ISO 18363-2:2025
(Main)Animal and vegetable fats and oils — Determination of fatty-acid-bound chloropropanediols (MCPDs) and glycidol by GC/MS — Part 2: Method using slow alkaline transesterification and measurement for 2-MCPD, 3-MCPD and glycidol
Animal and vegetable fats and oils — Determination of fatty-acid-bound chloropropanediols (MCPDs) and glycidol by GC/MS — Part 2: Method using slow alkaline transesterification and measurement for 2-MCPD, 3-MCPD and glycidol
This document specifies a procedure for the parallel determination of glycidol together with 2-MCPD and 3-MCPD present in bound or free form in oils and fats. The method is based on alkaline-catalysed ester cleavage, transformation of the released glycidol into monobromopropanediol (MBPD) and derivatisation of the derived free diols (MCPD and MBPD) with phenylboronic acid (PBA). Though free MCPD and glycidol are supposed to be present in fats and oils in low to negligible quantities only, in the event that free analytes are present, they would contribute proportionately to the results. The results always being the sum of the free and the bound form of a single analyte. This method is applicable to solid and liquid fats and oils. This document can also apply to animal fats and used frying oils and fats, but a validation study is undertaken before the analysis of these matrices. Milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) are excluded from the scope of this document.
Corps gras d’origines animale et végétale — Détermination des esters de chloropropanediols (MCPD) et d’acides gras et des esters de glycidol et d’acides gras par CPG/SM — Partie 2: Méthode par transestérification alcaline lente et mesure pour le 2-MCPD, le 3-MCPD et le glycidol
Le présent document spécifie un mode opératoire permettant la détermination parallèle du glycidol ainsi que du 2-MCPD et du 3-MCPD présents sous forme liée ou libre dans les corps gras. La méthode repose sur un clivage des esters par catalyse alcaline, une transformation du glycidol ainsi libéré en monobromopropanediol (MBPD) et une dérivatisation des diols libres (MCPD et MBPD) en présence d’acide phénylboronique (PBA). Bien qu’il soit considéré que du MCPD et du glycidol libres ne sont présents dans les corps gras qu’en quantités faibles ou négligeables, dans le cas où des analytes libres seraient présents, ceux-ci contribueraient proportionnellement aux résultats. Les résultats sont toujours la somme de la forme libre et de la forme liée d’un même analyte. La présente méthode est applicable aux corps gras solides et liquides. Le présent document peut également s’appliquer aux graisses animales et aux huiles de friture usagées, mais une étude de validation est menée avant de procéder à l’analyse de ces matrices. Le lait et les produits laitiers (ou les corps gras issus du lait et des produits laitiers) sont exclus du domaine d’application du présent document.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 18363-2
Second edition
Animal and vegetable fats and
2025-01
oils — Determination of fatty-acid-
bound chloropropanediols (MCPDs)
and glycidol by GC/MS —
Part 2:
Method using slow alkaline
transesterification and
measurement for 2-MCPD, 3-MCPD
and glycidol
Corps gras d’origines animale et végétale — Détermination des
esters de chloropropanediols (MCPD) et d’acides gras et des
esters de glycidol et d’acides gras par CPG/SM —
Partie 2: Méthode par transestérification alcaline lente et mesure
pour le 2-MCPD, le 3-MCPD et le glycidol
Reference number
© ISO 2025
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CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: +41 22 749 01 11
Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents . 3
5.1 General .3
5.2 Solvents and chemicals .3
5.3 Standard and reference compounds .3
5.4 Working solutions .4
5.5 Other solutions .4
6 Apparatus . 4
7 Sample . 5
7.1 Sampling .5
7.2 Preparation of the test sample .5
8 Procedure . 5
8.1 Spiking with surrogate standard and homogenization .5
8.2 Ester cleavage and glycidol transformation .5
8.3 Matrix removal .6
8.4 Derivatization .6
8.5 Gas chromatography/mass spectrometry references .6
9 Expression of results . 7
9.1 Determination of bound glycidol . .7
9.2 Determination of bound 2-MCPD .8
9.3 Determination of bound 3-MCPD .9
9.4 Determination of the degree of diester cleavage .9
9.5 Quality control .9
10 Notes . . 10
Annex A (informative) Examples of relevant chromatograms and data evaluation using “low-
MCPD” palm oil .12
Annex B (informative) Results of interlaboratory tests . 19
Bibliography .21
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11,
Animal and vegetable fats and oils, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN)
Technical Committee CEN/TC 307, Oilseeds, vegetable and animal fats and oils and their by-products - Methods
of sampling and analysis, in accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN
(Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 18363-2:2018), of which it constitutes a minor
revision to align the Introduction with ISO 18363-4:2021.
A list of all parts in the ISO 18363 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
[1]
The ISO 18363 series can be used for the determination of ester-bound MCPD and glycidol. This
introduction describes the methods specified in the different parts so that the analyst can decide which
methods are suitable for application. The detailed application of each method is contained within the scope
of each individual method.
[2] [3]
ISO 18363-1 is a differential method equivalent to the DGF standard C-VI 18 (10) and identical to AOCS
[4]
Official Method Cd 29c-13 . In brief, it is based on a fast alkaline catalysed release of 3-MCPD and glycidol
from the ester derivatives. Glycidol is subsequently converted into induced 3-MCPD. It consists of two parts.
The first part (A) allows the determination of the sum of ester-bound 3-MCPD and ester-bound glycidol,
whereas the second part (B) determines ester-bound 3-MCPD only. Both assays are based on the release
of the target analytes 3-MCPD and glycidol from the ester-bound form by an alkaline catalysed alcoholysis
carried out at room temperature. In part A, an acidified sodium chloride solution is used to stop the
reaction and subsequently convert the glycidol into induced 3-MCPD. Thus, 3-MCPD and glycidol become
indistinguishable in part A. In part B, the reaction stop is achieved by the addition of an acidified chloride-free
salt solution which also prevents the conversion of glycidol into induced MCPD. Consequently, part B allows
the determination of the genuine 3-MCPD content. Finally, the glycidol content of the sample is proportional
to the difference of both assays (A – B) and can be calculated when the transformation ratio from glycidol
to 3-MCPD has been determined. ISO 18363-1 is applicable to the fast determination of ester-bound 3-MCPD
and glycidol in refined and non-refined vegetable oils and fats. ISO 18363-1 can also apply to animal fats and
used frying oils and fats, but a validation study must be undertaken before the analysis of these matrices.
Any free analytes within the sample would be included in the results, but the document does not allow the
distinction between free and bound analytes. However, as of publication of this document, research has not
shown any evidence of a free analyte content as high as the esterified analyte content in refined vegetable
oils and fats. In principle, ISO 18363-1 can also be modified in such a way that the determination of 2-MCPD
[5]
is feasible, but again, a validation study must be undertaken before the analysis of this analyte.
[6][7]
This document (i.e. ISO 18363-2) represents AOCS Official Method Cd 29b-13. For information on
corresponding validation data, see Annex B. In brief, it is based on a slow alkaline release of MCPD and
glycidol from the ester derivatives. Glycidol is subsequently converted into 3-MBPD. This document consists
of two sample preparations that differ in the use of internal standards. Both preparations are used for
the determination of ester-bound 2-MCPD and 3-MCPD. In part A, a preliminary result for ester-bound
glycidol is determined. Because the 3-MCPD present in the sample is converted to some minor extent into
induced glycidol by the sample preparation, part B serves to quantify this amount of induced glycidol that is
subsequently subtracted from the preliminary glycidol result of part A. By the use of isotope-labelled free
MCPD isomers in assay A and isotopically-labelled ester-bound 2-MCPD and 3-MCPD in part B, the efficiency
of ester cleavage can be monitored. Both assays A and B are based on the release of the target analytes
2-MCPD, 3-MCPD and glycidol from the ester-bound form by a slow alkaline catalysed alcoholysis in the cold.
In both sample preparations, the reaction is stopped by the addition of an acidified concentrated sodium
bromide solution so as to convert the unstable and volatile glycidol into 3-MBPD which shows comparable
properties to 3-MCPD with regard to its stability and chromatographic performance. Moreover, the major
excess of bromide ions prevents the undesired formation of 3-MCPD from glycidol in the case of samples
which contain naturally occurring amounts of chloride. This document is applicable to the determination
of ester-bound 3-MCPD, 2-MCPD and glycidol in refined and unrefined vegetable oils and fats. It also applies
to animal fats and used frying oils and fats, but a validation study must be undertaken before the analysis
of these matrices. Any free analytes within the sample are included in the results, but the document does
not allow the distinction between free and bound analytes. However, as of publication of this document,
research has not shown any evidence of a free analyte content as high as the esterified analyte content in
refined vegetable oils and fats.
[8] [9][10]
ISO 18363-3 represents AOCS Official Method Cd 29a-13. In brief, it is based on the conversion of
glycidyl esters into 3-MBPD esters and a slow acidic catalysed release of MCPD and MBPD from the ester
derivatives. ISO 18363-3 is based on a single sample preparation in which glycidyl esters are converted into
MBPD monoesters, and subsequently the free analytes 2-MCPD, 3-MCPD and 3-MBPD are released by a slow
acid-catalysed alcoholysis. The 3-MBPD represents the genuine content of bound glycidol. ISO 18363-3 is
applicable to the determination of ester-bound 2-MCPD, 3-MCPD and glycidol in refined and non-refined
vegetable oils and fats. It also applies to animal fats and used frying oils and fats, but a validation study
must be undertaken before the analysis of these matrices. The method is suited for the analysis of bound
v
(esterified) analytes, but if required, ISO 18363-3 can also be performed without the initial conversion of
glycidyl esters. In such a setup, both free and bound 2-MCPD and 3-MCPD forms are included in the results
and the amount of free analytes can be calculated as the difference between two determinations performed
in both setups. However, as of publication of this document, research has not shown any evidence of a free
analyte content as high as the esterified analyte content in refined vegetable oils and fats.
[11]
ISO 18363-4 specifies a rapid procedure based on fast alkaline cleavage of the MCPD and glycidyl
esters. The released glycidol is subsequently converted into 3-MBPD. The pH of the fast alkaline cleavage
generally causes the released MCPD to partially convert to glycidol during the cleavage of the esters, leading
to overestimation of the glycidyl ester content of the sample. By adding two distinct isotopically labelled
ester-bound 3-MCPD and glycidol internal standards, it is possible to quantify the amount of labelled
glycidol resulting from the degradation of the released internal standard. This information can be used to
correct for overestimation of the glycidyl ester induced glycidol by 3-MCPD induced glycidol. The same two
internal standards are used for quantification of the bound MCPD and glycidol, requiring a single sample
preparation to quantify bound 2-MCPD-, 3-MCPD- and glycidol esters. In analogue with ISO 18363-1, this
document and ISO 18363-3, the released MCPDs and 3-MBPD are derivatized with phenylboronic acid before
GC-MS/MS analysis. In contrast to the other parts of the ISO 18363 series, ISO 18363-4 requires GC-MS/
MS instrumentation to unambiguously detect each of the (isotopically labelled) MBPDs required for correct
quantification of the glycidyl ester induced glycidol. ISO 18363-4 is applicable to the determination of ester-
bound 3-MCPD, 2-MCPD and glycidol in refined and unrefined vegetable oils and fats. It also applies to
animal fats and used frying oils and fats, but a validation study must be undertaken before analysis of these
matrices. Any free analytes within the sample are included in the results, but ISO 18363-4 will not allow the
distinction between free and bound analytes. However, as of publication of this document, research has not
shown any evidence of a free analyte content as high as the esterified analyte content in refined vegetable
oils and fats.
vi
International Standard ISO 18363-2:2025(en)
Animal and vegetable fats and oils — Determination of
fatty-acid-bound chloropropanediols (MCPDs) and glycidol
by GC/MS —
Part 2:
Method using slow alkaline transesterification and
measurement for 2-MCPD, 3-MCPD and glycidol
1 Scope
This document specifies a procedure for the parallel determination of glycidol together with 2-MCPD and
3-MCPD present in bound or free form in oils and fats. The method is based on alkaline-catalysed ester
cleavage, transformation of the released glycidol into monobromopropanediol (MBPD) and derivatisation of
the derived free diols (MCPD and MBPD) with phenylboronic acid (PBA). Though free MCPD and glycidol are
supposed to be present in fats and oils in low to negligible quantities only, in the event that free analytes are
present, they would contribute proportionately to the results. The results always being the sum of the free
and the bound form of a single analyte.
This method is applicable to solid and liquid fats and oils. This document can also apply to animal fats and
used frying oils and fats, but a validation study is undertaken before the analysis of these matrices.
Milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) are excluded from the scope of this
document.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
bound 2-MCPD
sum of all 2-MCPD-derivatives that are cleaved by alkaline-catalysed alcoholysis
Note 1 to entry: The content of bound 2-MCPD is reported in milligrams per kilogram (mg/kg).
3.2
bound 3-MCPD
sum of all 3-MCPD-derivatives that are cleaved by alkaline-catalysed alcoholysis
Note 1 to entry: The content of bound 3-MCPD is reported in milligrams per kilogram (mg/kg).
3.3
bound glycidol
sum of all glycidyl derivatives that are cleaved by alkaline-catalysed alcoholysis
Note 1 to entry: The content of bound glycidol is reported in milligrams per kilogram (mg/kg).
4 Principle
For the determination of bound 2-MCPD, bound 3-MCPD and bound glycidol as free 2-MCPD, free 3-MCPD and
free 3-MBPD (3-Monobromopropanediol), two aliquots (A and B) of the sample are spiked with surrogate
standards (d -2-MCPD, d -3-MCPD, d -glycidylester in assay A and d -2-MCPD-1,3-diester, d -3-MCPD-1,2-
5 5 5 5 5
diester in assay B) and dissolved in diethyl ether. Both assays are processed in parallel. The addition of a
diluted solution of sodium hydroxide or sodium methoxide in methanol in the cold will release free 2-MCPD,
free 3-MCPD and free glycidol over a period of 8 h to 12 h. This reaction is stopped by the addition of an excess
amount of sodium bromide in acidic solution. Under acidic conditions, free glycidol reacts with inorganic
bromide to form 3-MBPD and a small amount of 2-MBPD. Undesired non-polar compounds in the sample
are removed by double extraction of the aqueous phase with isohexane. The analytes, together with the
surrogate standards, are transferred into an organic phase by multiple extraction of the aqueous phase with
diethyl ether, ethyl acetate or a mixture of both solvents. Derivatization takes place in the organic phase by
reaction with PBA. In order to remove excess amounts of PBA, the analytes are concentrated and transferred
into an inert organic solvent. The sample extract is then placed over a small amount of anhydrous sodium
sulfate and evaporated to dryness under a stream of nitrogen before being finally redissolved in iso-octane
for the measurement by GC/MS.
The alkaline catalysed transesterification in the cold minimizes the undesired transformation of 3-MCPD
into glycidol that proceeds to a significant extend when the reaction is carried out at room temperature.
Nevertheless, in case of large amounts of 3-MCPD being present, even a minor transformation into glycidol
might increase the glycidol results from assay A artificially. In order to achieve the correct glycidol results,
even in the presence of high 3-MCPD content, assay B serves for the determination of the undesired
3-MCPD–glycidol transformation by determining the amount of d -glycidol that has been generated from d -
5 5
3-MCPD-diester by the sample preparation. The corresponding transformation ratio is used for correcting
the glycidol value derived from assay A. Another point to be taken into account is that 3-MCPD is converted
approximately 1,2-fold faster via glycidol into 3-MBPD than 3-MCPD-d via glycidol-d into 3-MBPD-d .
5 5 5
Consequently, the isotopic factor I = 1,2 has to be considered for the quantitative determination of the
amount of glycidol that has been generated accidentally from the non-labelled 3-MCPD by alkaline treatment
in assay A.
Quantification of the analytes is carried out by internal one-point-calibration using the corresponding
d -esters as surrogate standards. Therefore, no external calibration is necessary. Likewise, no analyte
recoveries have to be considered. However, the cleaving rates of MCPD mono- and diesters might be
different and as only d -MCPD-diesters serve as internal standards, the degree of ester cleavage should have
proceeded on a large scale. Therefore, the degree of variations in ester cleavage is monitored by calculating
the differences in 3-MCPD results between assay A and B. For information on deriving quantitative data
[9]
from corresponding chromatograms, see expression of results and Annex A.
As 3-MCPD can occur in certain polymers used for wet strengthening resins and for other purposes, it might
also occur from the use of consumables, e.g. screw lid vials or filter. Baking the glassware at 400 °C to 500 °C
can reduce this problem. A better solution is the use of non-contaminated materials.
5 Reagents
5.1 General
WARNING — This document requires handling of hazardous substances. Technical, organizational
and personal safety measures shall be followed.
Unless otherwise stated analytically pure reagents shall be used. Water shall comply with grade 3 of
ISO 3696.
5.2 Solvents and chemicals
5.2.1 Toluene.
5.2.2 tertiary-Butyl methyl ether (tBME), (2-Methoxy-2-methylpropane).
5.2.3 Methanol.
5.2.4 iso-Hexane (2-methyl pentane).
5.2.5 Ethyl acetate.
5.2.6 Diethyl ether.
5.2.7 iso-Octane.
5.2.8 Sodium sulfate anhydrous, granular.
5.3 Standard and reference compounds
5.3.1 2-MCPD.
5.3.2 2-MCPD-d .
1)
5.3.3 2-MCPD-1,3-bis-stearoylester.
1)
5.3.4 2-MCPD-d -1,3-bis-stearoylester.
5.3.5 3-MCPD.
5.3.6 3-MCPD-d .
1)
5.3.7 3-MCPD-1,2-bis-palmitoylester.
1)
5.3.8 3-MCPD-d -1,2-bis-palmitoylester.
1)
5.3.9 Glycidyl oleate.
1)
5.3.10 Glycidyl-d oleate.
1) Other commercially available fatty acid esters of the analytes may be substituted.
2)
5.4 Working solutions
5.4.1 2-MCPD: 10,0 μg/ml in methanol.
5.4.2 2-MCPD-d : 10,0 μg/ml in methanol.
5.4.3 3-MCPD: 10,0 μg/ml in methanol.
5.4.4 3-MCPD-d : 10,0 μg/ml in methanol.
5.4.5 2-MCPD-1,3-bis-stearoyl ester: 29,1 μg/ml in toluene; equivalent to 5,0 μg/ml free 2-MCPD.
5.4.6 2-MCPD-d -1,3-bis-stearoyl ester: 29,3 μg/ml in toluene; equivalent to 5,0 μg/ml free 2-MCPD.
5.4.7 3-MCPD-1,2-bis-palmitoyl ester: 26,6 μg/ml in toluene; equivalent to 5,0 μg/ml free 2-MCPD.
5.4.8 3-MCPD-d -1,2-bis-palmitoyl ester: 26,8 μg/ml in toluene; equivalent to 5,0 μg/ml free 2-MCPD.
5.4.9 Glycidyl oleate: 22,8 μg/ml in toluene; equivalent to 5,0 μg/ml free glycidol.
5.4.10 Glycidyl-d oleate: 23,2 μg/ml in toluene; equivalent to 5,0 μg/ml free glycidol.
5.5 Other solutions
5.5.1 Sodium hydroxide solution. Weigh 0,25 g freshly ground sodium hydroxide in a 100 ml plastic
bottle. Add 100 ml methanol and tightly seal the bottle. Shake vigorously (vortex) until the sodium hydroxide
has been dissolved completely. Store in a freezer at –22 °C to –25 °C (see 10.1).
5.5.2 Acidified sodium bromide solution. Weigh 600 g sodium bromide in a 1 l screw cap glass
volumetric flask, add deionised water up to the 1 l mark. Acidify the mixture with 3 ml of ortho-phosphoric
acid (85 %), seal tightly and shake (vortex) until the solution is clear. 600 μl of this solution must neutralize
350 μl of sodium hydroxide solution (5.5.1). Adjust the pH-value to the acidic range (pH 3 to pH 1). Store the
solution in a freezer at –22 °C to –25 °C (see 10.1).
5.5.3 Saturated solution of phenylboronic acid (PBA) in diethyl ether. Add approximately 200 mg
PBA to 10 ml diethyl ether in a screw cap vial. Shake well, allow non-dissolved PBA to settle and remain as
precipitate. For derivatization purposes, use only the clear supernatant.
6 Apparatus
6.1 Micropipettes (e.g. 10 µl to 100 µl, 10 µl to 200 µl, 100 µl to 1 000 µl).
6.2 Piston stroke and volumetric pipettes, various sizes.
6.3 Volumetric flasks, various sizes.
6.4 Analytical balance, readability 0,000 1 g, weighing precision 0,001 g.
6.5 Screw cap vials (approximately 2 ml in capacity) and screw caps with polytetrafluoroethylene
(PTFE)-coated septa.
2) Other concentrations of working solutions may be substituted.
6.6 Pasteur pipettes and pipette bulbs.
6.7 Micro inserts (approximately 200 µl in capacity) for screw cap vials (approximately 2 ml in capacity).
6.8 Nitrogen blow-off equipment.
6.9 GC/MS-system with temperature programmable injector.
6.10 Fused-silica-GC-column, stationary phase 50 % dipheny
...
Norme
internationale
ISO 18363-2
Deuxième édition
Corps gras d’origines animale et
2025-01
végétale — Détermination des
esters de chloropropanediols
(MCPD) et d’acides gras et des
esters de glycidol et d’acides gras
par CPG/SM —
Partie 2:
Méthode par transestérification
alcaline lente et mesure pour le
2-MCPD, le 3-MCPD et le glycidol
Animal and vegetable fats and oils — Determination of fatty-acid-
bound chloropropanediols (MCPDs) and glycidol by GC/MS —
Part 2: Method using slow alkaline transesterification and
measurement for 2-MCPD, 3-MCPD and glycidol
Numéro de référence
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CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 2
5 Réactifs . 3
5.1 Généralités .3
5.2 Solvants et produits chimiques .3
5.3 Composés étalons et composés de référence .3
5.4 Solutions de travail .4
5.5 Autres solutions .4
6 Appareillage . 4
7 Échantillon . 5
7.1 Échantillonnage .5
7.2 Préparation de l’échantillon pour essai .5
8 Mode opératoire . 5
8.1 Ajout d’étalon de substitution et homogénéisation .5
8.2 Clivage des esters et transformation du glycidol.6
8.3 Élimination de la matrice .6
8.4 Dérivatisation .6
8.5 Références relatives à la chromatographie en phase gazeuse/spectrométrie de masse
(CPG/SM) .6
9 Expression des résultats . 7
9.1 Détermination du glycidol lié .7
9.2 Détermination du 2-MCPD lié .9
9.3 Détermination du 3-MCPD lié.9
9.4 Détermination du degré de clivage des diesters .9
9.5 Contrôle qualité .10
10 Notes . . 10
Annexe A (informative) Exemples de chromatogrammes pertinents et d’évaluation des données
basés sur de l’huile de palme «à faible teneur en MCPD» .13
Annexe B (informative) Résultats des essais interlaboratoires .20
Bibliographie .22
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 307,
Oléagineux, corps gras d’origines végétale et animale et leurs co-produits — Méthodes d’échantillonnage et
d’analyse, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération technique
entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 18363-2:2018), dont elle constitue une
révision mineure pour aligner l’Introduction avec l’ISO 18363-4:2021.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 18363 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
[1]
La série ISO 18363 peut être utilisée pour la détermination des esters de MCPD et de glycidol.
Cette introduction décrit les méthodes spécifiées dans les différentes parties pour que les analystes puissent
décider des méthodes qui conviennent à leurs applications. L’application détaillée de chaque méthode figure
dans le domaine d’application de chaque méthode concernée.
[2] [3]
L’ISO 18363-1 est une méthode différentielle équivalente à la norme C-VI 18 (10) de la DGF et identique
[4]
à la méthode officielle Cd 29c-13 de l’AOCS. En résumé, elle repose sur la libération rapide par catalyse
alcaline de 3-MCPD et de glycidol à partir de leurs dérivés esters. Le glycidol est par la suite converti en
3-MCPD. Elle comprend deux parties. La première partie (A) permet de déterminer la somme des esters de
3-MCPD et des esters de glycidol, tandis que la seconde partie (B) ne détermine que les esters de 3-MCPD.
Les deux analyses reposent sur la libération des analytes cibles, le 3-MCPD et le glycidol, à partir des esters
par alcoolyse en présence d’un catalyseur alcalin à température ambiante. Dans la partie A, une solution
acidifiée de chlorure de sodium est utilisée pour interrompre la réaction et induire par la suite la conversion
du glycidol en 3-MCPD. Il n’est par conséquent plus possible de faire la distinction entre le 3-MCPD et le
glycidol dans la partie A. Dans la partie B, la réaction est interrompue par ajout d’une solution saline
acidifiée exempte de chlorure qui évite aussi la conversion du glycidol en MCPD. La partie B permet ainsi de
déterminer la véritable teneur en 3-MCPD. Enfin, la teneur en glycidol de l’échantillon est proportionnelle à
la différence entre les deux analyses (A – B) et peut être calculée lorsque le coefficient de transformation du
glycidol en 3-MCPD a été déterminé. L’ISO 18363-1 s’applique à la détermination rapide des esters de 3-MCPD
et de glycidol dans les corps gras d’origine végétale raffinés et non raffinés. L’ISO 18363-1 peut également
s’appliquer aux graisses animales et aux corps gras de friture usagés, mais une étude de validation doit
être menée avant de procéder à l’analyse de ces matrices. Les analytes libres éventuellement contenus
dans l’échantillon sont habituellement inclus dans les résultats, mais le document ne permet pas de faire la
distinction entre les analytes libres et les analytes liés. Néanmoins, les études disponibles au moment de la
publication du présent document ne révèlent aucune teneur en analytes libres aussi élevée que la teneur en
analytes estérifiés dans les corps gras d’origine végétale raffinés. En principe, l’ISO 18363-1 peut également
[5]
être modifiée de façon à permettre la détermination du 2-MCPD, mais une fois encore, une étude de
validation doit être menée avant d’analyser cet analyte.
[6][7]
Le présent document (à savoir l’ISO 18363-2) correspond à la méthode officielle Cd 29b-13 de l’AOCS.
Pour des informations sur les données de validation correspondantes, voir l’Annexe B. En résumé, elle
repose sur une libération alcaline lente de MCPD et de glycidol à partir des formes esters. Le glycidol est
par la suite converti en 3-MBPD. Le présent document comprend deux préparations d’échantillons qui se
distinguent par l’utilisation d’étalons internes. Les deux préparations sont utilisées pour la détermination
des esters de 2-MCPD et de 3-MCPD. Un résultat préliminaire pour les esters de glycidol est déterminé dans
la partie A. Comme le 3-MCPD présent dans l’échantillon est partiellement converti en glycidol lors de la
préparation de l’échantillon, la partie B sert à quantifier la teneur en glycidol issue de cette transformation
qui est ensuite soustraite du résultat préliminaire obtenu pour le glycidol dans la partie A. L’utilisation
d’isomères isotopiques de MCPD libres dans l’analyse A et de formes isotopiques d’esters de 2-MCPD
et de 3-MCPD dans la partie B permet de surveiller le rendement du clivage des esters. Les analyses A et
B reposent toutes les deux sur la libération des analytes cibles, 2-MCPD, 3-MCPD et glycidol à partir des
esters dans le cadre d’une alcoolyse lente en présence d’un catalyseur alcalin dans le froid. Dans les deux
préparations d’échantillons, la réaction est interrompue par l’ajout d’une solution acidifiée et concentrée
de bromure de sodium de façon à transformer le glycidol instable et volatil en 3-MBPD qui présente des
propriétés comparables au 3-MCPD en matière de stabilité et de performances chromatographiques. De
plus, l’excès important d’ions bromure empêche la formation non souhaitée de 3-MCPD à partir du glycidol
dans les échantillons contenant naturellement des quantités de chlorure. Le présent document s’applique
à la détermination des esters de 3-MCPD, de 2-MCPD et de glycidol dans les corps gras d’origine végétale
raffinés et non raffinés. Elle s’applique également aux graisses animales et aux corps gras de friture usagés,
mais une étude de validation doit être menée avant de procéder à l’analyse de ces matrices. Les analytes
libres éventuellement contenus dans l’échantillon sont inclus dans les résultats, mais le document ne permet
pas de faire la distinction entre les analytes libres et les analytes liés. Néanmoins, les études disponibles au
moment de la publication du présent document ne révèlent aucune teneur en analytes libres aussi élevée que
la teneur en analytes estérifiés dans les corps gras d’origine végétale raffinés.
[8] [9][10]
L’ISO 18363-3 correspond à la méthode officielle Cd 29a-13 de l’AOCS. En résumé, elle repose sur la
transformation des esters de glycidol en esters de 3-MBPD et une libération lente par catalyse acide du MCPD
v
et du MBPD à partir des formes esters. L’ISO 18363-3 repose sur la préparation d’un échantillon unique
dans lequel les esters de glycidol sont transformés en monoesters de MBPD puis les analytes libres 2-MCPD,
3-MCPD et 3-MBPD sont libérés par alcoolyse lente en présence d’un catalyseur acide. Le 3-MBPD représente
la véritable teneur en glycidol lié. L’ISO 18363-3 s’applique à la détermination des esters de 2-MCPD, de
3-MCPD et de glycidol dans les corps gras d’origine végétale raffinés et non raffinés. Elle s’applique également
aux graisses animales et aux corps gras de friture usagés, mais une étude de validation doit être menée avant
de procéder à l’analyse de ces matrices. La méthode est adaptée à l’analyse d’analytes liés (estérifiés), mais
si cela est exigé, l’ISO 18363-3 peut également être mise en œuvre sans la transformation initiale des esters
de glycidol. Dans cette configuration, les formes libres et liées du 2-MCPD et du 3-MCPD sont toutes deux
incluses dans les résultats et la teneur en analytes libres peut être calculée comme la différence entre deux
déterminations réalisées dans les deux configurations. Néanmoins, les études disponibles au moment de la
publication du présent document ne révèlent aucune teneur en analytes libres aussi élevée que la teneur en
analytes estérifiés dans les corps gras d’origine végétale raffinés.
[11]
L’ISO 18363-4 spécifie un mode opératoire rapide reposant sur un clivage alcalin rapide des esters de
MCPD et de glycidol. Le glycidol libéré est par la suite converti en 3-MBPD. Le pH du clivage alcalin rapide
entraîne généralement la transformation partielle des MCPD libérés en glycidol au cours du clivage des esters,
conduisant à une surestimation de la teneur en esters de glycidol de l’échantillon. En ajoutant deux étalons
internes distincts d’ester de 3-MCPD et d’ester de glycidol marqués aux isotopes, il est possible de quantifier
la quantité de glycidol marqué résultant de la dégradation de l’étalon interne libéré. Cette information peut
être utilisée pour corriger la surestimation du glycidol issu des esters de glycidol par le glycidol issu du
3-MCPD. Les deux mêmes étalons internes sont utilisés pour la quantification des esters de MCPD et des
esters de glycidol, nécessitant la préparation d’un seul échantillon pour quantifier les esters de 2-MCPD,
3-MCPD et de glycidol. De même que dans l’ISO 18363-1, le présent document et l’ISO 18363-3, les MCPD et
3-MBPD libérés sont dérivés avec de l’acide phénylboronique avant l’analyse par CPG-SM/SM. Au contraire
des autres parties de la série ISO 18363, l’ISO 18363-4 exige un appareil de type CPG-SM/SM pour détecter
sans ambiguïté chaque MBPD (marqué aux isotopes) requis pour une quantification exacte du glycidol issu
des esters de glycidol. L’ISO 18363-4 est applicable à la détermination des esters de 3-MCPD, de 2-MCPD
et de glycidol dans les corps gras d’origine végétale raffinés et non raffinés. Elle s’applique également aux
graisses animales et aux corps gras de friture usagés, mais une étude de validation doit être menée avant
de procéder à l’analyse de ces matrices. Les analytes libres éventuellement contenus dans l’échantillon sont
inclus dans les résultats, mais l’ISO 18363-4 ne permettra pas de faire la distinction entre les analytes libres
et les analytes liés. Néanmoins, les études disponibles au moment de la publication du présent document ne
révèlent aucune teneur en analytes libres aussi élevée que la teneur en analytes estérifiés dans les corps
gras d’origine végétale raffinés.
vi
Norme internationale ISO 18363-2:2025(fr)
Corps gras d’origines animale et végétale — Détermination
des esters de chloropropanediols (MCPD) et d’acides gras et
des esters de glycidol et d’acides gras par CPG/SM —
Partie 2:
Méthode par transestérification alcaline lente et mesure pour
le 2-MCPD, le 3-MCPD et le glycidol
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie un mode opératoire permettant la détermination parallèle du glycidol
ainsi que du 2-MCPD et du 3-MCPD présents sous forme liée ou libre dans les corps gras. La méthode
repose sur un clivage des esters par catalyse alcaline, une transformation du glycidol ainsi libéré en
monobromopropanediol (MBPD) et une dérivatisation des diols libres (MCPD et MBPD) en présence d’acide
phénylboronique (PBA). Bien qu’il soit considéré que du MCPD et du glycidol libres ne sont présents dans les
corps gras qu’en quantités faibles ou négligeables, dans le cas où des analytes libres seraient présents, ceux-
ci contribueraient proportionnellement aux résultats. Les résultats sont toujours la somme de la forme libre
et de la forme liée d’un même analyte.
La présente méthode est applicable aux corps gras solides et liquides. Le présent document peut également
s’appliquer aux graisses animales et aux huiles de friture usagées, mais une étude de validation est menée
avant de procéder à l’analyse de ces matrices.
Le lait et les produits laitiers (ou les corps gras issus du lait et des produits laitiers) sont exclus du domaine
d’application du présent document.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
2-MCPD lié
somme de tous les dérivés de 2-MCPD soumis à un clivage par alcoolyse en présence d’un catalyseur alcalin
Note 1 à l'article: La teneur en 2-MCPD lié est consignée en milligrammes par kilogramme (mg/kg).
3.2
3-MCPD lié
somme de tous les dérivés de 3-MCPD soumis à un clivage par alcoolyse en présence d’un catalyseur alcalin
Note 1 à l'article: La teneur en 3-MCPD lié est consignée en milligrammes par kilogramme (mg/kg).
3.3
glycidol lié
somme de tous les dérivés du glycidol soumis à un clivage par alcoolyse en présence d’un catalyseur alcalin
Note 1 à l'article: La teneur en glycidol lié est consignée en milligrammes par kilogramme (mg/kg).
4 Principe
Pour la détermination du 2-MCPD lié, du 3-MCPD lié et du glycidol lié sous forme de 2-MCPD libre, de 3-MCPD
libre et de 3-MBPD libre (3-monobromopropanediol), deux fractions aliquotes (A et B) de l’échantillon
sont mises en solution avec les étalons de substitution (2-MCPD-d , 3-MCPD-d , ester de glycidol-d pour
5 5 5
l’analyse A et 2-MCPD-d -1,3-diester, 3-MCPD-d -1,2-diester pour l’analyse B) puis sont dissoutes dans de
5 5
l’éther diéthylique. Les deux analyses sont menées en parallèle. L’ajout d’une solution diluée d’hydroxyde
de sodium ou de méthylate de sodium dans du méthanol à froid va permettre la formation de 2-MCPD libre,
de 3-MCPD libre et de glycidol libre sur une période de 8 h à 12 h. Cette réaction est interrompue par ajout
d’un excès de bromure de sodium en solution acide. En milieu acide, le glycidol libre réagit avec le bromure
inorganique pour former du 3-MBPD et une petite quantité de 2-MBPD. Les composés apolaires indésirables
de l’échantillon sont éliminés par double extraction de la phase aqueuse avec de l’isohexane. Les analytes,
ainsi que les étalons de substitution, sont transférés dans une phase organique par extractions multiples
de la phase aqueuse à l’aide d’éther diéthylique, d’acétate d’éthyle ou d’un mélange des deux solvants. La
dérivatisation se produit dans la phase organique par réaction avec l’acide phénylboronique (PBA). Afin
d’éliminer l’excès de PBA, concentrer les analytes et les transférer dans un solvant organique inerte. L’extrait
d’échantillon est placé sur une petite quantité de sulfate de sodium anhydre puis il est évaporé à sec sous
flux d’azote avant d’être à nouveau dissout dans de l’iso-octane pour mesurage par CPG/SM.
La transestérification par catalyse alcaline à froid permet de réduire au minimum la transformation non
souhaitée du 3-MCPD en glycidol et qui est importante à température ambiante. Néanmoins, en présence
de grandes quantités de 3-MCPD, même une faible transformation en glycidol pourrait augmenter
artificiellement les résultats du glycidol de l’analyse A. Afin d’obtenir des résultats de glycidol corrects,
même en présence d’une grande quantité de 3-MCPD, l’analyse B permet de déterminer la transformation
non souhaitée du 3-MCPD-glycidol en déterminant la teneur en glycidol-d générée à partir du 3-MCPD-d -
5 5
diester lors de la préparation de l’échantillon. Le coefficient de transformation correspondant permet de
corriger la valeur de glycidol provenant de l’analyse A. Un autre point à prendre en compte est que le 3-MCPD
est converti environ 1,2 fois plus rapidement en 3-MBPD via le glycidol que le 3-MCPD-d en 3-MBPD-d
5 5
via le glycidol-d . Par conséquent, il faut tenir compte du facteur isotopique I = 1,2 dans la détermination
quantitative de la quantité de glycidol générée accidentellement à partir du 3-MCPD non marqué lors du
traitement alcalin de l’analyse A.
La quantification des analytes est réalisée par un étalonnage interne à un point en utilisant les esters d
comme étalons de substitution. Aucun étalonnage externe n’est donc nécessaire. De même, aucun rendement
d’analyte ne doit être pris en compte. Cependant, il se peut que les taux de clivage diffèrent entre les
monoesters et les diesters de MCPD, et comme seuls les diesters de MCPD-d servent d’étalons internes,
il convient de déterminer le degré de clivage des esters sur une grande étendue. C’est pourquoi le degré de
variation du clivage des esters est surveillé en calculant la différence entre les résultats du 3-MCPD obtenus
pour les analyses A et B. Pour en savoir plus sur la façon de tirer des données quantitatives à partir des
[9]
chromatogrammes correspondants, voir l’expression des résultats et l’Annexe A.
Comme du 3-MCPD peut apparaître dans certains polymères utilisés pour humidifier des résines de renfort
et dans d’autres buts, il peut également apparaître à la suite de l’utilisation de consommables tels que les
filtres ou les flacons à bouchon vissé. Conditionner la verrerie entre 400 °C et 500 °C peut réduire ce risque,
la meilleure solution restant toutefois l’utilisation de matériaux non contaminés.
5 Réactifs
5.1 Généralités
AVERTISSEMENT — Le présent document exige la manipulation de substances dangereuses.
Les mesures de sécurité sur les plans technique, organisationnel et du personnel doivent être suivies.
Sauf indication contraire, des réactifs analytiquement purs doivent être utilisés. L’eau doit être de qualité 3
conformément à ISO 3696.
5.2 Solvants et produits chimiques
5.2.1 Toluène.
5.2.2 tert-Butyl méthyl éther (tBME), (2-méthoxy-2-méthylpropane).
5.2.3 Méthanol.
5.2.4 Iso-Hexane (2-méthylpentane).
5.2.5 Acétate d’éthyle.
5.2.6 Oxyde diéthylique.
5.2.7 Iso-octane.
5.2.8 Sulfate de sodium anhydre, poudre.
5.3 Composés étalons et composés de référence
5.3.1 2-MCPD.
5.3.2 2-MCPD-d .
1)
5.3.3 2-MCPD-1,3-bis-stéaroylester.
1)
5.3.4 2-MCPD-d -1,3-bis-stéaroylester.
5.3.5 3-MCPD.
5.3.6 3-MCPD-d .
1)
5.3.7 3-MCPD-1,2-bis-palmitoylester.
1)
5.3.8 3-MCPD-d -1,2-bis-palmitoylester.
1)
5.3.9 Oléate de glycidyle.
1)
5.3.10 Oléate de glycidyle-d .
1) Il est permis de substituer ces produits par d’autres esters d’acides gras des analytes disponibles sur le marché.
2)
5.4 Solutions de travail
5.4.1 2-MCPD: 10,0 μg/ml dans du méthanol.
5.4.2 2-MCPD-d : 10,0 μg/ml dans du méthanol.
5.4.3 3-MCPD: 10,0 μg/ml dans du méthanol.
5.4.4 3-MCPD-d : 10,0 μg/ml dans du méthanol.
5.4.5 2-MCPD-1,3-bis-stéaroylester: 29,1 μg/ml dans du toluène; équivalent à 5,0 μg/ml de
2-MCPD libre.
5.4.6 2-MCPD-d -1,3-bis-stéaroylester: 29,3 μg/ml dans du toluène; équivalent à 5,0 μg/ml de
2-MCPD libre.
5.4.7 3-MCPD-1,2-bis-palmitoylester: 26,6 μg/ml dans du toluène; équivalent à 5,0 μg/ml de
2-MCPD libre.
5.4.8 3-MCPD-d -1,2-bis-palmitoylester: 26,8 μg/ml dans du toluène; équivalent à 5,0 μg/ml de
2-MCPD libre.
5.4.9 Oléate de glycidyle: 22,8 μg/ml dans du toluène; équivalent à 5,0 μg/ml de glycidol libre.
5.4.10 Oléate de glycidyle-d : 23,2 μg/ml dans du toluène; équivalent à 5,0 μg/ml de glycidol libre.
5.5 Autres solutions
5.5.1 Solution d’hydroxyde de sodium. Peser 0,25 g d’hydroxyde de sodium fraîchement broyé et les placer
dans un flacon en plastique de 100 ml. Ajouter 100 ml de méthanol et fermer hermétiquement le flacon.
Agiter vigoureusement (à l’aide d’un agitateur de type vortex) jusqu’à dissolution complète. Stocker au
congélateur entre –22 °C et –25 °C (voir 10.1).
5.5.2 Solution acidifiée de bromure de sodium. Peser 600 g de bromure de sodium et les placer dans une
fiole jaugée en verre de 1 l munie d’un bouchon à vis, puis compléter avec de l’eau désionisée jusqu’à 1 l.
Acidifier le mélange avec 3 ml d’acide ortho-phosphorique (à 85 %), fermer hermétiquement et agiter (à l’aide
d’un agitateur de type vortex) jusqu’à obtention d’une solution transparente. 600 μl de cette solution doivent
neutraliser 350 μl de solution d’hydroxyde de sodium (5.5.1). Ajuster la valeur du pH dans la plage acide
(pH 3 à pH 1). Stocker la solution au congélateur entre –22 °C et –25 °C (voir 10.1).
5.5.3 Solution saturée d’acide phénylboronique (PBA) dans de l’éther diéthylique. Placer environ 200 mg
de PBA dans un flacon à bouchon vissé de 10 ml rempli d’éther diéthylique. Bien agiter puis laisser décanter
le PBA non dissout. Aux fins de la dérivatisation, utiliser uniquement le surnageant transparent.
6 Appareillage
6.1 Micropipettes (par exemple, de 10 µl à 100 µl, de 10 µl à 200 µl, de 100 µl à 1 000 µl).
6.2 Pipettes à piston et volumétriques, de différentes tailles.
6.3 Fioles jaugées, de différentes tailles.
2) Il est permis de substituer ces concentrations par d’autres concentrations de solutions de travail.
6.4 Balance analytique, précision d’affichage de 0,000 1 g, précision de pesée de 0,001 g.
6.5 Flacons à bouchon vissé (d’une capacité de 2 ml environ) et bouchons à vis avec septums recouverts
de polytétrafluoroéthylène (PTFE).
6.6 Pipettes Pasteur et poires à pipeter.
6.7 Micro inserts (d’une capacité d’environ 200 µl) pour flacons à bouchon vissé (d’une capacité de 2 ml
environ).
6.8 Équipement générateur de flux d’azote.
6.9 Système de CPG/SM avec injecteur à température programmable.
6.10 Colonne de CPG en silice fondue, phase stationnaire 50 % diphényl- 50 % diméthylpolysiloxane,
longueur 30 m, diamètre intérieur 0,25 mm, épaisseur du film 0,25 μm, à faible ressuage pour SM,
avec précolonne.
La précolonne, qu’il convient de remplacer périodiquement, piège les composants non volatils et permet
donc de prolonger la durée de vie de la colonne principale.
7 Échantillon
7.1 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la présente méthode. Une méthode d’échantillonnage recommandée
[12]
est donnée dans l’ISO 5555 .
7.2 Préparation de l’échantillon pour essai
Prélever directement des quantités aliquotes d’échantillons liquides. Faire fondre les matières grasses
solides ou semi-solides dans une étuve à dessiccation ou un bain-marie à environ 80 °C. Pour les matières
grasses ayant un point de fusion élevé, la température peut être augmentée par paliers de 10 °C jusqu’à
déclenchement du processus de fusion. Prélever des quantités aliquotes d’échantillons contenant une teneur
en eau plus élevée sans fusion pour éviter toute séparation de phase.
8 Mode opératoire
NOTE Voir 10.2.
8.1 Ajout d’étalon de substitution et homogénéisation
Peser deux quantités aliquotes de (100 ± 0,5) mg de l’échantillon et les placer dans deux flacons à bouchon
vissé d’une capacité d’environ 2 ml, ou peser avec précision deux quantités aliquotes d’environ 100 mg de
l’échantillon et veiller à obtenir un bilan massique correct en matière de quantification. Ajouter dans le
flacon d’analyse A 50 μg de chacune des solutions de travail étalons à base de 2-MCPD-d et de 3-MCPD-d
5 5
(5.4.2 et 5.4.4). Ajouter par pipetage dans le flacon d’analyse A 100 μl de solution de travail étalon d’ester
de glycidol-d (5.4.10). Transférer dans le flacon d’analyse B 100 μl de solution de travail étalon de 2-MCPD-
d -bis-ester (5.4.6) et 100 μl de solution de travail étalon de 3-MCPD-d -bis-ester (5.4.8). Ajouter à chaque
5 5
échantillon 600 μl d’éther diéthylique puis agiter (à l’aide d’un agitateur de type vortex) les mélanges
jusqu’à dissolution complète. En cas d’échantillon à point de fusion élevé, les flacons peuvent exiger un léger
chauffage.
8.2 Clivage des esters et transformation du glycidol
Placer au congélateur les deux flacons d’analyse pendant au moins 15 min pour abaisser leur température
entre −22 °C et −25 °C (une précipitation à ce stade de la préparation de l’échantillon n’est pas un problème).
Ajouter dans chaque flacon d’analyse 350 μl de solution méthanolique d’hydroxyde de sodium (5.5.1).
Pour procéder au clivage des esters, fermer les flacons, les agiter brièvement (à l’aide d’un agitateur de type
vortex) et les conserver pendant au moins 16 h entre –22 °C et –25 °C. Interrompre les réactions à l’aide de
600 μl de solution acidifiée de bromure de sodium (5.5.2) stockée entre –22 °C et –25 °C. Agiter brièvement
(à l’aide d’un agitateur de type vortex) les solutions et les placer sous un léger courant d’azote pour réduire
le volume de la phase organique à environ 100 μl. Ajouter aux deux flacons 600 µl d’iso-hexane, boucher les
flacons et les agiter vigoureusement (à l’aide d’un agitateur de type vortex). Laisser reposer les solutions
à température ambiante pendant environ 5 à 10 min pour achever la transformation du glycidol en MBPD
(voir 10.3).
NOTE D’autres plages de température peuvent être appliquées pour procéder au clivage des esters si une
validation de méthode a été réalisée. Il est important de garder en tête que travailler à une température supérieure
à −22 °C entraîne une augmentation de la conversion du 3-MCPD en glycidol. L’incertitude de la détermination de la
teneur en glycidol peut alors augmenter.
8.3 Élimination de la matrice
Éliminer la phase organique à l’aide d’une pipette Pasteur. Laver la phase aqueuse de chaque flacon d’analyse
avec 600 μl d’iso-hexane supplémentaires.
8.4 Dérivatisation
À l’aide de pipettes Pasteur neuves, procéder à l’extraction de chaque flacon d’analyse à trois reprises avec
600 µl d’un mélange 3:2 (v:v) d’éther diéthylique/acétate d’éthyle. Veiller à ce que la pipette ne touche pas la
phase aqueuse. Pour chaque flacon d’analyse A et B, réunir les extraits organiques dans un nouveau flacon à
bouchon vissé contenant une petite quantité de sulfate de sodium anhydre. Si l’agent déshydratant devient
collant, transférer la solution dans un nouveau flacon à bouchon vissé contenant du sulfate de sodium neuf.
Ajouter 20 μl du réactif de dérivation (5.5.3) aux deux extraits organiques pour procéder à la dérivatisation. Si
la réaction de dérivatisation donne une faible réponse de signal de l’analyte, augmenter la quantité d’agent de
dérivatisation jusqu’à ce que le rapport signal sur bruit du chromatogramme correspondant n’augmente pas.
La quantité maximale de réactif de dérivatisation pouvant être utilisée est limitée par la capacité individuelle
du système de chromatographie en phase gazeuse/spectrométrie de masse à éliminer l’excès de PBA. Pour
finaliser la réaction de dérivatisation et éliminer l’excès de réactif, évaporer à sec les deux flacons d’analyse
sous un léger flux d’azote. Redissoudre les fractions solubles dans environ 300 μl à 500 μl d’iso-octane et
agiter vigoureusement (à l’aide d’un agitateur de type vortex) le mélange pendant quelques secondes. Pour
les mesurages par CPG/SM, transférer une partie de chaque solution dans un micro-insert de 200 µl.
8.5 Références relatives à la chromatographie en phase gazeuse/spectrométrie de masse
(CPG/SM)
8.5.1 Chromatographie en phase gazeuse: volume d’injection: de 1 μl à 2 μl.
8.5.2 Gaz vecteur: hélium 4.6 (99,996 %) ou hélium 5.0 (99,999 %), débit constant de 1 ml/min à 1,5 ml/min.
8.5.3 Programme de température de l’injecteur à température programmable (PTV): par exemple 85 °C,
montée à 300 °C/min jusqu’à 165 °C, maintien 10 min en isotherme, puis montée à 300 °C/min jusqu’à 320 °C,
maintien 8 min en isotherme.
8.5.4 Injecteur: par exemple sans division, débit de purge 50 ml/min pendant 0,5 min à 1 min, purge de
septum 3 ml/min.
8.5.5 Programme de température de four de chromatographie en phase gazeuse: par exemple 85 °C,
en isotherme pendant 0,5 min, montée en température à 6 °C/min jusqu’à 150 °C, puis à 12 °C/min jusqu’à
180 °C, puis à 25 °C/min jusqu’à 280 °C, maintien en isotherme pendant 8 min.
8.5.6 Spectrométrie de masse: ionisation électronique (EI), fragmentométrie (mode SIM).
8.5.7 Les fragments détectés en lien avec les rapports masse/charge (m/z) des dérivés phénylboroniques
des analytes sont récapitulés dans le Tableau 1. Voir les exemples de chromatogrammes obtenus comme
indiqué dans les Figures A.1 à A.10.
Tableau 1 — Récapitulatif des fragments détectés en lien avec les rapports masse/charge (m/z)
des dérivés phénylboroniques des analytes
m/z m/z m/z m/z
3-MCPD-d 149 150 201 203
3-MCPD 146 147 196 198
2-MCPD-d 201 203
2-MCPD 196 198
3-MBPD-d (produit de transformation du glycidol-d ) 245 247
5 5
3-MBPD (produit de transformation du glycidol) 240 242
Il convient que les ions cibles des analytes marqués et non marqués correspondent aux fins de quantification,
par exemple m/z = 150 versus 147 (3-MCPD-d versus 3-MCPD), m/z = 201 versus 196 (2-MCPD-d versus
5 5
2-MCPD), m/z = 245 versus 240 (3-MBPD-d versus 3-MBPD).
8.5.8 Pour la quantification, il est recommandé d’utiliser un logiciel adapté avec analyse automatique des
données.
9 Expression des résultats
NOTE Voir 10.4.
9.1 Détermination du glycidol lié
9.1.1 Le glycidol lié dans l’analyse A est quantifié en 9.1.2 sans correction, lorsque le 3-MCPD est présent
en faible quantité par rapport à la teneur en glycidol. En présence de plus grandes quantités de 3-MCPD,
la conversion du 3-MCPD en glycidol peut être incomplète, ce qui entraîne une surestimation du glycidol.
Pour compenser cela, le rapport de conversion du 3-MCPD-d -diester en 3-MBPD-d dans l’analyse B est
5 5
déterminé et un facteur est appliqué pour quantifier la conversion potentielle du 3-MCPD en 3-MBPD dans
l’analyse A. Ce mode opératoire est décrit en 9.1.3 à 9.1.5.
9.1.2 Pour la détermination quantitative du glycidol lié, la surface du signal du dérivé phénylboronique
du 3-MBPD de l’analyse A est multipliée par le niveau d’ajout de l’étalon interne glycidol-d (introduit sous
forme d’ester de glycidol-d ) par rapport à sa concentration dans l’échantillon et divisée par la surface du
signal du dérivé phénylboronique du 3-MBPD-d , comme indiqué par la Formule (1):
SA ×w
3--MBPD(A)glycidold (A)
w = (1)
glycidol noncorrigé(A)
SA
3-MBPPD-d(A)
où
w est la fraction massique non corrigée du glycidol dans l’analyse A, en mg/kg;
glycidol noncorrigé(A)
w est la fraction massique du glycidol-d de l’analyse A, en mg/kg;
glycidol−d(A) 5
SA est la surface du signal du dérivé phénylboronique du 3-MBPD dans l’analyse A;
3-MBPD(A)
SA est la surface du signal du dérivé phénylboronique du 3-MBPD-d dans l’analyse A.
3-MBPDd− (A) 5
Si l’échantillon contient des quantités importantes de 3-MCPD, la valeur de glycidol non corrigée peut être
ajustée par un facteur comme suit.
9.1.3 Pour déterminer la transformation non souhaitée du 3-MCPD en 3-MBPD par l’intermédiaire
du glycidol lors de la préparation de l’échantillon, le coefficient de transformation correspondant
3-MCPD-d → 3-MBPD-d de l’analyse B est calculé en divisant la surface du signal du dérivé phénylboronique
5 5
du 3-MCPD-d par la surface du signal du dérivé phénylboronique du 3-MBPD-d de l’analyse B, comme
5 5
indiqué par la Formule (2):
SA
3M- BPDd− (B)
t = (2)
3MCPD
SA
3M- CPDd− (B)
où
t est le coefficient de transformation 3-MCPD-d → 3-MBPD-d ;
3MCPD 5 5
SA est la surface du signal du dérivé phénylboronique du 3-MBPD-d dans l’analyse B;
3M- BPDd− (B) 5
SA
est la surface du signal du dérivé phénylboronique du 3-MCPD-d dans l’analyse B.
3M- CPDd− (B) 5
9.1.4 Après préparation de l’échantillon et analyse CPG/SM conformément aux sections Mode opératoire et
Équipement, le rapport entre le 3-MBPD détecté et le 3-MBPD-d est corrélé au facteur isotopique (voir 10.5),
comme indiqué par la Formule (3):
SA
3-MBPD
I= (3)
SA
3-MBPD−d
où
I est le facteur isotopique;
SA est la surface du signal du dérivé phénylboronique du 3-MBPD;
3-MBPD
SA est la surface du signal du dérivé phénylboronique du 3-MBPD-d .
3M- BPDd− 5
9.1.5 La quantité corrigée de glycidol peut alors être déterminée par la Formule (4):
SA −×tSAI× w
()
33--MBPD()AMCPDM3- CPDA() glycidol−dA()
w = (4)
glycidol corrigé()A
SA
3-MBPD−dA()
où
w est la fraction massique corrigée du glycidol de l’analyse A, en mg/kg;
glycidol corrigé(A)
t est le coefficient de transformation 3-MCPD → 3-MBPD (9.1.3);
3-MCPD
I est le facteur isotopique (9.1.4);
w est la fraction massique du glycidol-d de l’analyse A, en mg/kg;
glycidol−d(A) 5
SA est la surface du signal du dérivé phénylboronique du 3-MBPD dans l’analyse A;
3-MBPD(A)
SA est la surface du signal du dérivé phénylboronique du 3-MCPD dans l’analyse A;
3-MCPD(A)
SA est la s
...
Questions, Comments and Discussion
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