ISO 15213-2:2023
(Main)Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Clostridium spp. — Part 2: Enumeration of Clostridium perfringens by colony-count technique
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Clostridium spp. — Part 2: Enumeration of Clostridium perfringens by colony-count technique
This document specifies the enumeration of Clostridium (C.) perfringens by colony-count technique. This document is applicable to: — products intended for human consumption; — products for feeding animals; — environmental samples in the area of food and feed production and handling; — samples from the primary production stage. NOTE This method has been validated in an interlaboratory study for the following food categories: — ready-to-eat, ready-to-reheat meat products; — eggs and egg products (derivates); — processed fruits and vegetables; — infant formula and infant cereals; — multi-component foods or meal components. It has also been validated for the following other categories: — pet food and animal feed; — environmental samples (food or feed production). As this method has been validated for at least five food categories, this method is applicable for a broad range of food. For detailed information on the validation, see Clause 11 and Annex C. Since the method is not commonly used for samples in the primary production stage, this category was not included in the interlaboratory study. Therefore, no performance characteristics were obtained for this category. This horizontal method was originally developed for the examination of all samples belonging to the food chain. Based on the information available at the time of publication of this document, this method is considered to be fully suited to the examination of all samples belonging to the food chain. However, because of the large variety of products in the food chain, it is possible that this horizontal method is not appropriate in every detail for all products. Nevertheless, it is expected that the required modifications are minimized so that they do not result in a significant deviation from this horizontal method. This technique is suitable for, but not limited to, the enumeration of microorganisms in test samples with a minimum of 10 colonies counted on a plate. This corresponds to a level of contamination that is expected to be higher than 10 cfu/ml for liquid samples or higher than 100 cfu/g for solid samples.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Clostridium spp. — Partie 2: Dénombrement de Clostridium perfringens par la technique de comptage des colonies
Le présent document spécifie le dénombrement de Clostridium (C.) perfringens par la technique de comptage des colonies. Le présent document s’applique: — aux produits destinés à la consommation humaine; — aux produits destinés à l’alimentation animale; — aux échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la distribution des aliments; — aux échantillons issus du stade de la production primaire. NOTE Cette méthode a été validée dans le cadre d’une étude interlaboratoires pour les catégories d’aliments suivantes: — les produits à base de viande prêts à consommer et prêts à réchauffer; — les œufs et ovoproduits (dérivés); — les fruits et légumes transformés; — les préparations et céréales pour nourrissons; — les aliments composés et les composants de repas. Elle a également été validée pour les autres catégories suivantes: — les produits destinés à l’alimentation animale et les aliments pour animaux; — les échantillons environnementaux (production d’aliments ou d’aliments pour animaux). Cette méthode ayant été validée pour au moins cinq catégories d’aliments, elle s’applique à un large éventail d’aliments. Pour des informations détaillées sur la validation, voir l’Article 11 et l’Annexe C. Étant donné que cette méthode n’est pas couramment utilisée pour les échantillons au stade de la production primaire, cette catégorie n’a pas été incluse dans l’étude interlaboratoires. Par conséquent, aucune caractéristique de performance n’a été déterminée pour cette catégorie. Cette méthode horizontale a été initialement développée pour l’examen de tous les échantillons provenant de la chaîne alimentaire. Sur la base des informations disponibles au moment de la publication du présent document, cette méthode est considérée comme parfaitement adaptée à l’examen de tous les échantillons provenant de la chaîne alimentaire. Cependant, en raison de la grande diversité des produits de la chaîne alimentaire, il est possible que cette méthode horizontale ne soit pas appropriée dans ses moindres détails à tous les produits. Néanmoins, il est attendu que les modifications requises soient réduites au minimum afin qu’elles n’entrainent pas de déviation significative de cette méthode horizontale. Cette technique est adaptée, sans toutefois s’y limiter, au dénombrement des micro-organismes dans les échantillons d’essai avec un minimum de 10 colonies dénombrées par boîte. Cela correspond à un niveau de contamination attendu supérieur à 10 UFC/ml pour les échantillons liquides ou supérieur à 100 UFC/g pour les échantillons solides.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15213-2
First edition
2023-11
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the detection
and enumeration of Clostridium
spp. —
Part 2:
Enumeration of Clostridium
perfringens by colony-count technique
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
la recherche et le dénombrement de Clostridium spp. —
Partie 2: Dénombrement de Clostridium perfringens par la technique
de comptage des colonies
Reference number
© ISO 2023
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction . vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 2
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 3
4.1 General . 3
4.2 Preparation of dilutions . 3
4.3 Enumeration . 3
4.4 Confirmation . 3
5 Culture media and reagents .4
6 Equipment and consumables .4
7 Sampling . 4
8 Preparation of test sample . 5
9 Procedure .5
9.1 General . 5
9.2 Test portion, initial suspension and dilutions . 5
9.3 Heat treatment to select spores . 5
9.4 Inoculation and incubation. 6
9.5 Enumeration of typical colonies . 6
9.6 Confirmation of C. perfringens . 7
9.6.1 Selection of colonies for confirmation . 7
9.6.2 Acid phosphatase test . 7
9.6.3 Sulfite indole motility (SIM) agar test . 7
9.6.4 Differentiation between human pathogenic and non-pathogenic
C. perfringens strains (optional) . 8
9.6.5 Interpretation . 8
10 Expression of results . 8
11 Validation of the method . 8
11.1 Interlaboratory study . 8
11.2 Performance characteristics . 8
12 Test report . 9
13 Quality assurance .10
Annex A (normative) Flow diagram of the procedure .11
Annex B (normative) Culture media and reagents .13
Annex C (informative) Method validation studies and performance characteristics .18
Annex D (informative) Molecular differentiation between pathogenic and non-pathogenic
C. perfringens .21
Bibliography .43
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use
of (a) patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed
patent rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received
notice of (a) patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are
cautioned that this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent
database available at www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all
such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 463, Microbiology of the food chain, in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This first edition of ISO 15213-2 cancels and replaces ISO 7937:2004, which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— the Scope has been expanded to samples from the primary production stage;
— the heat treatment of 10 min at 80 °C has been made optional, in the case of high background flora
or for the enumeration of only spores of Clostridium (C.) perfringens present in the sample;
— the selective medium has been re-named from sulfite-cycloserine agar (SC) to tryptose sulfite
cycloserine agar (TSC agar) without changes in the formulation;
— the confirmation methods described have been modified according to ISO 14189;
— the flow diagram in normative Annex A giving a short description of the procedure has been revised;
— in Annex B, criteria for the performance testing of culture media have been added;
— in Annex C (informative), the performance characteristics have been added;
— in Annex D (informative), two molecular methods have been added for differentiation between
pathogenic and non-pathogenic C. perfringens and one molecular method for the differentiation of
C. perfringens type A strains carrying a chromosomally encoded cpe gene or a plasmid encoded cpe
gene.
iv
A list of all parts in the ISO 15213 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
v
Introduction
Clostridium (C.) perfringens is a Gram-positive, anaerobic, spore-forming bacterium. As a ubiquitous
bacterium, C. perfringens is predominantly found in soil, but also in the intestinal tract of humans and
animals. Therefore, the presence of C. perfringens in high numbers can be an indication of inadequate
preparation or handling of food.
High numbers of C. perfringens in ready-to-eat-food can cause human illness, mainly diarrhoea. The
strains are classified into toxin types, depending on the ability to produce different so called “major”
and “minor” toxins. Food poisonings are caused by C. perfringens isolates with the ability to produce
C. perfringens enterotoxin (CPE).
A characteristic feature is the heat resistance of the spores; they have the ability to germinate and
multiply in ready-to-eat food after the cooking process. Ingestion of contaminated food is followed
by gastrointestinal disease, when enzyme-resistant C. perfringens enterotoxins are set free during
sporulation in the small intestine. The strains are classified into different types.
This document describes the horizontal method for the enumeration of C. perfringens in food,
feed, environmental samples and samples from the primary production stage. The method for the
enumeration of sulfite-reducing Clostridium spp. is described in ISO 15213-1. The method for the
detection of C. perfringens is described in ISO/TS 15213-3. These three parts are published as a series
of International Standards because the methods are closely linked to each other. These methods are
often conducted in association with each other in a laboratory and the media and their performance
characteristics can be similar.
The main technical changes listed in the Foreword, introduced in this document compared with
ISO 7937:2004, are considered as major (see ISO 17468).
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 15213-2
Première édition
2023-11
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche et le dénombrement
de Clostridium spp. —
Partie 2:
Dénombrement de Clostridium
perfringens par la technique de
comptage des colonies
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection
and enumeration of Clostridium spp. —
Part 2: Enumeration of Clostridium perfringens by colony-count
technique
Numéro de référence
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CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .2
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 3
4.1 Généralités . 3
4.2 Préparation des dilutions . 3
4.3 Dénombrement . 3
4.4 Confirmation . 4
5 Milieux de culture et réactifs .4
6 Équipement et consommables . 4
7 Échantillonnage .5
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 5
9 Mode opératoire . 5
9.1 Généralités . 5
9.2 Prise d’essai, suspension mère et dilutions . 5
9.3 Traitement thermique pour la sélection des spores . 6
9.4 Ensemencement et incubation . . 6
9.5 Dénombrement des colonies caractéristiques . 7
9.6 Confirmation de C. perfringens . . 7
9.6.1 Sélection des colonies à confirmer . 7
9.6.2 Essai à la phosphatase acide . 8
9.6.3 Essai sur gélose SIM (mobilité indole sulfite) . 8
9.6.4 Différenciation entre souches de C. perfringens pathogènes et non
pathogènes pour l’Homme (facultatif) . 8
9.6.5 Interprétation . 8
10 Expression des résultats . 8
11 Validation de la méthode . 9
11.1 Étude interlaboratoires . 9
11.2 Caractéristiques de performance . 9
12 Rapport d’essai .10
13 Assurance qualité .10
Annexe A (normative) Logigramme du mode opératoire .11
Annexe B (normative) Milieux de culture et réactifs .13
Annexe C (informative) Études de validation de la méthode et caractéristiques
de performance .19
Annexe D (informative) Différenciation moléculaire entre C. perfringens pathogènes et
non pathogènes.22
Bibliographie . 44
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner
l’utilisation d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et
à l’applicabilité de tout droit de propriété revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent
document, l’ISO n’avait pas reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa
mise en application. Toutefois, il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent
document que des informations plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de
brevets, disponible à l’adresse www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de brevets.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/iso/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la chaîne
alimentaire, du Comité européen de normalisation (CEN), conformément à l’Accord de coopération
technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette première édition de l’ISO 15213-2 annule et remplace l’ISO 7937:2004, qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— le Domaine d’application a été élargi aux échantillons prélevés au stade de la production primaire;
— le traitement thermique de 10 min à 80 °C est à présent facultatif, il est appliqué si la flore annexe
est élevée ou pour le dénombrement uniquement des spores de Clostridium (C.) perfringens dans
l’échantillon;
— le milieu sélectif précédemment appelé «gélose sulfite à la cyclosérine (SC)» est à présent appelé
«gélose tryptose-sulfite à la cyclosérine (gélose TSC)» sans changement de formulation;
— les méthodes de confirmation décrites ont été modifiées conformément à l’ISO 14189;
— le logigramme à l’Annexe A normative qui donne une brève description du mode opératoire a été
révisé;
— les critères pour les essais de performance du milieu de culture ont été ajoutés à l’Annexe B;
— les caractéristiques de performance ont été ajoutées à l’Annexe C (informative);
iv
— à l’Annexe D (informative), deux méthodes moléculaires ont été ajoutées pour une différenciation
entre les C. perfringens pathogènes et les C. perfringens non pathogènes, et une méthode moléculaire
est décrite pour la différenciation des souches de type A de C. perfringens portant un gène cpe codé
sur le matériel chromosomique de celles portant un gène cpe codé sur les plasmides.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 15213 se trouve sur le site Web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
v
Introduction
Clostridium (C.) perfringens est une bactérie à coloration de Gram-positive, anaérobie, qui forme des
spores. S’agissant d’une bactérie ubiquitaire, C. perfringens se retrouve principalement dans le sol,
mais elle se retrouve également dans le tube digestif des humains et des animaux. La présence d’un
nombre élevé de C. perfringens peut donc indiquer une préparation ou une manipulation inadéquate des
produits alimentaires.
Un nombre élevé de C. perfringens dans les aliments prêts à consommer peut provoquer des maladies
chez l’Homme, qui se traduisent essentiellement par une diarrhée. Les souches sont classées par type
toxinique, selon leur capacité à produire des toxines dites «majeures» et «mineures». Les toxi-infections
alimentaires sont causées par des isolats de C. perfringens qui produisent l’entérotoxine C. perfringens
(CPE).
Un élément caractéristique est la thermorésistance des spores: elles ont la capacité de germer et de se
multiplier dans les aliments prêts à consommer après le processus de cuisson. L’ingestion d’aliments
contaminés est suivie d’une maladie gastro-intestinale lorsque les entérotoxines enzymo-résistantes
de C. perfringens sont
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.