ISO 6888-2:2021
(Main)Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) — Part 2: Method using rabbit plasma fibrinogen agar medium
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) — Part 2: Method using rabbit plasma fibrinogen agar medium
This document specifies a horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci by counting the colonies obtained on a solid medium (rabbit plasma fibrinogen agar medium) after aerobic incubation at 34 °C to 38 °C (see Reference [10]). This document is applicable to: — products intended for human consumption; — products intended for animal feeding; — environmental samples in the area of food and feed production and handling; — samples from the primary production stage. This horizontal method was originally developed for the examination of all samples belonging to the food chain. Because of the large variety of products in the food chain, it is possible that this horizontal method is not appropriate in every detail for all products. Nevertheless, it is expected that the required modifications are minimized so that they do not result in a significant deviation from this horizontal method. Based on the information available at the time of publication of this document, this method is particularly suitable for the examination of fermented products or other products containing technological microbiota based on Staphylococcus spp. (e.g. S. xylosus) (such as cheeses made from raw milk and certain raw meat products) likely to be contaminated by: — staphylococci forming atypical colonies on a Baird-Parker agar medium; — background microbiota that can obscure the colonies being sought. Nevertheless, both ISO 6888-1 and this document are given equivalent status.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour le dénombrement des staphylocoques à coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres espèces) — Partie 2: Méthode utilisant le milieu gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène
Le présent document spécifie une méthode horizontale de dénombrement des staphylocoques à coagulase positive par comptage des colonies obtenues en milieu solide (milieu gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène) après incubation en aérobiose entre 34 °C et 38 °C (voir la Référence [10]). Le présent document s’applique aux: — produits destinés à la consommation humaine; — produits destinés à l’alimentation des animaux; — échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la distribution des aliments; et — échantillons prélevés au stade de production primaire. Cette méthode horizontale a été élaborée à l’origine pour l’examen de tous les échantillons appartenant à la chaîne alimentaire. En raison de la grande diversité des produits de la chaîne alimentaire, il est possible que cette méthode horizontale ne soit pas entièrement appropriée à tous les produits. Néanmoins, il est attendu que les modifications requises soient réduites le plus possible afin de ne pas s’écarter de manière significative de cette méthode horizontale. D’après les informations disponibles au moment de la publication du présent document, il convient de recommander cette méthode pour l’examen des produits fermentés ou d’autres produits contenant une flore technologique à base de Staphylococcus spp. (par exemple, S. xylosus) (tels que les fromages à base de lait cru et certains produits à base de viande crue) susceptibles d’être contaminés par: — des staphylocoques formant des colonies non caractéristiques sur un milieu gélosé de Baird-Parker; — une flore annexe pouvant masquer les colonies recherchées. Néanmoins, l’ISO 6888-1 et le présent document bénéficient d’un statut équivalent.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 6888-2
Second edition
2021-08
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the
enumeration of coagulase-positive
staphylococci (Staphylococcus aureus
and other species) —
Part 2:
Method using rabbit plasma
fibrinogen agar medium
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale
pour le dénombrement des staphylocoques à coagulase positive
(Staphylococcus aureus et autres espèces) —
Partie 2: Méthode utilisant le milieu gélosé au plasma de lapin et au
fibrinogène
Reference number
©
ISO 2021
© ISO 2021
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Published in Switzerland
ii © ISO 2021 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 2
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 2
4.1 General . 2
4.2 Incubation . 2
4.3 Enumeration . 3
5 Culture media and reagents . 3
6 Equipment and consumables . 3
7 Sampling . 4
8 Preparation of the test sample . 4
9 Procedure (see Figure A.1) . 4
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions . 4
9.2 Inoculation and incubation . 4
9.3 Counting of colonies . 5
9.3.1 General description of colonies growing on RPFA medium . 5
9.3.2 Colony counting procedure . 5
10 Expression of results . 5
11 Performance characteristics of the method . 5
11.1 Interlaboratory study . 5
11.2 Repeatability limit . 5
11.3 Reproducibility limit . 6
12 Test report . 7
13 Quality assurance . 7
Annex A (normative) Flow diagram of the procedure . 8
Annex B (normative) Culture media and reagents . 9
Annex C (informative) Results of the interlaboratory study .12
Bibliography .14
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 463, Microbiology of the food chain, in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 6888-2:1999), which has been technically
revised. It also incorporates the Amendment ISO 6888-2:1999/Amd 1:2003. The main changes compared
with the previous edition are as follows:
— the title has been changed to relate to the “food chain”;
— the status of ISO 6888-1 and this document has been clarified;
— the document has been aligned with ISO 7218:2007, i.e. and pour molten agar medium at 44 °C to
47 °C;
— all occurrences, when appropriate, have been changed from “35 °C or 37 °C” to “34 °C to 38 °C”;
— all occurrences of incubation time, when appropriate, have been changed from “18 h to 24 h” to
“24 h ± 2 h”;
— requirements have been added to use ISO 11133;
— all available standards related to sampling techniques have been updated;
— flow diagram procedure in Annex A has been updated;
— culture media and reagents with performance testing have been added and moved to Annex B;
— performance testing for rabbit plasma fibrinogen agar (RPFA) medium has been added;
— results of the interlaboratory study (from ISO 6888-2:1999/Amendment 1:2003 Precision data)
have been updated;
iv © ISO 2021 – All rights reserved
— the Bibliography has been updated.
A list of all parts in the ISO 6888 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
Introduction
ISO 6888-1, this document and ISO 6888-3 describe three horizontal methods for the detection
and enumeration of coagulase-positive staphylococci among which enterotoxinogenic strains are
encountered. It is mainly concerned with Staphylococcus aureus, but also with S. intermedius and certain
strains of S. hyicus.
For the purposes of this document, the characterization of staphylococci is based on a positive coagulase
reaction, but it is recognized that some strains of Staphylococcus aureus give weakly positive coagulase
reactions. These latter strains can be confused with other bacteria but they can be distinguished by the
use of additional tests not included in this document, such as tests for sensitivity to lysostaphin, and for
production of haemolysin, thermostable nuclease and acid from mannitol (see ISO 7218 and Reference
[13]).
The main technical changes listed in the Foreword, introduced in this document compared with the
previous edition, are considered as minor (see ISO 17468). They have a minor impact on the performance
characteristics of the method.
The results of the interlaboratory study and samples tested are described in Annex C.
vi © ISO 2021 – All rights reserved
INTERNATIONAL STANDARD ISO 6888-2:2021(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method
for the enumeration of coagulase-positive staphylococci
(Staphylococcus aureus and other species) —
Part 2:
Method using rabbit plasma fibrinogen agar medium
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests
for enumerating staphylococci are only undertaken in properly equipped laboratories, under
the control of a skilled microbiologist and that great care is taken in the disposal of all incubated
materials. Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety aspects, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
1 Scope
This document specifies a horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci
by counting the colonies obtained on a solid medium (rabbit plasma fibrinogen agar medium) after
aerobic incubation at 34 °C to 38 °C (see Reference [10]).
This document is applicable to:
— products intended for human consumption;
— products intended for animal feeding;
— environmental samples in the area of food and feed production and handling;
— samples from the primary production stage.
This horizontal method was originally developed for the examination of all samples belonging to the
food chain.
Because of the large variety of products in the food chain, it is possible that this horizontal method is not
appropriate in every detail for all products. Nevertheless, it is expected that the required modifications
are minimized so that they do not result in a significant deviation from this horizontal method.
Based on the information available at the time of publication of this document, this method is not
considered to be (fully) suited to the examination of fermented products or other products containing
technological flora based on Staphylococcus spp. (e.g. S. xylosus) (such as cheeses made from raw milk
and certain raw meat products) likely to be contaminated by:
— staphylococci forming atypical colonies on a Baird-Parker agar medium;
— background flora that can obscure the colonies being sought.
Nevertheless, both ISO 6888-1 and this document are given equivalent status.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
coagulase-positive staphylococci
bacteria that form typical colonies in a selective culture medium (rabbit plasma fibrinogen agar
medium)
Note 1 to entry: The typical colonies are described in 9.3.
3.2
enumeration of coagulase-positive staphylococci
determination of the number of coagulase-positive staphylococci (3.1) per gram, per millilitre, per square
centimetre or per sampling device/sampled area.
Note 1 to entry: A sampled area is an area not defined by a numerical size, for example, a hot tap, a door handle.
4 Principle
4.1 General
Preparation of poured plate of the rabbit plasma fibrinogen agar medium, with a specified quantity of
the test sample if the product is liquid or with a specified quantity of the initial suspension in the case
of other products.
Inoculation, under the same conditions, using decimal dilutions of the test sample, follow the
procedure(s) in accordance with ISO 7218.
NOTE The volume of rabbit plasma fibrinogen agar medium to be added to the inoculum is a critical point for
the coagulase method and reaction.
4.2 Incubation
Aerobic incubation of the plates at 34 °C to 38 °C and examination after 24 h and, if necessary, after
48 h.
2 © ISO 2021 – All rights reserved
4.3 Enumeration
Calculation of the number of coagulase-positive staphylococci per gram of sample, per millilitre of
sample, per square centimetre or per sampling device from the number of typical colonies obtained on
plates at dilution levels chosen to give a significant result within the counting limits of the method and
in accordance with ISO 7218.
NOTE See Annex A for a flow diagram.
5 Culture media and reagents
Follow current laboratory practices in accordance with ISO 7218.
The composition of culture media and reagents and their preparation are specified in Annex B.
For performance testing of culture media and reagents, follow the procedures in accordance with either
Annex B or ISO 11133, or both.
For diluent(s), see the relevant part of the ISO 6887 series.
6 Equipment and consumables
Disposable equipment is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications.
Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) and wet sterilization (autoclave).
See ISO 7218.
6.2 Incubator, capable of maintaining the inoculated media, within the temperature range 34 °C to
38 °C.
NOTE The range 34 °C to 38 °C for incubation of media includes the use of incubators set at 35 °C ± 1 °C,
36 °C ± 2 °C or 37 °C ± 1 °C.
6.3 Water bath, or similar apparatus, capable of being maintained at 44 °C to 47 °C.
6.4 Sterile Petri dishes, with a diameter of approximately 90 mm, made of glass or plastic.
6.5 Sterile graduated pipettes or automatic pipettes of nominal capacities 1 ml, 2 ml and 10 ml,
graduated in 0,1 ml, 0,1 ml and 0,5 ml divisions, respectively. See ISO 7218.
Graduated pipettes and pipettor tips should be fitted with a non-absorbent cotton wool plug to prevent
contamination when used to manipulate microbial cultures.
6.6 pH-meter, capable of being read to the nearest 0,01 pH unit, enabling measurements to be made
with a tolerance of ±0,1 pH unit. The pH meter shall be equipped with either manual or automatic
temperature compensation. See ISO 7218.
6.7 Refrigerator, capable of operating at 5 °C ± 3 °C.
6.8 Sterile tubes, bottles or flasks with caps, of appropriate capacity. Bottles or flasks with non-toxic
metallic or plastic screw-caps may be used.
6.9 Membranes, with 0,2 µm pore size.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. Follow the specific International
Standard dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard dealing
with the sampling of the product concerned, the parties concerned should come to an agreement on this
subject.
Recommended sampling techniques are given in the following documents:
— ISO/TS 17728 for food and animal feed;
— ISO 707 for milk and milk products;
— ISO 6887-3 for fish and fishery products;
— ISO 13307 for the primary production stage;
— ISO 17604 for carcasses;
— ISO 18593 for surfaces.
It is important that the laboratory receive a sample that is representative. The sample should not have
been damaged or changed during transport or storage.
8 Preparation of the test sample
Prepare the test sample from the laboratory sample in accordance with the specific International
Standard dealing with the product concerned: follow the procedures specified in the ISO 6887 series
and if necessary ISO 18593. If there is no specific International Standard available, the parties concerned
should come to an agreement on this subject.
9 Procedure (see Figure A.1)
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions
See the relevant part of the ISO 6887 series.
9.2 Inoculation and incubation
Transfer, by means of a sterile pipette (6.5), 1 ml of the test sample if liquid, or 1 ml of the initial
−1
suspension (10 dilution) in the case of other products, to a Petri dish (see Annex B). For enumeration
techniques in microbiology of the food chain, the number of Petri dishes to be used, according to the
tested dilutions, is stated in ISO 7218. Repeat the procedure for further decimal dilutions if necessary.
Into each Petri dish (6.4), immediately pour 18 ml to 20 ml freshly prepared complete medium (B.2.3)
to obtain a depth of at least 3 mm.
Carefully mix the inoculum with the culture medium and leave to solidify by placing the Petri dishes on
a horizontal surface.
After complete solidification, invert the dishes prepared above and p
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 6888-2
Deuxième édition
2021-08
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour le dénombrement des
staphylocoques à coagulase positive
(Staphylococcus aureus et autres
espèces) —
Partie 2:
Méthode utilisant le milieu gélosé au
plasma de lapin et au fibrinogène
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus
aureus and other species) —
Part 2: Method using rabbit plasma fibrinogen agar medium
Numéro de référence
©
ISO 2021
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y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2021 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Incubation . 3
4.3 Dénombrement . 3
5 Milieux de culture et réactifs . 3
6 Équipement et consommables . 3
7 Échantillonnage . 4
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
9 Mode opératoire (voir la Figure A.1) . 4
9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions . 4
9.2 Ensemencement et incubation . 4
9.3 Comptage des colonies . 5
9.3.1 Description générale des colonies en croissance sur un milieu RPFA. 5
9.3.2 Mode opératoire de comptage des colonies . 5
10 Expression des résultats. 5
11 Caractéristiques de performance de la méthode . 6
11.1 Étude interlaboratoires . 6
11.2 Limite de répétabilité . 6
11.3 Limite de reproductibilité . 6
12 Rapport d’essai . 7
13 Assurance qualité . 7
Annexe A (normative) Logigramme du mode opératoire . 8
Annexe B (normative) Milieux de culture et réactifs . 9
Annexe C (informative) Résultats de l’étude interlaboratoires .13
Bibliographie .16
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la
chaîne alimentaire, du Comité européen de normalisation (CEN), conformément à l’Accord de coopération
technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette seconde édition annule et remplace la première édition (ISO 6888-2:1999), qui a fait l’objet
d’une révision technique. Elle intègre également l’Amendement de l’ISO 6888-2:1999/Amd 1:2003. Les
principales modifications par rapport à l’édition précédente sont les suivantes:
— le titre a été modifié pour faire référence à la « chaîne alimentaire »;
— le statut de l’ISO 6888-1 et du présent document a été clarifié;
— le document a été aligné sur l’ISO 7218:2007, c’est-à-dire qu’il indique de verser le milieu gélosé
fondu à une température comprise entre 44 °C et 47 °C;
— toutes les occurrences de « 35 °C ou 37 °C », le cas échéant, ont été remplacées par « entre 34 °C
et 38 °C »;
— toutes les occurrences des durées d’incubation « 18 h à 24 h », le cas échéant, ont été remplacées
par « 24 h ± 2 h »;
— des exigences ont été ajoutées pour utiliser l’ISO 11133;
— toutes les normes disponibles concernant les techniques de prélèvement ont été mises à jour;
— le mode opératoire sous forme de logigramme à l’Annexe A a été mis à jour;
iv © ISO 2021 – Tous droits réservés
— les milieux de culture et les réactifs avec essais de performance ont été ajoutés et déplacés à
l’Annexe B;
— les essais de performance pour le milieu gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène (RPFA) ont été
ajoutés;
— les résultats de l’étude interlaboratoires (selon les données de fidélité de l’ISO 6888-2:1999/
Amendement 1:2003) ont été mis à jour;
— la Bibliographie a été mise à jour.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 6888 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
Introduction
L’ISO 6888-1, le présent document et l’ISO 6888-3 décrivent trois méthodes horizontales pour la
détection et le dénombrement de staphylocoques à coagulase positive parmi lesquels se trouvent
les souches entérotoxinogènes. Il s’agit principalement de Staphylococcus aureus, mais également
de S. intermedius et de certaines souches de S. hyicus.
Pour les besoins du présent document, la caractérisation des staphylocoques repose sur une réaction
positive à la coagulase, mais il est reconnu que certaines souches de Staphylococcus aureus donnent une
réaction faiblement positive à la coagulase. Ces dernières souches peuvent être confondues avec d’autres
bactéries, mais elles peuvent être distinguées en utilisant des essais complémentaires non inclus dans
le présent document, tels que la sensibilité à la lysostaphine, et pour la production d’hémolysine, de
nucléase thermostable et d’acide à partir de mannitol (voir l’ISO 7218 et la Référence [13]).
Les principales modifications techniques listées dans l’avant-propos qui ont été apportées au présent
document par rapport à la précédente édition sont considérées comme mineures (voir l’ISO 17468).
Ils ont un impact mineur sur les caractéristiques de performance de la méthode.
Les résultats de l’étude interlaboratoires et les échantillons soumis à essai sont décrits à l’Annexe C.
vi © ISO 2021 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE ISO 6888-2:2021(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour le dénombrement des staphylocoques
à coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres
espèces) —
Partie 2:
Méthode utilisant le milieu gélosé au plasma de lapin et au
fibrinogène
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que
les essais de dénombrement des staphylocoques ne soient effectués que dans des laboratoires
correctement équipés, sous la surveillance d’un microbiologiste expérimenté, et qu’un grand
soin soit apporté à l’élimination de tous les matériaux incubés. Il convient que les utilisateurs
du présent document maîtrisent les pratiques courantes de laboratoire. Le présent document
ne prétend pas aborder la totalité des aspects liés à la sécurité qui pourraient découler de son
utilisation. Il incombe à l’utilisateur de ce document d’établir des pratiques appropriées en
matière d’hygiène et de sécurité.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode horizontale de dénombrement des staphylocoques à
coagulase positive par comptage des colonies obtenues en milieu solide (milieu gélosé au plasma de
lapin et au fibrinogène) après incubation en aérobiose entre 34 °C et 38 °C (voir la Référence [10]).
Le présent document s’applique aux:
— produits destinés à la consommation humaine;
— produits destinés à l’alimentation des animaux;
— échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la distribution des
aliments; et
— échantillons prélevés au stade de production primaire.
Cette méthode horizontale a été élaborée à l’origine pour l’examen de tous les échantillons appartenant
à la chaîne alimentaire.
En raison de la grande diversité des produits de la chaîne alimentaire, il est possible que cette méthode
horizontale ne soit pas entièrement appropriée à tous les produits. Néanmoins, il est attendu que les
modifications requises soient réduites le plus possible afin de ne pas s’écarter de manière significative
de cette méthode horizontale.
D’après les informations disponibles au moment de la publication du présent document, cette méthode
n’est pas considérée comme étant (complètement) adaptée à l’examen des produits fermentés ou d’autres
produits contenant une flore technologique fondée sur Staphylococcus spp. (par exemple, S. xylosus)
(tels que les fromages à base de lait cru et certains produits à base de viande crue) susceptibles d’être
contaminés par:
— des staphylocoques formant des colonies non caractéristiques sur un milieu gélosé de Baird-Parker;
— une flore annexe pouvant masquer les colonies recherchées.
Néanmoins, l’ISO 6888-1 et le présent document bénéficient d’un statut équivalent.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/ .
3.1
staphylocoques à coagulase positive
bactéries formant des colonies caractéristiques dans un milieu de culture sélectif (milieu gélosé au
plasma de lapin et au fibrinogène)
Note 1 à l'article: Les colonies caractéristiques sont décrites en 9.3.
3.2
dénombrement des staphylocoques à coagulase positive
détermination du nombre de staphylocoques à coagulase positive (3.1) par gramme, millilitre,
centimètre carré ou dispositif de prélèvement/zone de prélèvement
Note 1 à l'article: Une zone de prélèvement est une zone qui n’est pas définie par une taille numérique, par exemple
un robinet d’eau chaude ou une poignée de porte.
4 Principe
4.1 Généralités
Ensemencement en profondeur du milieu gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène, avec une quantité
déterminée de l’échantillon pour essai si le produit est liquide, ou avec une quantité déterminée de la
suspension mère dans le cas d’autres produits.
Dans les mêmes conditions, ensemencement des dilutions décimales obtenues à partir de l’échantillon
pour essai en suivant le ou les modes opératoires conformément à l’ISO 7218.
NOTE Le volume de milieu gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène à ajouter à l’inoculum joue un rôle
essentiel dans la méthode et la réaction de coagulase.
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4.2 Incubation
Incubation des boîtes entre 34 °C et 38 °C en aérobiose et examen après 24 h et, si nécessaire, après
48 h.
4.3 Dénombrement
Calcul du nombre de staphylocoques à coagulase positive par gramme de l'échantillon, par millilitre
de l'échantillon, par centimètre carré ou par dispositif de prélèvement à partir du nombre de colonies
caractéristiques, obtenues sur les boîtes retenues aux niveaux de dilution donnant un résultat
significatif dans les limites de comptage de la méthode et conformément à l’ISO 7218.
NOTE Voir l’Annexe A relative au logigramme.
5 Milieux de culture et réactifs
Suivre les pratiques courantes de laboratoire conformément à l’ISO 7218.
La composition des milieux de culture et des réactifs et leur préparation sont décrites à l’Annexe B.
Pour les essais de performance des milieux de culture et des réactifs, suivre les modes opératoires
conformément à l’Annexe B ou à l’ISO 11133, ou aux deux.
Pour les diluants, voir la partie correspondante de la série de normes ISO 6887.
6 Équipement et consommables
Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, à condition que ses
spécifications soient convenables.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche (four) et en chaleur humide (autoclave).
Voir l’ISO 7218.
6.2 Étuve, permettant de maintenir les milieux ensemencés à l’intérieur d’une plage de température
comprise entre 34 °C et 38 °C.
NOTE La plage de température comprise entre 34 °C et 38 °C pour l’incubation de milieux inclut l’utilisation
d’étuves réglées à 35 °C ± 1 °C, à 36 °C ± 2 °C ou à 37 °C ± 1 °C.
6.3 Bain d’eau, ou dispositif similaire, pouvant être maintenu à une température entre 44 °C et 47 °C.
6.4 Boîtes de Petri, stériles, d’environ 90 mm de diamètre, en verre ou en matière plastique.
6.5 Pipettes graduées ou pipettes automatiques stériles, d’une capacité nominale de 1 ml, 2 ml
et 10 ml, graduées respectivement en 0,1 ml, 0,1 ml et 0,5 ml. Voir l’ISO 7218.
Il convient que les pipettes graduées et les cônes des pipettes soient munis d’un bouchon en coton
non absorbant pour empêcher la contamination lors de la manipulation de cultures microbiennes.
6.6 pH-mètre ayant une précision de lecture de ± 0,01 unité pH, permettant de réaliser des mesures
précises à ±0,1 unité pH. Le pH-mètre doit être équipé d’un système de compensation de température
soit manuel, soit automatique. Voir l’ISO 7218.
6.7 Réfrigérateur, pouvant fonctionner à 5 °C ± 3 °C.
6.8 Tubes à essai, flacons ou fioles avec bouchons, de capacités appropriées. Des flacons ou fioles
avec bouchons à vis métalliques ou plastiques non toxiques peuvent être utilisés.
6.9 Membranes, d’une porosité de 0,2 µm.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Suivre la Norme
internationale spécifique du produit concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique
traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il convient que les parties concernées se mettent
d’accord à ce sujet.
Des techniques d’échantillonnage recommandées sont décrites dans les documents suivants:
— ISO/TS 17728 pour les aliments et les aliments pour animaux;
— ISO 707 pour le lait et les produits laitiers;
— ISO 6887-3 pour les produits de la pêche;
— ISO 13307 pour le stade de production primaire;
— ISO 17604 pour les carcasses;
— ISO 18593 pour les surfaces.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif. Il convient que l’échantillon n’ait
pas été endommagé ni modifié au cours du transport ou du stockage.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai à partir de l’échantillon de laboratoire, conformément à la Norme
internationale spécifique du produit concerné: suivre les modes opératoires spécifiés dans la série de
normes ISO 6887 et, si nécessaire, dans l’ISO 18593. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique,
il convient que les parties concernées se mettent d’accord à ce sujet.
9 Mode opératoire (voir la Figure A.1)
9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions
Voir la partie correspondante de la série de normes ISO 6887.
9.2 Ensemencement et incubation
Transférer, à l’aide d’une pipette stérile (6.5), 1 ml de l’échantillon pour essai s’il est liquide ou 1 ml de
−1
la suspension mère (dilution 10 ) pour les autres produits, dans une boîte de Petri (voir l’Annexe B).
Pour les techniques de dénombrement en microbiologie de la chaîne alimentaire, le nombre de boîtes de
Petri à utiliser en fonction des dilutions soumises à essai est indiqué dans l’ISO 7218. Répéter le mode
opératoire pour les dilutions décimales suivantes si nécessaire.
Dans chaque boîte de Petri (6.4), verser immédiatement 18 ml à 20 ml de milieu complet (B.2.3) préparé
extemporanément de manière à obtenir une profondeur d’au moins 3 mm.
Mélanger soigneusement l’inoculum au milieu de culture et laisser solidifier en posant les boîtes de
Petri sur une surface horizontale.
Après solidification complète, retourner les boîtes préparées selon les instructions ci-dessus et les
placer dans l’étuve (6.2) réglée à une température comprise entre 34 °C et 38 °C. Après 24 h ± 2 h
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d’incubation, marquer sur le fond des boîtes les emplacements des colonies caractéristiques
éventuellement présentes. Si aucunes colonies ou aucunes col
...
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