ISO 17244:2025
(Main)Water quality — Determination of the toxicity of water samples on the embryo-larval development of the Japanese oyster (Magallana gigas) and the blue mussel (Mytilus edulis or M. galloprovincialis)
Water quality — Determination of the toxicity of water samples on the embryo-larval development of the Japanese oyster (Magallana gigas) and the blue mussel (Mytilus edulis or M. galloprovincialis)
This document specifies a method for assessing the effects of chemical and aqueous samples on the embryo-larval development of marine bivalves. This method allows the determination of the concentration levels that result in an abnormality in embryo-larval development. This test is suitable for salinity ranges: — between 20 PSU (practical salinity unit) and 40 PSU for mussels, and — between 25 PSU and 35 PSU for oysters. This method in this document applies to: — chemical substances and preparations, — marine and brackish waters, — streams and aqueous effluents (urban, agricultural, industrial effluents, etc.) as long as the salinity is adjusted or dilution is limited so that the aforementioned salinity ranges are respected, — aqueous extracts (pore water, elutriates, eluates and leachates) from sediments and petroleum products, and — samples of contaminated sediment or dredged material (see Annex C).
Qualité de l’eau — Détermination de la toxicité d’échantillons aqueux sur le développement embryolarvaire de l’huître creuse (Magallana gigas) et de la moule (Mytilus edulis ou M. galloprovincialis)
Le présent document spécifie une méthode pour l’évaluation des effets de substances chimiques et d’échantillons aqueux sur le développement embryolarvaire de bivalves marins. Cette méthode permet de déterminer les niveaux de concentration induisant une anomalie du développement embryolarvaire. Cet essai convient pour des gammes de salinité: — de 20 PSU à 40 PSU (unité de salinité pratique) pour les moules; et — de 25 PSU à 35 PSU pour les huîtres. La méthode décrite dans le présent document s’applique: — aux substances chimiques et préparations; — aux eaux marines et saumâtres; — aux eaux douces et effluents aqueux (urbains, agricoles, industriels, etc.) tant que la salinité est ajustée ou la dilution est limitée de sorte que les gammes de salinité susmentionnées sont respectées; — aux extraits aqueux (eaux interstitielles, élutriats, éluats et lixiviats) de sédiments et de produits pétroliers; et — aux échantillons de sédiments contaminés ou de sédiments de dragage (voir Annexe C).
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 17244
Second edition
Water quality — Determination of
2025-07
the toxicity of water samples on the
embryo-larval development of the
Japanese oyster (Magallana gigas)
and the blue mussel (Mytilus edulis
or M. galloprovincialis)
Qualité de l’eau — Détermination de la toxicité d’échantillons
aqueux sur le développement embryolarvaire de l’huître
creuse (Magallana gigas) et de la moule (Mytilus edulis ou M.
galloprovincialis)
Reference number
© ISO 2025
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Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Test organisms and seawater. 3
5.1 Spawning stock or mature bivalves .3
5.2 Reference seawater .3
5.2.1 General .3
5.2.2 Natural seawater .3
5.2.3 Artificial seawater .4
5.2.4 Hypersaline brine .4
6 Equipment . 4
7 Reference substance . 5
8 Test procedure . 5
8.1 Collection, preparation and preservation of aqueous samples .5
8.2 Preparation of test samples .6
8.2.1 Chemicals .6
8.2.2 Aqueous samples .6
8.2.3 sediment or dredged material .6
8.3 Selection of concentration range .6
8.4 Collecting gametes .6
8.4.1 General .6
8.4.2 Thermal stimulation .7
8.4.3 Stripping the gametes .8
8.5 Measurement of egg density .8
8.6 Fertilization and inoculation of fertilized eggs .8
8.7 Incubation .9
8.8 Observation .9
8.9 Analytical measurements .10
8.10 Disposal of adults .10
9 Expression of results . 10
10 Validity criteria .12
11 Test report .13
Annex A (informative) Overview of the test applied to the Japanese oyster Magallana gigas . 14
Annex B (informative) Performance data .15
Annex C (informative) Protocol to perform the test in direct contact with sediment .21
Bibliography .23
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
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patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
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Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 17244:2015), which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— Annex C, which gives a protocol to perform the test in direct contact with sediment, has been added;
— for Japanese oyster, the revised nomenclature, Magallana gigas,has been used;
— the possibility to extend the test duration to 48 h has been included.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
Traditionally, the level of pollution affecting a marine environment is shown in terms of the concentration
levels of the contaminants present in the environment of interest. However, these measurements do not
provide an estimation of the harmful effects on organisms and have to be complemented with the biological
responses obtained through bioassays (see Reference [5]).
Among the marine organisms used to assess the potential impact of chemicals or discharges into the
environment, bivalve embryos and larvae are, together with sea urchins, among the organisms which are
most frequently used in bioassays (see References [18] and [21]). The embryos and larvae are more sensitive
to pollutants than the adults of the same species. Therefore, they represent the critical stages for the toxicity
tests (see References [19] and [30]). Since 1972, it is recommended to use the Pacific oyster, Magallana gigas,
to assess the quality of seawater (see Reference [35]). Furthermore, their worldwide distribution in coastal
waters, as well as their commercial importance (see Reference [10]), make bivalves the species of choice for
the undertaking of bioassays.
The results of these bioassays demonstrate the necessity to determine the potential toxicity thresholds
of chemicals which can enter the marine environment either accidentally or chronically, as well as the
“biological quality” of an environment or the potential toxicity of river water or a discharge that reach the
sea. Potential toxicity has been defined based on teratological effects (see References [11], [27] and [26]).
This document specifies a method based on the embryo-larval development of bivalves (oyster or mussel). It
can be routinely used to assess development abnormalities caused by the possible presence of chemicals and
mixtures in seawater. It also allows to assess the toxicity of aqueous samples like seawater, surface water,
effluents (urban, agricultural, industrial effluents, etc.), aqueous extracts from sediments and petroleum
products that can be leached in the water column at the time of their resuspension or discharge and presence
in the sea.
This test can be performed throughout the year with embryos and larvae of mature bivalves sampled from
the natural environment during their reproduction periods or mature bivalves which come from a hatchery
where they have been conditioned.
[14]
This bioassay, recommended by the International Council for the Exploration of the Sea (ICES), has been
[31]
the subject of the first European inter-calibration test performed in 1991. The protocol described in this
document corresponds to a modification and simplification of Reference [3].
The toxicity assessment of metals performed on M. gigas and Mytilus edulis demonstrated that both
organisms had a similar level of sensitivity (see References [19] and [15]). Two other studies performed on
urban effluents showed similar findings for both species (see References [16] and [28]). These observations
have been confirmed by the work carried out on mercury (see Reference [4]), which compared the findings of
four embryo-larval tests: M. edulis, M. galloprovincialis, M. gigas and C. virginica. Another study showed that
the embryos of M. gigas are more sensitive to metals and hydrocarbons than the other marine organisms
which are commonly used, for example, polychaete, amphipods, fish and crustaceans (see Reference [8]).
The sensitivity of the bivalve embryo-larval development confirms the suitability of this test to assess the
toxicity of chemicals and aqueous samples. The pH, salinity and temperature range acceptable to bivalves
make them easy to use in ecotoxicity studies, particularly when assessing the quality of coastal and
estuarine environments (see Reference [11]).
v
International Standard ISO 17244:2025(en)
Water quality — Determination of the toxicity of water
samples on the embryo-larval development of the Japanese
oyster (Magallana gigas) and the blue mussel (Mytilus edulis
or M. galloprovincialis)
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice. This
document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its use. It is
the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document be
carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This document specifies a method for assessing the effects of chemical and aqueous samples on the embryo-
larval development of marine bivalves. This method allows the determination of the concentration levels
that result in an abnormality in embryo-larval development. This test is suitable for salinity ranges:
— between 20 PSU (practical salinity unit) and 40 PSU for mussels, and
— between 25 PSU and 35 PSU for oysters.
This method in this document applies to:
— chemical substances and preparations,
— marine and brackish waters,
— streams and aqueous effluents (urban, agricultural, industrial effluents, etc.) as long as the salinity is
adjusted or dilution is limited so that the aforementioned salinity ranges are respected,
— aqueous extracts (pore water, elutriates, eluates and leachates) from sediments and petroleum
products, and
— samples of contaminated sediment or dredged material (see Annex C).
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
effect concentration
EC
x
concentration at which a specific effect is detected; x is the percentage (10, 25, 50) of this effect, e.g. the
development abnormality
EXAMPLE EC means the concentration estimated to observed 50 % of development abnormality at the end of
the test compared to the control.
[SOURCE: ISO 15952:2018, 3.6, modified — "growth inhibition" has been replaced with "development
abnormality" in the definition and the EXAMPLE has been replaced.]
3.2
lowest observed effect concentration
LOEC
lowest tested concentration at which the test substance or dilution (of an aqueous sample, in %, or of a
sediment in g/l) is observed to have a statistically significant effect (p < 0,05) when compared with the control
Note 1 to entry: All test concentrations above the LOEC have a harmful effect equal to or greater than those observed
at the LOEC. When these two conditions cannot be satisfied, a full explanation should be given for how the LOEC [and
hence the no observed effect concentration (3.3)] has been selected.
[SOURCE: ISO 15952:2018, 3.8, modified — "substance or dilution (of an aqueous sample, in %, or of a
sediment in g/l)" has been added to the definition.]
3.3
no observed effect concentration
NOEC
test concentration immediately below the lowest observed effect concentration (3.2), which, when compared
with the control, has no statistically significant effect (p > 0,05) within a given exposure time
Note 1 to entry: The NOEC is the concentration just below the lowest observed effect concentration.
[SOURCE: ISO 15952:2018, 3.9, modified — Note 2 to entry has been deleted.]
3.4
reference seawater
natural or artificial seawater used to induce gamete production and prepare the solutions to be tested
3.5
D-shaped stage larvae
larvae stage so named due to their characteristic D-shaped under microscopic examination
Note 1 to entry: The normal D-shaped larvae obtained after incubation have fully developed and symmetrical shells
with a straight hinge. The larvae size is regular and around 70 µm. After fixation, the mantle nearly fills the interior of
the larvae, but is totally included within the two closed shells.
4 Principle
This bioassay assesses the effects of chemicals and aqueous environmental samples on the embryo-larval
development of marine bivalves under static conditions.
The exposure is performed from fertilized eggs to D-shaped larvae. This static test aims to determine the
concentration level (EC ) which results in abnormalities for x % of exposed larvae in 24 h (optionally 48 h)
x
for the Japanese oyster, also named Pacific oyster (Magallana gigas, previously Crassostrea gigas), and in 48 h
for the Blue and Mediterranean mussel (Mytilus edulis or Mytilus galloprovincialis). Several parameters can be
assessed in the abnormal larvae: alteration of the shell (hinge is not straight, unequal or incomplete valves),
hypertrophy of the mantle, delayed or stopped embryonic development, and finally, death. The results are
expressed as EC (EC or EC ). The lowest observed effect concentration (LOEC) and no observed effect
x 20 50
concentration (NOEC) can also be determined.
This method can be applied to other species of bivalves (e.g. C. virginica). Nevertheless, the test conditions
have to be defined to reach the validity criteria of this document.
Some regulations can extend the oyster exposure period to 48 h. In this case, the sensitivity test shall be
performed in the same conditions and the test duration is mentioned clearly in the test report.
5 Test organisms and seawater
5.1 Spawning stock or mature bivalves
The mature bivalves used for gamete production can be obtained from the natural environment during
reproductive periods as long as the sampling area is subject to little or no sources of contamination and free
from epizootic diseases. The reproduction period along the European and African coasts depends on the
site. In some places, it can occur all year.
For oysters, it is also possible to use mature animals from hatcheries where they have previously undergone
a conditioning cycle so that they are ready for spawning as soon as they arrive in the laboratory. This enables
conducting tests throughout the year.
For transportation or storage purpose, mature oyster can stay out of water up to three days as long as they
are kept in cool and damp conditions.
If the bivalves are received in the laboratory within three days after sampling, it is recommended to
keep them dry at 15 °C ± 2 °C until the collecting gametes or in seawater at a temperature close to their
conditioning or rearing temperature (usually, 20 °C for hatchery oysters).
If the mature bivalves have to be kept for more than three days after sampling and/or dispatching, they shall
be stored in water (see 5.2) at a temperature close to the original location and shall be provided with rich and
appropriate feeding (see Reference [9]). In this case, the spawning stock is placed in tanks (15 individuals
for 30 l of seawater). The water in the tanks is continuously aerated. On a daily basis, one third of the volume
has to be discarded and replaced by the same volume of a single-species Prasinophycean culture (Tetraselmis
suecica) at an average concentration of 1 × 10 cells per ml or diatom Skeletonema costatum at an average
concentration of 2,7 × 10 cells per ml.
The pH of seawater should be between 7,0 and 8,5 for mussels and oysters.
Mussel Mytilus edulis and M. galloprovincialis basic characterization-identification should be done after
organism sampling (e.g. biometry measurements or nuclear marker heterozygosity analyses).
NOTE Other species can be used, such as, Phaeodactylum tricornutum. Nevertheless, no information can be given
regarding the suitable concentration of algae.
5.2 Reference seawater
5.2.1 General
This test requires good quality reference seawater. This water is used to prepare the controls and dilutions
of the samples and/or chemicals to be tested. This seawater may be either natural or artificial.
5.2.2 Natural seawater
Natural seawater shall allow a good bivalve embryo-larval development and enable at least 80 % of the normal
D-shaped larvae to be free of any abnormality. The test is sensitive to high concentrations of ammonia (NH ).
Consequently, the ammonium concentration of seawater used shall not exceed 100 µmol/l (= 1,8 mg/l).
As soon as the water is collected, it should be checked to ensure that the water is not contaminated by any
known human activity. The water should be pre-filtered with a 1 µm to 5 µm membrane. The seawater shall
then be stored in the dark in controlled conditions between 2 °C and 15 °C and be used within two weeks
from collection. Under no circumstance shall this seawater be frozen or autoclaved.
Just before use, adjust the seawater salinity, if necessary, by adding ultra-pure water (for dilution) or
hypersaline brine (see 5.2.3) to reach the salinity range adapted to the selected species: i.e. from 20 PSU to
40 PSU for mussels and 25 PSU to 35 PSU for oysters. The salinity should be close to the original location.
Then, filter it through a 0,45 µm membrane. Salinity shall then be checked with a suitable probe (see 6.6).
The direct addition of sea salts to the sample can be a source of toxicity and should be avoided
(see Reference [17]).
5.2.3 Artificial seawater
Alternatively, artificial seawater prepared in accordance with Table 1 may be used. The composition of
this seawater is similar to that suggested in Reference [36] without EDTA in order not to reduce the bio-
availability of divalent metal ions, thus, resulting in a decrease in the apparent toxicity of these ions (see
Reference [25]). Artificial seawater is prepared by adding reagent grade chemicals to ultrapure water
(distilled or demineralized water) in the order specified in Table 1. Prepare a minimum of 5 l of artificial
seawater. Mix after each addition of salt to ensure a good dissolution.
Once ready, the artificial seawater is filtered through a 0,45 µm membrane (see 5.2.1).
Table 1 — Composition of artificial seawater for one litre of ultra-pure water
Chemical composition Concentration in ultrapure water
g/l
NaF 0,003
SrCl ·6H O 0,02
2 2
H BO 0,03
3 3
KBr 0,1
KCl 0,7
CaCl ·2H O 1,47
2 2
Na SO 4,0
2 4
MgCl ·6H O 10,78
2 2
NaCl 23,5
a
Na SiO ·H O 0,2
2 3 2
NaHCO 0,2
a
Silicate is not needed when the water is prepared in a glass vial.
Artificial seawater which only contains mineral salts can be kept for up to one year in a watertight container
that is kept out of the light in a clean, dry and odourless place between 2 °C and 15 °C.
5.2.4 Hypersaline brine
Hypersaline brine (HSB) can be made by concentrating natural seawater by freezing or evaporation. The
maximum salinity of brine prepared this way is around 100 % (a method is provided in Reference [33]).
Hypersaline brine can also be prepared following the Zaroogian’s formula concentrated up to 5× maximum.
Commercial sea salts may also be used to prepare HSB, but a test with the reference substance shall be
conducted to assess the absence of complexing agents.
A control test with the HSB diluted to an acceptable salinity for the embryo development has to be realized
to check the lack of effect of this preparation.
6 Equipment
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
6.1 Thermoregulated room or enclosure for the incubations.
6.2 Microscope, at least 200×, but preferably 400×.
If possible, use an inverse light microscope so that observations can be made directly in the small experiment
vials (e.g. microplate wells).
6.3 Culture flasks, capacity from a fraction of millilitres to several litres.
Experiments are usually performed using a volume of test solution of 50 ml. Therefore, culture flasks with
the capacity of 100 ml to 200 ml are preferred. Culture flasks may be made of glass (systematically washed
and sterilized) or single-use crystal polystyrene such as multi-well plates or medical sampling containers.
6.4 Cartridge or membrane-based filtering device, equipped with filters and pre-filters suitable for the
preparation of the test media.
6.5 Oven or autoclave, for sterilizing the equipment and glassware for the bioassay.
6.6 Equipment for measuring temperature, salinity, pH and dissolved oxygen in water.
6.7 Sieves, with mesh size of 32 µm and 100 µm for the filtering of male and female gametes, respectively.
The gametes which pass through the appropriate sieves are collected for the fertilization step.
6.8 Pipettes, single-use polyethylene transfer pipettes (1 ml to 3 ml).
6.9 Binocular magnifying glass.
6.10 Electronic particle counter (optional).
All glassware used as for isolation of the spawning stock and the collection of the gametes, as well as the
pipettes, shall either be disposable or sterilized before use in the tests (e.g. placed in an oven for 2 h at
200 °C for glassware).
7 Reference substance
Copper sulfate pentahydrate (CuSO ·5H O) is the recommended reference substance. Test reference shall
4 2
be performed at least twice a year but it is advisable to test it in each test series to check the sensitivity of
the larvae. The test concentrations are included in the range 0 µg/l to 100 µg/l of CuSO ·5H O or 0 µg/l to
4 2
25 µg/l expressed as copper.
The EC value shall be between 4 µg/l and 16 µg/l expressed as total copper (see Annex B).
Alternately, zinc sulfate heptahydrate (ZnSO ·7H O) can be used as reference substance. In such a case, the
4 2
test concentrations should be included in the range of 44 µg/l to 2 462,9 µg/l of ZnSO ·7H O or 10 µg to
4 2
560 µg expressed as zinc.
NOTE Experience gained with zinc sulfate is less than for copper sulfate. Therefore, no acceptable range can be
recommended in this document.
8 Test procedure
8.1 Collection, preparation and preservation of aqueous samples
Collect and transport the samples in accordance with the general procedures described in ISO 5667-16.
Undertake the toxicity test as soon as possible, ideally within 12 h after collection of the samples. In this
case, the sample can be stored at room temperature.
If this time cannot be followed, store the samples between 2 °C and 8 °C and perform the test preferably
within 15 d after sample collection (see ISO 5667-16).
8.2 Preparation of test samples
8.2.1 Chemicals
Stock solutions of test chemicals are prepared by dissolving the substances in the reference seawater (either
natural or artificial).
When the substance to be tested is poorly soluble in seawater, the stock solution may be prepared in
[38]
demineralized water or according to the modifications specified in ISO 14442 and ISO 5667-16 (use of a
solubilizing agent, ultrasonic dispersion, etc.).
8.2.2 Aqueous samples
Aqueous samples (seawater, river water, urban, agricultural or industrial effluents, or even aqueous
extracts) are tested in their raw state and/or after filtering or centrifugation to determine the fraction
responsible for the effects observed. Furthermore, depending on the physico-chemical parameters of these
aqueous samples, it can be necessary to adjust their salinity to be consistent with the recommended range
for the selected species.
8.2.3 sediment or dredged material
A protocol of preparation is explained in Annex C for samples of contaminated sediment or dredged material.
8.3 Selection of concentration range
For chemicals, the test solutions are prepared by diluting the stock solution in natural or artificial seawater.
In the case of samples of low salinity water, effluents, leachates and eluates, all dilutions shall remain within
the salinity range acceptable for the species being used. For freshwater, the maximum concentration tested
shall not exceed 18 % volume fraction of the initial sample. Salinity should be adjusted with hypersaline
brine (see 5.2.1) if this appears to be essential.
These solutions may be prepared in advance or immediately before the test if rapid changes in the sample
composition are expected.
A minimum of five dilutions shall be performed to cover a concentration range that enables the observation
of a full range of effects between 0 % and 100 % of abnormal embryo-larval development. Depending on
the possible effects sought, the substances may be tested alone or in mixtures. For the aqueous samples,
the dilution range to be tested may be optimized in line with the test's aim: calculation of an EC value or
x
determination of a no effect dilution.
If the preliminary test indicates that no effect is expected under the required test conditions, a limit test can
be performed to confirm the lack of effect at the highest concentration or lowest dilution of the range of the
preliminary test.
8.4 Collecting gametes
8.4.1 General
Male and female gametes are obtained by naturally spawning the adults (i.e. temperature shock) or by stripping
the gonads for oysters. Before stimulating the mature bivalves to obtain the gametes, they can be placed in
natural or artificial seawater (see 5.2) so that they can recover from the stress caused by transportation and
eliminate most of their faeces. Just before inducing the spawn, the bivalves are brushed and rinsed to remove
the epibionts (plant or animal organisms fixed to the shell of bivalves) and sedimentary debris.
8.4.2 Thermal stimulation
Thermal stimulation is used to induce egg-laying (see Reference [3]) in seawater tanks. The temperatures
used for these thermal stresses are in the interval of naturally observed spawning, namely between 14 °C
and 29 °C for oysters and 15 °C and 20 °C for mussels. Every 30 min, the bivalves alternate between warm
seawater tanks and cold seawater tanks (see Annex A). Spawning is generally triggered in the first 3 h
with males being the first to emit their spermatozoa. This causes the females to lay their gametes a few
minutes later, if the parents are very mature. In order to hasten the emission of gametes, the bivalves can be
chemically stimulated by adding a few millilitres of a suspension of inactivated oocytes or spermatozoa in
front of the mollusc inhaling syphon when they are widely open (which indicates that spawning is imminent).
In order to inactivate gametes, it is advised to freeze them at least one day below −18 °C.
Differentiating between male and female is simple.
— For mussels, spawning takes the form of a ribbon which disintegrates in water into an orange cluster for
the female and a grey-white cluster for the male (see Figure 1).
— For oysters, the females expel their eggs in grey-white clouds by vigorously beating the right valve
while males release sperm which turns the water milky (see Figure 1). A sample observed under a light
microscope with 400× magnification, as soon as the gametes are emitted, permits to confirm the gender
of the parents.
As soon as the release of the gametes is definitely in progress,
— the males are removed from the water and kept closed with an elastic band so that the spermatozoa do
not lose their fertilizing ability through prolonged contact with water, and
— the females, once rinsed, are immediately placed in individual 250 ml vessels filled with reference
seawater; as soon as they start to release gametes, once again, they are transferred to a new seawater
tank two to three times so as to only pick up the eggs of the selected spawner and eliminate those which
can have been fertilized in the stimulation tanks (see Figure 1).
a) Emission of gametes by the b) Emission of gametes by the c) Emission of gametes by the
mussel (Mytilus edulis) (1: male, 2: male Japanese oyster (Magalla- female Japanese oyster (Magal-
female) na gigas) lana gigas)
[25]
SOURCE: Quiniou et al. 2005, Figure 3, p.12, reproduced with the permission of the authors.
Figure 1 — Emission of gametes by a mussel and an oyster
As soon as the first females have emitted their gametes, an aliquot is collected to select the female which
will be used in the test. A female is retained when its oocytes, a few minutes after emission, are as uniform
as possible, for example, regular, spherical (for mussels) or slightly pyriformic (for oysters) oocytes, and
a uniformly granular cytoplasm. Once the female has been selected, the suspension of oocytes is filtered
through a 100 µm sieve in order to remove faeces and debris. The oocytes are then placed in a beaker
containing 2 l of reference seawater and their density is determined (see 8.5).
The males are then placed in individual 250 ml vessels and covered with just enough water to obtain a very
dense suspension of sperm. After two or three bath changes, the sperm solution is filtered through a 32 µm
sieve (the gametes pass through the sieves). A male is retained when the sperm is highly concentrated (see
Figure 1) and the spermatozoa are very mobile (checked under a stereoscopic inverted light microscope).
8.4.3 Stripping the gametes
The mature male and female oysters should be opened. This can be achieved by breaking the hinge and
cutting the adductor muscle with a knife, for example, with a standard oyster knife. The knife should be
inserted in the flat edge of the oyster and held level when cutting to avoid damaging the gonads. The body
cavity of each oyster should be thoroughly rinsed with seawater to remove any debris which can be present.
Prior to stripping sperm from a male oyster, a small sample of sperm from each male should be transferred
to a slide or small vessel together with a few drops of seawater. After 15 min to 30 min, the activity of the
sperm should be assessed using a microscope and male oysters with the most motile sperm are selected for
stripping.
The gametes can be stripped by one of the methods the following methods.
— A clean, Pasteur pipette is inserted into the gonad to a depth of 1 mm to 2 mm and the eggs or sperm are
collected. The gametes should be transferred to separate volumes of seawater and held at 24 °C ± 2 °C.
— Alternatively, the gonad is gently cut into with a sharp scalpel angling the blade upwards to avoid
puncturing the gut. Gametes should be collected by pipetting seawater (at 24 °C ± 2 °C) over the surface
of the gonad and washing the gametes into a suitable vessel.
Care should be taken to avoid puncturing the gut as contamination of gametes can lead to reduced
fertilization.
8.5 Measurement of egg density
A part of the initial egg suspension is diluted 1/100 in seawater. The egg density is evaluated by three counts
of 0,1 ml of this solution using a binocular magnifying glass (see 6.9). The initial solution is then adjusted to
obtain a final density in the test replicates between 20 000 eggs per litre and 50 000 eggs per litre.
8.6 Fertilization and inoculation of fertilized eggs
Fertilization is carried out by adding a few millimetres of the dense suspension of sperm in the beaker
containing the oocytes. The oocytes suspension should be fertilized within 60 min after obtaining the
oocytes and the sperm suspensions.
The content of the beaker is homogenized by gently shaking the beaker (every 1 min to 2 min) in order to
avoid polyspermy (see References [3], [12], [22], [24], [27] and [28]). A sample is taken from the beaker to
check the fertilization rate (each oocyte shall be surrounded by 6 to 10 spermatozoa which can be observed
on an equatorial plan). The fertilization rate should have reached 90 % to perform the inoculation. The
fertilization rate should be determined and mentioned in the test report.
From 15 min to 20 min post fertilization, the fertilized eggs (visualization of the polar bodies; see Figure 2),
whose density has been previously measured (see 8.5), are quickly inoculated in the test solutions on the
basis of 20 000 to 50 000 fertilized eggs per litre.
SOURCE: M. Régis Délesmont, France, reproduced with the permission of the authors.
Figure 2 — Fertilized eggs showing polar bodies
.
The inoculation starts when polar bodies can be observed in order to end the inoculation in all the test
replicates before the 4-cell stage.
For each experiment, a unique couple from the spawning stock is usually used. Nevertheless, it is possible
to mix fertilized eggs from several organisms if they reached suitable fertilization rate. Each test can be
performed in duplicate, in two simultaneous or successive series, using two batches of fertilized eggs.
The experiment should include at least three replicates per test concentration, one solvent control (if
appropriate), and 5 to 10 reference water controls.
If the test is performed in small vials (i.e. multi-well plate), the number of replicates per test condition should
be increased to reach the required number of larvae (at least 300 per test condition and 500 to 1 000 for
controls).
8.7 Incubation
The test vials are placed in the dark without aeration and food addition for a period of 24 h ± 2 h at 24 °C ± 2 °C
for the Japanese oyster and 48 h ± 2 h at 20 °C ± 2 °C for the mussel.
The dissolved oxygen content in the test concentrations and controls should be greater than 60 % at the
start of the test.
NOTE Experience has shown that the tests can be performed in vials containing less than 1 ml to several litres
(see 6.3). Nevertheless, experiments are usually performed using a volume of test solution of 50 ml.
Some regulations can extend the oyster exposure period to 48 h. In this case, the sensitivity test shall be
performed in the same conditions and the test duration is mentioned clearly in the test report.
8.8 Observation
After the incubation period, approximatively 10 % neutral formaldehyde, namely 20 ml/l, is added to each
test vessel to fix and preserve the larvae. Formaldehyde can be replaced by any other suitable preservative
compound (e.g. 70 % ethanol or 1 % glutaraldehyde). The observations of the larvae can then be carried
out immediately or up to several weeks later if the test vessels are kept hermetically sealed at the ambient
temperature of the laboratory.
The observations can be carried out directly in the incubation glassware with a stereoscopic inverted light
microscope fitted with a magnification of at least 200×, but preferably 400×.
If aliquots are sampled for counting, care should be taken to ensure that they are representative of the
selected replicate. This can be achieved by thoroughly mixing the vessel, prior to sub-sampling, to ensure
that the fixed larvae are in suspension.
8.9 Analytical measurements
Measure and record pH, oxygen concentration and salinity at the beginning and end of the test, at least at
the minimum and maximum test concentrations, as well as in the control. These analytical measurements
are performed in one additional vessel for each test condition. When it is possible, it is recommended to
prepare an additional vessel including organisms. This additional vessel preparation description (with or
without organisms) should be added in the test report.
In case of chemical testing, the concentration of the test substance should be measured, as a minimum, at
the highest and lowest test concentrations, at the beginning and end of the test.
8.10 Disposal of adults
Organism in good health can be kept for other experimentation.
After
...
Norme
internationale
ISO 17244
Deuxième édition
Qualité de l’eau — Détermination de
2025-07
la toxicité d’échantillons aqueux sur
le développement embryolarvaire
de l’huître creuse (Magallana gigas)
et de la moule (Mytilus edulis ou M.
galloprovincialis)
Water quality — Determination of the toxicity of water samples
on the embryo-larval development of the Japanese oyster
(Magallana gigas) and the blue mussel (Mytilus edulis or M.
galloprovincialis)
Numéro de référence
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 2
5 Organismes d’essai et eau de mer . 3
5.1 Géniteurs ou bivalves matures .3
5.2 Eau de mer de référence .4
5.2.1 Généralités .4
5.2.2 Eau de mer naturelle .4
5.2.3 Eau de mer artificielle.4
5.2.4 Saumure hypersaline .5
6 Matériel . 5
7 Substance de référence . 6
8 Procédure d’essai . 6
8.1 Prélèvement, préparation et conservation des échantillons aqueux .6
8.2 Préparation des échantillons pour essai .6
8.2.1 Substances chimiques .6
8.2.2 Échantillons aqueux .6
8.2.3 Sédiments ou sédiments de dragage .7
8.3 Choix de la gamme de concentration .7
8.4 Prélèvement de gamètes .7
8.4.1 Généralités .7
8.4.2 Stimulation thermique .7
8.4.3 Stripping des gamètes .8
8.5 Mesure de la densité d’œufs .9
8.6 Fécondation et ensemencement des œufs fécondés .9
8.7 Incubation .10
8.8 Observation .10
8.9 Mesures analytiques .10
8.10 Élimination des adultes .10
9 Expression des résultats .11
10 Critères de validité .13
11 Rapport d’essai .13
Annexe A (informative) Vue d’ensemble de l’essai appliqué à l’huître creuse Magallana gigas .15
Annexe B (informative) Données de performance .16
Annexe C (informative) Protocole de réalisation de l’essai en contact direct avec le sédiment .22
Bibliographie .25
iii
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité
de tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISOn'avait
pasreçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application.
Toutefois, il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des
informations plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à
l'adresse www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou
partie de tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion de
l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 17244:2015), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— l’Annexe C, qui fournit un protocole de réalisation de l’essai en contact direct avec le sédiment, a été
ajoutée;
— pour l’huître creuse, la nomenclature révisée, Magallana gigas, a été utilisée;
— la possibilité d’étendre la durée de l’essai à 48 h a été incluse.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
Habituellement, le niveau de pollution affectant un environnement marin est présenté en termes de
niveaux de concentration des contaminants présents dans l’environnement étudié. Cependant, ces mesures
ne permettent pas de fournir une estimation des effets nocifs sur les organismes et doivent donc être
complétées par les réponses biologiques obtenues au moyen de bio-essais (voir la Référence [5]).
Parmi les organismes marins utilisés afin d’évaluer l’impact potentiel des substances chimiques ou des rejets
arrivant dans l’environnement, les embryons et larves de bivalves sont, avec les oursins, les organismes les
plus fréquemment utilisés dans le cadre de bio-essais (voir les Références [18] et [21]). Les embryons et
larves sont plus sensibles aux polluants que les adultes de la même espèce. Ils représentent donc les stades
critiques pour les essais de toxicité (voir les Références [19] et [30]). Depuis 1972, il est recommandé
d’utiliser l’huître creuse, Magallana gigas, afin d’évaluer la qualité de l’eau de mer (voir la Référence [35]). De
plus, leur présence dans les eaux côtières à l’échelle mondiale, ainsi que leur importance commerciale (voir
la Référence [10]) font des bivalves des espèces de choix pour la réalisation de bio-essais.
Les résultats de ces bio-essais prouvent qu’il est nécessaire de déterminer les seuils de toxicité potentielle
des substances chimiques qui peuvent arriver dans l’environnement marin, de manière accidentelle ou
chronique, ainsi que la «qualité biologique» d’un environnement ou la toxicité potentielle de l’eau des cours
d’eau ou d’un rejet atteignant la mer. La toxicité potentielle a été définie sur la base des effets tératogènes
(voir les Références [11], [27] et [26]).
Le présent document spécifie une méthode fondée sur le développement embryolarvaire de bivalves
(huître ou moule). Il peut être utilisé en routine afin d’évaluer les anomalies de développement causées
par la présence éventuelle de substances chimiques et de mélanges dans l’eau de mer. Il permet également
d’évaluer la toxicité d’échantillons aqueux, comme des eaux de mer, des eaux de surface, des effluents
(effluents urbains, agricoles, industriels, etc.), des extraits aqueux de sédiments et des produits pétroliers
qui peuvent être relargués dans la colonne d’eau au moment de leur remise en suspension ou de leur rejet et
séjour en mer.
Cet essai peut être réalisé tout au long de l’année sur des embryons et des larves de bivalves matures prélevés
dans l’environnement naturel lors de leurs périodes de reproduction ou sur des bivalves matures issus d’une
écloserie où ils ont été conditionnés.
[14]
Ce bio-essai, recommandé par l’International Council for the Exploration of the Sea (ICES) ), a fait l’objet
[31]
d’un premier essai d’interétalonnage européen en 1991. Le protocole décrit dans le présent document
correspond à une modification et une simplification de la Référence [3].
L’évaluation de la toxicité des métaux réalisée sur M. gigas et Mytilus edulis a démontré que les deux
organismes présentaient un niveau semblable de sensibilité (voir les Références [19] et [15]). Deux autres
études effectuées sur des effluents urbains ont montré des résultats analogues pour les deux espèces (voir les
Références [16] et [28]). Ces observations ont été confirmées par les travaux réalisés sur du mercure (voir la
Référence [4]), qui comparaient les résultats de quatre essais embryolarvaires: M. edulis, M. galloprovincialis,
M. gigas et C. virginica. Une autre étude a révélé que les embryons de M. gigas sont plus sensibles aux métaux
et aux hydrocarbures que les autres organismes marins couramment utilisés, tels que les polychètes, les
amphipodes, les poissons et les crustacés (voir la Référence [8]).
La sensibilité du développement embryolarvaire des bivalves confirme la pertinence de cet essai pour
évaluer la toxicité des substances chimiques et des échantillons aqueux. Au vu de la gamme de pH, de
salinité et de température tolérée par les bivalves, ces derniers sont faciles à utiliser dans le cadre d’études
d’écotoxicité, en particulier pour évaluer la qualité des milieux côtiers et estuariens (voir la Référence [11]).
v
Norme internationale ISO 17244:2025(fr)
Qualité de l’eau — Détermination de la toxicité d’échantillons
aqueux sur le développement embryolarvaire de l’huître
creuse (Magallana gigas) et de la moule (Mytilus edulis ou M.
galloprovincialis)
AVERTISSEMENT — Il convient que les utilisateurs du présent document soient familiarisés avec
les pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur d’établir
des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais conduits conformément au présent
document soient exécutés par du personnel ayant reçu une formation adéquate.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode pour l’évaluation des effets de substances chimiques et
d’échantillons aqueux sur le développement embryolarvaire de bivalves marins. Cette méthode permet
de déterminer les niveaux de concentration induisant une anomalie du développement embryolarvaire.
Cet essai convient pour des gammes de salinité:
— de 20 PSU à 40 PSU (unité de salinité pratique) pour les moules; et
— de 25 PSU à 35 PSU pour les huîtres.
La méthode décrite dans le présent document s’applique:
— aux substances chimiques et préparations;
— aux eaux marines et saumâtres;
— aux eaux douces et effluents aqueux (urbains, agricoles, industriels, etc.) tant que la salinité est ajustée
ou la dilution est limitée de sorte que les gammes de salinité susmentionnées sont respectées;
— aux extraits aqueux (eaux interstitielles, élutriats, éluats et lixiviats) de sédiments et de produits
pétroliers; et
— aux échantillons de sédiments contaminés ou de sédiments de dragage (voir Annexe C).
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 5667-16, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques des
échantillons
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp/ ui
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
concentration efficace
CEx
concentration à laquelle est décelé un effet spécifique; x est le pourcentage (10, 25, 50) de cet effet,
par exemple anomalie du développement
EXEMPLE CE est la concentration estimée pour observer 50 % d’anomalie du développement à la fin de l’essai
par rapport au témoin.
[SOURCE: ISO 15952:2018, 3.6, modifié — le terme «inhibition de la croissance» a été remplacé par le terme
«anomalie du développement» dans la définition et l’EXEMPLE a été remplacé.]
3.2
concentration minimale avec effet observé
CMEO
concentration la plus basse soumise à l’essai, à laquelle il est observé que la substance d’essai ou la dilution
(d’un échantillon aqueux, en %, ou d’un sédiment en g/l) a un effet statistiquement significatif (p < 0,05)
par rapport au témoin
Note 1 à l'article: Toutes les concentrations d’essai supérieures à la CMEO ont un effet nocif supérieur ou égal à ceux
observés à la CMEO. Lorsqu’il n’est pas possible de satisfaire ces deux conditions, il convient d’expliquer dans le détail
comment a été sélectionnée la CMEO [et par conséquent la concentration maximale sans effet observé (3.3)].
[SOURCE: ISO 15952:2018, 3.8, modifié — l’expression «ou la dilution (d’un échantillon aqueux, en %, ou d’un
sédiment en g/l)» a été ajoutée à la définition.]
3.3
concentration maximale sans effet observé
CSEO
concentration de l’essai immédiatement inférieure à la concentration minimale avec effet observé (3.2),
qui, lorsqu’elle est comparée à celle du témoin, ne produit aucun effet statistiquement significatif (p > 0,05)
pendant un temps d’exposition donné
Note 1 à l'article: La CSEO est la concentration immédiatement inférieure à la concentration minimale avec effet
observé.
[SOURCE: ISO 15952:2018, 3.9, modifié — la Note 2 à l’article a été supprimée.]
3.4
eau de mer de référence
eau de mer naturelle ou artificielle utilisée pour induire la production de gamètes et préparer les solutions d’essai
3.5
stade larve D
stade larvaire appelé ainsi en raison de la forme D caractéristique des larves observées au microscope
Note 1 à l'article: La larve D normale obtenue après incubation possède des coquilles parfaitement développées et
symétriques pourvues d’une charnière rectiligne. La taille des larves est régulière et d’environ 70 µm. Après fixation,
le manteau remplit pratiquement l’intérieur des larves, mais est totalement inclus dans les deux coquilles fermées.
4 Principe
Ce bio-essai évalue les effets de substances chimiques et d’échantillons environnementaux aqueux sur le
développement embryolarvaire de bivalves marins en conditions statiques.
L’exposition porte sur la période allant de l’œuf fécondé au stade larve D. Cet essai statique vise à déterminer
le niveau de concentration (CE ) qui induit des anomalies chez x % des larves exposées pendant 24 h
x
(ou, facultativement, 48 h) pour l’huître creuse, également appelée huître du Pacifique (Magallana gigas,
auparavant Crassostrea gigas) et pendant 48 h pour la moule commune et méditerranéenne (Mytilus edulis ou
Mytilus galloprovincialis). Plusieurs paramètres peuvent être évalués sur les larves anormales: altération de
la coquille (charnière non rectiligne, valves inégales ou incomplètes), hypertrophie du manteau, retard ou
blocage du développement embryonnaire et, pour finir, mort. Les résultats sont exprimés sous forme de CEx
(CE ou CE ). La concentration minimale avec effet observé (CMEO) et la concentration sans effet observé
20 50
(CSEO) peuvent également être déterminées.
Cette méthode peut être appliquée à d’autres espèces de bivalves (par exemple C. virginica). Néanmoins,
les conditions d’essai doivent être définies pour remplir les critères de validité du présent document.
Certaines réglementations peuvent étendre la durée d’exposition des huîtres à 48 h. Dans ce cas, l’essai de
sensibilité doit être effectué dans les mêmes conditions et la durée de l’essai est clairement mentionnée dans
le rapport d’essai.
5 Organismes d’essai et eau de mer
5.1 Géniteurs ou bivalves matures
Les bivalves matures utilisés pour la production des gamètes peuvent être prélevés dans leur environnement
naturel pendant les périodes de reproduction tant que la zone de prélèvement est exposée à peu de sources
de contamination, voire aucune, et est exempte de maladies épizootiques. La période de reproduction sur
les côtes européennes et africaines dépend du site. Dans certaines régions, elle peut avoir lieu toute l’année.
Dans le cas des huîtres, il est également possible d’utiliser des animaux matures auprès d’écloseries où
ils ont préalablement subi un cycle de conditionnement de sorte à être prêts à pondre dès leur arrivée au
laboratoire. Cela permet d’effectuer des essais tout au long de l’année.
À des fins de transport ou de stockage, les huîtres matures peuvent rester hors de l’eau jusqu’à trois jours
tant qu’elles sont maintenues dans des conditions fraîches et humides.
Si les bivalves sont reçus au laboratoire dans les trois jours suivant le prélèvement, il est recommandé de les
conserver au sec à (15 ± 2) °C jusqu’au prélèvement des gamètes ou dans de l’eau de mer à une température
proche de leur température de conditionnement ou d’élevage (généralement 20 °C pour les huîtres
d’écloserie).
Si les bivalves matures doivent être conservés plus de trois jours après prélèvement et/ou envois, il faut
les stocker dans de l’eau (voir 5.2) à une température proche de celle de leur lieu d’origine et leur apporter
une alimentation riche et appropriée (voir la Référence [9]). Dans ce cas, les géniteurs sont placés dans des
aquariums (15 individus pour 30 l d’eau de mer). L’eau des aquariums est aérée en continu. Chaque jour,
un tiers du volume doit être éliminé et remplacé par le même volume d’une culture monospécifique de
Prasinophycées (Tetraselmis suecica) à une concentration moyenne de 1 × 10 cellules par ml ou de diatomées
Skeletonema costatum à une concentration moyenne de 2,7 × 10 cellules par ml.
Il convient que le pH de l’eau de mer soit compris entre 7,0 et 8,5 pour les moules et les huîtres.
Il convient qu’une caractérisation/identification de base des moules Mytilus edulis et M. galloprovincialis
soit effectuée après le prélèvement des organismes (par exemple mesures biométriques ou analyses
d’hétérozygotie des marqueurs nucléaires).
NOTE D’autres espèces peuvent être utilisées, tel que Phaeodactylum tricornutum. Néanmoins, aucune information
ne peut être donnée concernant la concentration appropriée en algues.
5.2 Eau de mer de référence
5.2.1 Généralités
Cet essai nécessite de l’eau de mer de référence de bonne qualité. Cette eau est destinée à la préparation des
témoins et des dilutions des échantillons et/ou des substances chimiques à soumettre à essai. Cette eau de
mer peut être soit naturelle, soit artificielle.
5.2.2 Eau de mer naturelle
L’eau de mer naturelle doit permettre un bon développement embryolarvaire des bivalves et permettre
l’obtention d’au moins 80 % de larves normales au stade D exemptes de toute anomalie. L’essai est sensible
à des concentrations élevées d’ammoniac (NH ). Par conséquent, la concentration en ammonium de l’eau de
mer utilisée ne doit pas dépasser 100 µmol/l (= 1,8 mg/l).
Dès son prélèvement, il convient de vérifier que l’eau n’a pas été contaminée par une quelconque activité
humaine connue. Il convient de préfiltrer l’eau au moyen d’une membrane d’une porosité de 1 µm à 5 µm.
L’eau de mer doit ensuite être conservée à l’abri de la lumière dans des conditions contrôlées entre 2 °C et
15 °C et être utilisée dans les deux semaines suivant son prélèvement. Cette eau de mer ne doit en aucun cas
être congelée ou passée à l’autoclave.
Juste avant son emploi, ajuster si nécessaire la salinité de l’eau de mer par addition d’eau ultrapure
(pour dilution) ou de saumure hypersaline (voir 5.2.3) pour respecter la gamme de salinité adaptée aux
espèces sélectionnées: c’est-à-dire de 20 PSU à 40 PSU pour les moules et de 25 PSU à 35 PSU pour les
huîtres. Il convient que la salinité soit proche de celle du lieu d’origine des organismes. Stériliser ensuite
l’eau à l’aide d’une membrane d’une porosité de 0,45 µm. La salinité doit ensuite être vérifiée à l’aide d’une
sonde appropriée (voir 6.6).
L’ajout direct de sels de mer à l’échantillon peut être une source de toxicité et il convient d’éviter cette
opération (voir la Référence [17]).
5.2.3 Eau de mer artificielle
De l’eau de mer artificielle, préparée conformément au Tableau 1, peut également être utilisée. La composition
de cette eau de mer est similaire à celle suggérée dans la Référence [36] sans EDTA afin de ne pas réduire la
biodisponibilité des ions métalliques bivalents, ce qui entraînerait une diminution de la toxicité apparente
de ces ions (voir la Référence [25]). L’eau de mer artificielle est préparée par ajout des substances chimiques
de qualité réactif à de l’eau ultrapure (eau distillée ou déminéralisée) dans l’ordre spécifié dans le Tableau 1.
Préparer au moins 5 l d’eau de mer artificielle. Mélanger l’eau après chaque ajout de sel pour garantir une
bonne dissolution.
Une fois prête, filtrer l’eau de mer artificielle à travers une membrane d’une porosité de 0,45 µm (voir 5.2.1).
Tableau 1 — Composition de l’eau de mer artificielle pour un litre d’eau ultrapure
Composition chimique Concentration dans l’eau ultrapure
g/l
NaF 0,003
SrCl ·6H O 0,02
2 2
H BO 0,03
3 3
KBr 0,1
KCl 0,7
CaCl ·2H O 1,47
2 2
Na SO 4,0
2 4
MgCl ·6H O 10,78
2 2
a
Le silicate n’est pas nécessaire lorsque l’eau est préparée dans un flacon en verre.
TTabableleaauu 1 1 ((ssuuiitte)e)
Composition chimique Concentration dans l’eau ultrapure
g/l
NaCl 23,5
a
Na SiO , H O 0,2
2 3 2
NaHCO 0,2
a
Le silicate n’est pas nécessaire lorsque l’eau est préparée dans un flacon en verre.
L’eau de mer artificielle, qui ne contient que des sels minéraux, peut être conservée jusqu’à un an dans un
récipient étanche, à l’abri de la lumière, dans un endroit propre, sec et inodore et à une température comprise
entre 2 °C et 15 °C.
5.2.4 Saumure hypersaline
De la saumure hypersaline (HSB) peut être obtenue en concentrant de l’eau de mer naturelle par congélation
ou évaporation. La salinité maximale de la saumure ainsi préparée est d’environ 100 % (une méthode est
fournie dans la Référence [33]).
De la saumure hypersaline peut également être préparée selon la formule de Zaroogian concentrée jusqu’à
5 × au maximum.
Des sels de mer du commerce peuvent également être utilisés pour préparer la HSB, mais un essai avec la
substance de référence doit être réalisé pour s’assurer de l’absence d’agents complexants.
Un essai témoin avec la HSB diluée à une salinité acceptable pour le développement embryonnaire doit être
réalisé afin de vérifier l’absence d’effet de cette préparation.
6 Matériel
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Armoire ou enceinte thermostatée pour les incubations.
6.2 Microscope, au moins 200×, mais de préférence 400×.
Si possible, utiliser un microscope optique inversé de sorte que les observations puissent être effectuées
directement dans les petits flacons expérimentaux (par exemple plaque multipuits).
6.3 Flacons de culture, d’une capacité allant d’une fraction de millilitres à plusieurs litres.
Les expériences sont généralement réalisées avec un volume de solution d’essai de 50 ml. Par conséquent,
il est préférable d’utiliser des flacons de culture d’une capacité de 100 ml à 200 ml. Les flacons de culture
peuvent être en verre (systématiquement lavés et stérilisés) ou en polystyrène cristal à usage unique,
par exemple des plaques multipuits ou des récipients destinés aux prélèvements médicaux.
6.4 Dispositif de filtration sur cartouche ou membrane, équipé de filtres et de préfiltres adéquats pour
la préparation du milieu d’essai.
6.5 Four ou autoclave, pour la stérilisation du matériel et de la verrerie destinés aux bio-essais.
6.6 Équipement de mesure de la température, de la salinité, du pH et de l’oxygène dissous dans l’eau.
6.7 Tamis, d’une taille de maille de 32 µm et 100 µm, destinés respectivement à la filtration des gamètes
mâles et femelles.
Les gamètes qui passent au travers des tamis appropriés sont prélevés en vue de l’étape de fécondation.
6.8 Pipettes, pipettes de transfert en polyéthylène à usage unique (1 ml à 3 ml).
6.9 Loupe binoculaire.
6.10 Compteur électronique de particules (facultatif).
Toute la verrerie utilisée pour isoler les géniteurs et prélever les gamètes ainsi que les pipettes doivent être
à usage unique ou stérilisées avant emploi pour les essais (par exemple placée dans un four pendant 2 h à
200 °C dans le cas de la verrerie).
7 Substance de référence
Le sulfate de cuivre pentahydraté (CuSO ·5H O) est la substance de référence recommandée. L’essai de
4 2
référence doit être réalisé au moins deux fois par an, mais il est conseillé de soumettre cette substance à essai
à chaque série d’essais afin de vérifier la sensibilité des larves. Les concentrations d’essai sont comprises
entre 0 µg/l et 100 µg/l de CuSO ·5H O, ou entre 0 µg/l et 25 µg/l, exprimées en cuivre.
4 2
La valeur de la CE doit être comprise entre 4 µg/l et 16 µg/l exprimée en cuivre total (voir l’Annexe B).
Du sulfate de zinc heptahydraté (ZnSO ·7H O) peut également être utilisé comme substance de référence.
4 2
Dans ce cas, il convient que les concentrations d’essai soient comprises entre 44 µg/l et 2 462,9 µg/l de
ZnSO ·7H O ou entre 10 µg et 560 µg, exprimées en zinc.
4 2
NOTE L’expérience acquise avec le sulfate de zinc est moindre que celle pour le sulfate de cuivre. Par conséquent,
aucune gamme d’acceptabilité ne peut être recommandée dans le présent document.
8 Procédure d’essai
8.1 Prélèvement, préparation et conservation des échantillons aqueux
Procéder au prélèvement et au transport des échantillons conformément aux modes opératoires généraux
décrits dans l’ISO 5667-16.
Procéder à l’essai de toxicité dès que possible, idéalement dans les 12 h suivant le prélèvement des
échantillons. Dans ce cas, l’échantillon peut être conservé à température ambiante.
Si cet intervalle de temps ne peut pas être respecté, conserver les échantillons à une température comprise
entre 2 °C et 8 °C et effectuer l’essai de préférence dans les 15 jours suivant le prélèvement des échantillons
(voir ISO 5667-16).
8.2 Préparation des échantillons pour essai
8.2.1 Substances chimiques
Les solutions mères des substances chimiques d’essai sont préparées en dissolvant les substances dans l’eau
de mer de référence (naturelle ou artificielle).
Lorsque la substance à soumettre à essai est peu soluble dans l’eau de mer, la solution mère peut être préparée
[38]
dans de l’eau déminéralisée ou selon les modifications spécifiées dans l’ISO 14442 et l’ISO 5667-16
(emploi d’un agent solubilisant, dispersion par ultrasons, etc.).
8.2.2 Échantillons aqueux
Les échantillons aqueux (eau de mer, eaux de cours d’eau, effluents urbains, agricoles ou industriels,
ou encore extraits aqueux) sont soumis à essai à l’état brut et/ou après filtration ou centrifugation, afin de
déterminer la fraction responsable des effets observés. De plus, selon les paramètres physico-chimiques
de ces échantillons aqueux, il peut être nécessaire d’ajuster leur salinité pour se conformer à la gamme
recommandée pour l’espèce choisie.
8.2.3 Sédiments ou sédiments de dragage
Un protocole de préparation est expliqué à l’Annexe C pour les échantillons de sédiments contaminés ou de
sédiments de dragage.
8.3 Choix de la gamme de concentration
Dans le cas des substances chimiques, les solutions d’essai sont préparées en diluant la solution mère dans
de l’eau de mer naturelle ou artificielle.
Dans le cas d’échantillons d’eau, d’effluents, de lixiviats et d’éluats de faible salinité, toutes les dilutions doivent
rester dans la gamme de salinité acceptable pour l’espèce utilisée. Pour les eaux douces, la concentration
maximale soumise à essai ne doit pas dépasser 18 % en fraction volumique de l’échantillon initial. Si cela
s’avère indispensable, il convient d’ajuster la salinité avec de la saumure hypersaline (voir 5.2.1).
Ces solutions peuvent être préparées à l’avance ou immédiatement avant l’essai si des modifications rapides
de la composition des échantillons sont attendues.
Au moins cinq dilutions doivent être effectuées pour couvrir une gamme de concentration permettant
d’observer une gamme complète d’effets entre 0 % et 100 % du développement embryolarvaire anormal.
Selon les effets potentiels recherchés, les substances peuvent être soumises à essai seules ou en mélanges.
Dans le cas d’échantillons aqueux, la gamme de dilution à soumettre à essai peut être optimisée en fonction
de l’objectif de l’essai: calcul d’une valeur de CE ou détermination d’une concentration sans effet.
x
Si l’essai préliminaire indique qu’aucun effet n’est attendu dans les conditions d’essai requises, un essai
limite peut être réalisé pour confirmer l’absence d’effet à la concentration la plus élevée ou à la dilution la
plus faible de la gamme de l’essai préliminaire.
8.4 Prélèvement de gamètes
8.4.1 Généralités
Les gamètes mâles et femelles sont obtenus par ponte naturelle des adultes (c’est-à-dire choc thermique)
ou par stripping des gonades pour les huîtres. Avant de stimuler les bivalves matures pour obtenir les
gamètes, ils peuvent être placés dans de l’eau de mer naturelle ou artificielle (voir 5.2) afin qu’ils puissent
se remettre du stress causé par le transport et éliminer la majorité de leurs fèces. Juste avant d’induire la
ponte, les bivalves sont brossés et rincés pour éliminer les épibiontes (organismes végétaux ou animaux
fixés à la coquille des bivalves) et les débris sédimentaires.
8.4.2 Stimulation thermique
La stimulation thermique est utilisée pour induire la ponte (voir la Référence [3]) dans des aquariums
d’eau de mer. Les températures utilisées dans le cadre de cette stimulation thermique sont comprises dans
l’intervalle de température naturellement observée pour la ponte, soit entre 14 °C et 29 °C pour les huîtres
et entre 15 °C et 20 °C pour les moules. Toutes les 30 min, les bivalves alternent entre les aquariums d’eau de
mer chaude et les aquariums d’eau de mer froide (voir l’Annexe A). La ponte est généralement déclenchée au
cours des trois premières heures, les mâles étant les premiers à émettre leurs spermatozoïdes. Cela amène
les femelles à pondre leurs œufs quelques minutes plus tard, si les parents sont très matures. Afin d’accélérer
l’émission de gamètes, les bivalves peuvent être stimulés chimiquement en ajoutant quelques millilitres
d’une suspension d’ovocytes ou de spermatozoïdes inactivés devant le siphon inhalant des mollusques
lorsqu’ils sont grand ouverts (ce qui indique que la ponte est imminente). Afin d’inactiver les gamètes, il est
conseillé de les congeler pendant au moins une journée en dessous de –18 °C.
Il est facile de différencier les individus mâles des femelles:
— dans le cas des moules, la ponte prend la forme d’un ruban qui se désintègre dans l’eau en une grappe
orange pour la femelle et une grappe gris-blanc pour le mâle (voir la Figure 1);
— dans le cas des huîtres, les femelles expulsent leurs œufs dans des nuages gris-blanc en battant
vigoureusement la valve droite, tandis que les mâles libèrent du sperme qui rend l’eau laiteuse (voir la
Figure 1). Il est possible de confirmer le sexe des parents en observant un échantillon au microscope
optique avec un grossissement 400× dès l’émission des gamètes.
Dès que la libération des gamètes est enclenchée sans nul doute possible,
— les mâles sont retirés de l’eau et maintenus fermés à l’aide d’un élastique de sorte que les spermatozoïdes
ne perdent pas leur capacité de fécondation par contact prolongé avec l’eau, et
— les femelles, une fois rincées, sont immédiatement placées dans des récipients individuels de 250 ml
remplis d’eau de mer de référence; dès qu’elles commencent à libérer de nouveau des gamètes, elles sont
transférées dans un nouvel aquarium d’eau de mer à deux à trois reprises afin de recueillir uniquement
les œufs du géniteur sélectionné et d’éliminer ceux qui ont pu être fécondés dans les aquariums de
stimulation (voir la Figure 1).
a) Émission de gamètes par la b) Émission de gamètes par c) Émission de gamètes par
moule (Mytilus edulis) l’huître creuse mâle l’huître creuse femelle
(1: mâle, 2: femelle) (Magallana gigas) (Magallana gigas)
[25]
SOURCE: Quiniou et al. 2005, Figure 3, p.12, reproduite avec l’autorisation des auteurs.
Figure 1 — Émission de gamètes par une moule et une huître
Dès que les premières femelles ont émis leurs gamètes, une aliquote est prélevée pour sélectionner la femelle
qui sera utilisée au cours de l’essai. Une femelle est retenue lorsque ses ovocytes sont aussi uniformes que
possible quelques minutes après leur émission, par exemple des ovocytes réguliers, sphériques (pour les
moules) ou légèrement piriformes (pour les huîtres), et un cytoplasme uniformément granulaire. Une fois
la femelle sélectionnée, la suspension d’ovocytes est filtrée à travers un tamis de 100 µm afin d’éliminer les
fèces et les débris. Les ovocytes sont ensuite placés dans un bécher contenant 2 l d’eau de mer de référence
et leur densité est déterminée (voir 8.5).
Les mâles sont alors transférés dans des récipients individuels de 250 ml et juste recouverts d’eau afin
d’obtenir une suspension très dense de sperme. Après deux ou trois changements de bain, la solution de
sperme est filtrée à travers un tamis de 32 µm (les gamètes passent à travers les mailles). Un mâle est retenu
lorsque le sperme est fortement concentré (voir la Figure 1) et que les spermatozoïdes sont très mobiles
(la mobilité étant vérifiée sous microscope stéréoscopique inversé).
8.4.3 Stripping des gamètes
Il convient d’ouvrir les huîtres mâles et femelles matures. Cette opération peut être réalisée en cassant la
charnière et en coupant le muscle adducteur à l’aide d’un couteau, un couteau à huître classique par exemple.
Il convient d’insérer le couteau dans le bord plat de l’huître et de le maintenir de niveau lors de la coupe
afin d’éviter d’endommager les gonades. Il convient de rincer soigneusement la cavité corporelle de chaque
huître à l’eau de mer pour éliminer les débris qui peuvent être présents.
Avant d’extraire le sperme d’une huître mâle, il convient de transférer un petit échantillon de sperme de
chaque mâle sur une lame ou un petit récipient avec quelques gouttes d’eau de mer. Après 15 min à 30 min,
il convient d’évaluer l’activité du sperme à l’aide d’un microscope et de sélectionner pour le stripping les
huîtres mâles possédant les spermatozoïdes les plus mobiles.
Les gamètes peuvent être extraits à l’aide d’une des méthodes suivantes:
— insérer une pipette Pasteur propre dans la gonade jusqu’à une profondeur de 1 mm à 2 mm et prélever
les œufs ou le sperme. Il convient de transférer les gamètes dans des volumes séparés d’eau de mer et de
les maintenir à (24 ± 2) °C;
— ou alors, couper délicatement la gonade au moyen d’un scalpel pointu en inclinant la lame vers le haut
pour éviter de perforer l’intestin. Il convient de prélever les gamètes en pipettant de l’eau de mer à
(24 ± 2) °C sur la surface de la gonade et en rinçant les gamètes dans un récipient approprié.
Il convient d’éviter de perforer l’intestin, car la contamination des gamètes peut entraîner une dégradation
de la fécondation.
8.5 Mesure de la densité d’œufs
Une partie de la suspension initiale d’œufs est diluée au 1/100 dans de l’eau de mer. La densité des œufs est
évaluée en procédant à trois comptages de 0,1 ml de cette solution à l’aide d’une loupe binoculaire (voir 6.9).
La solution initiale est ensuite ajustée pour obtenir une densité finale dans les réplicats d’essai comprise
entre 20 000 œufs/l et 50 000 œufs/l.
8.6 Fécondation et ensemencement des œufs fécondés
La fécondation s’effectue en ajoutant quelques millimètres de la suspension dense de sperme dans le bécher
contenant les ovocytes. Il convient de féconder la suspension d’ovocytes dans les 60 min qui suivent le
recueil des suspensions d’
...
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