ISO 7937:2004

NORME ISO
INTERNATIONALE 7937
Troisième édition
2004-08-15
Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour le dénombrement de
Clostridium perfringens — Technique par
comptage des colonies
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for
the enumeration of Clostridium perfringens — Colony-count technique

Numéro de référence
©
ISO 2004
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.

©  ISO 2004
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax. + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2004 – Tous droits réservés

Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives. 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 2
5 Diluant, milieux de culture et réactifs . 2
6 Appareillage et verrerie. 7
7 Échantillonnage. 8
8 Préparation de l'échantillon pour essai. 8
9 Mode opératoire. 8
10 Expression des résultats. 10
11 Rapport d'essai. 12
Annexe A (informative) Résultats d'essai interlaboratoires. 13
Bibliographie . 17

Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 7937 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 7937:1997, EN 13401:1999), qui a fait
l'objet d'une révision technique.
iv © ISO 2004 – Tous droits réservés

Introduction
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est possible que cette méthode horizontale ne
convienne pas exactement, dans tous ses détails, pour certains produits pour lesquels il peut être nécessaire
d'employer des méthodes différentes ou spécifiques à ces produits si cela est absolument nécessaire pour
des raisons techniques justifiées. Néanmoins, il convient que tous les efforts soient faits pour appliquer cette
méthode horizontale chaque fois que ce sera possible.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminée, il sera tenu compte de tous les renseignements
disponibles à ce moment-là, à savoir dans quelle mesure cette méthode horizontale aura été suivie et les
raisons pour lesquelles il aura été nécessaire d'y déroger dans le cas de produits particuliers.
L'harmonisation des méthodes d'essai ne peut être réalisée de façon immédiate et, pour certains groupes de
produits, des Normes internationales et/ou des normes nationales qui ne concordent pas avec cette méthode
horizontale, existent peut-être déjà. Lorsque de telles normes viendront en révision, il serait souhaitable de les
aligner sur la présente Norme internationale, si bien que, finalement, les seules divergences restantes seront
celles qui sont nécessaires pour des raisons techniques bien établies.

NORME INTERNATIONALE ISO 7937:2004(F)

Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le
dénombrement de Clostridium perfringens — Technique par
comptage des colonies
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale décrit une méthode horizontale pour le dénombrement des Clostridium
perfringens revivifiables. La présente norme est applicable
 aux produits pour l'alimentation humaine et animale, et
 aux échantillons d'environnement pour la production et la distribution des aliments.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de
la suspension mère et des dilutions décimales
ISO 6887-2, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 2: Règles spécifiques pour la préparation
des viandes et produits à base de viande
ISO 6887-3, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 3: Règles spécifiques pour la préparation
des produits de la pêche
ISO 6887-4, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 4: Règles spécifiques pour la préparation de
produits autres que les produits laitiers, les produits carnés et les produits de la pêche
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Règles générales pour les examens microbiologiques
ISO 8261, Lait et produits laitiers — Lignes directrices générales pour la préparation des échantillons pour
essai, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
ISO TS 11133-1, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 1: Guide général pour l'assurance de la qualité pour la préparation des milieux de culture en
laboratoire
ISO TS 11133-2 Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 2: Guide général pour les essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins de la présente Norme internationale, les définitions suivantes s'appliquent.
3.1
Clostridium perfringens
C. perfringens
bactéries qui forment des colonies caractéristiques (précipité noir, causé par la réduction du sulfite en sulfure
qui colore les colonies en noir) dans le milieu sélectif spécifié et qui donnent des réactions de confirmation
positives lorsque l'essai est effectué par l'une des deux méthodes spécifiées dans la présente Norme
internationale
3.2
dénombrement de C. perfringens
détermination du nombre de bactéries Clostridium perfringens que l'on peut mettre en culture et confirmées
par millilitre ou par gramme d'échantillon lorsque l'essai est effectué conformément à la méthode spécifiée
dans la présente Norme internationale
4 Principe
4.1 Des boîtes de Petri sont ensemencées avec une quantité déterminée de l'échantillon pour essai si le
produit à examiner est liquide, ou avec une quantité déterminée de la suspension mère dans le cas d'autres
produits.
D'autres boîtes de Petri sont ensemencées, dans les mêmes conditions, en utilisant des dilutions décimales
obtenues à partir de l'échantillon pour essai ou de la suspension mère.
Un milieu sélectif est ajouté (technique d'ensemencement dans la masse) puis une couche du même milieu
est ajoutée par le dessus.
4.2 Les boîtes sont incubées en anaérobiose à 37 °C pendant 20 h ± 2 h.
4.3 Les colonies caractéristiques sont dénombrées.
4.4 La quantité de colonies caractéristiques est confirmée et le nombre de C. perfringens par millilitre ou
par gramme d'échantillon est calculé.
5 Diluant, milieux de culture et réactifs
Voir l'ISO 7218, l'ISO/TS 11133-1 et l'ISO/TS 11133-2. Pour la préparation, la production et le contrôle des
milieux de culture.
5.1 Diluant
Voir la partie pertinente de l'ISO 6887 ou l'ISO 8261.
5.2 Gélose tryptose-Sulfite à la cyclosérine (SC)
NOTE SC était désigné à l'origine comme «egg-yolk-free TSC» (TSC exempt de jaune d'œuf), (voir [1]).
2 © ISO 2004 – Tous droits réservés

5.2.1 Milieu de base
5.2.1.1 Composition
Digestat enzymatique de protéine 15,0 g
Digestat enzymatique de Soja 5,0 g
Extrait de levure 5,0 g
Bisulfite disodique (Na S O ), anhydre 1,0 g
2 2 5
a
Citrate de fer(III) ammoniacal 1,0 g
b
Agar 9,0 g à 18,0 g
Eau 1 000 ml
a
Il convient que ce réactif contienne au moins 15 % (en fraction massique) de fer.
b
Selon le pouvoir gélifiant de l'agar.

5.2.1.2 Préparation
5.2.1.2.1 Dissoudre les composants dans l'eau, en portant à ébullition. Ajuster le pH de sorte qu'après
stérilisation, il soit de 7,6 ± 0,2 à 25 °C. Répartir le milieu de base dans des flacons ou des fioles de capacité
appropriée. Stériliser pendant 15 min à 121 °C. Conserver au réfrigérateur à 5 °C ± 3 °C. Éliminer le milieu
inutilisé deux semaines après sa préparation.
5.2.1.2.2 Dans certains cas (voir 9.4.3.1), il est nécessaire de préparer des boîtes de milieu de base SC en
vue de la confirmation utilisant le milieu nitrate motilité (5.5) et le milieu lactose gélatine (5.8). Pour ce faire,
transférer des quantités d'environ 15 ml de milieu [refroidis à approximativement 44 °C à 47 °C à l'aide du
bain d'eau (6.10)] dans des boîtes de Petri. Laisser solidifier. Sécher les boîtes juste avant leur utilisation (voir
l'ISO 7218).
5.2.2 Solution de D-Cyclosérine
5.2.2.1 Composition
a
D-Cyclosérine 4,0 g
Eau 100 ml
a
Utiliser uniquement de la poudre blanche cristalline.

5.2.2.2 Préparation
Dissoudre la D-cyclosérine dans l'eau et stériliser la solution par filtration.
Conserver au réfrigérateur à 3 °C ± 2 °C.
Éliminer la solution inutilisée quatre semaines après sa préparation.
5.2.3 Milieu complet
Immédiatement avant de commencer la méthode d'ensemencement dans la masse (voir 9.2), ajouter 1 ml de
la solution de D-cyclosérine (5.2.2) pour chaque 100 ml de milieu de base stérile (5.2.1) fondu et refroidi entre
44 °C et 47 °C.
5.2.4 Essai de performance pour l'assurance qualité du milieu
Pour la définition de la sélectivité et de la productivité se référer à l'ISO/TS 11133-2. Pour vérifier les
performances, se référer à l' ISO/TS 11133-2:2003, Tableau B.1 [voir TS(C)].
5.3 Milieu thioglycolate liquide
5.3.1 Composition
Digestat enzymatique de caséine 15,0 g
L-Cystine 0,5 g
D-Glucose 5,5 g
Extrait de levure 5,0 g
Chlorure de sodium 2,5 g
Thioglycolate de sodium (mercaptoacétate) 0,5 g
a
Agar-agar
0,5 g à 2,0 g
Résazurine 0,001 g
Eau 1 000 ml
a
Selon le pouvoir gélifiant de l'agar.

5.3.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l'eau en portant à ébullition (si nécessaire). Ajuster le pH de sorte qu'après
stérilisation il soit de 7,1 ± 0,2 à 25 °C.
Répartir le milieu dans des tubes par quantités de 10 ml et stériliser à 121 °C pendant 15 min.
Avant l'emploi ce milieu doit être désaéré.
5.3.3 Essai de performance pour l'assurance qualité du milieu thioglycolate
Pour la définition de la sélectivité et de la productivité se référer à l'ISO/TS 11133-2. Pour vérifier les
performances, se référer à l'ISO TS/11133-2:2003, Tableau B.4.
5.4 Milieu lactose sulfite (LS) (facultatif)
5.4.1 Milieu de base
5.4.1.1 Composition
Digestat enzymatique de caséine 5,0 g
Extrait de levure 2,5 g
Chlorure de sodium 2,5 g
Lactose 10 g
Hydrochlorure de L-Cystéine 0,3 g
Eau 1 000 ml
4 © ISO 2004 – Tous droits réservés

5.4.1.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l'eau, en portant à ébullition (si nécessaire). Ajuster le pH de sorte qu'après
stérilisation il soit de 7,1 ± 0,2 à 25 °C.
Répartir le milieu par quantités de 8 ml dans des tubes à essai ou des flacons d'essai contenant des cloches
de Durham inversées (6.7) et stériliser à 121 °C pendant 15 min.
Le milieu peut être conservé au plus quatre semaines à 3 °C ± 2 °C.
5.4.2 Solution de bisulfite disodique anhydre
5.4.2.1 Composition
Bisulfite disodique (Na S O ) anhydre 1,2 g
2 2 5
Eau 100 ml
5.4.2.2 Préparation
Dissoudre le bisulfite disodique dans l'eau et stériliser la solution par filtration.
Utiliser la solution dans la journée.
5.4.3 Solution de citrate de fer(III) ammoniacal
5.4.3.1 Composition
Citrate de fer(III) ammoniacal 1 g
Eau 100 ml
5.4.3.2 Préparation
Dissoudre le citrate de fer(III) ammoniacal dans l'eau et stériliser la solution par filtration.
Utiliser la solution dans la journée.
5.4.4 Milieu complet
Si le milieu n'est pas utilisé le jour de sa préparation, désaérer le milieu juste avant l'achèvement par
chauffage et refroidir ensuite rapidement. Si le milieu est contenu dans des flacons avec bouchon à vis,
desserrer les bouchons avant chauffage et les resserrer avant refroidissement.
Ajouter ensuite 0,5 ml de la solution de bisulfite disodique (5.4.2) et 0,5 ml de la solution de citrate de fer(III)
ammoniacal (5.4.3) à chaque 8 ml du milieu de base (5.4.1).
Utiliser le milieu complet le jour de sa préparation.
5.5 Milieu nitrate motilité (facultatif)
5.5.1 Composition
Digestat enzymatique de caséine 5,0 g
Extrait de viande 3,0 g
Galactose 5,0 g
Glycérol 5,0 g
Nitrate de potassium (KNO) 1,0 g
Orthohydrogénophosphate disodique (Na HPO) 2,5 g
2 4
a
Agar 1,0 g to 5,0 g
Eau 1 000 ml
a
Selon le pouvoir gélifiant de l'agar.

5.5.2 Préparation
Dissoudre les composants dans l'eau, en portant à ébullition. Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit
de 7,3 ± 0,2 à 25 °C.
Répartir le milieu par quantités de 10 ml dans des tubes à essais et stériliser à 121 °C pendant 15 min. Si le
milieu n'est pas utilisé dans la journée, le conserver au réfrigérateur à 5 °C ± 3 °C. Juste avant l'emploi,
chauffer dans l'eau bouillante ou sous un courant de vapeur pendant 15 min, puis le refroidir rapidement à la
température d'incubation.
Éliminer le milieu inutilisé quatre semaines après sa préparation.
5.6 Réactif pour la recherche des nitrites (facultatif)
5.6.1 Solution d'acide amino-5-naphtalène-2-sulphonique (5-2-ANSA)
Dissoudre 0,1 g de 5-2-ANSA dans 100 ml de solution d'acide acétique à 15 % (en fraction volumique). Filtrer
sur papier-filtre.
Conserver dans un flacon de verre brun bien bouché (de préférence muni d'un compte-gouttes) à 5 °C ± 3 °C.
5.6.2 Solution d'acide sulfanilique
Dissoudre 0,4 g d'acide sulfanilique dans 100 ml de solution d'acide acétique à 15 % (en fraction volumique).
Filtrer sur papier-filtre.
Conserver dans un flacon de verre brun bien bouché (de préférence muni d'un compte-gouttes) à 5 °C ± 3 °C.
5.6.3 Préparation du réactif complet
Mélanger, en quantités équivalentes les deux solutions (5.6.1 et 5.6.2) immédiatement avant usage. Éliminer
la solution inutilisée.
5.7 Zinc pulvérulent (facultatif)
6 © ISO 2004 – Tous droits réservés

5.8 Milieu lactosé à la gélatine (facultatif)
5.8.1 Composition
Digestat enzymatique de caséine 15,0 g
Extrait de levure 10,0 g
Lactose 10,0 g
Gélatine 120,0 g
Rouge de phénol 0,05 g
Eau 1 000 ml
5.8.2 Préparation
Dissoudre les composants, à l'exception du rouge de phénol et du lactose, dans l'eau. Ajuster le pH de sorte
qu'après stérilisation il soit de 7,5 ± 0,2 à 25 °C.
Ajouter le rouge phénol et le lactose. Répartir le milieu par quantités de 10 ml dans des tubes à essais et
stériliser à 121 °C pendant 15 min. Si le milieu n'est pas utilisé dans la journée, le conserver au réfrigérateur à
5 °C ± 3 °C.
Juste avant l'emploi, chauffer dans l'eau bouillante ou sous un courant de vapeur pendant 15 min, puis le
refroidir rapidement à la température d'incubation.
Éliminer le milieu inutilisé trois semaines après sa préparation.
6 Appareillage et verrerie
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l'ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave).
Voir l'ISO 7218.
6.2 Étuve, réglable à 37 °C ± 1 °C.
6.3 Jarres à atmosphère modifiable, ou tout autre appareillage approprié pour la culture en anaérobiose.
6.4 pH-mètre, ayant une précision de lecture de ± 0,01 unité pH à 25 °C, permettant de réaliser des
mesures précises à 0,1 unité pH.
6.5 Anses bouclées, en platine iridié ou en nickel-chrome, d'environ 3 mm de diamètre et fil à
ensemencer de même matériau, ou anses bouclées stériles jetables et fils à ensemencer équivalents.
6.6 Appareil de filtration, pour la stérilisation des solutions.
6.7 Tubes à essais, flacons ou fioles, de capacité appropriée, dont des tubes à essais de
16 mm × 160 mm munis de cloches de Durham inversées, par exemple de 35 mm de longueur et de 7 mm de
diamètre.
6.8 Pipettes graduées à écoulement total ou micropipettes, de 1 ml et 10 ml de capacités nominales,
graduées respectivement en intervalles de 0,1 ml et 0,5 ml.
6.9 Boîtes de Petri, en verre ou en plastique, de 90 mm à 100 mm de diamètre.
6.10 Bains d'eau, ou disposit
...