ISO 16634-1:2008
(Main)Food products - Determination of the total nitrogen content by combustion according to the Dumas principle and calculation of the crude protein content — Part 1: Oilseeds and animal feeding stuffs
Food products - Determination of the total nitrogen content by combustion according to the Dumas principle and calculation of the crude protein content — Part 1: Oilseeds and animal feeding stuffs
ISO 16634-1:2008 specifies a method for the determination of the total nitrogen content and the calculation of crude protein content of oilseeds and animal feeding stuffs. This method, like the Kjeldahl method, does not distinguish between protein nitrogen and non-protein nitrogen. For the calculation of protein content, various conversion factors are used. This method is not applicable to milk and milk products.
Produits alimentaires - Détermination de la teneur en azote total par combustion selon le principe Dumas et calcul de la teneur en protéines brutes — Partie 1: Graines oléagineuses et aliments des animaux
L'ISO 16634-1:2008 spécifie une méthode pour la détermination de la teneur en azote total et le calcul de la teneur en protéines brutes des graines oléagineuses et des aliments pour animaux. Cette méthode, comme la méthode Kjeldahl, ne distingue pas l'azote protéique de l'azote non protéique. Divers facteurs de conversion sont utilisés pour le calcul de la teneur en protéines. Cette méthode ne s'applique pas au lait et aux produits laitier.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16634-1
First edition
2008-11-01
Food products — Determination of the
total nitrogen content by combustion
according to the Dumas principle and
calculation of the crude protein
content —
Part 1:
Oilseeds and animal feeding stuffs
Produits alimentaires — Détermination de la teneur en azote total par
combustion selon le principe Dumas et calcul de la teneur en protéines
brutes —
Partie 1: Graines oléagineuses et aliments des animaux
Reference number
©
ISO 2008
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Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 2
5 Reagents. 2
6 Apparatus . 3
7 Sampling. 4
8 Preparation of test sample. 4
9 Procedure . 4
9.1 General. 4
9.2 Test portion . 4
9.3 Control of oxygen demand . 5
9.4 Calibration . 5
9.5 Determination. 5
9.6 Detection and integration . 6
10 Calculation and expression of results. 6
10.1 Calculation. 6
10.1.1 Nitrogen content . 6
10.1.2 Crude protein content . 6
10.2 Expression of results . 7
11 Precision. 7
11.1 Interlaboratory tests . 7
11.2 Repeatability. 7
11.3 Reproducibility. 7
12 Test report . 7
Annex A (informative) Flowchart for the basic design of a Dumas apparatus . 8
Annex B (informative) Schemes of suitable types of Dumas apparatus . 9
Annex C (informative) Equipment calibration . 12
Annex D (informative) Examples of factors for converting nitrogen content to protein content . 14
Annex E (informative) Result of collaborative studies. 15
Annex F (informative) Relationship between Dumas nitrogen and Kjeldahl nitrogen. 24
Bibliography . 28
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 16634-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products.
ISO 16634 consists of the following parts, under the general title Food products — Determination of the total
nitrogen content by combustion according to the Dumas principle and calculation of the crude protein content:
⎯ Part 1: Oilseeds and animal feeding stuffs
A part 2 on cereals, pulses and milled cereal products is in preparation.
iv © ISO 2008 – All rights reserved
Introduction
For a long time the Kjeldahl method has been the most frequently used method for the determination of
protein content of food products. However, in recent years, the Kjeldahl method has increasingly been
replaced by the Dumas method, which is faster and does not use dangerous chemicals. Although the
principles of the two methods are different, both measure the nitrogen content of the product. Nitrogen can be
converted into protein content by using an appropriate factor. The value of this factor varies with the relative
amounts of different proteins and their amino-acid composition in the given product.
Neither the Dumas nor the Kjeldahl method distinguishes between protein and non-protein nitrogen. In most
cases, results obtained by the Dumas method are slightly higher than those of the Kjeldahl method. This is
due to the fact that the Dumas method measures almost all of the non-protein nitrogen, whereas the Kjeldahl
method measures only a part of it.
Taking into consideration that the calculated protein content of a product by both methods only approximates
the true value, it is a matter of discretion which one is accepted. The most appropriate solution should be the
use of a second factor for the elimination of the systematic error caused by the non-protein nitrogen content of
the different products. However, this second factor has to be determined for each product, like existing factors,
which show the ratio of the protein to the nitrogen content.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16634-1:2008(E)
Food products — Determination of the total nitrogen content by
combustion according to the Dumas principle and calculation
of the crude protein content —
Part 1:
Oilseeds and animal feeding stuffs
1 Scope
This part of ISO 16634 specifies a method for the determination of the total nitrogen content and the
calculation of crude protein content of oilseeds and animal feeding stuffs.
This method, like the Kjeldahl method, does not distinguish between protein nitrogen and non-protein nitrogen.
For the calculation of protein content, various conversion factors are used (see Annex D).
This method is not applicable to milk and milk products, for which a method is specified in
[10]
ISO 14891⎪IDF 185 .
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 664, Oilseeds — Reduction of laboratory sample to test sample
ISO 665, Oilseeds — Determination of moisture and volatile matter content
ISO 771, Oilseed residues — Determination of moisture and volatile matter content
ISO 6496, Animal feeding stuffs — Determination of moisture and other volatile matter content
ISO 6498, Animal feeding stuffs — Preparation of test samples
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
nitrogen content
mass fraction of the total nitrogen determined by the procedure specified in this part of ISO 16634
NOTE The mass fraction is expressed as a percentage.
3.2
crude protein content
nitrogen content (3.1) multiplied by a factor, usually 6,25
NOTE 1 A listing of other factors for possible use with various commodities is given in Annex D.
NOTE 2 The factors for calculation of crude protein content from the total content of nitrogen are derived from the
Kjeldahl method which is the reference method for the determination of total nitrogen content. As the method uses the
same factors as the Kjeldahl method, the use of these factors has to be verified due to the slight difference in results
between the Kjeldahl and Dumas methods.
4 Principle
Samples are converted to gases by heating in a combustion tube which gasifies samples. Interfering
components are removed from the resulting gas mixture. The nitrogen compounds in the gas mixture or a
representative part of them are converted to molecular nitrogen, which is quantitatively determined by a
thermal conductivity detector. The nitrogen content is calculated by a microprocessor.
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, or reagents of equivalent purity as specified by instrument
manufacturers. Except for the reference materials (5.12), all reagents shall be free from nitrogen.
5.1 Carrier gas(es): use one of 5.1.1 and 5.1.2.
5.1.1 Carbon dioxide, as pure as possible and of minimum volume fraction, ϕ(CO ) W 99,99 %.
5.1.2 Helium, as pure as possible and of minimum volume fraction, ϕ(He) W 99,99 %.
5.2 Oxygen, as pure as possible and of minimum volume fraction, ϕ(O ) W 99,99 %.
5.3 Sulfur dioxide and halogen absorbent, to eliminate any sulfur from the sample [e.g. lead chromate
(PbCrO ) or steel wool].
5.4 Copper oxide platinum catalyst (filling material for the post-combustion tube).
Platinum catalyst [5 % of Pt on alumina (Al O )] is blended with CuO at a ratio of 1:7 parts or 1:8 parts
2 3
according to the manufacturer's recommendations.
To prevent separation as a result of the different bulk densities of the two materials, it is recommended not to
prepare the mixture before filling the tube. It is advisable to pour the platinum catalyst and copper oxide
simultaneously into the post-combustion tube using a suitable funnel.
5.5 Silver or copper wool.
This should be disaggregated before being inserted in the post-combustion or reduction tube.
5.6 Silica (quartz) or glass wool or cotton wool, as recommended by the instrument manufacturer.
5.7 Copper (wire, cuttings, turnings or powder), or tungsten for the reduction tube.
The use of copper wires can improve the precision of analytical results for samples with low nitrogen contents
(about 1 % mass fraction).
5.8 Diphosphorus pentoxide (P O ) or granulated magnesium perchlorate [Mg(ClO ) ], or another
2 5 4 2
suitable support material, to fill the drying tubes.
2 © ISO 2008 – All rights reserved
5.9 Hollow corundum spheres or aluminium oxide pellets, for the combustion tube.
5.10 Copper oxide (CuO), as filling material for the combustion tube.
5.11 Sodium hydroxide (NaOH), on a support material.
5.12 Aspartic acid (C H NO ) or ethylenediaminetetraacetic acid (C H N O ) or glutamic acid
4 7 4 10 16 2 8
(C H NO ) or hippuric acid (C H NO ) standard, or other suitable reference materials with known, constant,
5 9 4 9 9 3
certified nitrogen content.
Minimum recovery should be 99 % mass fraction.
5.13 Light petroleum, with boiling range between 30 °C and 60 °C, or acetone or ethanol.
6 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
6.1 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,000 1 g.
6.2 Grinding device, appropriate to the nature of the sample.
6.3 Sieve, of nominal size of openings 800 µm or 1 mm, made of non-ferrous material.
6.4 Crucibles (e.g. made of stainless steel, quartz, ceramic or platinum) or tin capsules or nitrogen-free
filter paper for pressing pellets, suitable for the Dumas apparatus used.
NOTE 1 Several commercial instruments are provided with an automatic sampler.
NOTE 2 Some solid samples (e.g. powders) can be pressed to form pellets.
1)
6.5 Dumas apparatus , fitted with a furnace able to maintain a given temperature greater than or equal to
850 °C, with a thermal conductivity detector and suitable device for signal integration.
Suitable Dumas apparatus operates according to the general flowchart given in Annex A, although different
arrangements and components may be used.
NOTE Schemes of three available instruments are shown as examples in Figures B.1, B.2, and B.3.
To avoid leaks, the sealing O-rings shall be slightly lubricated with high-vacuum grease prior to installation.
Experience has shown that it is important to clean all pieces of silica and glassware carefully, and to remove
fingerprints from the tubes using a suitable solvent (e.g. acetone) before inserting them in the furnace.
1) Elementar Analysensysteme, Sumika Chemical Analysis Service, and LECO Instruments produce suitable equipment
available commercially. This information is given for the convenience of users of this International Standard and does not
constitute an endorsement by ISO of this equipment. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the
same results.
7 Sampling
A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 16634. Recommended sampling methods are
[1] [3]
given in ISO 542 for oilseeds, in ISO 5500 for oilseed residues, and in ISO 6498 for animal feeding stuffs.
8 Preparation of test sample
The laboratory sample shall be prepared in such a way that a homogeneous test sample is obtained, which is
representative of the oilseeds (see ISO 664) or animal feeding stuff (see ISO 6498).
Using a suitable grinding device (6.2), grind the laboratory sample. Generally, pass the ground material
through a sieve (6.3) of nominal size of openings 800 µm for small sample sizes (under 300 mg), or a sieve of
[15]
nominal size of openings 1 mm, for larger sample sizes (300 mg or more) . Mills that produce particle sizes
meeting the specifications given in Table 1 will give acceptable results.
Table 1 — Required particle size
Nominal size of sieve openings Amount passing through sieve
µm % mass fraction
710 100
500 95 to 100
200 85 or less
Grinding may result in moisture loss and therefore the moisture content of the ground sample should also be
analysed when reporting nitrogen or protein values to dry matter or a constant moisture basis. Determination
of the moisture shall be carried out according to ISO 665, ISO 771 or ISO 6496.
The grinder efficiency may be checked by replicate preparation of ground samples of a 2+1 mixture of corn
and soya seeds. The expected coefficient of variation should be less than 2 % mass fraction.
9 Procedure
9.1 General
Carefully follow the manufacturer's instructions for instrument set-up, optimization, calibration and operation.
Switch the instrument on and allow it to stabilize as defined in local procedures.
An instrument performance test should be made daily, using the reference material (5.12). The recovery of
nitrogen should be > 99,0 % mass fraction.
9.2 Test portion
Weigh, to the nearest 0,000 1 g, at least 0,1 g of the test sample into a crucible or tin capsule or nitrogen-free
filter paper for pressing pellets (6.4). For samples low in protein (< 1 % mass fraction), the amount of the test
portion may be increased up to 3,5 g, depending on both the type of the Dumas equipment used and the
nature of the test portion.
Depending on the type of equipment used, if the samples contain over 17 % mass fraction moisture, it may be
necessary to dry them before analysis.
4 © ISO 2008 – All rights reserved
Lower masses may be necessary for very high protein content samples or where only very small amounts of
sample are available. In the case of masses less than 0,1 g, a validation shall be performed.
9.3 Control of oxygen demand
Control oxygen demand, in particular the flow, according to the instructions of the material supplier.
Conduct as many blanks as necessary to stabilize the equipment, each using an equivalent mass of sucrose
in place of the sample, with each set of nitrogen or protein determinations to mimic the test sample run. The
sucrose blank provides the amount of nitrogen that is introduced by the atmospheric gases and is trapped
within a powdered organic material source. Use the mean value of the atmospheric blank determinations as
an error correction in the calculation of the nitrogen or protein determination of each test sample.
9.4 Calibration
Use pure compounds with known constant nitrogen content, e.g. aspartic acid (5.12), as standards for long-
term instrument calibration. Analyse, in duplicate, three pure compounds, each with three different
concentrations, chosen according to the measurement range of the actual samples.
To prepare a calibration curve, choose the compound and the amount used to ensure that an absolute
amount of nitrogen in connection with the matrices to be analysed can be detected. For calibration, five
standard samples (minimum) should be used, according to the scope of the analysed matrices.
Above 200 mg of nitrogen, the calibration curve is expected to be non-linear. In this non-linear section, several
short segments may be used for calibration. To ensure the quality of calibration in this region, standard
samples should be increased in steps of 1 mg to 5 mg of nitrogen.
Calibration may also be performed using aqueous standard solutions.
Check the calibration at least three times at the beginning of the series, and then every 15 to 25 samples,
analysing either one of the replicate standards, or a sample of known value. The value obtained shall be less
than 0,05 % mass fraction nitrogen of the expected value. Otherwise, analyse the samples again after
checking instrument performance.
9.5 Determination
With the instrument under operating conditions, introduce the test portion according to the manufacturer's
instructions.
During analysis, the following processes take place in the instrument (see Figure B.1, B.2 or B 3).
The test portion is quantitatively combusted under standardized conditions at a temperature of 850 °C
minimum, depending on the instrument and the material being tested.
Volatile decomposition products (mainly molecular nitrogen, nitrogen oxides, carbon dioxide, and water
vapour) are transported by the carrier gas (5.1) through the instrument.
Nitrogen oxides are reduced to molecular nitrogen and the excess of oxygen is bound to the copper or
tungsten in the reduction column (5.7).
Water is removed by means of a condenser filled with magnesium perchlorate, diphosphorus pentoxide or
other drying agents (5.8). Unless carbon dioxide is used as carrier gas (5.1.1), it is removed by being passed
over a suitable absorbent, e.g. sodium hydroxide on a support material (5.11).
Interfering compounds (e.g. volatile halogen and sulfur compounds) are removed by absorbents (5.3) or
contact materials [e.g. silver wool (5.5) or sodium hydroxide on a suitable support material (5.11)].
The nitrogen in the residual gas mixture, consisting of nitrogen and carrier gas, is passed through a thermal
conductivity detector.
9.6 Detection and integration
For quantitative nitrogen determination, the instrument uses a sensitive thermal conductivity cell that is
optimized for the carrier gas employed and which may have automatic zero adjustment between the
measurement of the test portions. After amplification and analog/digital conversion of the detector signal, data
obtained are processed by peripheral microprocessor hardware.
10 Calculation and expression of results
10.1 Calculation
10.1.1 Nitrogen content
Results for the total nitrogen content, w , expressed as a percentage mass fraction, are usually available from
N
instrument printouts.
10.1.2 Crude protein content
The correction factor, F , is obtained by using Equation (1):
c
100− w
HO,1
F = (1)
c
100− w
HO,2
where
w is the moisture mass fraction, expressed as a percentage, before grinding;
H O,1
w is the moisture mass fraction, expressed as a percentage, after grinding.
H O,2
The crude protein content, w , expressed as a percentage mass fraction, is obtained by using Equation (2):
p
w = w F F (2)
p N c
where
w is the numerical value of the nitrogen content, expressed as a percentage mass fraction, of the
N
sample at its natural moisture content;
F is the generally agreed ratio for the analysed product, equal to 6,25 for animal feeding stuffs (see
Annex D).
On request, the crude protein content, w , expressed as a percentage mass fraction of the dry matter, can be
pd
calculated by using Equation (3):
100w
p
w = (3)
pd
100− w
HO
where w is the moisture content, expressed as a percentage mass fraction, determined according to
H O
ISO 665, ISO 771 or ISO 6496.
6 © ISO 2008 – All rights reserved
10.2 Expression of results
Express the results to three significant figures (e.g. 9,53 % or 20,5 % or 35,4 %).
11 Precision
11.1 Interlaboratory tests
Details of interlaboratory tests on the precision of the method are summarized in Annex E.
The values derived for these interlaboratory tests may not be applicable to concentration ranges and matrices
other than those given.
11.2 Repeatability
The absolute difference between two independent single test results, obtained using the same method on
identical test material in the same laboratory by the same operator using the same equipment within a short
interval of time, will in not more than 5 % of cases be greater than:
a) 0,1 % mass fraction if the sample contains less than 4 % mass fraction nitrogen; and
b) 2 % mass fraction of the nitrogen content if the sample contains 4 % mass fraction or more nitrogen.
11.3 Reproducibility
The absolute difference between two single test results, obtained using the same method on identical test
material in different laboratories with different operators using different equipment, will in not more than 5 % of
cases be greater than:
a) a mass fraction of 0,17 % if the sample contains less than a mass fraction of 4 % nitrogen; and
b) a mass fraction of 4 % of the nitrogen content if the sample contains a mass fraction of 4 % or more of
nitrogen.
12 Test report
The test report shall contain at least the following information
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16634-1
Première édition
2008-11-01
Produits alimentaires — Détermination de
la teneur en azote total par combustion
selon le principe Dumas et calcul de la
teneur en protéines brutes —
Partie 1:
Graines oléagineuses et aliments des
animaux
Food products — Determination of the total nitrogen content by
combustion according to the Dumas principle and calculation of the
crude protein content —
Part 1: Oilseeds and animal feeding stuffs
Numéro de référence
©
ISO 2008
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Web www.iso.org
Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe. 2
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 3
7 Échantillonnage . 4
8 Préparation de l'échantillon pour essai. 4
9 Mode opératoire . 4
9.1 Généralités . 4
9.2 Prise d'essai . 5
9.3 Contrôle de la demande d'oxygène . 5
9.4 Étalonnage. 5
9.5 Détermination. 5
9.6 Détection et intégration. 6
10 Calcul et expression des résultats. 6
10.1 Calcul . 6
10.1.1 Teneur en azote. 6
10.1.2 Teneur en protéines brutes . 6
10.2 Expression des résultats . 7
11 Fidélité . 7
11.1 Essais interlaboratoires . 7
11.2 Répétabilité. 7
11.3 Reproductibilité. 7
12 Rapport d'essai . 8
Annexe A (informative) Organigramme élémentaire pour la conception d'un appareil de Dumas . 9
Annexe B (informative) Schémas de types d'appareils de Dumas appropriés. 10
Annexe C (informative) Étalonnage du matériel . 13
Annexe D (informative) Exemples de facteurs de conversion pour obtenir la teneur en protéines à
partir de la teneur en azote . 15
Annexe E (informative) Résultat des essais interlaboratoires . 16
Annexe F (informative) Rapport entre l'azote Dumas et l'azote Kjeldahl . 25
Bibliographie . 29
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 16634-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires.
L'ISO 16634 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Produits alimentaires —
Détermination de la teneur en azote total par combustion selon le principe Dumas et calcul de la teneur en
protéines brutes:
⎯ Partie 1: Graines oléagineuses et aliments des animaux
Une partie 2 concernant les céréales, légumineuses et produits céréaliers de mouture est en cours de
préparation.
iv © ISO 2008 – Tous droits réservés
Introduction
Longtemps, la méthode Kjeldahl a été la méthode la plus fréquemment utilisée pour la détermination de la
teneur en protéines des produits alimentaires. Cependant, au cours des dernières années, elle a de plus en
plus souvent été remplacée par la méthode de Dumas qui est plus rapide et n'utilise pas de produits
chimiques dangereux. Bien que les principes des deux méthodes soient différents, toutes deux mesurent la
teneur en azote du produit. Il est possible de convertir l'azote pour obtenir la teneur en protéines à l'aide d'un
facteur approprié. La valeur de ce facteur varie avec les quantités relatives des différentes protéines et leur
composition en acides aminés dans le produit donné.
Ni la méthode de Dumas, ni la méthode Kjeldahl ne distinguent l'azote protéique de l'azote non protéique.
Dans la plupart des cas, les résultats obtenus avec la méthode de Dumas sont légèrement supérieurs à ceux
produits par la méthode Kjeldahl. En effet, la méthode de Dumas mesure presque tout l'azote non protéique
alors que la méthode Kjeldahl n'en mesure qu'une partie.
Compte tenu du fait que la teneur en protéines d'un produit calculée à l'aide des deux méthodes ne fait que se
rapprocher de la valeur vraie, il appartient de décider laquelle est acceptée. La solution la plus appropriée
consiste à utiliser un second facteur afin d'éliminer l'erreur systématique causée par la teneur en azote non
protéique des différents produits. Cependant, ce second facteur est à déterminer pour chaque produit, tout
comme les facteurs existants qui présentent le rapport de la teneur en protéines en fonction de la teneur en
azote.
NORME INTERNATIONALE ISO 16634-1:2008(F)
Produits alimentaires — Détermination de la teneur en azote
total par combustion selon le principe Dumas et calcul de la
teneur en protéines brutes —
Partie 1:
Graines oléagineuses et aliments des animaux
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 16634 spécifie une méthode pour la détermination de la teneur en azote total et le
calcul de la teneur en protéines brutes des graines oléagineuses et des aliments pour animaux.
Cette méthode, comme la méthode Kjeldahl, ne distingue pas l'azote protéique de l'azote non protéique.
Divers facteurs de conversion sont utilisés pour le calcul de la teneur en protéines (voir l'Annexe D).
Cette méthode ne s'applique pas au lait et aux produits laitiers, pour lesquels une méthode est spécifiée dans
[10]
l'ISO 14891⎪FIL 185 .
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 664, Graines oléagineuses — Réduction de l'échantillon pour laboratoire en échantillon pour essai
ISO 665, Graines oléagineuses — Détermination de la teneur en eau et en matières volatiles
ISO 771, Tourteaux de graines oléagineuses — Détermination de la teneur en eau et en matières volatiles
ISO 6496, Aliments des animaux — Détermination de la teneur en eau et en d'autres matières volatiles
ISO 6498, Aliments des animaux — Préparation des échantillons pour essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
teneur en azote
fraction massique de l'azote total, déterminée selon le mode opératoire spécifié dans la présente partie de
l'ISO 16634
NOTE La fraction massique est exprimée en pourcentage.
3.2
teneur en protéines brutes
teneur en azote (3.1) multipliée par un facteur, généralement égal à 6,25
NOTE 1 Une liste d'autres facteurs pouvant être utilisés selon les différents produits est donnée dans l'Annexe D.
NOTE 2 Les facteurs utilisés pour le calcul de la teneur en protéines brutes à partir de la teneur en azote total sont
dérivés de la méthode Kjeldahl qui est la méthode de référence pour la détermination de la teneur en azote total. Étant
donné que la présente méthode utilise les mêmes facteurs que la méthode Kjeldahl, le recours à ces facteurs doit être
vérifié en raison de la légère différence dans les résultats obtenus avec les méthodes Kjeldahl et de Dumas.
4 Principe
Les échantillons sont transformés en gaz par chauffage dans un tube à combustion. Les composants
interférents sont éliminés du mélange gazeux obtenu. Les composés azotés du mélange gazeux ou d'une
partie représentative de ceux-ci sont transformés en azote moléculaire, qui est déterminé quantitativement au
moyen d'un détecteur à conductivité thermique. La teneur en azote de l'échantillon est calculée par un
système informatique.
5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue ou des réactifs d'une pureté équivalente selon
les spécifications des fabricants d'appareils. À l'exception des matériaux de référence (5.12), aucun réactif ne
doit contenir d'azote.
5.1 Gaz vecteur(s): utiliser l'un des gaz en 5.1.1 ou 5.1.2.
5.1.1 Dioxyde de carbone, aussi pur que possible et de fraction volumique minimale, ϕ(CO ) W 99,99 %.
5.1.2 Hélium, aussi pur que possible et de fraction volumique minimale, ϕ(He) W 99,99 %.
5.2 Oxygène, aussi pur que possible et de fraction volumique minimale, ϕ(O ) W 99,99 %.
5.3 Produit absorbant le dioxyde de soufre et les halogènes, afin d'éliminer toute trace de composés
soufrés de l'échantillon [par exemple chromate de plomb (PbCrO ) ou laine d'acier].
5.4 Catalyseur au platine et à l'oxyde de cuivre (matériau de remplissage du tube de postcombustion).
Le catalyseur au platine [(5 % de platine (Pt) sur alumine (Al O )] est mélangé à de l'oxyde de cuivre (CuO)
2 3
dans un rapport de 1:7 ou 1:8, conformément aux recommandations du fabricant.
Afin d'éviter une séparation de ces deux matériaux en raison de leurs masses volumiques en vrac différentes,
il est recommandé de ne pas préparer le mélange avant de remplir le tube. Il est conseillé de verser
simultanément le catalyseur au platine et à l'oxyde de cuivre dans le tube de postcombustion, en utilisant un
entonnoir adapté.
5.5 Laine d'argent ou de cuivre.
Il convient de désagréger la laine d'argent ou de cuivre avant de l'introduire dans le tube de postcombustion
ou de réduction.
5.6 Silice (quartz) ou laine de verre ou ouate, selon ce qui est recommandé par le fabricant d'appareils.
5.7 Cuivre (fils, copeaux, tournures ou poudre) ou tungstène, pour le tube de réduction.
L'utilisation de fils de cuivre peut améliorer la fidélité des résultats analytiques dans le cas d'échantillons à
faibles teneurs en azote (fraction massique de 1 % environ).
2 © ISO 2008 – Tous droits réservés
5.8 Pentoxyde de diphosphore (P O ) ou perchlorate de magnésium en granulés [Mg(ClO ) ] ou autre
2 5 4 2
matériau de support approprié, afin de remplir les tubes de déshydratation.
5.9 Sphères creuses de corindon ou pastilles d'oxyde d'aluminium, pour le tube de combustion.
5.10 Oxyde de cuivre (CuO), comme matériau pour le remplissage du tube de combustion.
5.11 Hydroxyde de sodium (NaOH), sur un matériau de support.
5.12 Composés étalons, par exemple acide aspartique (C H NO ) ou acide éthylènediamine
4 7 4
tétraacétique (C H N O ) ou acide glutamique (C H NO ) ou acide hippurique (C H NO ), ou autres
10 16 2 8 5 9 4 9 9 3
matériaux de référence appropriés de teneur en azote certifiée, connue et constante.
Il convient que le dosage minimal soit de 99 % en fraction massique.
5.13 Éther de pétrole, dont le point d'ébullition est compris entre 30 °C et 60 °C, ou acétone ou éthanol.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Balance analytique, permettant des pesées à 0,000 1 g près.
6.2 Broyeur, adapté à la nature de l'échantillon.
6.3 Tamis, fabriqué dans un matériau non ferreux et de dimension nominale d'ouverture de 800 µm ou
de 1 mm.
6.4 Creusets (par exemple en acier inoxydable, en quartz, en céramique ou en platine) ou capsules en
étain ou papier filtre exempt d'azote, adaptés à l'appareil de Dumas utilisé.
NOTE 1 Un certain nombre d'appareils disponibles dans le commerce sont fournis avec un échantillonneur
automatique.
NOTE 2 Certains échantillons sous forme solide (par exemple des poudres) peuvent être agglomérés sous forme de
pastilles.
1)
6.5 Appareil de Dumas équipé d'un four capable de maintenir une température donnée supérieure ou
égale à 850 °C, d'un détecteur à conductivité thermique et d'un dispositif d'intégration du signal.
Des types d'appareils de Dumas appropriés disponibles sur le marché fonctionnent selon le principe général
donné dans l'Annexe A, malgré certaines disparités de configuration et de composants.
NOTE Les schémas correspondant à trois types d'appareils disponibles sont illustrés, à titre d'exemple, aux
Figures B.1, B.2 et B.3.
Afin d'éviter les fuites, les joints toriques utilisés pour assurer l'étanchéité doivent être légèrement lubrifiés
avec une graisse compatible avec un vide poussé avant d'être mis en place.
L'expérience a montré qu'il est important de nettoyer soigneusement toutes les pièces de silice et la verrerie,
et d'ôter les traces de doigts sur les tubes au moyen d'un solvant approprié (par exemple acétone) avant de
placer ces derniers dans le four.
1) Elementar Analysensysteme GmbH, Sumika Chemical Analysis Service, Ltd et LECO Instruments fabriquent des
appareils appropriés disponibles sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente
Norme internationale et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l‘emploi exclusif des appareils ainsi
désignés. Des appareils équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats.
7 Échantillonnage
Il convient qu'un échantillon représentatif ait été envoyé au laboratoire et qu'il n'ait pas été endommagé ou
modifié au cours du transport ou du stockage.
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l'ISO 16634. Des
[1]
méthodes d'échantillonnage recommandées sont données dans l'ISO 542 pour les graines oléagineuses,
[3]
dans l'ISO 5500 pour les tourteaux de graines oléagineuses, et dans l'ISO 6498 pour les aliments des
animaux.
8 Préparation de l'échantillon pour essai
L'échantillon de laboratoire doit être préparé de façon à obtenir un échantillon pour essai homogène et
représentatif des graines oléagineuses (voir l'ISO 664) ou des aliments des animaux (voir l'ISO 6498).
Broyer l'échantillon de laboratoire à l'aide d'un broyeur approprié (6.2). Généralement, procéder au broyage
sur un tamis (6.3) de dimension nominale d'ouverture de 800 µm pour les échantillons de petite taille
(inférieure à 300 mg) ou un tamis de dimension nominale d'ouverture de 1 mm pour les échantillons de taille
[15]
plus élevée (300 mg ou plus) . Les broyeurs qui produisent des particules aux dimensions répondant aux
spécifications données dans le Tableau 1 donnent des résultats acceptables.
Tableau 1 — Taille de particules requise
Dimension nominale Quantité passant
d'ouverture du tamis à travers le tamis
µm fraction massique en %
710 100
500 95 à 100
200 85 ou moins
Il peut résulter du broyage une perte d'humidité et, par conséquent, il convient d'analyser également la teneur
en humidité de l'échantillon broyé lorsque les valeurs relatives à l'azote et aux protéines sont rapportées à la
matière sèche ou à une base constante d'humidité. La détermination de l'humidité doit être réalisée
conformément à l'ISO 665, à l'ISO 771, ou à l'ISO 6496.
L'efficacité du broyeur peut être vérifiée en préparant un échantillon en double d'un mélange broyé de maïs et
de graines de soja dans un rapport de 2+1. Il convient que le coefficient de variation théorique soit inférieur à
2 % en fraction massique.
9 Mode opératoire
9.1 Généralités
Suivre attentivement les instructions du fabricant concernant l'installation, l'optimisation, l'étalonnage et
l'utilisation de l'appareil. Mettre l'appareil en position de marche et le laisser se stabiliser comme défini dans
les modes opératoires locaux.
Il convient de réaliser un essai de performance de l'appareil tous les jours, à l'aide du matériau de référence
(5.12). Il convient que le dosage minimal d'azote soit > 99,0 % en fraction massique.
4 © ISO 2008 – Tous droits réservés
9.2 Prise d'essai
Peser, à 0,000 1 g près, au moins 0,1 g de l'échantillon pour essai dans un creuset ou une capsule en étain
ou du papier filtre exempt d'azote (6.4). Pour les échantillons à faible teneur en protéines (fraction
massique < 1 %), la quantité de prise d'essai peut aller jusqu'à 3,5 g, selon le type d'appareil de Dumas
utilisé et la nature de la prise d'essai.
En fonction du type de matériel utilisé, si les échantillons contiennent une fraction massique de plus de 17 %
d'humidité, il peut être nécessaire de les sécher avant l'analyse.
Des masses plus faibles peuvent être nécessaires dans le cas d'échantillons à très forte teneur en protéines
ou lorsque seulement de très petites quantités d'échantillon sont disponibles. Dans le cas de masses
inférieures à 0,1 g, une validation doit être réalisée.
9.3 Contrôle de la demande d'oxygène
Contrôler la demande d'oxygène, en particulier le débit, conformément aux instructions du fabricant du
matériel.
Réaliser autant de déterminations à blanc que nécessaire pour de stabiliser le matériel en utilisant pour
chacune une masse équivalente de saccharose à la place de l'échantillon, chaque ensemble de
déterminations de l'azote ou des protéines étant destiné à simuler l'échantillon pour essai à analyser. Le blanc
à base de saccharose fournit la quantité d'azote qui est apportée par les gaz atmosphériques et est piégée
dans une source de matière organique en poudre. Utiliser la valeur moyenne des déterminations à blanc
atmosphériques comme une correction d'erreur dans le calcul de la détermination de l'azote ou des protéines
de chaque échantillon pour essai.
9.4 Étalonnage
Utiliser des composés purs dont la teneur en azote est connue et constante, par exemple l'acide aspartique
(5.12), comme étalons pour l'étalonnage à long terme de l'appareil. Effectuer deux analyses de trois
composés purs, chacun à trois concentrations différentes, choisies selon la plage de mesure des échantillons
réels.
Pour l'élaboration de la courbe d'étalonnage, choisir le composé et sa quantité de façon à pouvoir détecter
une quantité absolue d'azote en rapport avec les matrices à analyser. Pour l'étalonnage, il convient d'utiliser
(au minimum) cinq échantillons étalons selon la gamme des matrices analysées.
Pour des quantités d'azote supérieures à 200 mg, la courbe d'étalonnage est théoriquement non linéaire.
Dans cette section non linéaire, l'étalonnage peut être réalisé en plusieurs segments de taille réduite. Afin de
garantir la qualité de l'étalonnage dans cette gamme, il convient de faire des ajouts aux échantillons étalons
par paliers de 1 mg à 5 mg d'azote.
L'étalonnage peut également être effectué à l'aide de solutions étalons aqueuses.
Vérifier l'étalonnage au moins trois fois au début de la série de déterminations, puis tous les 15 à
25 échantillons, en analysant soit l'un des étalons en double, soit un échantillon de valeur connue. La valeur
obtenue doit être inférieure à 0,05 % en fraction massique d'azote de la valeur théorique. Dans le cas
contraire, analyser les échantillons à nouveau après avoir vérifié les performances de l'appareil.
9.5 Détermination
L'appareil étant en marche et stabilisé, y introduire la prise d'essai conformément aux instructions du
fabricant.
Pendant l'analyse, les processus suivants se déroulent dans l'appareil (voir les Figures B.1, B.2 ou B.3).
La prise d'essai est soumise à une combustion quantitative dans des conditions normalisées, à une
température minimale de 850 °C, en fonction de l'appareil et du matériau en cours d'analyse.
Les produits volatils issus de la décomposition (principalement azote moléculaire, oxydes d'azote, dioxyde de
carbone et eau) sont transportés par le gaz vecteur (5.1) à travers l'appareil.
Les oxydes d'azote sont réduits en azote moléculaire et l'oxygène en excès est retenu sur le cuivre ou le
tungstène dans la colonne de réduction (5.7).
L'eau est éliminée au moyen d'un condenseur rempli de perchlorate de magnésium, de pentoxyde de
diphosphore ou d'autres agents de déshydratation (5.8). À moins que le dioxyde de carbone ne soit utilisé
comme gaz vecteur (5.1.1), il est éliminé après passage sur un matériau absorbant approprié, par exemple de
l'hydroxyde de sodium sur un matériau de support (5.11).
Les composés interférents (par exemple les gaz halogènes et les composés soufrés volatils) sont éliminés au
moyen de matériaux absorbants (5.3) ou de matériaux de rétention [par exemple de la laine d'argent (5.5) ou
de l'hydroxyde de sodium sur un matériau de support approprié (5.11)].
L'azote présent dans le mélange gazeux résiduel contenant l'azote et le gaz vecteur est acheminé à travers
un détecteur à conductivité thermique.
9.6 Détection et intégration
Une cellule à conductivité thermique sensible, optimisée pour le gaz vecteur employé et pouvant être munie
d'un système de mise à zéro automatique entre les mesurages des prises d'essai individuelles, est utilisée
pour la détermination quantitative d'azote. Après amplification et conversion analogique-numérique du signal
fourni par le détecteur, les données obtenues sont traitées par un ordinateur périphérique.
10 Calcul et expression des résultats
10.1 Calcul
10.1.1 Teneur en azote
Les résultats indiquant la teneur en azote total, w , en fraction massique, exprimée en pourcentage, sont
N
généralement fournis par les sorties sur imprimante des appareils.
10.1.2 Teneur en protéines brutes
Le facteur de correction, F est obtenu à l'aide de l'Équation (1):
c
100 − w
HO,1
F = (1)
c
100 − w
HO,2
où
w est la fraction massique d'humidité, exprimée en pourcentage, avant broyage;
H O,1
w est la fraction massique d'humidité, exprimée en pourcentage, après broyage.
H O,2
La teneur en protéines brutes, w , en fraction massique, exprimée en pourcentage, est obtenue à l'aide de
p
l'Équation (2):
w = w F F (2)
p N c
6 © ISO 2008 – Tous droits réservés
où
w est la valeur numérique de la teneur en azote, en fraction massique, exprimée en pourcentage, de
N
l'échantillon à sa teneur en humidité naturelle;
F est le rapport généralement reconnu pour le produit analysé, égal à 6,25 pour les aliments des
animaux (voir l'Annexe D).
Au besoin, la teneur en protéines brutes, w , en fraction massique de la matière sèche, exprimée en
pd
pourcentage, peut être calculée à l'aide de l'Équation (3):
100w
p
w = (3)
pd
100 − w
HO
où w est la teneur en humidité en fraction massique, exprimée en pourcentage, déterminée conformément
HO
à l'ISO 665, à l'ISO 771, ou à l'ISO 6496.
10.2 Expression des résultats
Exprimer les résultats avec trois chiffres significatifs (par exemple 9,53 % ou 20,5 % ou 35,4 %).
11 Fidélité
11.1 Essais interlaboratoires
Les détails d'essais interlaboratoires relatifs à la fidélité de la méthode sont résumés dans l'Annexe E.
Les valeurs dérivées de ces essais interlaboratoires peuvent ne pas être applicables à des gammes de
concentrations ou à des matrices autres que celles données.
11.2 Répétabilité
La différence absolue entre deux résultats d'essai individuels indépendants, obtenus par la même méthode,
sur un matériel d'essai identique, dans le même laboratoire, par le même opérateur utilisant le même
équipement pendant un court intervalle de temps, ne sera pas supérieure dans plus de 5 % des cas à:
⎯ une fraction massique de 0,1 % si l'échantillon contient une fraction massique inférieure à 4 % d'azote, et
⎯ une fraction massique de 2 % de la teneur en azote si l'échantillon contient une fraction massique égale
ou supérieure à 4 % d'azote.
...
Questions, Comments and Discussion
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