ISO 22964:2017

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 22964
First edition
2017-04
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the detection
of Cronobacter spp.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
la recherche de Cronobacter spp.
Reference number
©
ISO 2017
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Abbreviated terms . 2
5 Principle . 2
5.1 Non-selective pre-enrichment in BPW . 2
5.2 Enrichment in a selective medium (CSB) . 2
5.3 Plating out and identification on chromogenic agar (CCI agar) . 2
5.4 Confirmation . 2
6 Culture media and reagents . 2
7 Equipment and consumables . 2
8 Sampling . 3
9 Preparation of test sample . 3
10 Procedure (as shown in Annex A) . 3
10.1 Test portion . 3
10.2 Pre-enrichment . 4
10.3 Enrichment . 4
10.4 Isolation of presumptive Cronobacter spp. 4
10.5 Confirmation . 4
10.5.1 General. 4
10.5.2 Purification of colonies . . 5
10.5.3 Biochemical confirmation . 5
10.6 Interpretation of biochemical results. 6
11 Expression of results . 6
12 Performance characteristics of the method . 7
12.1 Interlaboratory study . 7
12.2 Sensitivity . 7
12.3 Specificity . 7
12.4 LOD .
50 7
13 Test report . 7
Annex A (normative) Diagram of the test procedure . 8
Annex B (normative) Composition, preparation and performance testing of culture media
and reagents . 9
Annex C (informative) Distinction of Cronobacter spp. from other genera .17
Annex D (informative) Method validation studies and performance characteristics .19
Bibliography .22
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/275, Food Analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical
Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the
agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This first edition cancels and replaces ISO/TS 22964:2006, which has been technically revised with the
following changes:
— the scope has been extended to Cronobacter spp. detection in food products for humans and feeding
animals and environmental samples and the title changed accordingly;
— the enrichment broth, modified lauryl sulfate tryptose broth (mLST), has been replaced by
Cronobacter selective broth (CSB);
— the isolation agar, Enterobacter sakazakii isolation agar (ESIA) has been replaced by chromogenic
Cronobacter isolation (CCI) agar;
— several confirmation tests have been replaced by other tests according to Table 1 of this document.
iv © ISO 2017 – All rights reserved

Introduction
This document describes a horizontal method for the detection of Cronobacter spp. in food, in animal
feed and in environmental samples. The main changes, listed in the foreword, introduced in this
[2]
document compared to ISO/TS 22964:2006 are considered as major (see ISO 17468 ).
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate
in every detail for certain products. In this case, different methods, which are specific to these products,
may be used if absolutely necessary for justified technical reasons. Nevertheless, every attempt should
be made to apply this horizontal method as far as possible.
When this document is next reviewed, account will be taken of all information then available regarding
the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from this
method in the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain groups of products,
International Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this
horizontal method. It is hoped that when such standards are reviewed they will be changed to comply
with this document so that eventually the only remaining departures from this horizontal method will
be those necessary for well-established technical reasons.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 22964:2017(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the detection of Cronobacter spp.
1 Scope
This document specifies a horizontal method for the detection of Cronobacter spp.
Subject to the limitations discussed in the introduction, this document is applicable to
— food products and ingredients intended for human consumption and the feeding of animals, and
— environmental samples in the area of food production and food handling.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www.e lectropedia. org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www. iso. org/o bp
3.1
Cronobacter spp.
[10]
microorganisms which form typical colonies on chromogenic Cronobacter isolation (CCI) agar and
which display the biochemical characteristics described, when tests are carried out in accordance with
this document
3.2
detection o
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 22964
Première édition
2017-04
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche de Cronobacter spp.
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
detection of Cronobacter spp.
Numéro de référence
©
ISO 2017
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ii © ISO 2017 – Tous droits réservés

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Termes abrégés . 2
5 Principe . 2
5.1 Pré-enrichissement non sélectif dans de l’eau peptonée tamponnée (EPT) . 2
5.2 Enrichissement dans un milieu sélectif (CSB) . 2
5.3 Ensemencement et identification sur une gélose chromogène (gélose CCI) . 2
5.4 Confirmation . 2
6 Milieux de culture et réactifs . 2
7 Matériel et consommables . 2
8 Échantillonnage . 3
9 Préparation de l’échantillon pour essai . 3
10 Mode opératoire (comme représenté à l’Annexe A) . 3
10.1 Prise d’essai . 3
10.2 Pré-enrichissement . 4
10.3 Enrichissement . 4
10.4 Isolement de colonies présumées de Cronobacter spp. . 4
10.5 Confirmation . 4
10.5.1 Généralités . 4
10.5.2 Purification des colonies . 5
10.5.3 Confirmation biochimique . 5
10.6 Interprétation des résultats des essais biochimiques . 6
11 Expression des résultats. 7
12 Caractéristiques de performance de la méthode . 7
12.1 Étude interlaboratoires . 7
12.2 Sensibilité . 7
12.3 Spécificité . 7
12.4 LOD .
50 7
13 Rapport d’essai . 7
Annexe A (normative) Représentation schématique du mode opératoire d’essai.8
Annexe B (normative) Composition, préparation et essais de performance des milieux de
culture et des réactifs . 9
Annexe C (informative) Distinction entre Cronobacter spp. et d’autres genres .17
Annexe D (informative) Études de validation des méthodes et caractéristiques de performance .19
Bibliographie .22
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré(e) par le comité technique CEN/TC 275 Analyse des produits
alimentaires — Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec
le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, Sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à
l’accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette première édition annule et remplace l’ISO/TS 22964:2006, qui a fait l’objet d’une révision
technique avec les modifications suivantes:
— le domaine d’application a été étendu à la recherche de Cronobacter spp. dans les produits
alimentaires destinés à la consommation humaine et à l’alimentation animale, ainsi qu’aux
échantillons environnementaux et le titre changé en conséquence;
— le bouillon d’enrichissement, bouillon lauryl sulfate tryptose modifié (mLST), a été remplacé par le
bouillon sélectif Cronobacter (CSB);
— la gélose d’isolement, gélose d’isolement Enterobacter sakazakii (ESIA), a été remplacée par la gélose
d’isolement chromogène pour Cronobacter (CCI);
— plusieurs essais de confirmation ont été remplacés par d’autres essais, conformément au Tableau 1
du présent document.
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés

Introduction
Le présent document décrit une méthode horizontale pour la recherche de Cronobacter spp. dans
les produits alimentaires destinés à la consommation humaine et à l’alimentation animale et dans
les échantillons environnementaux. Les principales modifications, énumérées dans l’avant-propos,
introduites dans le présent document par rapport à l’ISO/TS 22964:2006, sont considérées comme
[2]
majeures (voir l’ISO 17468 ).
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est possible que la présente méthode
horizontale ne convienne pas exactement, dans tous ses détails, à certains d’entre eux. Dans ce cas,
des méthodes différentes, spécifiques de ces produits, peuvent être utilisées, si cela est absolument
nécessaire et pour des raisons techniques justifiées. Néanmoins, il convient de faire tous les efforts
envisageables afin d’appliquer, dans la mesure du possible, la présente méthode horizontale.
À la prochaine révision du présent document, il sera tenu compte de toutes les informations collectées
depuis sa publication, indiquant dans quelle mesure la présente méthode horizontale aura été suivie et
les raisons pour lesquelles on y aura dérogé dans le cas de produits particuliers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut être immédiate et, pour certains groupes de produits,
des Normes internationales et/ou nationales ne concordant pas avec la présente méthode horizontale
existent peut-être déjà. Lors de la révision de ces normes, il serait souhaitable de les aligner sur
le présent document de sorte qu’à terme, les seules divergences restantes par rapport à la présente
méthode horizontale se limiteront à celles qui sont nécessaires pour des raisons techniques bien
établies.
NORME INTERNATIONALE ISO 22964:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche de Cronobacter spp.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode horizontale pour la recherche de Cronobacter spp.
Sous réserve des restrictions exposées dans l’introduction, le présent document est applicable aux:
— produits et ingrédients alimentaires destinés à la consommation humaine et à l’alimentation
animale;
— échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la manutention
des aliments.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire— Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 22964
Première édition
2017-04
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche de Cronobacter spp.
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
detection of Cronobacter spp.
Numéro de référence
©
ISO 2017
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© ISO 2017, Publié en Suisse
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland
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Fax +41 22 749 09 47
copyright@iso.org
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Termes abrégés . 2
5 Principe . 2
5.1 Pré-enrichissement non sélectif dans de l’eau peptonée tamponnée (EPT) . 2
5.2 Enrichissement dans un milieu sélectif (CSB) . 2
5.3 Ensemencement et identification sur une gélose chromogène (gélose CCI) . 2
5.4 Confirmation . 2
6 Milieux de culture et réactifs . 2
7 Matériel et consommables . 2
8 Échantillonnage . 3
9 Préparation de l’échantillon pour essai . 3
10 Mode opératoire (comme représenté à l’Annexe A) . 3
10.1 Prise d’essai . 3
10.2 Pré-enrichissement . 4
10.3 Enrichissement . 4
10.4 Isolement de colonies présumées de Cronobacter spp. . 4
10.5 Confirmation . 4
10.5.1 Généralités . 4
10.5.2 Purification des colonies . 5
10.5.3 Confirmation biochimique . 5
10.6 Interprétation des résultats des essais biochimiques . 6
11 Expression des résultats. 7
12 Caractéristiques de performance de la méthode . 7
12.1 Étude interlaboratoires . 7
12.2 Sensibilité . 7
12.3 Spécificité . 7
12.4 LOD .
50 7
13 Rapport d’essai . 7
Annexe A (normative) Représentation schématique du mode opératoire d’essai.8
Annexe B (normative) Composition, préparation et essais de performance des milieux de
culture et des réactifs . 9
Annexe C (informative) Distinction entre Cronobacter spp. et d’autres genres .17
Annexe D (informative) Études de validation des méthodes et caractéristiques de performance .19
Bibliographie .22
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré(e) par le comité technique CEN/TC 275 Analyse des produits
alimentaires — Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec
le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, Sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à
l’accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette première édition annule et remplace l’ISO/TS 22964:2006, qui a fait l’objet d’une révision
technique avec les modifications suivantes:
— le domaine d’application a été étendu à la recherche de Cronobacter spp. dans les produits
alimentaires destinés à la consommation humaine et à l’alimentation animale, ainsi qu’aux
échantillons environnementaux et le titre changé en conséquence;
— le bouillon d’enrichissement, bouillon lauryl sulfate tryptose modifié (mLST), a été remplacé par le
bouillon sélectif Cronobacter (CSB);
— la gélose d’isolement, gélose d’isolement Enterobacter sakazakii (ESIA), a été remplacée par la gélose
d’isolement chromogène pour Cronobacter (CCI);
— plusieurs essais de confirmation ont été remplacés par d’autres essais, conformément au Tableau 1
du présent document.
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés

Introduction
Le présent document décrit une méthode horizontale pour la recherche de Cronobacter spp. dans
les produits alimentaires destinés à la consommation humaine et à l’alimentation animale et dans
les échantillons environnementaux. Les principales modifications, énumérées dans l’avant-propos,
introduites dans le présent document par rapport à l’ISO/TS 22964:2006, sont considérées comme
[2]
majeures (voir l’ISO 17468 ).
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est possible que la présente méthode
horizontale ne convienne pas exactement, dans tous ses détails, à certains d’entre eux. Dans ce cas,
des méthodes différentes, spécifiques de ces produits, peuvent être utilisées, si cela est absolument
nécessaire et pour des raisons techniques justifiées. Néanmoins, il convient de faire tous les efforts
envisageables afin d’appliquer, dans la mesure du possible, la présente méthode horizontale.
À la prochaine révision du présent document, il sera tenu compte de toutes les informations collectées
depuis sa publication, indiquant dans quelle mesure la présente méthode horizontale aura été suivie et
les raisons pour lesquelles on y aura dérogé dans le cas de produits particuliers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut être immédiate et, pour certains groupes de produits,
des Normes internationales et/ou nationales ne concordant pas avec la présente méthode horizontale
existent peut-être déjà. Lors de la révision de ces normes, il serait souhaitable de les aligner sur
le présent document de sorte qu’à terme, les seules divergences restantes par rapport à la présente
méthode horizontale se limiteront à celles qui sont nécessaires pour des raisons techniques bien
établies.
NORME INTERNATIONALE ISO 22964:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche de Cronobacter spp.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode horizontale pour la recherche de Cronobacter spp.
Sous réserve des restrictions exposées dans l’introduction, le présent document est applicable aux:
— produits et ingrédients alimentaires destinés à la consommation humaine et à l’alimentation
animale;
— échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la manutention
des aliments.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire— Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO
...

ISO/TC 34/SC 9
Deleted: 02‐09
Date:  2017-04
Deleted: /FDIS
ISO/TC 34/SC 9
Secrétariat:  AFNOR
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche
de Cronobacter spp.
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection of
Cronobacter spp.
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le
droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet
de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour
responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails
concernant les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés
lors de l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations
de brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles Deleted: l'OMC
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/iso/fr/avant‐propos.html.
Le présent document a été élaboré(e) par le comité technique CEN/TC 275 Analyse des produits Deleted: Comité européen de normalisation
(CEN),
alimentaires — Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration
avec le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, Sous‐comité SC 9, Microbiologie,
conformément à l’accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne). Deleted: l’Accord
Cette première édition annule et remplace l’ISO/TS 22964:2006, qui a fait l’objet d’une révision
technique avec les modifications suivantes:
— le domaine d’application a été étendu à la recherche de Cronobacter spp. dans les produits
alimentaires destinés à la consommation humaine et à l’alimentation animale, ainsi qu’aux
échantillons environnementaux et le titre changé en conséquence;
— le bouillon d’enrichissement, bouillon lauryl sulfate tryptose modifié (mLST), a été remplacé par le
bouillon sélectif Cronobacter (CSB);
— la gélose d’isolement, gélose d’isolement Enterobacter sakazakii (ESIA), a été remplacée par la
gélose d’isolement chromogène pour Cronobacter (CCI);
— plusieurs essais de confirmation ont été remplacés par d’autres essais, conformément au Tableau 1
du présent document.
Introduction
Le présent document décrit une méthode horizontale pour la recherche de Cronobacter spp. dans les
produits alimentaires destinés à la consommation humaine et à l’alimentation animale et dans les
échantillons environnementaux. Les principales modifications, énumérées dans l’avant‐propos,
introduites dans le présent document par rapport à l’ISO/TS 22964:2006, sont considérées comme
[2]
majeures (voir l’ISO 17468 ). Deleted: ).
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est possible que la présente méthode
horizontale ne convienne pas exactement, dans tous ses détails, à certains d’entre eux. Dans ce cas, des
méthodes différentes, spécifiques de ces produits, peuvent être utilisées, si cela est absolument
nécessaire et pour des raisons techniques justifiées. Néanmoins, il convient de faire tous les efforts
envisageables afin d’appliquer, dans la mesure du possible, la présente méthode horizontale.
À la prochaine révision du présent document, il sera tenu compte de toutes les informations collectées
depuis sa publication, indiquant dans quelle mesure la présente méthode horizontale aura été suivie et
les raisons pour lesquelles on y aura dérogé dans le cas de produits particuliers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut être immédiate et, pour certains groupes de produits, Deleted: instantanée
des Normes internationales et/ou nationales ne concordant pas avec la présente méthode horizontale
existent peut‐être déjà. Lors de la révision de ces normes, il serait souhaitable de les aligner sur le
présent document de sorte qu’à terme, les seules divergences restantes par rapport à la présente
méthode horizontale se limiteront à celles qui sont nécessaires pour des raisons techniques bien
établies.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche de Cronobacter spp.
1 Domaine d'application
Le présent document spécifie une méthode horizontale pour la recherche de Cronobacter spp.
Sous réserve des restrictions exposées dans l’introduction, le présent document est applicable aux:
— produits et ingrédients alimentaires destinés à la consommation humaine et à l’alimentation
animale;
— échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la manutention
des aliments.
2 Références normatives
Les documents ci‐après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension
mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http://www.electropedia.org/.
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http://www.iso.org/obp.
3.1
Cronobacter spp.
microorganismes formant des colonies caractéristiques sur une gélose d’isolement chromogène pour
[10]
9][
Cronobacter (CCI) et possédant les caractéristiques biochimiques décrites lorsque les essais sont
Deleted:
réalisés conformément au présent document
3.2
recherche des Cronobacter spp.
détermination de Cronobacter spp. (3.1) dans une masse, un volume ou une surface donné(e) de
produit, lorsque les essais sont réalisés conformément au présent document

4 Termes abrégés
Pour les besoins du présent document, les abréviations suivantes s’appliquent.
Deleted: BPW
EPT eau peptonée tamponnée (buffered peptone water)
CCI isolement chromogène de Cronobacter (chromogenic Cronobacter isolation)
CSB bouillon sélectif pour Cronobacter (Cronobacter selective broth)
TSA gélose tryptone soja (tryptone soya agar)
5 Principe
5.1 Pré-enrichissement non sélectif dans de l’eau peptonée tamponnée (EPT)
Ensemencement d’une prise d’essai dans de l’eau peptonée tamponnée, puis incubation à une
température comprise entre 34 °C et 38 °C, pendant 18 h ± 2 h.
NOTE Des Cronobacter spp. peuvent être présentes en petit nombre accompagnées d’autres
Enterobacteriaceae telles que E. cloacae, pouvant interférer avec leur détection.
5.2 Enrichissement dans un milieu sélectif (CSB)
Ensemencement du milieu d’enrichissement sélectif avec la culture obtenue en 5.1 et incubation à
41,5 °C ± 1 °C pendant 24 h ± 2 h.
5.3 Ensemencement et identification sur une gélose chromogène (gélose CCI)
Ensemencement de la gélose chromogène à partir de la culture d’enrichissement obtenue en 5.2 et
incubation à 41,5 °C ± 1 °C pendant 24 h ± 2 h.
5.4 Confirmation
Des colonies caractéristiques sont isolées à partir de la gélose chromogène, purifiées sur une gélose non
sélective comme la TSA et caractérisées sur le plan biochimique.
6 Milieux de culture et réactifs
Pour les pratiques en vigueur de laboratoire voir l’ISO 7218 et l’ISO 11133. Deleted: courantes
La composition et la préparation des milieux de culture et des réactifs sont décrites à l’Annexe B.
Pour consulter les essais de performance des milieux de culture, voir l’ISO 11133 et/ou l’Annexe B.
7 Matériel et consommables
Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, si les spécifications
sont appropriées. Deleted: similaires
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.
7.1 Appareil pour la stérilisation par chaleur sèche (four) ou par chaleur humide (autoclave).
Comme spécifié dans l’ISO 7218.
7.2 Étuves, réglables de 34 °C à 38 °C, à 37 °C ± 1 °C et à 41,5 °C ± 1 °C.

7.3 Anses bouclées stériles, d’environ 3 mm de diamètre (10 µl de volume), et de 1 µl de volume, et
fil droit (ose).
7.4 pH-mètre, d’une exactitude d’étalonnage de ± 0,1 unité de pH à 25 °C.
7.5 Fioles et flacons, avec bouchons, d’une capacité permettant de les utiliser pour la préparation
des bouillons d’enrichissement et des géloses, ainsi que leur stockage.
7.6 Pipettes graduées ou pipettes automatiques stériles, de capacités nominales 10 ml, 1 ml et
0,1 ml.
7.7 Tubes (bouchés ou avec capsules), ou flacons de culture, d’une capacité appropriée, à capsules
métalliques non toxiques avec revêtement ou capsules en plastique jetables (voir l’ISO 7218).
7.8 Boîtes de Petri, d’environ 90 mm de diamètre.
7.9 Spectrophotomètre, pouvant mesurer l’absorption de la lumière d’une longueur d’onde de
405 nm.
7.10 Pilon et mortier
7.11 Réfrigérateur, réglable à 5 °C ± 3 °C
7.12 Bains d’eau, réglables entre 47 °C et 50 °C et à 37 °C ± 1 °C.
7.13 Enceinte de séchage (ou four ventilé par convection), pouvant être maintenue à une
température comprise entre 25 °C et 50 °C.
8 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Voir la Norme
internationale spécifique du produit concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique
traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il est recommandé que les parties concernées se
mettent d’accord à ce sujet.
[3]
Une méthode d’échantillonnage recommandée est donnée dans l’ISO/TS 17728 pour les denrées
[4]
alimentaires et les aliments pour animaux et dans l’ISO 18593 pour l’échantillonnage des surfaces.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé, ni
altéré lors du transport ou du stockage (voir l’ISO 7218).
9 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai à partir de l’échantillon de laboratoire conformément à la Norme
internationale spécifique du produit concerné: voir l’ISO 6887 (toutes les parties). S’il n’existe pas de
Norme internationale spécifique, il est recommandé que les parties concernées se mettent d’accord à ce
sujet.
10 Mode opératoire (comme représenté à l’Annexe A)
10.1 Prise d’essai
En général, pour préparer la suspension mère, ajouter 10 g ou 10 ml de l’échantillon pour essai
(Article 9) à 90 ml du milieu de pré‐enrichissement (B.1) (EPT), ce qui correspond à une dilution au
Deleted: BPW
e
1/10. Préchauffer l’eau peptonée tamponnée à température ambiante avant utilisation. Pour les
produits spécifiques, suivre les modes opératoires spécifiés dans l’ISO 6887 (toutes les parties). Pour le
lait sec, suivre l’ISO 6887‐5.

Le présent document a été validé pour des prises d’essai de 10 g. Une prise d’essai de plus petite taille
peut être utilisée sans nécessiter de validation ou vérification supplémentaire, dans la mesure où le
rapport entre le bouillon de pré‐enrichissement et la prise d’essai demeure le même. Une prise d’essai
plus importante que celle validée à l’origine peut être utilisée, si une étude de validation/vérification a
démontré l’absence d’effets négatifs sur la détection de Cronobacter spp.
NOTE 1 Une validation peut être effectuée conformément aux documents appropriés de l’ISO 16140 (toutes les
parties). La vérification du regroupement d’échantillons peut être effectuée conformément au protocole décrit
dans l’ISO 6887‐1:2017, Annexe D (protocole de vérification du regroupement d’échantillons pour les essais
Deleted: 1999
qualitatifs).
NOTE 2 Des échantillons de taille importante peuvent compromettre la récupération des Cronobacter spp.
[5],[6]
][
stressés en présence d’une microflore interférente, comme des probiotiques .
Deleted:
Pour la préparation des quantités supérieures à 10 g, il convient de préchauffer l’eau peptonée
tamponnée entre 34 °C et 38 °C (7.2) avant ensemencement avec la prise d’essai.
10.2 Pré-enrichissement
Incuber le milieu de pré‐enrichissement ensemencé, préparé conformément à 10.1, à une température
comprise entre 34 °C et 38 °C (7.2) pendant 18 h ± 2 h.
10.3 Enrichissement
Après incubation du milieu de pré‐enrichissement ensemencé, bien mélanger et transférer 0,1 ml de la
culture obtenue en 10.2 dans 10 ml de bouillon CSB (B.2) et bien mélanger. Incuber à 41,5 °C (7.2)
pendant 24 h ± 2 h.
10.4 Isolement de colonies présumées de Cronobacter spp.
Laisser les boîtes de gélose CCI (B.3) se stabiliser à température ambiante si elles étaient stockées à une
température inférieure. Si nécessaire, sécher la surface des b
...