ISO 12966-4:2026
(Main)Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 4: Determination by capillary gas chromatography
Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 4: Determination by capillary gas chromatography
This document specifies a method for the determination of fatty acid methyl esters (FAMEs) derived by transesterification or esterification from fats, oils, and fatty acids by capillary gas chromatography (GLC). FAMEs from C4 to C24 can be separated using this document including saturated FAMEs, cis- and trans-monounsaturated FAMEs, and cis- and trans-polyunsaturated FAMEs. This document is applicable to crude, refined, partially hydrogenated or fully hydrogenated fats, oils and fatty acids derived from animal and vegetable sources, and fats extracted from foodstuff. This document does not apply to milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) or products supplemented with conjugated linoleic acid (CLA). This document does not apply to di-, tri-, polymerized, hydroxylated and oxidized fatty acids, and fats and oils. A method for the determination of the composition of FAMEs expressed by area % in liquid vegetable oils is proposed in Annex E.
Corps gras d’origines animale et végétale — Chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques d’acides gras — Partie 4: Détermination par chromatographie capillaire en phase gazeuse
Le présent document spécifie une méthode de détermination des esters méthyliques d’acides gras (EMAG) obtenus par transestérification ou estérification de corps gras et d’acide gras par chromatographie en phase gazeuse (CPG) sur colonne capillaire. Les EMAG de C4 à C24 peuvent être séparés en utilisant le présent document, y compris les EMAG saturés, les EMAG mono-insaturés cis et trans et les EMAG poly-insaturés cis et trans. Le présent document s’applique aux corps gras et acides gras bruts, raffinés, partiellement hydrogénés ou totalement hydrogénés d’origines animale et végétale et aux corps gras extraits de produits alimentaires. Le présent document ne s’applique pas au lait et aux produits laitiers (ou à la matière grasse provenant du lait et des produits laitiers), ni aux produits supplémentés en acide linoléique conjugué (ALC). Le présent document ne s’applique pas aux acides gras et corps gras dimérisés, trimérisés, polymérisés, hydroxylés et oxydés. Une méthode de détermination de la composition en EMAG exprimée en % en aire des huiles végétales liquides est présentée à l’Annexe E.
General Information
- Status
- Published
- Publication Date
- 08-Mar-2026
- Technical Committee
- ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
- Drafting Committee
- ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
- Current Stage
- 6060 - International Standard published
- Start Date
- 09-Mar-2026
- Due Date
- 21-Mar-2026
- Completion Date
- 09-Mar-2026
Relations
- Effective Date
- 12-Feb-2026
- Effective Date
- 06-Jun-2022
Overview
ISO/PRF 12966-4:2026 is an essential International Standard developed by ISO for the precise determination of fatty acid methyl esters (FAMEs) in animal and vegetable fats and oils using capillary gas chromatography (GLC). This method focuses on separating and quantifying FAMEs ranging from C4 to C24, including critical saturated, monounsaturated (cis- and trans-), and polyunsaturated (cis- and trans-) fatty acid methyl esters. Designed for crude, refined, partially hydrogenated, and fully hydrogenated fats and oils from animal and vegetable origins, this standard excludes milk fats and products, as well as polymerized and oxidized fats.
Capillary gas chromatography as outlined in ISO 12966-4 ensures high-resolution separation based on chain length and unsaturation degree, enabling accurate profiling critical for quality control, regulatory compliance, and nutritional labeling across food industries.
Key Topics
Scope and Applicability
Applies to fats, oils, and fatty acids from animal and vegetable sources except milk fats, milk products, conjugated linoleic acid (CLA) supplements, polymerized, and oxidized fats. Suitable for complex matrices including partially and fully hydrogenated oils.Analytical Principle
Separation of fatty acid methyl esters by capillary gas chromatography on a polar stationary phase. Identification by retention times compared to pure standards and quantification utilizing internal standards with instrument correction factors.Reagents and Standards
Utilizes high-purity FAME reference standards such as cis- and trans-octadecenoic, linoleic, linolenic acid methyl esters, and conjugated linoleic acids. Selection of solvents like iso-octane, MTBE, n-hexane, and dichloromethane is critical for sample preparation.Chromatographic Conditions
Requires 100 m capillary columns with 0.25 mm internal diameter and 0.20 μm film thickness for optimal separation of C18:1 cis- and trans-isomers. Method includes performance checks to assure reproducibility and repeatability.Quantification Methods
Quantifies FAMEs either by area percentage or mass concentration (g/100 g), including the total trans fatty acid content, essential for food safety and nutritional labeling.Exclusions and Limitations
Excludes milk and milk products fats due to matrix complexity as well as di-, tri-, polymerized, hydroxylated, and oxidized fatty acids that require alternative analytical techniques.
Applications
Food Industry Compliance
Enables manufacturers and regulatory bodies to accurately quantify fatty acid profiles in edible oils and fats for labeling, quality assurance, and trans fat monitoring.Nutritional Analysis
Supports nutritional profiling of animal and vegetable fats, informing dietary recommendations and health assessments.Research and Development
Used by food scientists and technologists for formulation improvements, especially in hydrogenated and partially hydrogenated oils where trans fats content is critical.Quality Control Laboratories
Provides a standardized method to verify fat composition consistency, detect adulteration, and monitor refining processes.
Related Standards
ISO 12966 Series
- Part 1: General guidelines for gas chromatography of FAMEs.
- Part 2: Preparation of methyl esters of fatty acids using traditional transesterification.
- Part 3: Preparation using trimethylsulfonium hydroxide (TMSH).
ISO 661
Preparation of test samples for animal and vegetable fats and oils analysis.ISO 3696
Specification for laboratory grade water used in analytical chemistry.ISO 6353-2 and ISO 6353-3
Specifications for reagents used in chemical analyses relevant to fat and oil testing.
This standardized approach in ISO/PRF 12966-4 revolutionizes the gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters, offering robust, reproducible, and regulatory-aligned methods crucial in the global food quality landscape. For detailed implementation, laboratories are encouraged to integrate ISO 12966-4 alongside complementary parts of the ISO 12966 series for comprehensive fatty acid methyl ester profiling.
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Frequently Asked Questions
ISO 12966-4:2026 is a standard published by the International Organization for Standardization (ISO). Its full title is "Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 4: Determination by capillary gas chromatography". This standard covers: This document specifies a method for the determination of fatty acid methyl esters (FAMEs) derived by transesterification or esterification from fats, oils, and fatty acids by capillary gas chromatography (GLC). FAMEs from C4 to C24 can be separated using this document including saturated FAMEs, cis- and trans-monounsaturated FAMEs, and cis- and trans-polyunsaturated FAMEs. This document is applicable to crude, refined, partially hydrogenated or fully hydrogenated fats, oils and fatty acids derived from animal and vegetable sources, and fats extracted from foodstuff. This document does not apply to milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) or products supplemented with conjugated linoleic acid (CLA). This document does not apply to di-, tri-, polymerized, hydroxylated and oxidized fatty acids, and fats and oils. A method for the determination of the composition of FAMEs expressed by area % in liquid vegetable oils is proposed in Annex E.
This document specifies a method for the determination of fatty acid methyl esters (FAMEs) derived by transesterification or esterification from fats, oils, and fatty acids by capillary gas chromatography (GLC). FAMEs from C4 to C24 can be separated using this document including saturated FAMEs, cis- and trans-monounsaturated FAMEs, and cis- and trans-polyunsaturated FAMEs. This document is applicable to crude, refined, partially hydrogenated or fully hydrogenated fats, oils and fatty acids derived from animal and vegetable sources, and fats extracted from foodstuff. This document does not apply to milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) or products supplemented with conjugated linoleic acid (CLA). This document does not apply to di-, tri-, polymerized, hydroxylated and oxidized fatty acids, and fats and oils. A method for the determination of the composition of FAMEs expressed by area % in liquid vegetable oils is proposed in Annex E.
ISO 12966-4:2026 is classified under the following ICS (International Classification for Standards) categories: 67.200.10 - Animal and vegetable fats and oils. The ICS classification helps identify the subject area and facilitates finding related standards.
ISO 12966-4:2026 has the following relationships with other standards: It is inter standard links to EN ISO 12966-4:2026, ISO 12966-4:2015. Understanding these relationships helps ensure you are using the most current and applicable version of the standard.
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Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 12966-4
Second edition
Animal and vegetable fats and
2026-03
oils — Gas chromatography of fatty
acid methyl esters —
Part 4:
Determination by capillary gas
chromatography
Corps gras d’origines animale et végétale — Chromatographie en
phase gazeuse des esters méthyliques d’acides gras —
Partie 4: Détermination par chromatographie capillaire en phase
gazeuse
Reference number
© ISO 2026
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on
the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below
or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: +41 22 749 01 11
Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents and materials . 2
5.1 Reference standards. .2
5.1.1 Reference FAMEs. .2
5.1.2 Fats and oils with certified fatty acid composition. . .3
5.1.3 Quantitative FAME standard mixture containing cis and trans FAMEs from C4:0
to C22:6. .3
5.1.4 Calibration FAME standard solution at 2 mg/ml for the calculation of the
correction factors. .3
5.2 Internal standards. .3
5.3 Iso-octane (2,2,4-trimethyl pentane). .4
5.4 Methyl tert-Butyl ether (MTBE) (2-Methoxy-2-methylpropane). .4
5.5 n-Hexane. .4
5.6 n-Heptane. .4
5.7 Qualitative cis and trans isomers standard mixture solution. .4
5.8 Dichloromethane (methylene chloride). .5
6 Apparatus . 5
7 Sampling . 5
8 Preparation of test sample . 5
9 Preparation of methyl esters from fats, oils, and fatty acids . 6
10 Procedure . 6
10.1 General .6
10.2 GC conditions .6
10.3 Performance check .6
11 Calculations . 7
11.1 Qualitative analysis and peak identification .7
11.2 Quantitative analysis .8
11.2.1 General .8
11.2.2 FAMEs quantification, by mass (g/100 g) .9
11.2.3 FAMEs quantification, by area % .9
11.2.4 Butyric acid and caproic acid methyl esters quantification (only), by mass
(g/100 g) in fat containing short chain fatty acids .9
11.2.5 Total trans FAMEs quantification (only), by mass (g/100 g) .10
11.3 Expression of the results for food labelling .10
12 Precision .11
12.1 Results of interlaboratory test .11
12.2 Repeatability .11
12.3 Reproducibility .11
13 Test report .11
Annex A (informative) Theoretical flame ionization detector correction factor for fatty acid
methyl esters .12
Annex B (informative) Examples of chromatograms . 14
Annex C (informative) Elution zone of the trans fatty acid methyl esters .21
iii
Annex D (informative) Stoichiometric factors for converting fatty acid methyl esters to fatty
acids .26
Annex E (informative) Determination of the composition of fatty acid methyl esters expressed
by area % in liquid vegetable oils .28
Annex F (informative) Results of an interlaboratory trial .29
Bibliography .39
iv
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11,
Animal and vegetable fats and oils, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN)
Technical Committee CEN/TC 307, Oilseeds, vegetable and animal fats and oils and their by-products - Methods
of sampling and analysis, in accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN
(Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 12966-4:2015), which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— the Scope has been extended to the separation of fatty acid methyl esters from C4 to C24;
— ruminant fat has been added to the Scope,
— quantification by area (%) or by mass (g/100 g) using internal standards and corrections factors
calculated with a quantitative fatty acid methyl esters standard mixture containing cis and trans fatty
acid methyl esters from C4:0 to C22:6; has been added
— quantification of total trans fatty acid methyl esters by mass (g/100 g) has been added;
— the use of 100 m, 0,25 mm ID, 0,20 µm film thickness columns are now required to separate most C18:1
trans- and cis-isomers;
— a method has been added for determination of the composition of fatty acid methyl esters expressed by
area % in liquid vegetable oils.
A list of all parts in the ISO 12966 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
v
Introduction
This document is one part of a series of four International Standards for the preparation and determination
of fatty acid methyl esters (FAMEs) by gas chromatography in animal and vegetable fats and oils. The
ISO 12966 series is applicable to crude, refined, partially hydrogenated, or fully hydrogenated fats, oils, and
fatty acids derived from animal and vegetable sources, and fats extracted from foodstuff.
The ISO 12966 series is not suitable for milk and milk products (or fat coming from milk and milk products),
or products supplemented with conjugated linoleic acid (CLA). Furthermore, it is not intended to be applied
to polymerized and oxidized fats and oils.
This document gives the conditions for the analysis of FAMEs by capillary gas chromatography, while
ISO 12966-2 and ISO 12966-3 cover the preparation of FAMEs by different methods. ISO 12966-1 is a
guideline to the modern gas chromatography of FAMEs.
vi
International Standard ISO 12966-4:2026(en)
Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of
fatty acid methyl esters —
Part 4:
Determination by capillary gas chromatography
1 Scope
This document specifies a method for the determination of fatty acid methyl esters (FAMEs) derived by
transesterification or esterification from fats, oils, and fatty acids by capillary gas chromatography (GLC).
FAMEs from C4 to C24 can be separated using this document including saturated FAMEs, cis- and trans-
monounsaturated FAMEs, and cis- and trans-polyunsaturated FAMEs.
This document is applicable to crude, refined, partially hydrogenated or fully hydrogenated fats, oils and
fatty acids derived from animal and vegetable sources, and fats extracted from foodstuff.
This document does not apply to milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) or
products supplemented with conjugated linoleic acid (CLA).
This document does not apply to di-, tri-, polymerized, hydroxylated and oxidized fatty acids, and fats and
oils.
A method for the determination of the composition of FAMEs expressed by area % in liquid vegetable oils is
proposed in Annex E.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 6353-2, Reagents for chemical analysis — Part 2: Specifications — First series
ISO 6353-3, Reagents for chemical analysis — Part 3: Specifications — Second series
ISO 12966-2:2017, Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part
2: Preparation of methyl esters of fatty acids
ISO 12966-3, Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 3:
Preparation of methyl esters using trimethylsulfonium hydroxide (TMSH)
3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
4 Principle
Using capillary gas chromatography, FAMEs are separated on a highly polar stationary phase with respect
to their chain length, degree of (un)saturation, and geometry and position of the double bonds. Peaks are
identified by comparison with the retention time of pure standards and quantified as fatty acids methyl
esters by reference to internal standards and instrument correction factors.
5 Reagents and materials
Unless otherwise stated, use only reagents as specified in ISO 6353-2 and ISO 6353-3 (if listed there). If not,
then use reagents of recognized analytical grade and water of at least grade 3, as defined in ISO 3696.
WARNING — Attention is drawn to the regulations which specify the handling of dangerous matter.
Technical, organizational and personal safety measures shall be followed.
5.1 Reference standards.
5.1.1 Reference FAMEs.
Methyl esters of pure fatty acids, in particular, cis- and trans-isomers of octadecenoic (oleic), trans-isomers
of octadecadienoic (linoleic), and octadecatrienoic (α-linolenic) acids. Wide ranges of cis- and trans methyl
ester isomers are available on the market. The following are examples of suitable products available
commercially.
5.1.1.1 Octadecenoic acid methyl esters,cis and trans isomers mixture of C18:1 with trans-4 to trans-16
octadecenoic (all isomers) and principal cis isomers. Concentration 2,5 mg/ml in iso-octane (5.3) or MTBE
(5.4) or n-heptane (5.6) or n-hexane (5.5) or dichloromethane (5.8).
1)
NOTE This standard is commercially available from Supelco Inc, brand of Sigma-Aldrich (Cat. 40495-U) .
5.1.1.2 Linoleic acid methyl esters,cis and trans isomers mixture of C18:2 with trans-9, trans-12-
octadecadienoic acid (approximately 50 %), cis-9,trans-12-octadecadienoic acid (approximately 20 %), trans-
9,cis-12-octadecadienoic acid (approximately 20 %) and cis-9,cis-12-octadecadienoic acid (approximately
10 %). Concentration 10 mg/ml in iso-octane (5.3) or MTBE (5.4) or n-heptane (5.6) or n-hexane (5.5) or
dichloromethane (5.8).
1)
NOTE This standard is commercially available from Supelco Inc, brand of Sigma-Aldrich (Cat. 47791) .
5.1.1.3 Linolenic acid methyl esters, cis and trans isomers mixture of C18:3 with:
— cis-9,cis-12,cis-15-octadecatrienoic acid methyl ester (approximately a mass fraction of 3 %);
— cis-9,cis-12,trans-15-octadecatrienoic acid methyl ester (approximately a mass fraction of 7 %);
— cis-9,trans-12,cis-15-octadecatrienoic acid methyl ester (approximately a mass fraction of 7 %);
— cis-9,trans-12,trans-15-octadecatrienoic acid methyl ester (approximately a mass fraction of 15 %);
— trans-9,cis-12,cis-15-octadecatrienoic acid methyl ester (approximately a mass fraction of 7 %);
— trans-9,cis-12,trans-15-octadecatrienoic acid methyl ester (approximately a mass fraction of 15 %);
— trans-9,trans-12,cis-15-octadecatrienoic acid methyl ester (approximately a mass fraction of 15 %);
1) Supelco Inc., brand of Sigma Aldrich, is an example of suitable product available commercially. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by either ISO or IDF of the
product named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
— trans-9,trans-12,trans-15-octadecatrienoic acid methyl ester (approximately a mass fraction of 30 %).
Concentration 10 mg/ml in iso-octane (5.3) or MTBE (5.4) or n-heptane (5.6) or n-hexane (5.5) or
dichloromethane (5.8).
1)
NOTE This standard is commercially available from Supelco Inc, brand of Sigma Aldrich (Cat. 47792) . This
standard contains all trans isomers of C18:3 (eight in total) but their abundance and ratio are different to those
observed in refined/deodorized oils and fats.
5.1.1.4 Methyl octadecadienoate conjugated acids (CLA), mixture of C18:2 cis-9,trans-11 and cis-
10,trans-12-octadecadienoate conjugated acids, of purity ≥ 99 % mass fraction.
1)
NOTE This standard is commercially available from Supelco Inc, brand of Sigma Aldrich (Cat. O5507) . This
standard contains the two principal CLA isomers, but isomer ratio can vary from lot to lot.
5.1.2 Fats and oils with certified fatty acid composition.
Fats and oils with certified fatty acid composition (e.g. external reference materials or certified reference
material). This type of sample is accompanied with a certificate that provides mean values and its
associated uncertainty for each fatty acid. These products are often, for example, commercially available
from proficiency testing programmes (BIPEA, AOCS, FAPAS, JRC, etc).
5.1.3 Quantitative FAME standard mixture containing cis and trans FAMEs from C4:0 to C22:6.
2)
This type of FAME mixture is commercially available . It is also possible to prepare the FAME standard
mixture from individual and pure FAME standards, but the purchasing of individual FAME standards is
more expensive and the preparation is time consuming and requires high precision.
The amount of each FAME standard present in the mixture is necessary for determining the correction
factor (area/amount) for each FAME (see Figure B.1).
5.1.4 Calibration FAME standard solution at 2 mg/ml for the calculation of the correction factors.
Allow quantitative FAME standard mixture (5.1.3) to come to room temperature in the dark without heating.
Using a Pasteur pipet, rapidly transfer the content of the vial into a 50 ml volumetric flask, and dilute to the
mark with iso-octane (5.3), or MTBE (5.4), or n-heptane (5.6), or n-hexane (5.5). Dilute accordingly to the
type of injector used.
5.2 Internal standards.
For the quantification of the fatty acids, in grams per 100 g, the use of a FAME as an internal standard (IS) is
mandatory.
If it is necessary to check the recovery and the effectiveness of the derivatization method, then either or
both a triacylglycerol (TAG) and a FAME internal standard should be used. While the TAG-IS is added to
the sample prior to the FAME preparation, the FAME-IS is added before or after the FAME preparation. The
FAME-IS is used to calculate the recovery of the FAME from the TAG-IS and therefore, the efficiency of the
derivatisation procedure. In this case, a different chain length of the standards is required.
For the quantification of all fatty acids in vegetable oils, animal fats or extracted fats, C21:0 FAME or C19:
0 -FAME are the recommended internal standards, depending on the risk of coelutions such as C21: 0/ C18: 2
conjugated.
For the quantification of all fatty acids in fish oil, C23:0 FAME is the recommended internal standard.
For the quantification of butyric acid (C4:0) and caproic acid (C6:0) only, in fat containing short chain fatty
acids, C5:0 FAME is the recommended internal standard.
2) Examples of suitable products available commercially: Nu-Check-Prep, Cat. No. GLC 36 or GLC 37 (including C23:0
FAME). This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement
by ISO of these products. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
For the quantification of trans fatty acids only, in vegetable oils, animal fats or extracted fats, C19: 0 -FAME
is the recommended internal standard. The concentration of the internal standard should be adapted to the
expected content of trans fatty acids.
Depending on the capillary column and carrier gas used, the coelutions can be different. It is recommended
to carry out further analysis of the sample without the addition of the internal standard to check the natural
content of the fatty acid, which is used as the internal standard (C19:0 or C21:0 or C23:0). The content shall
be considered in the calculation.
The internal standard solutions are stable if precautions are taken to eliminate the loss of solvent and
therefore, a change in the concentration of the IS. For example, store the solution in a refrigerator in a well-
sealed amber bottle when not in use. Pure standards are available on the market. Purity of the IS shall be
confirmed by thin-layer chromatography, high-performance liquid chromatography, gas chromatography
analysis or by any other appropriate technique.
The following are examples of suitable standard solutions:
— Internal standard solution of C5:0 FAME: valeric acid methyl ester (purity ≥ 99 % mass fraction), mass
concentration 0,5 mg/ml in iso-octane (5.3) or MTBE (5.4) or n-heptane (5.6) or n-hexane (5.5) can be
used as the internal standard.
— Internal standard solution of C19:0 FAME: nonadecanoic acid methyl ester (purity ≥ 99 % mass fraction),
mass concentration 5 mg/ml in iso-octane (5.3) or MTBE (5.4) or n-heptane (5.6) or n-hexane (5.5) can
be used as the internal standard.
— Internal standard solution of C21:0 FAME: heneicosanoic acid methyl ester (purity ≥ 99 % mass fraction),
mass concentration 5 mg/ml in iso-octane (5.3) or MTBE (5.4) or n-heptane (5.6) or n-hexane (5.5) can
be used as the internal standard.
— Internal standard solution of C23:0 FAME: tricosanoic acid methyl ester (purity ≥ 99 % mass fraction),
mass concentration 5 mg/ml in iso-octane (5.3) or MTBE (5.4) or n-heptane (5.6) or n-hexane (5.5) can
be used as the internal standard.
In order to check the recovery and the effectiveness of the derivatization method, the suitable standard
solution is the following:
— Internal standard solution of C13:0 TAG: tritridecanoin (purity > 99 % mass fraction), mass concentration
5 mg/ml in iso-octane (5.3) or MTBE (5.4) or n-heptane (5.6) or n-hexane (5.5) can be used as the internal
standard.
If the TAG-IS is hard to dissolve in the cold, a hot methylation procedure, as specified in ISO 12966-2:2017,
4.3, 4.4, and 4.5, shall be used.
5.3 Iso-octane (2,2,4-trimethyl pentane).
5.4 Methyl tert-Butyl ether (MTBE) (2-Methoxy-2-methylpropane).
5.5 n-Hexane.
5.6 n-Heptane.
5.7 Qualitative cis and trans isomers standard mixture solution.
For the retention time (RT) identification of cis and trans isomers (i.e. C18:1, C18:2, C18:3 and CLA),
prepare a qualitative standard solution with the standards listed in 5.1.1.1 to 5.1.1.4. All standards that are
commercially available can be used. Into a 50 ml volumetric flask, add each standard isomer solution in
equal proportion. Dissolve and make up to the mark with iso-octane (5.3) or MTBE (5.4) or n-heptane (5.6)
or n-hexane (5.5). Dilute in accordance with the type of injector used.
It is also possible to identify the retention times of cis and trans isomers using a fat or an oil with certified
fatty acid composition (5.1.2), for example, reference hydrogenated oil samples.
5.8 Dichloromethane (methylene chloride).
6 Apparatus
The usual laboratory equipment and, in particular, the following shall be used.
6.1 Gas chromatograph, equipped with flame ionization detector, split or splitless injector, and data
acquisition system.
NOTE The use of on-column and programmable temperature vaporizer (PTV) injectors are also possible.
6.2 Capillary column, fused silica capillary 100 m and 0,25 mm i.d. coated with cyanopropyl-polysiloxane
3)
stationary phase, such as SP-2560 or CP-Sil 88 to a thickness of 0,20 µm. Commercially prepared columns
are available from different suppliers.
The use of 100 m, 0,25 mm ID, 0,20 µm film thickness columns with SP-2560 or CP-Sil 88 as the stationary
phase are required as the separation capacity of these columns is sufficient to separate most C18:1 trans-
and cis-isomers and is in accordance with resolution specification indicated in 10.3. If this separation is not
required, a 50 m or 60 m column can also be used. However, it is possible that some 50 m or 60 m long
columns can also achieve this separation, mostly for vegetable oils. Other types of columns (BPX70, DB-23,
HP-23, Rtx-2330, SP-2330, SP-2380, etc.) are also possible, but a shift in the elution order is possible. For fast
GC analysis, short columns are also possible (10 m to 15 m), but with limited information which in certain
cases, will not be a problem.
6.3 Micro syringe, for gas chromatography, 10 μl delivery with a hardened needle.
6.4 Carrier gas, hydrogen (recommended), nitrogen or helium, 99,999 5 % pure or better, gas
chromatography quality, dried, oxygen removed by suitable filters (<0,1 mg/kg), free from organic
impurities.
WARNING — Hydrogen, which is used with capillary columns, can double the speed of the analysis
(in comparison with helium), but is hazardous. Hydrogen generators and safety devices are available
and it is essential that a suitable device be incorporated into the apparatus.
6.5 Flame gases, hydrogen and air, gas chromatography quality, free from organic impurities.
6.6 Make-up gas, nitrogen or helium, gas chromatography quality, free from organic impurities.
7 Sampling
A representative sample should be sent to the laboratory. It should not be damaged or changed during
transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this document. A recommended sampling method is given in
ISO 5555.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with ISO 661.
3) Examples of suitable products available commercially. This information is given for the convenience of users of this
document and does not constitute an endorsement by ISO of these products. Equivalent products may be used if they can
be shown to lead to the same results.
9 Preparation of methyl esters from fats, oils, and fatty acids
The FAMEs shall be prepared in accordance with ISO 12966-2 or ISO 12966-3. The use of ISO 12966-3 is not
recommended for FAMEs quantification by mass (g/100 g) because only 70 % to 80 % of free fatty acids
are esterified and this preparation can lead to an isomerization of unsaturated fatty acids such as methyl
octadecadienoate conjugated acids (CLA).
Prior to methylation, the internal standard solution, is added to the reaction flask so that after the oil or fat
is added, the mass fraction is between 0,01 and 0,20 mg IS/mg oil or fat.
For example, 2 ml of internal standard solution (5.2) can be added to 100 mg test portion of fat prior to
methylation.
Dissolve the prepared FAMEs in iso-octane (5.3) or MTBE (5.4) or n-heptane (5.6) or n-hexane (5.5). The
mass concentration should be approximately 15 mg/ml to 20 mg/ml for split injection. For on-column
injection, the mass concentration should be adapted.
It is recommended to carry out further analysis of the sample without the addition of the internal standard
to check the natural content of the fatty acid which is used as the internal standard. This natural content
shall be considered in the calculation.
10 Procedure
WARNING — Due to the toxic character of some solvents, a ventilated hood shall be used.
10.1 General
The first sample in an analysis batch shall always be a blank FAME dissolution solvent. No peaks shall be
detected in this blank run.
10.2 GC conditions
Adapt the temperatures and GC conditions considering the type of fat, oil, or fatty acid analysed and the
apparatus used. The following conditions have been proven to be suitable for the separation of FAMEs (C4 to
C24) on 100 m columns. However, other conditions are also possible and can be used.
Injector temperature: 250 °C
Detector temperature: 250 °C
Oven temperature: 60 °C (2 min) to 172 °C with 30 °C/min, hold 5 min at 172 °C, 172 °C to 210 °C
with 1 °C/min, hold 22 min at 210 °C
Carrier gas hydrogen: column head pressure, 150 kPa (constant pressure)
linear velocity; (30 to 40) cm/s, flow rate approximately 1,0 ml/min
split ratio, 1:25 or 1:100 depending on the dilution
Injection volume: 1 µl (equivalent to 15 µg to 20 μg FAME)
Examples of chromatograms are shown in Annex B.
NOTE For the analysis of animal fats, the complete elution of all FAMEs can be checked with certified reference
standards.
10.3 Performance check
Column performance is checked using a suitable mixture of FAMEs covering the range of fatty acids under
investigation. Since commercial GC designs are different and the separation obtained is not identical to the
example chromatograms, small changes in the sample size, sample concentration or oven temperature can
be required. If so, adjust the sample size, sample concentration or oven temperature until the best separation
results are obtained. If the column oven temperature needs to be adjusted, it should be adjusted by small
increments, preferably in steps of 1 °C.
Pay particular attention to the separation and identification of critical pair such as C16: 1/ C17: 0, C18: 3n -3/
C20: 1 and C21: 0/ C18: 2 conjugated.
For the accurate quantification of C18:1 TFA (level ≥ 0,3 g/100 g fat), a sufficient resolution between C18:1
trans-13/14 and C18:1 cis-9 (oleic acid) is required. Resolution is determined with the injection of the
qualitative cis and trans C18:1 FAME isomers standard mixture solution (5.1.1.1) or the injection of the
qualitative cis and trans isomers standard mixture solution (5.7).
Dilute in accordance with the type of injector used. Inject into the gas chromatograph the calibrating solution
(5.1.1.1 or 5.7). Determine peak width at half height and distance between the left of the chromatogram and
the top of peak for C18:1 trans-13/14 and C18:1 cis-9 (oleic acid methyl ester). The resolution criteria R is
calculated by using Formula (1):
11, 8 tt
RR21
R (1)
WW
1 1
1 2
2 2
where
t is the distance, in minutes, between the left of the chromatogram and the top of peak 1 (C18:1
R1
trans-13/14);
t is the distance, in minutes, between the left of the chromatogram and the top of peak 2 (C18:1
R2
cis-9);
W is the peak width, in minutes, at half-height, of peak 1 (C18:1 trans-13/14);
1
W is the peak width, in minutes, at half-height, of peak 2 (C18:1 cis-9).
1
The resolution is sufficient when the R criterion is ≥ 1,00 ± 5 % (see Figure C.6).
NOTE In case of insufficient resolution, but with R close to the target value, the fine tuning of chromatography
conditions (i.e. slight modification of carrier gas pressure/flow, or oven temperature programme) can give an
acceptable R value.
11 Calculations
11.1 Qualitative analysis and peak identification
The individual FAMEs are identified by their retention times and in comparison with FAME reference
standards, by using qualitative cis and trans isomers standard mixture solution (5.7) or by using a fat or an
oil with certified fatty acid composition (5.1.2).
When unknown peaks are observed, they should be identified using appropriate procedures such as GC-MS,
FTIR, silver-ion chromatography, and classical chemical methods. Peaks of unknown identity should not be
included in the summation of peak areas when calculating the fatty acid composition, unless they have been
confirmed to be fatty acids. It is also possible to summarize unknown peaks as such.
C18:1 trans fatty acids identification: identify and group all trans isomers of C18:1 eluted before the oleic
acid methyl ester (C18:1 n-9 cis) according to chromatograms in Annex C.
C18:2 trans fatty acids identification: identify and group all trans isomers of C18:2 eluted before the linoleic
acid methyl ester (C18:2 n-6 cis) according to chromatograms in Annex C.
C18:3 trans fatty acids identification: identify and group all trans isomers of C18:3 eluted before the linolenic
acid methyl ester (C18:3 n-3 cis) according to chromatograms in Annex C.
11.2 Quantitative analysis
11.2.1 General
Areas are corrected with specific correction factors (F). These factors are determined for each single
instrument. For this purpose, a calibration FAME standard solution (5.1.4) containing certified fatty acid
composition, is injected three times.
These correction factors are not identical with theoretical FID correction factors, which are given in
Annex A, as they also include the performance of the injection system, etc. However, in the case of bigger
differences, the whole system shall be checked for performance.
For the calibration FAME standard solution (5.1.4), the mass fraction w , in grams per 100 g of FAME, i, is
i
given by Formula (2):
m
i
w ×100 (2)
i
m
where
m is the mass of the FAME, i, in the calibration FAME standard solution;
i
Σm is the total of the masses of the various components, as FAMEs of the calibration FAME standard
solution.
From the chromatogram of the calibration FAME standard solution (5.1.4), calculate the percentage by area
for the FAME, i, as follows in Formula (3):
A
i
x ×100 (3)
i
A
where
A is the area of the FAME, i, in the calibration FAME standard solution;
i
ΣA is the sum of all areas of all FAMEs of the calibration FAME standard solution.
The correction factor, F , is then determined as shown in Formula (4):
i
w mA
i i
F (4)
i
x Am
i i
where
w mass fraction in grams per 100 g of FAME, i;
i
x percentage by area for the FAME, i;
i
A is the area of the FAME, i;
i
ΣA is the sum of all areas of all FAMEs of the calibration FAME standard solution;
m is the mass of the FAME, i, in the calibration FAME standard solution;
i
Σm is the total of the masses of the various components, as FAMEs of the calibration FAME standard
solution.
The mean of the three injections is used for each correction factor F . The variation between three injections
i
is optimal when coefficients of variation are less than 2 %.
The correction factor calculated for C18:2 cis-9,12 (or n-6) can be applied for C18:2 CLA (cis-9, trans-11) and
that calculated for C18:3 cis-9,12,15 (n-3) can be applied for C18:3 trans isomers.
11.2.2 FAMEs quantification, by mass (g/100 g)
The mass fraction in grams per 100 g, of the fatty acid, i, expressed as methyl ester, is then given by
Formula (5):
mF A
IS ii
w ×100 (5)
i
mF A
IS IS
where
A is the area of the FAME, i;
i
A is the area of the internal standard;
IS
F is the correction factor of the fatty acid, i, expressed as FAME;
i
F is the correction factor of the internal standard, expressed as FAME;
IS
m is the mass of the test portion, in milligrams;
m is the mass of the internal standard, in milligrams, corrected by its purity (usually 0,99).
IS
The results are expressed to two decimal places.
11.2.3 FAMEs quantification, by area %
The content of each of the individual fatty acids from C4 to C24 present in the chromatogram, w , expressed
i
as a percentage by area of methyl esters, is then given by Formula (6):
AF
ii
w 100 (6)
i
()AF
ii
where
A is the area of the fatty acid, i, expressed as FAME;
i
F is the correction factor of the fatty acid, i, expressed as FAME.
i
The results are expressed to two decimal places.
11.2.4 Butyric acid and caproic acid methyl esters quantification (only), by mass (g/100 g) in fat
containing short chain fatty acids
When short chain fatty acids are present in the sample, the mass fraction of butyric acid (C4:0) and caproic
acid (C6:0) is calculated using the C5:0 FAME internal standard. Assuming that the response factors of
C4:0 and C6:0 are equivalents to the response factor of the internal standard, area is not corrected by the
correction factor (F .
i)
The mass fraction in grams per 100 g, of butyric acid (C4:0) or caproic acid (C6:0), expressed as methyl ester,
w , is then given by Formula (7):
i
mA
IS i
w ×100 (7)
i
mA
IS
where
A is the area of the butyric acid or the caproic acid, expressed as FAME (C4:0 FAME or C6:0 FAME);
i
A is the area of the internal standard (C5:0 FAME);
IS
m is the mass of the test portion, in milligrams;
m is the mass of the internal standard (C5:0 FAME), in milligrams, corrected by its purity (usually
IS
0,99).
The results are expressed to two decimal places.
11.2.5 Total trans FAMEs quantification (only), by mass (g/100 g)
For the quantification of total trans fatty acids (sum of trans C18:1, trans C18:2 and trans C18:3), in grams
per 100 g, the use of an internal standard, such as C21: 0 -FAME, is necessary.
The mass fraction in grams per 100 g, of the fatty acid, i, expressed as methyl ester, W , is then given by
i
Formula (8):
mF AF AF A
IS ttCC18::1181 ttCC18::2182 CC18::31t 83
w 100 (8)
i
mF A
IIS IS
where
F is the correction factor of the fatty acid, trans C18:1, expressed as FAME;
tC18:1
F is the correction factor of the fatty acid, trans C18:2, expressed as FAME;
tC18:2
F is the correction factor of the fatty acid, C18:3, expressed as FAME;
C18:3
F is the correction factor of the internal standard, expressed as FAME (C21:0 FAME);
IS
A is the area of the FAME, trans C18:1;
tC18:1
A is the area of the FAME, trans C18:2;
tC18:2
A is the area of the FAME, trans C18:3;
tC18:3
A is the area of the internal standard (IS) (C21:0 FAM
...
Norme
internationale
ISO 12966-4
Deuxième édition
Corps gras d’origines animale
2026-03
et végétale — Chromatographie
en phase gazeuse des esters
méthyliques d’acides gras —
Partie 4:
Détermination par
chromatographie capillaire en
phase gazeuse
Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of
fatty acid methyl esters —
Part 4: Determination by capillary gas chromatography
Numéro de référence
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
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Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vii
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 2
5 Réactifs et matériaux . 2
5.1 Étalons de référence .2
5.1.1 EMAG de référence .2
5.1.2 Corps gras ayant une composition certifiée en acides gras .3
5.1.3 Mélange étalon quantitatif d’EMAG contenant des EMAG cis et trans de C4:0 à
C22:6 .3
5.1.4 Solution étalon d’étalonnage d’EMAG à 2 mg/ml pour le calcul des facteurs de
correction .3
5.2 Étalons internes .3
5.3 Iso-octane (2,2,4-triméthylpentane) .5
5.4 Méthyl tert-butyl éther (MTBE) (2-méthoxy-2-méthylpropane) .5
5.5 n-Hexane .5
5.6 n-Heptane .5
5.7 Solution qualitative de mélange étalon d’isomères cis et trans .5
5.8 Dichlorométhane (chlorure de méthylène) .5
6 Appareillage . 5
7 Échantillonnage . 6
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 6
9 Préparation des esters méthyliques de corps gras et d’acides gras . 6
10 Mode opératoire . 6
10.1 Généralités .7
10.2 Conditions de chromatographie en phase gazeuse .7
10.3 Contrôle des performances .7
11 Calculs . 8
11.1 Analyse qualitative et identification des pics .8
11.2 Analyse quantitative .8
11.2.1 Généralités .8
11.2.2 Quantification des EMAG, en masse (g/100 g) .10
11.2.3 Quantification des EMAG, en % en aire.10
11.2.4 Quantification des esters méthyliques d’acide butyrique et d’acide caproïque
(uniquement), en masse (g/100 g) dans le corps gras contenant des acides gras
à chaîne courte .10
11.2.5 Quantification des EMAG trans totaux (uniquement), en masse (g/100 g) .11
11.3 Expression des résultats pour l’étiquetage des denrées alimentaires .11
12 Fidélité .12
12.1 Résultats d’un essai interlaboratoires . 12
12.2 Répétabilité . 12
12.3 Reproductibilité . 12
13 Rapport d’essai .12
Annexe A (informative) Facteur de correction théorique du détecteur à ionisation de flamme
pour les esters méthyliques d’acides gras .13
Annexe B (informative) Exemples de chromatogrammes .16
iii
Annexe C (informative) Zone d’élution des esters méthyliques d’acides gras trans .23
Annexe D (informative) Facteurs stœchiométriques pour la conversion des esters méthyliques
d’acides gras en acides gras.28
Annexe E (informative) Détermination de la composition en esters méthyliques d’acides gras
exprimée en % en aire des huiles végétales liquides .30
Annexe F (informative) Résultats d’un essai interlaboratoires .32
Bibliographie .42
iv
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 307,
Oléagineux, corps gras d’origines végétale et animale et leurs co-produits - Méthodes d’échantillonnage et
d’analyse, du Comité européen de normalisation (CEN), conformément à l’Accord de coopération technique
entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 12966-4:2015), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— élargissement du domaine d’application à la séparation des esters méthyliques d’acides gras de C4 à C24;
— élargissement du domaine d’application aux matières grasses de ruminants;
— ajout de la quantification en aire (%) ou en masse (g/100 g) à l’aide d’étalons internes et de facteurs de
correction calculés à partir d’un mélange étalon quantitatif d’esters méthyliques d’acides gras contenant
des esters méthyliques d’acides gras cis et trans de C4:0 à C22:6;
— ajout de la quantification des esters méthyliques d’acides gras trans totaux en masse (g/100 g);
— précision sur la nécessité d’utiliser désormais des colonnes de 100 m de longueur, 0,25 mm de diamètre
intérieur et 0,20 µm d’épaisseur de film pour séparer la plupart des isomères trans et cis de C18:1;
— ajout d’une méthode de détermination de la composition en esters méthyliques d’acides gras exprimée
en % en aire des huiles végétales liquides.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 12966 se trouve sur le site web de l’ISO.
v
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
vi
Introduction
Le présent document est une partie d’une série de quatre Normes internationales relatives à la préparation
et à la détermination des esters méthyliques d’acides gras (EMAG) par chromatographie en phase gazeuse
dans les corps gras d’origines animale et végétale. La série ISO 12966 s’applique aux corps gras et acides
gras bruts, raffinés, partiellement hydrogénés ou totalement hydrogénés d’origines animale et végétale et
aux corps gras extraits de produits alimentaires.
La série ISO 12966 ne convient pas au lait et aux produits laitiers (ou à la matière grasse provenant du lait et
des produits laitiers), ni aux produits supplémentés en acide linoléique conjugué (ALC). En outre, elle n’est
pas destinée à être appliquée aux corps gras polymérisés et oxydés.
Le présent document donne les conditions pour l’analyse des EMAG par chromatographie en phase gazeuse
sur colonne capillaire, tandis que l’ISO 12966-2 et l’ISO 12966-3 couvrent la préparation des EMAG par
différentes méthodes. L’ISO 12966-1 est une ligne directrice relative à la chromatographie en phase gazeuse
moderne des EMAG.
vii
Norme internationale ISO 12966-4:2026(fr)
Corps gras d’origines animale et végétale — Chromatographie
en phase gazeuse des esters méthyliques d’acides gras —
Partie 4:
Détermination par chromatographie capillaire en phase
gazeuse
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de détermination des esters méthyliques d’acides gras (EMAG)
obtenus par transestérification ou estérification de corps gras et d’acide gras par chromatographie en phase
gazeuse (CPG) sur colonne capillaire. Les EMAG de C4 à C24 peuvent être séparés en utilisant le présent
document, y compris les EMAG saturés, les EMAG mono-insaturés cis et trans et les EMAG poly-insaturés cis
et trans.
Le présent document s’applique aux corps gras et acides gras bruts, raffinés, partiellement hydrogénés ou
totalement hydrogénés d’origines animale et végétale et aux corps gras extraits de produits alimentaires.
Le présent document ne s’applique pas au lait et aux produits laitiers (ou à la matière grasse provenant du
lait et des produits laitiers), ni aux produits supplémentés en acide linoléique conjugué (ALC).
Le présent document ne s’applique pas aux acides gras et corps gras dimérisés, trimérisés, polymérisés,
hydroxylés et oxydés.
Une méthode de détermination de la composition en EMAG exprimée en % en aire des huiles végétales
liquides est présentée à l’Annexe E.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 661, Corps gras d’origines animale et végétale — Préparation de l’échantillon pour essai
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 6353-2, Réactifs pour analyse chimique — Partie 2: Spécifications — Première série
ISO 6353-3, Réactifs pour analyse chimique — Partie 3: Spécifications — Deuxième série
ISO 12966-2:2017, Corps gras d’origines animale et végétale — Chromatographie en phase gazeuse des esters
méthyliques d’acides gras — Partie 2: Préparation des esters méthyliques d’acides gras
ISO 12966-3, Corps gras d’origines animale et végétale — Chromatographie en phase gazeuse des
esters méthyliques d’acides gras — Partie 3: Préparation des esters méthyliques à l’aide d’hydroxyde de
triméthylsulfonium (TMSH)
3 Termes et définitions
Aucun terme n’est défini dans le présent document.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
4 Principe
En utilisant la chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire, les EMAG sont séparés sur une
phase stationnaire de polarité élevée, en fonction de la longueur de leur chaîne, de leur degré de (in)
saturation ainsi que de la géométrie et de la position des doubles liaisons. Les pics d’esters méthyliques
d’acides gras sont identifiés par comparaison avec le temps de rétention des étalons purs et quantifiés par
référence aux étalons internes et aux facteurs de correction de l’instrument.
5 Réactifs et matériaux
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs spécifiés dans l’ISO 6353-2 et l’ISO 6353-3 (s’ils
y sont énumérés). Sinon, utiliser des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau de qualité 3 au
minimum, telle que définie dans l’ISO 3696.
AVERTISSEMENT — L’attention des lecteurs est attirée sur les règles qui régissent la manipulation
des produits dangereux. Les mesures de sécurité sur les plans technique, organisationnel et du
personnel doivent être suivies.
5.1 Étalons de référence
5.1.1 EMAG de référence
Esters méthyliques d’acides gras purs, en particulier isomères cis et trans de l’acide octadécénoïque (oléique),
isomères trans des acides octadécadiénoïque (linoléique) et octadécatriénoïque (α-linolénique). Une vaste
gamme d’isomères cis et trans d’esters méthyliques est disponible sur le marché. Les produits suivants sont
des exemples de produits appropriés disponibles sur le marché.
5.1.1.1 Esters méthyliques d’acide octadécénoïque, mélange d’isomères cis et trans de C18:1 avec
acide trans-4 à trans-16 octadécénoïque (tous les isomères) et principaux isomères cis. Concentration de
2,5 mg/ml dans de l’iso-octane (5.3) ou du MTBE (5.4) ou du n-heptane (5.6) ou du n-hexane (5.5) ou du
dichlorométhane (5.8).
NOTE Cet étalon est disponible sur le marché auprès de Supelco Inc, marque de Sigma-Aldrich (Cat. 40495-U).
5.1.1.2 Esters méthyliques d’acide linoléique, mélange d’isomères cis et trans de C18:2 avec acide trans-
9,trans-12-octadécadiénoïque (environ 50 %), acide cis-9,trans-12-octadécadiénoïque (environ 20 %), acide
trans-9,cis-12-octadécadiénoïque (environ 20 %) et acide cis-9,cis-12-octadécadiénoïque (environ 10 %).
Concentration de 10 mg/ml dans de l’iso-octane (5.3) ou du MTBE (5.4) ou du n-heptane (5.6) ou du
n-hexane (5.5) ou du dichlorométhane (5.8).
1)
NOTE Cet étalon est disponible sur le marché auprès de Supelco Inc, marque de Sigma-Aldrich (Cat. 47791) .
5.1.1.3 Esters méthyliques d’acide linolénique, mélange d’isomères cis et trans de C18:3 avec:
— ester méthylique d’acide cis-9,cis-12,cis-15-octadécatriénoïque (fraction massique d’environ 3 %);
1) Le produit de Supelco Inc., marque de Sigma Aldrich, est un exemple de produit approprié disponible sur le marché.
Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’IDF ou
l’ISO approuve l’emploi du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils
aboutissent aux mêmes résultats.
— ester méthylique d’acide cis-9,cis-12,trans-15-octadécatriénoïque (fraction massique d’environ 7 %);
— ester méthylique d’acide cis-9,trans-12,cis-15-octadécatriénoïque (fraction massique d’environ 7 %);
— ester méthylique d’acide cis-9,trans-12,trans-15-octadécatriénoïque (fraction massique d’environ 15 %);
— ester méthylique d’acide trans-9,cis-12,cis-15-octadécatriénoïque (fraction massique d’environ 7 %);
— ester méthylique d’acide trans-9,cis-12,trans-15-octadécatriénoïque (fraction massique d’environ 15 %);
— ester méthylique d’acide trans-9,trans-12,cis-15-octadécatriénoïque (fraction massique d’environ 15 %);
— ester méthylique d’acide trans-9,trans-12,trans-15-octadécatriénoïque (fraction massique d’environ
30 %).
Concentration de 10 mg/ml dans de l’iso-octane (5.3) ou du MTBE (5.4) ou du n-heptane (5.6) ou du
n-hexane (5.5) ou du dichlorométhane (5.8).
1)
NOTE Cet étalon est disponible sur le marché auprès de Supelco Inc, marque de Sigma-Aldrich (Cat. 47792) .
Cet étalon contient tous les isomères trans de C18:3 (huit au total), mais leur abondance et leur rapport sont différents
de ceux observés dans les corps gras raffinés/désodorisés.
5.1.1.4 Acides conjugués d’octadécadiénoate de méthyle (ALC), mélange d’acides conjugués C18:2 cis-
9,trans-11 et cis-10,trans-12-octadécadiénoate, d’une pureté ≥ 99 % en fraction massique.
1)
NOTE Cet étalon est disponible sur le marché auprès de Supelco Inc, marque de Sigma-Aldrich (Cat. O5507) .
Cet étalon contient les deux principaux isomères d’ALC, mais le rapport des isomères peut varier d’un lot à l’autre.
5.1.2 Corps gras ayant une composition certifiée en acides gras
Corps gras ayant une composition certifiée en acides gras (par exemple matériaux de référence externes
ou matériau de référence certifié). Ce type d’échantillon est accompagné d’un certificat qui fournit les
valeurs moyennes et l’incertitude associée pour chaque acide gras. Ces produits sont souvent, par exemple,
disponibles sur le marché dans le cadre de programmes d’essais d’aptitude (BIPEA, AOCS, FAPAS, JRC, etc.).
5.1.3 Mélange étalon quantitatif d’EMAG contenant des EMAG cis et trans de C4:0 à C22:6
2)
Ce type de mélange d’EMAG est disponible sur le marché . Il est également possible de préparer le mélange
étalon d’EMAG à partir d’étalons d’EMAG individuels et purs, mais les étalons d’EMAG individuels sont plus
coûteux et la préparation prend du temps et exige une grande précision.
Il est nécessaire de connaître la quantité de chaque étalon d’EMAG présent dans le mélange pour déterminer
le facteur de correction (aire/quantité) pour chaque EMAG (voir Figure B.1).
5.1.4 Solution étalon d’étalonnage d’EMAG à 2 mg/ml pour le calcul des facteurs de correction
Laisser le mélange étalon quantitatif d’EMAG (5.1.3) atteindre la température ambiante à l’obscurité sans
chauffage. À l’aide d’une pipette Pasteur, transférer rapidement le contenu du flacon dans une fiole jaugée
de 50 ml et compléter au volume avec de l’iso-octane (5.3) ou du MTBE (5.4) ou du n-heptane (5.6) ou du
n-hexane (5.5). Diluer en fonction du type d’injecteur utilisé.
5.2 Étalons internes
Pour la quantification des acides gras, en grammes pour 100 g, il faut utiliser un EMAG comme étalon interne.
2) Exemples de produits appropriés disponibles sur le marché. Nu-Check-Prep, Cat. n° GLC 36 ou GLC 37 (avec EMAG
C23:0). Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO
approuve l’emploi des produits ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils
aboutissent aux mêmes résultats.
S’il est nécessaire de vérifier le taux de récupération et l’efficacité de la méthode de dérivatisation, il
convient alors d’utiliser les deux étalons internes triacylglycérol (TAG) et EMAG, ou l’un des deux. Alors que
l’étalon interne TAG-EI est ajouté à l’échantillon avant la préparation des EMAG, l’étalon interne EMAG-EI est
ajouté avant ou après la préparation des EMAG. L’EMAG-EI est utilisé pour calculer le taux de récupération
de l’EMAG à partir du TAG-EI et, par conséquent, l’efficacité de la procédure de dérivation. Dans ce cas, les
étalons doivent avoir une longueur de chaîne différente.
Pour la quantification de tous les acides gras dans les huiles végétales, les graisses animales ou les corps
gras extraits, l’étalon interne recommandé est l’EMAG C21:0 ou l’EMAG C19:0, en fonction des coélutions
possibles, telles que celle de C21:0/C18:2 conjugués.
Pour la quantification de tous les acides gras dans l’huile de poisson, l’étalon interne recommandé est
l’EMAG C23:0.
Pour la quantification de l’acide butyrique (C4:0) et de l’acide caproïque (C6:0) uniquement dans les corps
gras contenant des acides gras à chaîne courte, l’étalon interne recommandé est l’EMAG C5:0.
Pour la quantification des acides gras trans uniquement, dans les huiles végétales, les graisses animales ou
les corps gras extraits, l’étalon interne recommandé est l’EMAG C19:0. Il convient d’adapter la concentration
de l’étalon interne à la teneur attendue en acides gras trans.
Selon la colonne capillaire et le gaz vecteur utilisés, les coélutions peuvent être différentes. Il est recommandé
d’effectuer une analyse supplémentaire de l’échantillon sans ajouter l’étalon interne afin de vérifier la teneur
naturelle en acide gras qui est utilisé comme étalon interne (C19:0 ou C21:0 ou C23:0). La teneur doit être
prise en compte dans le calcul.
Les solutions d’étalon interne sont stables si des précautions sont prises pour éviter la perte de solvant,
et donc une variation de la concentration de l’EI. Par exemple, conserver la solution au réfrigérateur dans
une bouteille ambrée étanche lorsqu’elle n’est pas utilisée. Des étalons purs sont disponibles sur le marché.
La pureté de l’étalon interne doit être confirmée par une analyse par chromatographie sur couche mince,
chromatographie en phase liquide à haute performance, chromatographie en phase gazeuse ou par toute
autre technique appropriée.
Les solutions suivantes sont des exemples de solutions étalons appropriées:
— Une solution d’étalon interne d’EMAG C5:0: ester méthylique d’acide valérique (pureté ≥ 99 % en fraction
massique), d’une concentration massique de 0,5 mg/ml dans de l’iso-octane (5.3) ou du MTBE (5.4), ou
du n-heptane (5.6) ou du n-hexane (5.5) peut être utilisée comme étalon interne.
— Une solution d’étalon interne d’EMAG C19:0: ester méthylique d’acide nonadécanoïque (pureté ≥ 99 %
en fraction massique), d’une concentration massique de 5 mg/ml dans de l’iso-octane (5.3) ou du MTBE
(5.4) ou du n-heptane (5.6) ou du n-hexane (5.5) peut être utilisée comme étalon interne.
— Une solution d’étalon interne d’EMAG C21:0: ester méthylique d’acide hénéicosanoïque (pureté ≥ 99 %
en fraction massique), d’une concentration massique de 5 mg/ml dans de l’iso-octane (5.3) ou du MTBE
(5.4) ou du n-heptane (5.6) ou du n-hexane (5.5) peut être utilisée comme étalon interne.
— Une solution d’étalon interne d’EMAG C23:0: ester méthylique d’acide tricosanoïque (pureté ≥ 99 % en
fraction massique), d’une concentration massique de 5 mg/ml dans de l’iso-octane (5.3) ou du MTBE
(5.4) ou du n-heptane (5.6) ou du n-hexane (5.5) peut être utilisée comme étalon interne.
Afin de vérifier le taux de récupération et l’efficacité de la méthode de dérivatisation, la solution étalon
appropriée est la suivante:
— Une solution d’étalon interne de TAG C13:0: tritridécanoine (pureté > 99 % en fraction massique),
d’une concentration massique de 5 mg/ml dans de l’iso-octane (5.3) ou du MTBE (5.4) ou du n-heptane
(5.6) ou du n-hexane (5.5) peut être utilisée comme étalon interne.
Si le TAG-EI est difficile à dissoudre à froid, une méthode de méthylation à chaud, comme spécifié dans
l’ISO 12966-2:2017, 4.3, 4.4 et 4.5, doit être utilisée.
5.3 Iso-octane (2,2,4-triméthylpentane)
5.4 Méthyl tert-butyl éther (MTBE) (2-méthoxy-2-méthylpropane)
5.5 n-Hexane
5.6 n-Heptane
5.7 Solution qualitative de mélange étalon d’isomères cis et trans
Pour l’identification du temps de rétention (TR) des isomères cis et trans (c’est-à-dire C18:1, C18:2, C18:3 et
ALC), préparer une solution étalon qualitative avec les étalons énumérés de 5.1.1.1 à 5.1.1.4. Tous les étalons
disponibles sur le marché peuvent être utilisés. Dans une fiole jaugée de 50 ml, ajouter chaque solution
étalon d’isomère en proportion égale. Dissoudre et compléter jusqu’au trait avec de l’iso-octane (5.3) ou du
MTBE (5.4) ou du n-heptane (5.6) ou du n-hexane (5.5). Diluer en fonction du type d’injecteur utilisé.
Il est également possible d’identifier les temps de rétention des isomères cis et trans à l’aide d’une matière
grasse ou d’une huile dont la composition en acides gras est certifiée (5.1.2), par exemple des échantillons
d’huile hydrogénée de référence.
5.8 Dichlorométhane (chlorure de méthylène)
6 Appareillage
L’équipement courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit doit être utilisé.
6.1 Appareil de chromatographie en phase gazeuse, muni d’un détecteur à ionisation de flamme,
d’un dispositif d’injection avec ou sans division et d’un système d’acquisition de données.
NOTE Il est également possible d’utiliser des dispositifs d’injection directe dans la colonne et des vaporisateurs à
température programmée (PTV).
6.2 Colonne capillaire, capillaire en silice fondue de 100 m de longueur et 0,25 mm de diamètre intérieur,
3)
revêtu d’une phase stationnaire constituée de cyanopropyl-polysiloxane, telle que SP-2560 ou CP-Sil 88 ,
d’une épaisseur de 0,20 µm. Des colonnes préparées sont disponibles sur le marché auprès de différents
fournisseurs.
Il est requis d’utiliser des colonnes de 100 m de longueur, 0,25 mm de diamètre intérieur, 0,20 μm d’épaisseur
de film avec comme phase stationnaire SP-2560 ou CP-Sil 88, car la capacité de séparation de ces colonnes
est suffisante pour séparer la plupart des isomères trans et cis de C18:1 et est conforme à la spécification
de résolution indiquée en 10.3. Si cette séparation n’est pas requise, une colonne de 50 m ou de 60 m peut
également être utilisée. Toutefois, il est également possible que certaines colonnes de 50 m ou 60 m de
longueur puissent également obtenir cette séparation, essentiellement pour des huiles d’origine végétale.
D’autres types de colonnes (BPX70, DB-23, HP-23, Rtx-2330, SP-2330, SP-2380, etc.) peuvent également être
utilisés, mais un décalage de l’ordre d’élution est possible. Pour une analyse rapide par chromatographie
en phase gazeuse, il est également possible d’utiliser des colonnes courtes (10 m à 15 m), mais avec des
informations limitées qui, dans certains cas, ne constitueront pas un problème.
6.3 Microseringue, pour chromatographie en phase gazeuse, contenance 10 μl, avec aiguille en acier
trempé.
3) Exemples de produits appropriés disponibles sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs
du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve l’emploi des produits ainsi désignés. Des produits
équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils aboutissent aux mêmes résultats.
6.4 Gaz vecteur, hydrogène (recommandé), azote ou hélium, pureté 99,999 5 % ou supérieure, de qualité
pour chromatographie en phase gazeuse, sec et privé d’oxygène à l’aide de filtres appropriés (<0,1 mg/kg),
exempt d’impuretés organiques.
AVERTISSEMENT — L’hydrogène, utilisé avec les colonnes capillaires, permet de doubler la vitesse
d’analyse (par rapport à l’hélium), mais il est dangereux. Il existe cependant des générateurs
d’hydrogène et des dispositifs de sécurité et il est indispensable d’incorporer un dispositif approprié
dans l’appareil.
6.5 Gaz de flamme, hydrogène et air, de qualité pour chromatographie en phase gazeuse,
exempts d’impuretés organiques.
6.6 Gaz d’entraînement, azote ou hélium, de qualité pour chromatographie en phase gazeuse,
exempt d’impuretés organiques.
7 Échantillonnage
Il convient qu’un échantillon représentatif soit transmis au laboratoire. Il convient qu’il ne soit pas
endommagé ou modifié pendant le transport ou la conservation.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Une méthode
d’échantillonnage recommandée est donnée dans l’ISO 5555.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformément à l’ISO 661.
9 Préparation des esters méthyliques de corps gras et d’acides gras
Les EMAG doivent être préparés conformément à l’ISO 12966-2 ou à l’ISO 12966-3. L’utilisation de
l’ISO 12966-3 n’est pas recommandée pour la quantification en masse des EMAG (g/100 g) car seuls 70 % à
80 % des acides gras libres sont estérifiés et cette préparation peut conduire à une isomérisation des acides
gras insaturés tels que les acides conjugués d’octadécadiénoate de méthyle (ALC).
Avant la méthylation, la solution d’étalon interne est introduite dans la fiole de réaction de manière à obtenir,
après l’addition du corps gras, une fraction massique comprise entre 0,01 mg et 0,20 mg d’étalon interne/mg
de corps gras.
Par exemple, 2 ml de solution étalon interne (5.2) peuvent être ajoutés à une prise d’essai de 100 mg de corps
gras avant méthylation.
Dissoudre les EMAG préparés dans de l’iso-octane (5.3) ou du MTBE (5.4) ou du n-heptane (5.6) ou du n-hexane
(5.5). Pour une injection avec division, il convient que la concentration massique soit d’environ 15 mg/ml à
20 mg/ml. Pour une injection directe dans la colonne, il convient que la concentration massique soit adaptée.
Il est recommandé d’effectuer une analyse supplémentaire de l’échantillon sans ajouter l’étalon interne afin
de vérifier la teneur naturelle en acide gras qui est utilisé comme étalon interne. Cette teneur naturelle doit
être prise en compte dans le calcul.
10 Mode opératoire
AVERTISSEMENT — Compte tenu du caractère toxique de certains solvants, une hotte ventilée doit
être utilisée.
10.1 Généralités
Le premier échantillon d’un lot d’analyse doit toujours être un solvant de dissolution des EMAG à blanc.
Aucun pic ne doit être détecté lors de cet essai à blanc.
10.2 Conditions de chromatographie en phase gazeuse
Régler les températures et les conditions de chromatographie en phase gazeuse en tenant compte du type
de corps gras ou d’acide gras analysé et de l’appareillage utilisé. Les conditions suivantes se sont révélées
appropriées pour la séparation des EMAG (C4 à C24) sur des colonnes de 100 m. Toutefois, d’autres conditions
sont également possibles et peuvent être utilisées.
Température de l’injecteur: 250 °C
Température du détecteur: 250 °C
Température du four: 60 °C (2 min) à 172 °C à 30 °C/min, maintien pendant 5 min à 172 °C, 172 °C à
210 °C à 1 °C/min, maintien pendant 22 min à 210 °C
Gaz vecteur (hydrogène): pression en tête de colonne, 150 kPa (pression constante)
vitesse linéaire: 30 cm/s à 40 cm/s; débit: environ 1,0 ml/min
rapport de division, 1:25 ou 1:100 selon la dilution
Volume d’injection: 1 µl (équivalent à 15 µg à 20 µg d’EMAG)
Des exemples de chromatogrammes sont donnés à l’Annexe B.
NOTE Pour l’analyse des corps gras d’origine animale, l’élution complète de tous les EMAG peut être contrôlée
avec des étalons de référence certifiés.
10.3 Contrôle des performances
Les performances de la colonne sont contrôlées à l’aide d’un mélange approprié d’EMAG couvrant la gamme
des acides gras étudiés. Étant donné que les modèles d’appareils de CPG du commerce sont différents et
que la séparation obtenue n’est pas identique aux exemples de chromatogrammes, de légères modifications
de la taille de l’échantillon, de la concentration de l’échantillon ou de la température du four peuvent être
nécessaires. Dans ce cas, ajuster la taille de l’échantillon, la concentration de l’échantillon ou la température
du four jusqu’à obtention des meilleurs résultats de séparation. Si la température du four pour colonne doit
être ajustée, il convient de le faire par petits incréments, de préférence par paliers de 1 °C.
Prêter une attention particulière à la séparation et à l’identification des paires critiques telles que C16:1/
C17:0, C18:3n-3/C20:1 et C21:0/C18:2 conjugués.
Pour la quantification précise d’AGT C18:1 (teneur ≥ 0,3 g/100 g de corps gras), une résolution suffisante
entre C18:1 trans-13/14 et C18:1 cis-9 (acide oléique) est requise. La résolution est déterminée par injection
de la solution qualitative de mélange étalon d’isomères EMAG C18:1 cis et trans (5.1.1.1) ou par injection de
la solution qualitative de mélange étalon d’isomères cis et trans (5.7).
Diluer en fonction du type d’injecteur utilisé. Injecter la solution d’étalonnage (5.1.1.1 ou 5.7) dans le
chromatographe en phase gazeuse. Déterminer la largeur du pic à mi-hauteur et la distance entre la gauche
du chromatogramme et le sommet du pic pour C18:1 trans-13/14 et C18:1 cis-9 (ester méthylique d’acide
oléique). Le critère de résolution R est calculé en utilisant la Formule (1):
11, 8 tt
RR21
R (1)
WW
1 1
1 2
2 2
où
t est la distance, en minutes, entre la gauche du chromatogramme et le sommet du pic 1 (C18:1
R1
trans-13/14);
t est la distance, en minutes, entre la gauche du chromatogramme et le sommet du pic 2 (C18:1
R2
cis-9);
W est la largeur du pic, en minutes, à mi-hauteur, du pic 1 (C18:1 trans-13/14);
W est la largeur du pic, en minutes, à mi-hauteur, du pic 2 (C18:1 cis-9).
1
La résolution est suffisante lorsque le critère R est ≥ 1,00 ± 5 % (voir Figure C.6).
NOTE En cas de résolution insuffisante, mais avec R proche de la valeur cible, le réglage fin des conditions de
chromatographie (c’est-à-dire une légère modification de la pression/du débit du gaz vecteur ou du programme de
température du four) peut donner une valeur R acceptable.
11 Calculs
11.1 Analyse qualitative et identification des pics
Chaque EMAG est identifié par son temps de rétention et par comparaison avec des étalons d’EMAG de
référence, en utilisant une solution qualitative de mélange étalon d’isomères cis et trans (5.7) ou en utilisant
un corps gras ou une huile ayant une composition certifiée en acides gras (5.1.2).
Lorsque des pics inconnus sont observés, il convient de les identifier à l’aide de méthodes appropriées telles
que la chromatographie en phase gazeuse couplée à une spectrométrie de masse (CG-SM), la spectrométrie
infrarouge à transformée de Fourier (FTIR), la chromatographie à l’ion argent et des méthodes chimiques
classiques. Il convient de ne pas inclure les pics d’identité inconnue dans la somme des aires des pics lors
du calcul de la composition en acides gras, sauf s’il a été confirmé qu’il s’agit d’acides gras. Il est également
possible d’établir un récapitulatif des pics inconnus.
Identification des acides gras trans C18:1: identifier et regrouper tous les isomères trans de C18:1 élués avant
l’ester méthylique d’acide oléique (C18:1 n-9 cis) selon les chromatogrammes de l’Annexe C.
Identification des acides gras trans C18:2: identifier et regrouper tous les isomères trans de C18:2 élués avant
l’ester méthylique d’acide linoléique (C18:2 n-6 cis) selon les chromatogrammes de l’Annexe C.
Identification des acides gras trans C18:3: identifier et regrouper tous les isomères trans de C18:3 élués avant
l’ester méthylique d’acide linolénique (C18:3 n-3 cis) selon les chromatogrammes de l’Annexe C.
11.2 Analyse quantitative
11.2.1 Généralités
Les aires sont corrigées par des facteurs de correction spécifiques (F). Ces facteurs sont déterminés pour
chaque instrument. À cet effet, une solution étalon d’EMAG d’étalonnage (5.1.4) contenant une composition
d’acides gras certifiée est injectée trois fois.
Ces facteurs de correction ne sont pas identiques aux facteurs de correction théoriques du détecteur à
ionisation de flamme (FID) qui sont indiqués à l’Annexe A, car ils englobent également les performances du
système d’injection, etc. Toutefois, en cas de différences plus importantes, les performances de l’ensemble du
système doivent être contrôlées.
Pour la solution étalon d’EMAG d’étalonnage (5.1.4), la fraction massique w , en grammes pour 100 g d’EMAG,
i
i, est donnée par la Formule (2):
m
i
w ×100 (2)
i
m
où
m est la masse de l’EMAG i dans la solution étalon d’EMAG d’étalonnage;
i
Σm est la somme des masses des différents constituants EMAG de la solution étalon d’EMAG
d’étalonnage.
À partir du chromatogramme de la solution étalon d’EMAG d’étalonnage (5.1.4), calculer le pourcentag
...
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