial.
— Add 10 μl of calibration standard (8.5), neutralized sample solution (8.4), or neutralized converted
cystine standard (8.4) to the vial.
— Vortex mix briefly.
— Add 20 μl of reconstituted AccQ·Tag™ Ultra reagent (6.1.7) to the sample vial.
— Mix the solution immediately by pipetting up and down several times. Cap and mix by vortex
immediately for several seconds and tap the vial to ensure no bubble is trapped.
— Let stand for 1 min at room temperature.
— Heat the vial in a heating block for 10 min at 55 °C ± 1 °C.
8.7 UHPLC separation
Perform UHPLC separation as follows:
— Prime solvent lines for 5 min.
— Prime wash/sample syringes for four cycles.
— Allow the chromatographic system to stabilize before injecting standards and samples. Make sure
the system pressure and initial conditions are stable before performing injections (around 62 MPa).
— Before starting a series of analyses, inject two blanks (water) to condition the column.
IDF 254:2022(E)
— Inject 1 µl of each derivatized calibration standards, and then inject 1 µl of derivatized sample
solutions. Perform single injections. Add a blank injection (water) at the end of each calibration
series.
— Perform UHPLC under the following conditions and those given in Table 4:
— column temperature: 50 °C;
— UV detector: 260 nm;
— injection volume: 1 μl;
— flow rate: 0,4 ml/min;
— mobile phase A: Eluent A (6.5.1);
— mobile phase B: Eluent B (6.5.2).
NOTE Fluorescence detection can be used provided equivalence has been demonstrated.
Operating conditions can vary depending on the apparatus. Follow the supplier’s instructions. Examples
1)
of wash solvents used with Waters UPLC systems are given in 6.5.3.
Table 4 — Eluent gradient
Time % A % B Curve
0,00 99,9 0,1
5,50 99,9 0,1 2
15,22 90,9 9,1 7
20,47 78,8 21,2 6
21,26 40,4 59,6 6
21,29 10 90 6
22,84 10 90 6
26,00 99,9 0,1 6
32,00 99,9 0,1 6
8.8 Peak identification and integration
Identify the amino acids peaks in the sample solution by comparison with the retention times of the
corresponding peaks obtained in the calibration standards (see Annex B for examples). If a peak has not
been integrated correctly, call the recorded data and reintegrate.
To verify system stability, inject a mid-level standard a minimum of three times (5 × for United States
Pharmacopoeia (USP) requirements) and ensure response and retention times have a coefficient of
variation, C < 2.
v
Check that peaks are separated with a good resolution (baseline separation). If this is not the case,
adapt the chromatographic conditions (gradient, temperature, tubing length, etc.) accordingly.
To check that the derivatization reagent was present in sufficient amount (excess), verify that the
derivatization peak is present in the chromatogram. The response of the excess reagent is present in
the chromatography as the large 6-aminoquinoline (AMQ) peak first to elute. The response should be
equal to that of the 25 pmol/μl standard or the reaction and sample should be flagged and discarded.
The derivatization peak at approximately 17 min prior to lysine can be ignored.
IDF 254:2022(E)
9 Calculation and expression of results
9.1 Calibration curve
Establish the calibration curve from the six different calibration standards for each amino acid and
converted cystine at the beginning of each series of analyses by plotting the response (peak area ratio
of analyte versus internal standard, multiplied by the concentration of the internal standard, see
Formula (1) against analyte concentration:
A
s
R=×c (1)
is
A
is
where
R is the response;
A is the peak area of individual amino acids in the calibration standard solution;
s
A is the peak area of internal standard in the calibration standard solution;
is
c is the concentration of internal standard in the calibration standard solution, in pmol/μl.
is
Force the linear regression through zero. Check the linearity of the calibration (the correlation
coefficient R shall be above 0,99).
9.2 Amino acid calculation
Calculate the amount of individual amino acids present in the sample in pmol/μl from the calibration
curve using Formula (2):
Ac×
sis
c = (2)
s
AS×
is
where
c is the concentration of individual amino acid in the test sample solution in pmol/μl;
s
A is the peak area of individual amino acid in the test sample solution;
s
c is the concentration of internal standard in the test sample solution, in pmol/μl;
is
A is the peak area of internal standard in the test sample solution;
is
S is the slope of the calibration curve (all curves are forced through zero, equation: y = ax).
Calculate the mass fraction, w, of each amino acid, in milligram per 100 g of product, using Formula (3):
cM××Vd××d
sA s 12
w= (3)
m ×10
s
where
c is the concentration of individual amino acid in the test sample solution in pmol/μl;
s
M is the molar mass of individual amino acids in g/mol (see Table 5);
A
V is the volume of hydrolysis solution in ml (typically V = 5 ml);
s s
d is the dilution factor in the neutralization step (4 or 10, depending on the sample);
IDF 254:2022(E)
d is the dilution factor in the derivatization step (10);
m is the mass of the test portion in mg;
s
−9 3 −5
10 is the combined factor to convert pg to mg (10 ), ml to μl (10 ) and mg to 100 g (1/10 ).
Table 5 — Molar mass (M ) of amino acids
A
Amino acid M Amino acid M
A A
g/mol g/mol
Alanine 89,10 Lysine 146,19
Arginine 174,20 Methionine 149,21
Aspartic acid 133,11 Phenylalanine 165,19
Cystine 240,30 Proline 115,13
Glutamic acid 147,13 Serine 105,09
Glycine 75,07 Threonine 119,12
Histidine 155,16 Tyrosine 181,19
Isoleucine 131,18 Valine 117,15
Leucine 131,18
10 Precision
10.1 General
Details of the interlaboratory test of the precision of the method are summarized in Annex A. The values
derived from the interlaboratory test may not be applicable to analyte concentration ranges and/or
matrices other than those given in Annex A.
10.2 Repeatability
The absolute difference between two single test results found on identical test material by one operator
using the same apparatus with the shortest feasible time interval will exceed the repeatability limit r in
not more than 5 % of the cases. The values of r are given in Table 6.
10.3 Reproducibility
The absolute difference between two single test results found on identical test material reported by
two laboratories will exceed the reproducibility limit R in not more than 5 % of the cases. The values of
R are given in Table 6.
IDF 254:2022(E)
̄̄̄̄̄̄
Table 6 — Precision data
Alanine
a b c d e f g h i j k l m n p
Sample S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2° C3
x , mg/100 g 60,0 66,5 59,9 60,9 59,7 49,4 60,9 59,7 86,7 107,8 516,1 2 756,4 816,7 421,5 756,4 271,5
r, mg/100 g 3,94 2,21 2,91 2,41 2,70 1,46 2,57 3,20 3,59 7,52 38,03 108,16 46,37 13,37 53,87 15,64
R, mg/100 g 14,93 8,47 7,60 9,31 6,96 5,79 8,48 7,47 13,56 16,23 77,36 546,48 123,27 52,01 113,78 30,31
Arginine
a b c d e f g h i j k l m n p
Sample S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2° C3
x , mg/100 g 62,8 32,7 102,3 106,4 32,9 36,5 103,5 50,6 89,1 115,0 256,4 3 448,9 850,7 463,3 839,1 254,2
r, mg/100 g 6,44 2,42 5,26 5,99 4,12 3,14 6,12 2,48 6,76 12,12 52,87 171,83 51,03 27,21 104,91 19,54
R, mg/100 g 14,45 4,32 13,80 11,39 5,16 5,82 13,28 5,89 10,06 27,48 52,87 565,90 91,17 91,90 135,54 58,31
Asparagine and aspartic acid
a b c d e f g h i j k l m n p
Sample S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2° C3
x , mg/100 g 143,1 150,7 163,8 182,0 136,9 112,8 166,8 139,0 137,2 259,3 1 148,0 6 380,1 1 950,0 619,6 1 791,7 374,4
r, mg/100 g 3,47 11,87 11,46 25,22 8,70 3,98 12,80 7,34 6,86 19,66 67,31 324,55 173,10 25,38 152,94 28,05
R, mg/100 g 19,46 17,61 18,03 25,86 26,58 13,14 21,86 14,80 21,25 64,90 155,39 1 540,26 253,03 86,73 370,90 60,48
Cysteine and cystine
a b c d e f g h i j k l m n p
Sample S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2° C3
x , mg/100 g 18,1 35,1 18,0 24,4 20,3 19,6 18,0 20,9 16,7 25,9 258,9 389,1 199,8 177,2 187,8 125,6
r, mg/100 g 2,73 1,67 1,37 3,95 2,71 1,19 2,31 0,74 0,84 2,06 12,40 27,93 19,63 15,70 20,60 8,10
R, mg/100 g 6,95 11,20 5,57 8,17 5,70 6,46 6,24 3,80 7,24 5,13 47,63 118,68 21,50 48,67 30,66 30,33
Glutamine and glutamic acid
a b c d e f g h i j k l m n p
Sample S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2° C3
x , mg/100 g 336,7 242,4 276,8 234,7 279,3 248,4 282,9 334,3 242,7 720,0 1 949,6 20 287,3 5 389,8 2 663,7 2 313,9 2 010,7
r, mg/100 g 7,05 9,68 15,03 6,27 11,88 6,18 9,80 17,82 10,84 48,54 186,89 930,50 311,87 93,90 241,76 121,51
R, mg/100 g 33,74 24,42 34,03 23,87 27,81 18,87 23,30 30,25 26,81 136,04 225,89 5 174,93 684,89 370,85 376,24 290,40
Glycine
a b c d e f g h i j k l m n p
Sample S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2° C3
x , mg/100 g 36,2 24,7 57,9 46,8 27,4 22,6 58,3 30,6 150,7 62,2 228,0 1 745,0 471,3 495,7 789,3 313,0
r, mg/100 g 1,61 0,88 3,43 4,27 1,81 0,97 3,76 1,91 6,28 7,50 36,65 122,58 40,57 21,36 22,27 22,24
R, mg/100 g 8,30 4,15 7,19 7,51 3,14 3,46 9,04 4,79 25,29 9,16 48,52 327,30 59,32 84,88 66,42 48,49
IDF 254:2022(E)
̄̄̄̄̄̄
Table 6 (continued)
Histidine
a b c d e f g h i j k l m n p
Sample S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2° C3
x , mg/100 g 40,3 24,0 35,1 44,0 24,8 27,2 34,8 40,2 43,9 88,5 187,2 2 706,5 668,5 241,8 365,3 147,8
r, mg/100 g 1,93 0,47 5,93 2,45 1,36 1,29 3,01 0,95 1,62 3,30 17,08 230,24 37,49 16,95 22,98 14,35
R, mg/100 g 10,38 4,46 8,32 5,99 2,76 6,28 5,31 7,72 5,26 9,42 32,98 600,16 74,10 46,97 40,51 29,75
Isoleucine
a b c d e f g h i j k l m n p
Sample S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2° C3
x , mg/100 g 86,0 84,0 66,8 120,9 83,3 69,6 68,1 88,5 87,1 175,9 670,6 4 854,9 1 296,0 352,4 657,6 254,1
r, mg/100 g 2,47 4,04 4,70 4,15 3,27 2,83 5,36 4,61 1,69 10,78 52,94 169,94 52,39 20,28 57,87 21,80
R, mg/100 g 9,45 9,83 8,75 11,59 12,64 7,65 7,00 8,96 7,01 36,10 52,94 772,90 199,66 63,44 96,38 55,89
Leucine
a b c d e f g h i j k l m n p
Sample S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2° C3
x , mg/100 g 153,0 141,3 110,9 197,0 147,4 124,7 113,4 161,6 138,0 331,3 1 104,1 8 660,8 2 424,4 672,9 1 151,8 484,8
r, mg/100 g 5,09 3,74 6,26 6,71 2,18 4,58 9,50 7,66 3,61 7,87 85,20 286,78 103,00 13,98 84,69 26,57
R, mg/100 g 14,57 12,14 8,21 18,16 16,86 10,96 10,58 12,12 9,29 31,93 100,36 1 016,61 239,93 72,48 102,61 60,96
Lysine
a b c d e f g h i j k l m n p
Sample S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2° C3
x , mg/100 g 131,4 122,9 86,1 110,2 97,4 99,5 84,2 130,7 91,1 260,1 959,1 7 210,1 1 953,0 190,9 813,2 99,5
r, mg/100 g 7,56 8,51 5,93 13,54 4,58 3,89 6,49 11,42 5,27 33,99 111,63 527,39 152,28 16,90 83,12 15,21
R, mg/100 g 30,40 12,61 10,70 14,48 25,69 11,16 10,23 15,71 13,50 64,10 119,22 1 580,88 292,99 39,40 98,12 26,74
Methionine
a b c d e f g h i j k l m n p
Sample S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2° C3
x , mg/100 g 51,6 27,9 36,6 43,7 30,2 29,0 42,1 39,9 37,3 87,5 214,9 2 655,2 643,3 136,1 138,3 101,9
r, mg/100 g 1,65 3,17 2,46 2,87 2,78 1,67 1,17 1,96 1,11 11,35 29,05 161,65 51,50 8,05 22,97 9,30
R, mg/100 g 8,46 5,67 4,71 5,44 4,97 3,42 5,08 5,48 4,63 21,04 69,45 440,70 115,51 31,98 74,14 20,12
Phenylalanine
a b c d e f g h i j k l m n p
Sample S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2° C3
x , mg/100 g 73,5 42,9 72,9 100,4 57,4 50,5 73,6 71,4 76,5 164,4 341,4 4 856,9 1 212,2 457,3 735,9 323,0
r, mg/100 g 2,58 4,48 2,93 6,94 5,19 4,21 7,21 4,48 6,27 5,74 13,47 538,26 79,83 41,50 54,43 24,08
R, mg/100 g 5,84 6,88 8,62 8,54 9,12 6,02 7,21 9,05 9,20 15,19 53,37 1 085,91 146,31 74,15 89,31 49,79
IDF 254:2022(E)
̄̄̄̄̄
Table 6 (continued)
Proline
a b c d e f g h i j k l m n p
Sample S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2° C3
x , mg/100 g 136,2 79,1 71,8 60,4 113,8 100,4 73,3 140,7 128,5 334,0 635,4 9 892,8 2 404,1 859,0 902,3 671,9
r, mg/100 g 4,27 2,71 3,23 3,87 5,57 2,52 4,74 3,98 6,56 7,22 30,99 315,21 105,69 29,14 78,04 55,70
R, mg/100 g 12,47 7,98 4,19 6,36 14,63 8,73 6,69 11,58 10,99 35,67 61,81 1 307,39 245,37 78,45 83,65 99,82
Serine
a b c d e f g h i j k l m n p
Sample S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2° C3
x , mg/100 g 89,6 72,1 74,8 56,0 78,9 67,9 75,8 89,3 70,4 190,4 554,8 5 378,2 1 400,8 471,4 780,5 335,9
r, mg/100 g 4,91 3,05 5,49 3,12 3,44 2,44 5,16 4,46 2,37 7,03 36,60 218,35 82,09 24,46 43,45 19,46
R, mg/100 g 16,09 11,49 13,61 9,94 11,56 10,75 12,98 13,57 10,52 35,98 142,32 1 242,03 245,78 106,04 75,43 52,40
Threonine
a b c d e f g h i j k l m n p
Sample S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2° C3
x , mg/100 g 76,9 95,1 53,7 77,7 86,1 67,5 55,1 81,8 68,9 150,9 719,3 4 048,8 1 099,2 319,9 611,6 217,2
r, mg/100 g 1,52 2,29 2,22 5,59 4,15 1,73 2,03 3,94 1,95 4,32 34,59 154,91 59,51 13,79 32,58 14,18
R, mg/100 g 11,28 10,41 6,80 10,21 11,17 8,10 6,50 8,91 7,77 17,06 87,67 686,35 127,47 33,67 50,66 26,08
Tyrosine
a b c d e f g h i j k l m n p
Sample
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 4214
FIL 254
Première édition
2022-12
Lait et produits laitiers —
Détermination des acides aminés dans
les formules infantiles, les produits
nutritionnels pour adultes/enfants et
autres produits laitiers
Milk and milk products — Determination of amino acids in infant and
adult/paediatric nutritional formulas and dairy products
Numéros de référence
FIL 254:2022(F)
© ISO et FIL 2022
FIL 254:2022(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO et FIL 2022
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8 Silver Building • Bd Auguste Reyers 70/B
CH-1214 Vernier, Genève B-1030 Brussels
Tél.: +41 22 749 01 11 Tél.: + 32 2 325 67 40
Fax: +41 22 749 09 47 Fax: + 32 2 325 67 41
E-mail: copyright@iso.org E-mail: info@fil-idf.org
Web: www.iso.org Web: www.fil-idf.org
Publié en Suisse
ii
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 2
5 Réactifs . 2
6 Préparation des réactifs et des étalons . 3
6.1 Généralités . 3
6.2 Étalons internes de norvaline (Nva) . 4
6.3 Solutions d’étalonnage de cystine . 5
6.4 Solutions d’étalonnage d’acides aminés (AA) (à l’exception de la cystine) . 5
6.5 Solvants de chromatographie (phases mobiles). 5
7 Appareillage . 6
8 Analyse d’échantillon . 7
8.1 Préparation des échantillons . 7
8.2 Préparation des solutions d’étalonnage de cystine . 7
8.3 Hydrolyse (des échantillons et des étalons de cystine) . 8
8.4 Neutralisation et dilution (d’échantillons et d’étalons de cystine) . 8
8.5 Préparation des solutions d’étalonnage d’acides aminés (non nécessaire pour une
hydrolyse acide) . 8
8.6 Dérivatisation (d’échantillons, d’étalons de cystine et d’acides aminés) . 9
8.7 Séparation CLUHP . 9
8.8 Identification et intégration des pics . 10
9 Calcul et expression des résultats .10
9.1 Droite d’étalonnage . 10
9.2 Calcul des acides aminés . . 11
10 Fidélité .12
10.1 Généralités .12
10.2 Répétabilité .12
10.3 Reproductibilité . .12
11 Rapport d’essai .16
Annexe A (informative) Données de fidélité .17
Annexe B (informative) Exemples de chromatogramme .35
Bibliographie .36
iii
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers et la Fédération internationale du lait (FIL) en collaboration avec l’AOAC
INTERNATIONAL et l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 4, Céréales et légumineuses. Il est
publié conjointement par l’ISO et la FIL et séparément par l’AOAC INTERNATIONAL.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente
les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont
organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de
groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des
acteurs de l’industrie de transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des
universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL collaborent étroitement sur toutes les activités de normalisation concernant les méthodes
d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient
conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux
organisations.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Le présent document a été élaboré par le Comité permanent de la FIL chargé des méthodes d’analyse de
la composition de la Fédération internationale du lait (FIL) et le comité technique ISO/TC 34, Produits
alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, en collaboration avec l’AOAC INTERNATIONAL et
l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 4, Céréales et légumineuses. Il est publié conjointement
par l’ISO et la FIL et séparément par l’AOAC INTERNATIONAL.
L’ensemble des travaux a été confié à l’Équipe d’action FIL/ISO C51, du Comité permanent chargé des
Méthodes d’analyse de la composition, sous la conduite de son chef de projet, M. C. Fuerer (CH).
v
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE
FIL 254:2022(F)
Lait et produits laitiers — Détermination des acides
aminés dans les formules infantiles, les produits
nutritionnels pour adultes/enfants et autres produits
laitiers
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de détermination quantitative des acides aminés totaux
en utilisant la dérivatisation du 6-aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl carbamate (ACQ) suivie
d’une séparation de chromatographie en phase liquide à ultra haute performance (CLUHP) et d’une
détection par ultraviolet (UV). Il spécifie une méthode pour la détermination, en une seule analyse, des
acides aminés suivants: alanine, arginine, acide aspartique (combiné à l’asparagine), cystine (dimère
de la cystéine, combiné à la cystéine), acide glutamique (combiné à la glutamine), glycine, histidine,
isoleucine, leucine, lysine, méthionine, phénylalanine, proline, sérine,thréonine, tyrosine et valine.
Cette méthode ne s’applique pas à la détermination du tryptophane.
Cette méthode s’applique aux formules infantiles, aux produits nutritionnels pour adultes/enfants,
aux produits laitiers et à d’autres matrices telles que les céréales. Elle a été validée dans les formules
infantiles (à base de lait et de soja, y compris les produits partiellement hydrolysés et les produits
élémentaires), les préparations pour nourrissons, les poudres nutritionnelles pour adultes, le lait
écrémé UHT, le lactosérum en poudre, le caséinate de sodium, le lait entier en poudre, les aliments pour
animaux au son, les aliments secs pour animaux et les céréales pour petit-déjeuner (voir Annexe A pour
plus de détails).
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
formule infantile
substitut du lait maternel spécialement fabriqué pour satisfaire, par lui-même, les besoins nutritionnels
des nourrissons pendant les premiers mois de la vie jusqu’à l’introduction d’une alimentation
complémentaire appropriée
[SOURCE: Norme Codex 72-1981]
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
3.2
produits nutritionnels pour adultes/enfants
aliments complets sur le plan nutritionnel, spécialement formulés, consommés sous forme liquide,
qui peuvent constituer une source d’alimentation unique, fabriqués à partir de toute combinaison de
lait, de soja, de riz, de lactosérum, de protéines hydrolysées, d’amidon et d’acides aminés, avec ou sans
protéines intactes
4 Principe
Les protéines sont hydrolysées dans 6 mol/l d’acide chlorhydrique (HCl) pendant 24 h à 110 °C en
présence de phénol, d’acide 3-3'-dithiodipropionique (DDP) et de norvaline. Le phénol est ajouté pour
prévenir l’halogénation de la tyrosine. La norvaline est ajoutée comme étalon interne. Le DDP est ajouté
pour transformer la cystine et la cystéine en S-2-carboxyéthylthiocystéine (XCys), comme décrit dans
la Référence [1], et le dérivé résultant peut être séparé des autres acides aminés pour la quantification.
Après la neutralisation, les acides aminés et la cystéine transformée (XCys) sont dérivés en utilisant
l’AQC. Les acides aminés dérivés sont séparés en utilisant une méthode CLUHP en phase inverse avec
détection par UV à une longueur d’onde de 260 nm.
NOTE Il est possible d’utiliser une méthode de détection par fluorescence, à condition que l’équivalence ait
été démontrée.
Lors de l’hydrolyse acide, la glutamine (Gln) et l’asparagine (ASN) sont transformées respectivement
en acide glutamique (Glu) et en acide aspartique (Asp). Ainsi, les valeurs Glu représentent les valeurs
combinées de Glu et de Gln, et les valeurs Asp représentent les valeurs combinées de Asp et Asn.
Les valeurs Cys2 représentent les valeurs combinées de cystéine et de cystine puisque les deux sont
converties en XCys par le DDP.
5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
Les références commerciales ne constituent qu’une ligne directrice. Il est possible d’utiliser des
matériaux ou produits chimiques équivalents, à condition que l’équivalence ait été démontrée. Avant
d’utiliser des produits chimiques, se référer aux fiches techniques de sécurité et s’assurer que les
précautions de sécurité sont appliquées.
1)
5.1 Kit de dérivatisation AccQ Tag™ Ultra (Waters 186003836 ).
En variante de tampon de dérivation, il est possible d’utiliser du tétraborate de disodium décahydraté
2)
(numéro de registre CAS© 1303-96-4).
Le 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (CAS 148757-94-2) peut être utilisé comme
réactif de marquage alternatif.
5.2 Concentré d’éluant A AccQ Tag™ Ultra (Waters 1860038381)).
Il est possible d’utiliser comme réactifs alternatifs l’acétonitrile, le grade de gradient pour la
chromatographie liquide (CL) (CAS 75-05-8), et l’acide formique (CAS 64-18-6).
1) Il s’agit d’un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que la FIL ou l’ISO approuve l’emploi
du produit ainsi désigné. Il a été démontré que les réactifs alternatifs énumérés dans le présent document
conduisaient aux mêmes résultats.
2) Le numéro de registre CAS® est une marque de la société CAS. Cette information est donnée à l’intention
des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve l’emploi du produit ainsi désigné.
Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils aboutissent aux mêmes résultats.
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
1)
5.3 Éluant B Ultra AccQ·Tag™ (Waters 186003839 ).
Il est possible d’utiliser comme réactifs alternatifs l’acétonitrile, le grade de gradient pour la
chromatographie liquide (CL) (CAS 75-05-8), l’acide formique (CAS 64-18-6) et le formiate d’ammonium
(CAS 540-69-2).
5.4 Phénol (CAS 108-95-2).
5.5 3,3′-acide dithiodipropionique (CAS 1119-62-6).
5.6 Solution étalon d’acides aminés, contenant les 17 acides aminés suivants à 2,5 µmol/ml chacun
(sauf la l-cystine à 1,25 µmol/ml) dans 0,1 mol/l d’HCl: l-alanine, l-arginine, acide l-aspartique,
l-cystine, acide l-glutamique, l-glycine, l-histidine, l-isoleucine, l-leucine, l-lysine, l-méthionine,
l-phénylalanine, l-proline, l-sérine, l-thréonine, l-tyrosine et l-valine.
5.7 l-cystine (CAS 56-89-3).
5.8 Norvaline (CAS 6600-40-4).
5.9 Pastilles d’hydroxyde de sodium, qualité réactif (CAS 1310-73-2).
5.10 Solution d’hydroxyde de sodium (CAS 1310-73-2), concentration de la substance c = 1 mol/l.
5.11 Solution d’hydroxyde de sodium (facultative) (CAS 1310-73-2), c = 6 mol/l.
5.12 Acide chlorhydrique fumant 37 % (CAS 7647-01-0), c = 12 mol/l, qualité GR pour analyse.
5.13 Solution d’acide chlorhydrique (CAS 7647-01-0), c = 1 mol/l.
5.14 Solution d’acide chlorhydrique (CAS 7647-01-0), c = 0,1 mol/l.
5.15 Eau de laboratoire, avec une résistivité de 18,2 MΩ-cm (eau ultra-pure).
6 Préparation des réactifs et des étalons
6.1 Généralités
6.1.1 Solutions d’hydroxyde de sodium (NaOH), c = 6 mol/l, c = 0,2 mol/l et c = 0,05 mol/l.
Pour la solution c = 6 mol/l, peser 24 g d’hydroxyde de sodium (5.9) dans une fiole jaugée de 100 ml.
Dissoudre dans environ 80 ml d’eau. Laisser refroidir et diluer à la marque avec de l’eau. Facultatif:
utiliser un équivalent disponible dans le commerce (5.11).
Pour la solution c = 0,2 mol/l, prélever à la pipette 20 ml de NaOH 1 mol/l (5.10) dans une fiole jaugée
de 100 ml et compléter avec de l’eau jusqu’au trait.
Pour la solution c = 0,05 mol/l, prélever à la pipette 5 ml de NaOH 1 mol/l (5.10) dans une fiole jaugée
de 100 ml et compléter avec de l’eau jusqu’au trait.
6.1.2 Solution d’acide chlorhydrique (HCl), c = 0,2 mol/l.
Prélever 20 ml d’HCl 1 mol/l (5.13) à la pipette dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter avec de
l’eau jusqu’au trait.
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
6.1.3 Solution de DDP, concentration massique ρ = 10 g/l (dans le NaOH, c = 0,2 mol/l).
Peser 500 mg de DDP dans une fiole jaugée de 50 ml et compléter jusqu’au trait avec du NaOH 0,2 mol/l
(6.1.1).
6.1.4 Solution d’HCl/phénol, ρ = 1 g/l (dans l’HCl, c = 12 mol/l).
Peser 100 mg de phénol dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter jusqu’au trait avec de l’HCl 12 mol/l
(5.12).
1)
6.1.5 Kit de dérivatisation AccQ·Tag™ Ultra.
Préparer les réactifs inclus dans le kit conformément aux instructions du fabricant.
1)
6.1.6 Tampon AccQ Tag™ Ultra Borate (réactif 1).
Solution prête à l’emploi. Le tétraborate de sodium dans une solution aqueuse (ρ = 50 g/l) peut être
utilisé comme réactif alternatif. Dans une fiole jaugée de 100 ml, ajouter 5 g de tétraborate de sodium
décahydraté, le faire dissoudre et compléter jusqu’au repère avec de l’eau.
1)
6.1.7 Réactif AccQ·Tag™ Ultra (flacons 2A et 2B).
Reconstituer le réactif AccQ·Tag™ Ultra (flacon 2A) conformément aux instructions du fabricant
indiquées ci-dessous:
a) préchauffer un bloc chauffant à 55 °C;
b) tapoter légèrement le flacon 2A avant de l’ouvrir pour s’assurer que toute la poudre de réactif
AccQ Tag™ Ultra se trouve au fond du flacon;
c) rincer une micropipette propre en prélevant et rejetant 1 ml de diluant de réactif AccQ·Tag™ Ultra
provenant du flacon 2B (solution prête à l’emploi). Répéter deux fois;
d) prélever 1,0 ml du flacon 2B et le transférer dans le flacon 2A contenant la poudre de réactif
AccQ Tag™ Ultra. Fermer hermétiquement le flacon;
e) mélanger avec un agitateur de type vortex pendant environ 10 s;
f) chauffer le flacon 2A sur le bloc chauffant préchauffé jusqu’à la dissolution de la poudre de réactif
AccQ·Tag™ Ultra. Ne pas chauffer le réactif pendant plus de 10 minutes.
Une fois reconstitué, la concentration du réactif AccQ·Tag™ Ultra est d’environ 10 mmol/l. Conserver
le réactif AccQ·Tag™ Ultra reconstitué dans un dessiccateur à température ambiante pendant une
semaine maximum.
ATTENTION — Le réactif AccQ·Tag™ Ultra réagit avec une atmosphère humide. Fermer
hermétiquement le récipient lorsqu’il n’est pas utilisé. Ne pas réfrigérer. Ne pas utiliser de réactif
décoloré, surtout s’il est jaune ou vert.
Les réactifs alternatifs suivants peuvent être utilisés. Dans un flacon de 4 ml, peser environ 3,0 mg
à 4,0 mg de 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate. Passer à l’étape c) en utilisant de
l’acétonitrile de qualité CL au lieu du diluant de réactif AccQ·Tag™ Ultra.
6.2 Étalons internes de norvaline (Nva)
6.2.1 Solution mère de Nva, c = 10 mmol/l.
Peser 117,16 mg de Nva dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter jusqu’au trait avec de l’HCl
à 0,1 mol/l (5.14).
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
6.2.2 Solution de Nva, c = 2,5 mmol/l.
Prélever à la pipette 2,5 ml de solution mère de Nva (6.2.1) dans une fiole jaugée de 10 ml et compléter
jusqu’au trait avec de l’HCl à 0,1 mol/l (5.14).
Conserver les deux solutions de Nva à -20 °C pendant six mois maximum sous la forme d’aliquotes
de 2 ml.
6.3 Solutions d’étalonnage de cystine
6.3.1 Solution mère de cystine, c = 10 mmol/l.
Peser 240 mg de cystine dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter jusqu’au trait avec du NaOH
à 0,05 mol/l (6.1.1). Conserver cette solution à -20 °C pendant trois mois maximum sous la forme
d’aliquotes de 1 ml.
6.3.2 Solution de cystine, c = 1 mmol/l.
Ajouter 900 µl de solution de NaOH de concentration 0,05 mol/l (6.1.1) à 100 µl de solution mère
de cystine (6.3.1). Préparer cette solution fraîchement avant chaque analyse.
6.4 Solutions d’étalonnage d’acides aminés (AA) (à l’exception de la cystine)
6.4.1 Solution mère d’AA, c = 2,5 mmol/l.
La solution étalon d’acides aminés est prête à l’emploi et contient 2,5 mmol/l de chaque acide aminé
(bien que présente dans cette solution, la cystine n’est pas utilisée pour la quantification et est préparée
séparément, voir 6.3).
Conserver cette solution mère de solution d’étalonnage à -20 °C pendant six mois maximum sous la
forme d’aliquotes de 250 µl.
6.4.2 Solution 1 d’AA, c = 0,5 mmol/l.
Ajouter 600 µl de solution d’HCl de concentration 0,1 mol/l (5.14) à 150 µl de solution mère d’AA (6.4.1).
Préparer cette solution fraîchement avant chaque analyse.
6.4.3 Solution 2 d’AA, c = 0,05 mmol/l.
Ajouter 900 µl de solution d’HCl de concentration 0,1 mol/l (5.14) à 100 µl de solution 1 d’AA (6.4.2).
Préparer cette solution fraîchement avant chaque analyse.
6.5 Solvants de chromatographie (phases mobiles)
6.5.1 Éluant A (solvant A).
Préparer l’éluant A du concentré de l’éluant A AccQ·Tag™ Ultra comme indiqué ci-dessous:
a) mesurer 850 ml d’eau dans un cylindre gradué de 1 l;
b) dans un cylindre gradué séparé, mesurer 150 ml de concentré d’éluant A AccQ·Tag™ Ultra;
c) ajouter le concentré à l’eau et mélanger soigneusement.
Le concentré d’éluant A, une fois ouvert, doit être conservé hermétiquement fermé à environ 4 °C.
L’éluant A dilué est stable pendant une semaine à température ambiante.
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
Il est possible d’utiliser la solution suivante comme alternative au concentré d’éluant A. Mélanger
840 ml de solution de formate d’ammonium à une concentration de 200 mmol/l (12,61 g de formiate
d’ammonium dans 1 l d’eau), 110 ml d’acétonitrile et 50 ml d’acide formique. Préparer l’éluant A à partir
du concentré tel que décrit ci-dessus.
6.5.2 Éluant B (solvant B).
L’éluant B AccQ·Tag™ est fourni comme solution de travail. Aucune préparation supplémentaire n’est
requise. L’éluant B, une fois ouvert, doit être conservé hermétiquement fermé à environ 4 °C pendant
un mois au maximum.
Il est possible d’utiliser la solution suivante comme alternative à l’éluant B. Ajouter 13,2 ml d’acide
formique dans 1 l d’acétonitrile.
6.5.3 Solvants de lavage.
a) Le solvant faible de lavage des aiguilles consiste en 50 ml/l d’acétonitrile dans de l’eau.
b) Le solvant fort de lavage des aiguilles consiste en 950 ml/l d’acétonitrile dans de l’eau.
c) Le solvant de lavage des joints consiste en 500 ml/l d’acétonitrile dans de l’eau.
7 Appareillage
7.1 Système CLUHP qui maintient une pression d’environ 62 MPa et peut réaliser une séparation
3)
de base des acides aminés .
7.2 Colonne de chromatographie, colonne ACQUITY UPLC™ BEH C18, 130 Å, 1,7 μm,
1)
2,1 mm x 150 mm (Waters 186002353 ) ou équivalente, à condition qu’elle permette un retour à la
ligne de base entre les pics des acides aminés.
7.3 Micropipettes réglables, d’un volume de 10 µl, 20 µl, 200 µl et 1 000 µl et pointes.
7.4 Agitateur de type vortex.
7.5 Balance analytique, d’une précision de 0,1 mg.
7.6 Bloc chauffant, capable de maintenir une température de 55 °C + 2 °C.
7.7 Four de laboratoire, capable de maintenir une température de 110 °C ± 2 °C. ®
7.8 Disque filtrant pour seringue, fluorure de polyvinylidène 0,45 µm (PVDF) Millex -HV
1)
(par exemple Millipore SLHV013NL ou équivalent).
7.9 Seringues, d’un volume de 2 ml.
7.10 Tubes en verre borosilicaté (par exemple Pyrex), d’un volume de 10 ml avec bouchon à vis.
7.11 Microtubes, d’un volume de 1,5 ml et 2 ml.
7.12 Flacon avec bouchon à vis, d’un volume de 4 ml.
1) 1) 1) 1)
3) Agilent 1260 Infinity II , Waters Acquity , Waters Acquity-I , Waters Acquity-H et Thermo Fisher
1)
Scientific 3000 RS ont été utilisés avec succès au cours de l’étude interlaboratoires.
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
1)
7.12.1 Flacon à récupération totale en verre à col vissé, 12 mm x 32 mm (Waters 186000384C
ou équivalent).
8 Analyse d’échantillon
8.1 Préparation des échantillons
Préparer différemment divers types d’échantillons. Les produits nutritionnels pour adultes/enfants
en poudre doivent être reconstitués dans de l’eau au préalable. D’autres échantillons sont utilisés sans
reconstitution.
Reconstituer les échantillons de produits nutritionnels pour adultes/enfants en poudre en ajoutant 25 g
de poudre dans 200 g d’eau. Mélanger soigneusement. Peser 220 mg ± 20 mg de poudres reconstitués
dans un tube en verre de 10 ml avec bouchon à vis. Consigner la masse de l’échantillon à 0,1 mg près.
Pour les échantillons de produits nutritionnels prêts à l’emploi pour nourrissons et adultes/enfants et
de produits laitiers liquides, peser 220 mg ± 20 mg de liquide dans un tube en verre de 10 ml avec
bouchon à vis. Consigner la masse de l’échantillon à 0,1 mg près.
En ce qui concerne les échantillons de produits laitiers en poudre et de céréales, peser 50 mg ± 5 mg
d’échantillons de produits laitiers en poudre ou 100 mg ± 10 mg d’échantillons de céréales dans un tube
en verre de 10 ml avec bouchon à vis. Consigner la masse de l’échantillon à 0,1 mg près.
Dans chaque tube, ajouter de l’eau, du DDP, de l’HCl, de la Nva, et du phénol/de l’HCl selon le Tableau 1.
Ajouter la solution de phénol/HCl sous la hotte. Injecter de l’azote dans le tube pendant environ 5 s
afin d’éliminer l’oxygène. Fermer les tubes avec des bouchons vissés et agiter avec un agitateur de
type vortex. S’assurer que les bouchons sont propres (c’est-à-dire dépourvus de toute particule) pour
garantir l’étanchéité et éviter l’évaporation au cours de l’hydrolyse.
Tableau 1 — Préparation des tubes de prélèvement
Solution Formules infantiles et produits nutrition- Poudres de Céréales
nels pour adultes reconstitués, formules produits laitiers
et échantillons de produits laitiers
liquides prêts à l’emploi
Échantillon, mg 220 50 100
Eau, µl 880 750 1 000
Solution DDP (6.1.3), µl 600 600 600
HCl à 0,2 mol/l (6.1.2), µl 600 600 600
Solution mère de Nva (6.2.1), µl 200 500 200
Solution d’HCl/phénol (6.1.4), µl 2 500 2 500 2 500
8.2 Préparation des solutions d’étalonnage de cystine
Le Tableau 2 décrit la méthode de préparation des solutions d’étalonnage de cystine transformée
à 0 pmol/µl à 10 pmol/l avec la Nva à 10 pmol/µl (toutes sont des concentrations finales après la
dérivatisation).
Ajouter la solution de phénol/HCl sous la hotte. Injecter de l’azote dans le tube pendant environ 5 s
afin d’éliminer l’oxygène. Fermer les tubes avec des bouchons vissés et agiter avec un agitateur de
type vortex. S’assurer que les bouchons sont propres (c’est-à-dire dépourvus de toute particule) pour
garantir l’étanchéité et éviter l’évaporation au cours de l’hydrolyse.
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
Tableau 2 — Concentration finale de cystine après dérivatisation
Solution 10 pmol/µl 5 pmol/µl 2,5 pmol/ 1 pmol/µl 0,5 pmol/ 0 pmol/µl
µl µl
a a a b b
Solution de cystine, µl 200 100 50 200 100 0
Eau, µl 900 1 000 1 050 900 1 000 1 100
Solution DDP (6.1.3), µl 600 600 600 600 600 600
HCl à 0,2 mol/l (6.1.2), µl 600 600 600 600 600 600
Solution mère de Nva (6.2.1), µl 200 200 200 200 200 200
Solution d’HCl/phénol (6.1.4), µl 2 500 2 500 2 500 2 500 2 500 2 500
a
Solution mère de cystine à 10 mmol/l (6.3.1).
b
Solution de cystine à 1 mmol/l (6.3.2).
8.3 Hydrolyse (des échantillons et des étalons de cystine)
Placer les tubes dans un four à 110 °C ± 2 °C pendant 24 h ± 0,5 h.
8.4 Neutralisation et dilution (d’échantillons et d’étalons de cystine)
Sortir les tubes du four. Laisser les hydrolysats refroidir et les particules se déposer avant de prélever
une aliquote. Lors du transfert des aliquotes, prélever à la pipette environ 1 cm en dessous de la surface
du liquide. Effectuer la neutralisation sous la hotte.
Pour les formules infantiles, les échantillons de produits laitiers liquides et de céréales, ainsi que les
étalons de cystine convertis, transférer 0,2 ml de chaque hydrolysat (échantillons et étalons de cystine
convertis) dans un microtube de 1,5 ml, ajouter 0,2 ml de NaOH à 6 mol/l (6.1.1) et ensuite 0,4 ml d’HCl
à 0,1 mol/l (5.14). Bien mélanger et transvaser dans un autre microtube de 1,5 ml en les faisant passer
à travers une membrane filtrante de 0,45 µm.
Pour les échantillons de produits laitiers en poudre, transférer 0,2 ml de la solution d’échantillon
d’hydrolysat dans un microtube de 2 ml, ajouter 0,2 ml de NaOH à 6 mol/l (6.1.1), puis 1,6 ml d’HCl
à 0,1 mol/l (5.14). Bien mélanger et transvaser dans un autre microtube de 2 ml en les faisant passer
à travers une membrane filtrante de 0,45 µm.
8.5 Préparation des solutions d’étalonnage d’acides aminés (non nécessaire pour une
hydrolyse acide)
Le Tableau 3 décrit la méthode de préparation des solutions d’étalonnage de 0,5 ml à 0 pmol/
µl jusqu’à 25 pmol/µl avec la Nva à 10 pmol/µl (toutes sont des concentrations finales après la
dérivatisation).
Les solutions d’acides aminés sont stables pendant une semaine lorsqu’elles sont conservées à
4 °C ± 2 °C.
Tableau 3 — Concentrations en acides aminés (individuelle, finale, après dérivatisation)
Solution 25 pmol/µl 10 pmol/µl 5 pmol/µl 1 pmol/µl 0,5 pmol/µl 0 pmol/µl
a b b c c
Solution d’acides aminés, µl 50 100 50 100 50 0
Eau, µl 50 100 50 100 50 0
Solution de Nva (6.2.2), µl 20 20 20 20 20 20
HCl à 0,1 mol/l (5.14), µl 380 280 380 280 380 480
a
Solution mère d’AA à 2,5 mmol/l (6.4.1).
b
Solution 1 d’AA à 0,5 mmol/l (6.4.2).
c
Solution 2 d’AA à 0,05 mmol/l (6.4.3).
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
8.6 Dérivatisation (d’échantillons, d’étalons de cystine et d’acides aminés)
La dérivatisation transforme les acides aminés libres en dérivés très stables. Les étalons et les
échantillons sont dérivés selon les instructions du fabricant décrites ci-dessous:
— préchauffer un bloc chauffant à 55 °C;
— à l’aide d’une micropipette, ajouter 70 μl de tampon de AccQ Tag™ Ultra Borate (réactif 1, voir 6.1.6)
dans un flacon à récupération totale en verre à col vissé de 12 mm x 32 mm;
— ajouter 10 μl de solution d’étalonnage (8.5), de solution d’échantillon neutralisée (8.4) ou d’étalon
de cystine transformée neutralisée (8.4);
— mélanger brièvement avec un agitateur de type vortex;
— ajouter 20 μl de réactif AccQ Tag™ Ultra reconstitué (6.1.7) dans le flacon d’échantillon;
— mélanger immédiatement la solution en la prélevant plusieurs fois avec une pipette. Fermer le flacon
et mélanger immédiatement avec un agitateur de type vortex pendant plusieurs secondes. Tapoter
le flacon pour s’assurer qu’aucune bulle n’est piégée;
— laisser reposer 1 min à température ambiante;
— chauffer le flacon sur un bloc chauffant pendant 10 min à 55 °C ± 1 °C.
8.7 Séparation CLUHP
Procéder à une séparation CLUHP comme indiqué ci-dessous:
— amorcer les lignes de solvant pendant 5 min;
— amorcer les seringues de lavage/de prélèvement pendant quatre cycles;
— laisser le chromatographe se stabiliser avant d’injecter des étalons et des échantillons. S’assurer
que la pression du système et les conditions initiales sont stables avant d’effectuer des injections
(environ 62 MPa);
— avant de commencer une série d’analyses, injecter deux blancs (eau) pour conditionner la colonne;
— injecter 1 µl de chaque solution d’étalonnage dérivée, puis injecter 1 µl de solution d’échantillon
dérivé. Effectuer des injections uniques. Ajouter une injection de blanc (eau) à la fin de chaque série
d’étalonnage;
— réaliser une CLUHP dans les conditions indiquées ci-après et dans le Tableau 4:
— température de colonne: 50 °C;
— détecteur UV: 260 nm;
— volume d’injection: 1 μl;
— débit: 0,4 ml/min;
— phase mobile A: éluant A (6.5.1);
— phase mobile B: éluant B (6.5.2).
NOTE Il est possible d’utiliser une méthode de détection par fluorescence, à condition que l’équivalence ait
été démontrée.
Ces conditions d’exploitation peuvent varier en fonction de l’appareillage. Suivre les instructions du
1)
fournisseur. Des exemples de solvants de lavage utilisés avec les systèmes UPLC sont indiqués en 6.5.3.
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
Tableau 4 — Gradient d’éluant
Temps % A % B Profil
0,00 99,9 0,1
5,50 99,9 0,1 2
15,22 90,9 9,1 7
20,47 78,8 21,2 6
21,26 40,4 59,6 6
21,29 10 90 6
22,84 10 90 6
26,00 99,9 0,1 6
32,00 99,9 0,1 6
8.8 Identification et intégration des pics
Identifier les pics des acides aminés dans les solutions d’échantillon en comparant les résultats aux
temps de rétention des pics correspondants des solutions d’étalonnage (voir Annexe B pour consulter
des exemples). Si un pic n’a pas été correctement intégré, consulter les données consignées et le
réintégrer.
Pour vérifier la stabilité du système, injecter un étalon de niveau intermédiaire au moins trois fois
(5 fois pour les exigences USP [United States Pharmacopeia, pharmacopée des États-Unis d’Amérique])
et s’assurer que les temps de réponse et de rétention présentent un coefficient de variation C < 2.
v
Vérifier que les pics sont séparés avec une bonne résolution (séparation au niveau de la ligne de base).
Si ce n’est pas le cas, adapter les conditions de chromatographie (gradient, température, longueur de la
tubulure, etc.) en conséquence.
Pour vérifier que le réactif de dérivatisation était présent en quantité suffisante (excès), vérifier que
le pic de dérivatisation est visible dans le chromatogramme. La réponse du réactif excédentaire est
présente dans la chromatographie sous la forme du premier grand pic visible de 6-aminoquinoléine
(AMQ) lors de l’élution. Il convient que la réponse soit égale à celle de l’étalon de 25 pmol/μl ou que la
réaction et l’échantillon soient signalés et éliminés. Le pic de dérivatisation visible à environ 17 min
avant la lysine peut être ignoré.
9 Calcul et expression des résultats
9.1 Droite d’étalonnage
Établir la droite d’étalonnage à partir des six solutions d’étalonnage différentes pour chaque acide
aminé et convertir la cystine au début de chaque série d’analyses en traçant la réponse (rapport de
surface du pic de l’analyte par rapport à l’étalon interne, multiplié par la concentration de l’étalon
interne, voir Formule (1) par rapport à la concentration de l’analyte:
A
s
R=×c (1)
is
A
is
où
R est la réponse;
A est l’aire du pic des acides aminés individuels dans la solution d’étalonnage;
s
A est l’aire du pic de l’étalon interne dans la solution d’étalonnage;
is
c est la concentration de l’étalon interne dans la solution d’étalonnage, en pmol/µl.
is
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
Forcer la régression linéaire en passant par zéro. Vérifier la linéarité de l’étalonnage (le coefficient
de corrélation R doit être supérieur à 0,99).
9.2 Calcul des acides aminés
Calculer la quantité d’acides aminés individuels présente dans l’échantillon en pmol/μl à partir de la
droite d’étalonnage et en utilisant la Formule (2):
Ac×
sis
c = (2)
s
AS×
is
où
c est la concentration de l’acide aminé individuel dans l’échantillon d’essai, en pmol/µl;
s
A est l’aire du pic des acides aminés individuels dans l’échantillon d’essai;
s
c est la concentration de l’étalon interne dans l’échantillon d’essai, en pmol/µl;
is
A est l’aire du pic de l’étalon interne dans l’échantillon d’essai;
is
S est la pente de la droite d’étalonnage (toutes les droites sont forcées par zéro, équation: y = ax).
Calculer la fraction massique, w, de chaque acide aminé, en milligramme par 100 g de produit, en
utilisant la Formule (3):
cM××Vd××d
sA s 12
w= (3)
m ×10
s
où
c est la concentration de l’acide aminé individuel dans l’échantillon d’essai, en pmol/µl;
s
M est la masse molaire des acides aminés individuels en g/mol (voir Tableau 5);
A
V est le volume de la solution d’hydrolyse en ml (généralement V = 5 ml);
s s
d est le facteur de dilution de l’étape de neutralisation (4 ou 10, selon l’échantillon);
d est le facteur de dilution dans l’étape de dérivatisation (10);
m est la masse de la prise d’essai, en mg;
s
-9 3
10 est le facteur combiné pour convertir les pg en mg (10 ), les ml en μl (10 ) et les mg
-5
en 100 g (1/10 ).
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
Tableau 5 — Masse molaire (MA) des acides aminés
Acides aminés M Acides aminés M
A A
g/mol g/mol
Alanine 89,10 Lysine 146,19
Arginine 174,20 Méthionine 149,21
Acide aspartique 133,11 Phénylalanine 165,19
Cystine 240,30 Proline 115,13
Acide glutamique 147,13 Sérine 105,09
Glycine 75,07 Thréonine 119,12
Histidine 155,16 Tyrosine 181,19
Isoleucine 131,18 Valine 117,15
Leucine 131,18
10 Fidélité
10.1 Généralités
Les détails de l’essai interlaboratoires relatif à la fidélité de la méthode sont résumés dans l’Annexe A.
Les valeurs dérivées de cet essai peuvent ne pas être applicables aux plages de concentrations de
l’analyte et/ou aux matrices autres que celles données dans l’Annexe A.
10.2 Répétabilité
La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels obtenus sur un produit d’essai identique
par un opérateur utilisant le même appareillage pendant le laps de temps le plus court possible ne doit
pas dépasser la limite de répétabilité r dans plus de 5 % des cas. Les valeurs de r sont données dans
le Tableau 6.
10.3 Reproductibilité
La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels obtenus sur des substances d’essai
identiques par deux laboratoires ne doit pas dépasser la limite de reproductibilité R dans plus de 5 %
des cas. Les valeurs de R sont données dans le Tableau 6.
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
̄̄̄̄̄̄
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
Tableau 6 — Données de fidélité
Alanine
a b c d e f g h i j k l m n o p
Échantillon S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2 C3
x , mg/100 g 60,0 66,5 59,9 60,9 59,7 49,4 60,9 59,7 86,7 107,8 516,1 2 756,4 816,7 421,5 756,4 271,5
r, mg/100 g 3,94 2,21 2,91 2,41 2,70 1,46 2,57 3,20 3,59 7,52 38,03 108,16 46,37 13,37 53,87 15,64
R, mg/100 g 14,93 8,47 7,60 9,31 6,96 5,79 8,48 7,47 13,56 16,23 77,36 546,48 123,27 52,01 113,78 30,31
Arginine
a b c d e f g h i j k l m n o p
Échantillon S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2 C3
x , mg/100 g 62,8 32,7 102,3 106,4 32,9 36,5 103,5 50,6 89,1 115,0 256,4 3 448,9 850,7 463,3 839,1 254,2
r, mg/100 g 6,44 2,42 5,26 5,99 4,12 3,14 6,12 2,48 6,76 12,12 52,87 171,83 51,03 27,21 104,91 19,54
R, mg/100 g 14,45 4,32 13,80 11,39 5,16 5,82 13,28 5,89 10,06 27,48 52,87 565,90 91,17 91,90 135,54 58,31
Asparagine et acide aspartique
...
ISO/TC 34/SC 5
Date : 2022
| FIL 254:2022(F)
Date: 2022-12
ISO/TC 34/SC 5
Secrétariat: NEN
Lait et produits laitiers — Détermination des acides aminés dans
les formules infantiles, les produits nutritionnels pour
adultes/enfants et autres produits laitiers
Milk and milk products — Determination of amino acids in infant and adult/paediatric
nutritional formulas and dairy products
ICS : 67.100.10
Type du document : Norme internationale
Sous-type du document :
Stade du document : (60) Publication
Langue du document : F
FIL 254:2022(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© © ISO et FIL 2022
Droits de reproductionTous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de
sa mise en oeuvreœuvre, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, ou la diffusion
sur l’internetl'internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut être
demandée à l’ISOl'ISO à l’adressel'adresse ci--après ou au comité membre de l’ISOl'ISO dans le pays du
demandeur.
ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 401 • • Ch. de Blandonnet 8 Silver Building • Bd Auguste Reyers 70/B
CH--1214 Vernier, Genève B--1030 Brussels
Tél. + .: +41 22 749 01 11 Tél. :.: + 32 2 325 67 40
E-mail : E-mail :
Web :
Web : Fax: + 32 2 325 67 41
E-mail: copyright@iso.org E-mail: info@fil-idf.org
Web: www.iso.org Web: www.fil-idf.org
Publié en Suisse
ii © ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
Sommaire Page
Avant-propos . 1
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs . 2
6 Préparation des réactifs et des étalons . 4
6.1 Généralités . 4
6.2 Étalons internes de norvaline (Nva) . 5
6.3 Solutions d’étalonnage de cystine . 5
6.4 Solutions d’étalonnage d’acides aminés (AA) (à l’exception de la cystine) . 5
6.5 Solvants de chromatographie (phases mobiles) . 6
7 Appareillage . 7
8 Analyse d’échantillon . 7
8.1 Préparation des échantillons . 7
8.2 Préparation des solutions d’étalonnage de cystine . 8
8.3 Hydrolyse (des échantillons et des étalons de cystine) . 9
8.4 Neutralisation et dilution (d’échantillons et d’étalons de cystine) . 9
8.5 Préparation des solutions d’étalonnage d’acides aminés (non nécessaire pour une
hydrolyse acide) . 9
8.6 Dérivatisation (d’échantillons, d’étalons de cystine et d’acides aminés) . 10
8.7 Séparation CLUHP . 10
8.8 Identification et intégration des pics . 11
9 Calcul et expression des résultats . 12
9.1 Droite d’étalonnage . 12
9.2 Calcul des acides aminés . 12
10 Fidélité . 14
10.1 Généralités . 14
10.2 Répétabilité . 14
10.3 Reproductibilité . 14
11 Rapport d’essai . 20
Annexe A (informative) Données de fidélité . 21
Annexe B (informative) Exemples de chromatogramme . 56
Bibliographie . 57
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés iii
FIL 254:2022(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en
général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit
de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales
et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la
normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant : www.iso.org/iso/fr/avant--propos.
Le présent document a été élaboré par le Comitécomité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, ainsi que par et la Fédération internationale de laiteriedu lait
(FIL),) en collaboration avec l’AOAC INTERNATIOALINTERNATIONAL et l’ISO/TC 34, Produits
alimentaires, sous-comité SC 4, Céréales et légumineuses. Il est publié conjointement par l’ISO et la FIL et
séparément par l’AOAC INTERNATIONAL.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv © ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente
les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont
organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de
groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des
acteurs de l’industrie de transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des
universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL collaborent étroitement sur toutes les activités de normalisation concernant les méthodes
d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient
conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux
organisations.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Le présent document a été élaboré par le Comité permanent de la FIL en chargechargé des méthodes
d’analyse de la composition, ainsi que parFédération internationale du lait (FIL) et le Comitécomité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, en collaboration
avec l’AOAC INTERNATIONAL et l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 4, Céréales et
légumineuses. Il est publié conjointement par l’ISO et la FIL et séparément par l’AOAC INTERNATIONAL.
L’ensemble des travaux a été confié à l’Équipe d’action FIL/ISO C51, du Comité permanent chargé des
Méthodes d’analyse de la composition, sous la conduite de son chef de projet, M. C. Fuerer (CH).
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés v
NORME INTERNATIONALE ISO 4214:2022(F)
FIL 254:2022(F)
Lait et produits laitiers — Détermination des acides aminés dans
les formules infantiles, les produits nutritionnels
pour adultes/enfants et autres produits laitiers
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de détermination quantitative des acides aminés totaux
en utilisant la dérivatisation du 6-aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl carbamate (ACQ) suivie d’une
séparation de chromatographie en phase liquide à ultra haute performance (CLUHP) et d’une détection
par ultraviolet (UV). Il spécifie une méthode pour la détermination, en une seule analyse, des acides
aminés suivants: alanine, arginine, acide aspartique (combiné à l’asparagine), cystine (dimère de la
cystéine, combiné à la cystéine), acide glutamique (combiné à la glutamine), glycine, histidine, isoleucine,
leucine, lysine, méthionine, phénylalanine, proline, sérine,thréonine, tyrosine et valine.
Cette méthode ne s’applique pas à la détermination du tryptophane.
Cette méthode s’applique aux formules infantiles, aux produits nutritionnels pour adultes/enfants,
aux produits laitiers et à d’autres matrices telles que les céréales. Elle a été validée dans les formules
infantiles (à base de lait et de soja, y compris les produits partiellement hydrolysés et les produits
élémentaires), les préparations pour nourrissons, les poudres nutritionnelles pour adultes, le lait
écrémé UHT, le lactosérum en poudre, le caséinate de sodium, le lait entier en poudre, les aliments pour
animaux au son, les aliments secs pour animaux et les céréales pour petit-déjeuner (voir Annexe A pour
plus de détails).
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes ::
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https://www.iso.org/obp ;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https://www.electropedia.org/.
3.1
formule infantile
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés 1
FIL 254:2022(F)
substitut du lait maternel spécialement fabriqué pour satisfaire, par lui-même, les besoins nutritionnels
des nourrissons pendant les premiers mois de la vie jusqu’à l’introduction d’une alimentation
complémentaire appropriée
[SOURCE: Norme Codex 72-1981]
3.2
produits nutritionnels pour adultes/enfants
aliments complets sur le plan nutritionnel, spécialement formulés, consommés sous forme liquide,
qui peuvent constituer une source d’alimentation unique, fabriqués à partir de toute combinaison de lait,
de soja, de riz, de lactosérum, de protéines hydrolysées, d’amidon et d’acides aminés, avec ou sans
protéines intactes
4 Principe
Les protéines sont hydrolysées dans 6 mol/l d’acide chlorhydrique (HCl) pendant 24 h à 110 °C en
présence de phénol, d’acide 3-3'-dithiodipropionique (DDP) et de norvaline. Le phénol est ajouté pour
prévenir l’halogénation de la tyrosine. La norvaline est ajoutée comme étalon interne. Le DDP est ajouté
pour transformer la cystine et la cystéine en S-2-carboxyéthylthiocystéine (XCys), comme décrit dans la
Référence [1], et le dérivé résultant peut être séparé des autres acides aminés pour la quantification.
Après la neutralisation, les acides aminés et la cystéine transformée (XCys) sont dérivés en utilisant l’AQC.
Les acides aminés dérivés sont séparés en utilisant une méthode CLUHP en phase inverse avec détection
par UV à une longueur d’onde de 260 nm.
NOTE Il est possible d’utiliser une méthode de détection par fluorescence, à condition que l’équivalence ait été
démontrée.
Lors de l’hydrolyse acide, la glutamine (Gln) et l’asparagine (ASN) sont transformées respectivement
en acide glutamique (Glu) et en acide aspartique (Asp). Ainsi, les valeurs Glu représentent les valeurs
combinées de Glu et de Gln, et les valeurs Asp représentent les valeurs combinées de Asp et Asn.
Les valeurs Cys2 représentent les valeurs combinées de cystéine et de cystine puisque les deux sont
converties en XCys par le DDP.
5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
Les références commerciales ne constituent qu’une ligne directrice. Il est possible d’utiliser des
matériaux ou produits chimiques équivalents, à condition que l’équivalence ait été démontrée. Avant
d’utiliser des produits chimiques, se référer aux fiches techniques de sécurité et s’assurer que les
précautions de sécurité sont appliquées.
5.1 Kit de dérivatisation AccQ Tag™ Ultra (Waters 186003836 ).
Il s’agit d’un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que la FIL ou l’ISO approuve l’emploi
du produit ainsi désigné. Il a été démontré que les réactifs alternatifs énumérés dans le présent document
conduisaient aux mêmes résultats.
2 © ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
En variante de tampon de dérivation, il est possible d’utiliser du tétraborate de disodium décahydraté
(numéro de registre CAS© 1303-96-4).
Le 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (CAS 148757-94-2) peut être utilisé comme
réactif de marquage alternatif.
5.2 Concentré d’éluant A AccQ Tag™ Ultra (Waters 1860038381)).
Il est possible d’utiliser comme réactifs alternatifs l’acétonitrile, le grade de gradient pour la
chromatographie liquide (CL) (CAS 75-05-8), et l’acide formique (CAS 64-18-6).
1)
5.3 Éluant B Ultra AccQ·Tag™ (Waters 186003839 ).
Il est possible d’utiliser comme réactifs alternatifs l’acétonitrile, le grade de gradient pour la
chromatographie liquide (CL) (CAS 75-05-8), l’acide formique (CAS 64-18-6) et le formiate d’ammonium
(CAS 540-69-2).
5.4 Phénol (CAS 108-95-2).
5.5 3,3′-acide dithiodipropionique (CAS 1119-62-6).
5.6 Solution étalon d’acides aminés, contenant les 17 acides aminés suivants à 2,5 µmol/ml chacun
(sauf la LL-cystine à 1,25 µmol/ml) dans 0,1 mol/l d’HCl : L: L-alanine, LL-arginine, acide LL-aspartique,
LL-cystine, acide LL-glutamique, LL-glycine, LL-histidine, LL-isoleucine, LL-leucine, LL-lysine, LL-
méthionine, LL-phénylalanine, LL-proline, LL-sérine, LL-thréonine, LL-tyrosine et LL-valine.
5.7 LL-cystine (CAS 56-89-3).
5.8 Norvaline (CAS 6600-40-4).
5.9 Pastilles d’hydroxyde de sodium, qualité réactif (CAS 1310-73-2).
5.10 Solution d’hydroxyde de sodium (CAS 1310-73-2), concentration de la substance c = 1 mol/l.
5.11 Solution d’hydroxyde de sodium (facultative) (CAS 1310-73-2), c = 6 mol/l.
5.12 Acide chlorhydrique fumant 37 % (CAS 7647-01-0), c = 12 mol/l, qualité GR pour analyse.
5.13 Solution d’acide chlorhydrique (CAS 7647-01-0), c = 1 mol/l.
5.14 Solution d’acide chlorhydrique (CAS 7647-01-0), c = 0,1 mol/l.
5.15 Eau de laboratoire, avec une résistivité de 18,2 MΩ-cm (eau ultra-pure).
Le numéro de registre CAS® est une marque de la société CAS. Cette information est donnée à l’intention
des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve l’emploi du produit ainsi
désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils aboutissent aux mêmes résultats.
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés 3
FIL 254:2022(F)
6 Préparation des réactifs et des étalons
6.1 Généralités
6.1.1 Solutions d’hydroxyde de sodium (NaOH), c = 6 mol/l, c = 0,2 mol/l et c = 0,05 mol/l.
Pour la solution c = 6 mol/l, peser 24 g d’hydroxyde de sodium (5.9) dans une fiole jaugée de 100 ml.
Dissoudre dans environ 80 ml d’eau. Laisser refroidir et diluer à la marque avec de l’eau. Facultatif:
utiliser un équivalent disponible dans le commerce (5.11).
Pour la solution c = 0,2 mol/l, prélever à la pipette 20 ml de NaOH 1 mol/l (5.10) dans une fiole jaugée
de 100 ml et compléter avec de l’eau jusqu’au trait.
Pour la solution c = 0,05 mol/l, prélever à la pipette 5 ml de NaOH 1 mol/l (5.10) dans une fiole jaugée
de 100 ml et compléter avec de l’eau jusqu’au trait.
6.1.2 Solution d’acide chlorhydrique (HCl), c = 0,2 mol/l.
Prélever 20 ml d’HCl 1 mol/l (5.13) à la pipette dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter avec de l’eau
jusqu’au trait.
6.1.3 Solution de DDP, concentration massique ρ = 10 g/l (dans le NaOH, c = 0,2 mol/l).
Peser 500 mg de DDP dans une fiole jaugée de 50 ml et compléter jusqu’au trait avec du NaOH 0,2 mol/l
(6.1.1).
6.1.4 Solution d’HCl/phénol, ρ = 1 g/l (dans l’HCl, c = 12 mol/l).
Peser 100 mg de phénol dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter jusqu’au trait avec de l’HCl 12 mol/l
(5.12).
1)
6.1.5 Kit de dérivatisation AccQ·Tag™ Ultra.
Préparer les réactifs inclus dans le kit conformément aux instructions du fabricant.
1)
6.1.6 Tampon AccQ Tag™ Ultra Borate (réactif 1).
Solution prête à l’emploi. Le tétraborate de sodium dans une solution aqueuse (ρ = 50 g/l) peut être
utilisé comme réactif alternatif. Dans une fiole jaugée de 100 ml, ajouter 5 g de tétraborate de sodium
décahydraté, le faire dissoudre et compléter jusqu’au repère avec de l’eau.
1)
6.1.7 Réactif AccQ·Tag™ Ultra (flacons 2A et 2B).
Reconstituer le réactif AccQ·Tag™ Ultra (flacon 2A) conformément aux instructions du fabricant
indiquées ci-dessous:
a) préchauffer un bloc chauffant à 55 °C;
b) tapoter légèrement le flacon 2A avant de l’ouvrir pour s’assurer que toute la poudre de réactif
AccQ Tag™ Ultra se trouve au fond du flacon;
c) rincer une micropipette propre en prélevant et rejetant 1 ml de diluant de réactif AccQ·Tag™ Ultra
provenant du flacon 2B (solution prête à l’emploi). Répéter deux fois;
4 © ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
d) prélever 1,0 ml du flacon 2B et le transférer dans le flacon 2A contenant la poudre de réactif
AccQ Tag™ Ultra. Fermer hermétiquement le flacon;
e) mélanger avec un agitateur de type vortex pendant environ 10 s;
f) chauffer le flacon 2A sur le bloc chauffant préchauffé jusqu’à la dissolution de la poudre de réactif
AccQ·Tag™ Ultra. Ne pas chauffer le réactif pendant plus de 10 minutes.
Une fois reconstitué, la concentration du réactif AccQ·Tag™ Ultra est d’environ 10 mmol/l. Conserver
le réactif AccQ·Tag™ Ultra reconstitué dans un dessiccateur à température ambiante pendant une
semaine maximum.
ATTENTION — Le réactif AccQ·Tag™ Ultra réagit avec une atmosphère humide. Fermer hermétiquement
le récipient lorsqu’il n’est pas utilisé. Ne pas réfrigérer. Ne pas utiliser de réactif décoloré, surtout s’il est
jaune ou vert.
Les réactifs alternatifs suivants peuvent être utilisés. Dans un flacon de 4 ml, peser environ 3,0 mg
à 4,0 mg de 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate. Passer à l’étape c) en utilisant de
l’acétonitrile de qualité CL au lieu du diluant de réactif AccQ·Tag™ Ultra.
6.2 Étalons internes de norvaline (Nva)
6.2.1 Solution mère de Nva, c = 10 mmol/l.
Peser 117,16 mg de Nva dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter jusqu’au trait avec de l’HCl
à 0,1 mol/l (5.14).
6.2.2 Solution de Nva, c = 2,5 mmol/l.
Prélever à la pipette 2,5 ml de solution mère de Nva (6.2.1) dans une fiole jaugée de 10 ml et compléter
jusqu’au trait avec de l’HCl à 0,1 mol/l (5.14).
Conserver les deux solutions de Nva à -20 °C pendant six mois maximum sous la forme d’aliquotes
de 2 ml.
6.3 Solutions d’étalonnage de cystine
6.3.1 Solution mère de cystine, c = 10 mmol/l.
Peser 240 mg de cystine dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter jusqu’au trait avec du NaOH
à 0,05 mol/l (6.1.1). Conserver cette solution à -20 °C pendant trois mois maximum sous la forme
d’aliquotes de 1 ml.
6.3.2 Solution de cystine, c = 1 mmol/l.
Ajouter 900 µl de solution de NaOH de concentration 0,05 mol/l (6.1.1) à 100 µl de solution mère
de cystine (6.3.1). Préparer cette solution fraîchement avant chaque analyse.
6.4 Solutions d’étalonnage d’acides aminés (AA) (à l’exception de la cystine)
6.4.1 Solution mère d’AA, c = 2,5 mmol/l.
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés 5
FIL 254:2022(F)
La solution étalon d’acides aminés est prête à l’emploi et contient 2,5 mmol/l de chaque acide aminé
(bien que présente dans cette solution, la cystine n’est pas utilisée pour la quantification et est préparée
séparément, voir 6.3).
Conserver cette solution mère de solution d’étalonnage à -20 °C pendant six mois maximum sous la forme
d’aliquotes de 250 µl.
6.4.2 Solution 1 d’AA, c = 0,5 mmol/l.
Ajouter 600 µl de solution d’HCl de concentration 0,1 mol/l (5.14) à 150 µl de solution mère d’AA (6.4.1).
Préparer cette solution fraîchement avant chaque analyse.
6.4.3 Solution 2 d’AA, c = 0,05 mmol/l.
Ajouter 900 µl de solution d’HCl de concentration 0,1 mol/l (5.14) à 100 µl de solution 1 d’AA (6.4.2).
Préparer cette solution fraîchement avant chaque analyse.
6.5 Solvants de chromatographie (phases mobiles)
6.5.1 Éluant A (solvant A).
Préparer l’éluant A du concentré de l’éluant A AccQ·Tag™ Ultra comme indiqué ci-dessous:
a) mesurer 850 ml d’eau dans un cylindre gradué de 1 l;
b) dans un cylindre gradué séparé, mesurer 150 ml de concentré d’éluant A AccQ·Tag™ Ultra;
c) ajouter le concentré à l’eau et mélanger soigneusement.
Le concentré d’éluant A, une fois ouvert, doit être conservé hermétiquement fermé à environ 4 °C.
L’éluant A dilué est stable pendant une semaine à température ambiante.
Il est possible d’utiliser la solution suivante comme alternative au concentré d’éluant A. Mélanger 840 ml
de solution de formate d’ammonium à une concentration de 200 mmol/l (12,61 g de formiate
d’ammonium dans 1 l d’eau), 110 ml d’acétonitrile et 50 ml d’acide formique. Préparer l’éluant A à partir
du concentré tel que décrit ci-dessus.
6.5.2 Éluant B (solvant B).
L’éluant B AccQ·Tag™ est fourni comme solution de travail. Aucune préparation supplémentaire n’est
requise. L’éluant B, une fois ouvert, doit être conservé hermétiquement fermé à environ 4 °C pendant
un mois au maximum.
Il est possible d’utiliser la solution suivante comme alternative à l’éluant B. Ajouter 13,2 ml d’acide
formique dans 1 l d’acétonitrile.
6.5.3 Solvants de lavage.
a) Le solvant faible de lavage des aiguilles consiste en 50 ml/l d’acétonitrile dans de l’eau.
b) Le solvant fort de lavage des aiguilles consiste en 950 ml/l d’acétonitrile dans de l’eau.
c) Le solvant de lavage des joints consiste en 500 ml/l d’acétonitrile dans de l’eau.
6 © ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
7 Appareillage
7.1 Système CLUHP qui maintient une pression d’environ 62 MPa et peut réaliser une séparation
de base des acides aminés .
7.2 Colonne de chromatographie, colonne ACQUITY UPLC™ BEH C18, 130 Å, 1,7 μm,
1)
2,1 mm x 150 mm (Waters 186002353 ) ou équivalente, à condition qu’elle permette un retour à la ligne
de base entre les pics des acides aminés.
7.3 Micropipettes réglables, d’un volume de 10 µl, 20 µl, 200 µl et 1 000 µl et pointes.
7.4 Agitateur de type vortex.
7.5 Balance analytique, d’une précision de 0,1 mg.
7.6 Bloc chauffant, capable de maintenir une température de 55 °C + 2 °C.
7.7 Four de laboratoire, capable de maintenir une température de 110 °C ± 2 °C. ®
7.8 Disque filtrant pour seringue, fluorure de polyvinylidène 0,45 µm (PVDF) Millex -HV
1)
(par exemple Millipore SLHV013NL ou équivalent).
7.9 Seringues, d’un volume de 2 ml.
7.10 Tubes en verre borosilicaté (par exemple Pyrex), d’un volume de 10 ml avec bouchon à vis.
7.11 Microtubes, d’un volume de 1,5 ml et 2 ml.
7.12 Flacon avec bouchon à vis, d’un volume de 4 ml.
1)
7.12.1 Flacon à récupération totale en verre à col vissé, 12 mm x 32 mm (Waters 186000384C
ou équivalent).
8 Analyse d’échantillon
8.1 Préparation des échantillons
Préparer différemment divers types d’échantillons. Les produits nutritionnels pour adultes/enfants
en poudre doivent être reconstitués dans de l’eau au préalable. D’autres échantillons sont utilisés sans
reconstitution.
Reconstituer les échantillons de produits nutritionnels pour adultes/enfants en poudre en ajoutant 25 g
de poudre dans 200 g d’eau. Mélanger soigneusement. Peser 220 mg ± 20 mg de poudres reconstitués
dans un tube en verre de 10 ml avec bouchon à vis. Consigner la masse de l’échantillon à 0,1 mg près.
Pour les échantillons de produits nutritionnels prêts à l’emploi pour nourrissons et adultes/enfants et
de produits laitiers liquides, peser 220 mg ± 20 mg de liquide dans un tube en verre de 10 ml avec
bouchon à vis. Consigner la masse de l’échantillon à 0,1 mg près.
1) 1) 1) 1)
Agilent 1260 Infinity II , Waters Acquity , Waters Acquity-I , Waters Acquity-H et Thermo Fisher
1)
Scientific 3000 RS ont été utilisés avec succès au cours de l’étude interlaboratoires.
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés 7
FIL 254:2022(F)
En ce qui concerne les échantillons de produits laitiers en poudre et de céréales, peser 50 mg ± 5 mg
d’échantillons de produits laitiers en poudre ou 100 mg ± 10 mg d’échantillons de céréales dans un tube
en verre de 10 ml avec bouchon à vis. Consigner la masse de l’échantillon à 0,1 mg près.
Dans chaque tube, ajouter de l’eau, du DDP, de l’HCl, de la Nva, et du phénol/de l’HCl selon le Tableau 1.
Ajouter la solution de phénol/HCl sous la hotte. Injecter de l’azote dans le tube pendant environ 5 s afin
d’éliminer l’oxygène. Fermer les tubes avec des bouchons vissés et agiter avec un agitateur de type vortex.
S’assurer que les bouchons sont propres (c’est-à-dire dépourvus de toute particule) pour garantir
l’étanchéité et éviter l’évaporation au cours de l’hydrolyse.
Tableau 1 — Préparation des tubes de prélèvement
Solution Formules infantiles et produits Poudres de Céréales
nutritionnels pour adultes reconstitués, produits laitiers
formules et échantillons de produits
laitiers liquides prêts à l’emploi
Échantillon, mg 220 50 100
Eau, µl 880 750 1 000
Solution DDP (6.1.3), µl 600 600 600
HCl à 0,2 mol/l (6.1.2), µl 600 600 600
Solution mère de Nva (6.2.1), µl 200 500 200
Solution d’HCl/phénol (6.1.4), µl 2 500 2 500 2 500
8.2 Préparation des solutions d’étalonnage de cystine
Le Tableau 2 décrit la méthode de préparation des solutions d’étalonnage de cystine transformée
à 0 pmol/µl à 10 pmol/l avec la Nva à 10 pmol/µl (toutes sont des concentrations finales après la
dérivatisation).
Ajouter la solution de phénol/HCl sous la hotte. Injecter de l’azote dans le tube pendant environ 5 s afin
d’éliminer l’oxygène. Fermer les tubes avec des bouchons vissés et agiter avec un agitateur de type vortex.
S’assurer que les bouchons sont propres (c’est-à-dire dépourvus de toute particule) pour garantir
l’étanchéité et éviter l’évaporation au cours de l’hydrolyse.
Tableau 2 — Concentration finale de cystine après dérivatisation
Solution 10 pmol/µl 5 pmol/µl 2,5 pmol/µl 1 pmol/µl 0,5 pmol/µl 0 pmol/µl
a a a b b
Solution de cystine, µl 0
200 100 50 200 100
Eau, µl 900 1 000 1 050 900 1 000 1 100
Solution DDP (6.1.3), µl 600 600 600 600 600 600
HCl à 0,2 mol/l (6.1.2), µl 600 600 600 600 600 600
Solution mère de Nva (6.2.1), µl 200 200 200 200 200 200
Solution d’HCl/phénol (6.1.4), µl 2 500 2 500 2 500 2 500 2 500 2 500
a
Solution mère de cystine à 10 mmol/l (6.3.1).
8 © ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
Solution 10 pmol/µl 5 pmol/µl 2,5 pmol/µl 1 pmol/µl 0,5 pmol/µl 0 pmol/µl
b
Solution de cystine à 1 mmol/l (6.3.2).
8.3 Hydrolyse (des échantillons et des étalons de cystine)
Placer les tubes dans un four à 110 °C ± 2 °C pendant 24 h ± 0,5 h.
8.4 Neutralisation et dilution (d’échantillons et d’étalons de cystine)
Sortir les tubes du four. Laisser les hydrolysats refroidir et les particules se déposer avant de prélever
une aliquote. Lors du transfert des aliquotes, prélever à la pipette environ 1 cm en dessous de la surface
du liquide. Effectuer la neutralisation sous la hotte.
Pour les formules infantiles, les échantillons de produits laitiers liquides et de céréales, ainsi que les
étalons de cystine convertis, transférer 0,2 ml de chaque hydrolysat (échantillons et étalons de cystine
convertis) dans un microtube de 1,5 ml, ajouter 0,2 ml de NaOH à 6 mol/l (6.1.1) et ensuite 0,4 ml d’HCl
à 0,1 mol/l (5.14). Bien mélanger et transvaser dans un autre microtube de 1,5 ml en les faisant passer
à travers une membrane filtrante de 0,45 µm.
Pour les échantillons de produits laitiers en poudre, transférer 0,2 ml de la solution d’échantillon
d’hydrolysat dans un microtube de 2 ml, ajouter 0,2 ml de NaOH à 6 mol/l (6.1.1), puis 1,6 ml d’HCl
à 0,1 mol/l (5.14). Bien mélanger et transvaser dans un autre microtube de 2 ml en les faisant passer
à travers une membrane filtrante de 0,45 µm.
8.5 Préparation des solutions d’étalonnage d’acides aminés (non nécessaire pour une
hydrolyse acide)
Le Tableau 3 décrit la méthode de préparation des solutions d’étalonnage de 0,5 ml à 0 pmol/µl
jusqu’à 25 pmol/µl avec la Nva à 10 pmol/µl (toutes sont des concentrations finales après la
dérivatisation).
Les solutions d’acides aminés sont stables pendant une semaine lorsqu’elles sont conservées à 4 °C ± 2 °C.
Tableau 3 — Concentrations en acides aminés (individuelle, finale, après dérivatisation)
Solution 25 pmol/µl 10 pmol/µl 5 pmol/µl 1 pmol/µl 0,5 pmol/µl 0 pmol/µl
a b b c c
Solution d’acides aminés, µl 0
50 100 50 100 50
Eau, µl 50 100 50 100 50 0
Solution de Nva (6.2.2), µl 20 20 20 20 20 20
HCl à 0,1 mol/l (5.14), µl 380 280 380 280 380 480
a
Solution mère d’AA à 2,5 mmol/l (6.4.1).
b
Solution 1 d’AA à 0,5 mmol/l (6.4.2).
c
Solution 2 d’AA à 0,05 mmol/l (6.4.3).
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés 9
FIL 254:2022(F)
8.6 Dérivatisation (d’échantillons, d’étalons de cystine et d’acides aminés)
La dérivatisation transforme les acides aminés libres en dérivés très stables. Les étalons et les
échantillons sont dérivés selon les instructions du fabricant décrites ci-dessous:
— préchauffer un bloc chauffant à 55 °C;
— à l’aide d’une micropipette, ajouter 70 μl de tampon de AccQ Tag™ Ultra Borate (réactif 1, voir 6.1.6)
dans un flacon à récupération totale en verre à col vissé de 12 mm x 32 mm;
— ajouter 10 μl de solution d’étalonnage (8.5), de solution d’échantillon neutralisée (8.4) ou d’étalon de
cystine transformée neutralisée (8.4);
— mélanger brièvement avec un agitateur de type vortex;
— ajouter 20 μl de réactif AccQ Tag™ Ultra reconstitué (6.1.7) dans le flacon d’échantillon;
— mélanger immédiatement la solution en la prélevant plusieurs fois avec une pipette. Fermer le flacon
et mélanger immédiatement avec un agitateur de type vortex pendant plusieurs secondes. Tapoter
le flacon pour s’assurer qu’aucune bulle n’est piégée;
— laisser reposer 1 min à température ambiante;
— chauffer le flacon sur un bloc chauffant pendant 10 min à 55 °C ± 1 °C.
8.7 Séparation CLUHP
Procéder à une séparation CLUHP comme indiqué ci-dessous:
— amorcer les lignes de solvant pendant 5 min;
— amorcer les seringues de lavage/de prélèvement pendant quatre cycles;
— laisser le chromatographe se stabiliser avant d’injecter des étalons et des échantillons. S’assurer que
la pression du système et les conditions initiales sont stables avant d’effectuer des injections
(environ 62 MPa);
— avant de commencer une série d’analyses, injecter deux blancs (eau) pour conditionner la colonne;
— injecter 1 µl de chaque solution d’étalonnage dérivée, puis injecter 1 µl de solution d’échantillon
dérivé. Effectuer des injections uniques. Ajouter une injection de blanc (eau) à la fin de chaque série
d’étalonnage;
— réaliser une CLUHP dans les conditions indiquées ci-après et dans le Tableau 4:
— température de colonne: 50 °C;
— détecteur UV: 260 nm;
— volume d’injection: 1 μl;
— débit: 0,4 ml/min;
10 © ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
— phase mobile A: éluant A (6.5.1);
— phase mobile B: éluant B (6.5.2).
NOTE Il est possible d’utiliser une méthode de détection par fluorescence, à condition que l’équivalence ait été
démontrée.
Ces conditions d’exploitation peuvent varier en fonction de l’appareillage. Suivre les instructions du
1)
fournisseur. Des exemples de solvants de lavage utilisés avec les systèmes UPLC sont indiqués en 6.5.3.
Tableau 4 — Gradient d’éluant
Temps % A % B Profil
0,00 99,9 0,1
5,50 99,9 0,1 2
15,22 90,9 9,1 7
20,47 78,8 21,2 6
21,26 40,4 59,6 6
21,29 10 90 6
22,84 10 90 6
26,00 99,9 0,1 6
32,00 99,9 0,1 6
8.8 Identification et intégration des pics
Identifier les pics des acides aminés dans les solutions d’échantillon en comparant les résultats aux temps
de rétention des pics correspondants des solutions d’étalonnage (voir Annexe B pour consulter des
exemples). Si un pic n’a pas été correctement intégré, consulter les données consignées et le réintégrer.
Pour vérifier la stabilité du système, injecter un étalon de niveau intermédiaire au moins trois fois
(5 fois pour les exigences USP [United States Pharmacopeia, pharmacopée des États-Unis d’Amérique])
et s’assurer que les temps de réponse et de rétention présentent un coefficient de variation C < 2.
v
Vérifier que les pics sont séparés avec une bonne résolution (séparation au niveau de la ligne de base).
Si ce n’est pas le cas, adapter les conditions de chromatographie (gradient, température, longueur de la
tubulure, etc.) en conséquence.
Pour vérifier que le réactif de dérivatisation était présent en quantité suffisante (excès), vérifier que le pic
de dérivatisation est visible dans le chromatogramme. La réponse du réactif excédentaire est présente
dans la chromatographie sous la forme du premier grand pic visible de 6-aminoquinoléine (AMQ) lors de
l’élution. Il convient que la réponse soit égale à celle de l’étalon de 25 pmol/μl ou que la réaction et
l’échantillon soient signalés et éliminés. Le pic de dérivatisation visible à environ 17 min avant la lysine
peut être ignoré.
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés 11
FIL 254:2022(F)
9 Calcul et expression des résultats
9.1 Droite d’étalonnage
Établir la droite d’étalonnage à partir des six solutions d’étalonnage différentes pour chaque acide aminé
et convertir la cystine au début de chaque série d’analyses en traçant la réponse (rapport de surface
du pic de l’analyte par rapport à l’étalon interne, multiplié par la concentration de l’étalon interne,
voir Formule (1) par rapport à la concentration de l’analyte:
A
s
Rc× (1)
is
A
is
où
R est la réponse;
A est l’aire du pic des acides aminés individuels dans la solution d’étalonnage;
s
A est l’aire du pic de l’étalon interne dans la solution d’étalonnage;
is
c est la concentration de l’étalon interne dans la solution d’étalonnage, en pmol/µl.
is
Forcer la régression linéaire en passant par zéro. Vérifier la linéarité de l’étalonnage (le coefficient
de corrélation R doit être supérieur à 0,99).
9.2 Calcul des acides aminés
Calculer la quantité d’acides aminés individuels présente dans l’échantillon en pmol/μl à partir de la
droite d’étalonnage et en utilisant la Formule (2):
Ac×
s is
c =
s
AS×
is
(2)
où
c est la concentration de l’acide aminé individuel dans l’échantillon d’essai, en pmol/µl;
s
A est l’aire du pic des acides aminés individuels dans l’échantillon d’essai;
s
c est la concentration de l’étalon interne dans l’échantillon d’essai, en pmol/µl;
is
A est l’aire du pic de l’étalon interne dans l’échantillon d’essai;
is
S est la pente de la droite d’étalonnage (toutes les droites sont forcées par zéro, équation: y = ax).
Calculer la fraction massique, w, de chaque acide aminé, en milligramme par 100 g de produit, en utilisant
la Formule (3):
c × M ××Vd ×d
s A s 12
(3)
w=
m ×10
s
où
12 © ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
=
FIL 254:2022(F)
c est la concentration de l’acide aminé individuel dans l’échantillon d’essai, en pmol/µl;
s
M est la masse molaire des acides aminés individuels en g/mol (voir Tableau 5);
A
V est le volume de la solution d’hydrolyse en ml (généralement V = 5 ml);
s s
d est le facteur de dilution de l’étape de neutralisation (4 ou 10, selon l’échantillon);
d est le facteur de dilution dans l’étape de dérivatisation (10);
m est la masse de la prise d’essai, en mg;
s
-9 3
10 est le facteur combiné pour convertir les pg en mg (10 ), les ml en μl (10 ) et les mg
-5
en 100 g (1/10 ).
© ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés 13
FIL 254:2022(F)
Tableau 5 — Masse molaire (MA) des acides aminés
Acides aminés MA Acides aminés MA
g/mol g/mol
Alanine 89,10 Lysine 146,19
Arginine 174,20 Méthionine 149,21
Acide aspartique 133,11 Phénylalanine 165,19
Cystine 240,30 Proline 115,13
Acide glutamique 147,13 Sérine 105,09
Glycine 75,07 Thréonine 119,12
Histidine 155,16 Tyrosine 181,19
Isoleucine 131,18 Valine 117,15
Leucine 131,18
10 Fidélité
10.1 Généralités
Les détails de l’essai interlaboratoires relatif à la fidélité de la méthode sont résumés dans l’Annexe A.
Les valeurs dérivées de cet essai peuvent ne pas être applicables aux plages de concentrations de l’analyte
et/ou aux matrices autres que celles données dans l’Annexe A.
10.2 Répétabilité
La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels obtenus sur un produit d’essai identique
par un opérateur utilisant le même appareillage pendant le laps de temps le plus court possible ne doit
pas dépasser la limite de répétabilité r dans plus de 5 % des cas. Les valeurs de r sont données dans
le Tableau 6.
10.3 Reproductibilité
La différence absolue entre deux résultats d’essai individuels obtenus sur des substances d’essai
identiques par deux laboratoires ne doit pas dépasser la limite de reproductibilité R dans plus de 5 % des
cas. Les valeurs de R sont données dans le Tableau 6.
14 © ISO et FIL 2022 – Tous droits réservés
FIL 254:2022(F)
Tableau 6 — Données de fidélité
Alanine
a b c d e f g h i j k l m n o p
Échantillon
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2 C3
x̄, mg/100 g 60,0 66,5 59,9 60,9 59,7 49,4 60,9 59,7 86,7 107,8 516,1 2 756,4 816,7 421,5 756,4 271,5
r, mg/100 g 3,94 2,21 2,91 2,41 2,70 1,46 2,57 3,20 3,59 7,52 38,03 108,16 46,37 13,37 53,87 15,64
R, mg/100 g 14,93 8,47 7,60 9,31 6,96 5,79 8,48 7,47 13,56 16,23 77,36 546,48 123,27 52,01 113,78 30,31
Arginine
a b c d e f g h i j k l m n o p
Échantillon
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 D1 D2 D3 D4 C1 C2 C3
x̄, mg/100 g 62,8 32,7 102,3 106,4 32,9 36,5 103,5 50,6 89
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
Loading comments...