ISO 19040-3:2018

NORME ISO
INTERNATIONALE 19040-3
Première édition
2018-08
Qualité de l'eau — Détermination du
potentiel oestrogène de l'eau et des
eaux résiduaires —
Partie 3:
Essai in vitro sur cellules humaines
avec gène rapporteur
Water quality — Determination of the estrogenic potential of water
and waste water —
Part 3: In vitro human cell-based reporter gene assay
Numéro de référence
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Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 2
4 Interférences . 4
5 Principe. 4
6 Appareillage et matériel .5
7 Réactifs, cellules et milieux .6
8 Échantillonnage et échantillons .9
8.1 Généralités . 9
8.2 Flacons et matériel d’échantillonnage . 9
8.3 Nettoyage préalable des flacons et du matériel . 10
8.4 Mode opératoire d’échantillonnage . 10
8.5 Transport des échantillons . 10
8.6 Prétraitement de l’échantillon . 10
8.7 Conservation des échantillons . 11
9 Mode opératoire .11
9.1 Entretien de la culture cellulaire . 11
9.1.1 Congélation des cellules . 11
9.1.2 Démarrage d’une nouvelle culture cellulaire . 11
9.1.3 Culture des cellules . 11
9.2 Mode opératoire d’essai sur cellules humaines avec gène rapporteur .12
9.2.1 Ensemencement des cellules (jour 1) . .12
9.2.2 Préparation de la référence E2 (jour 2) .12
9.2.3 Préparation des dilutions d’échantillon (jour 2) .13
9.2.4 Blanc de terrain .13
9.2.5 Exposition des cellules (jour 2) . 14
9.2.6 Récolte des cellules (jour 3) . 14
9.2.7 Mesurage de la luminescence (jour 3) . 14
9.3 Analyse des données . 14
9.3.1 Calcul de l’induction du gène rapporteur . 14
9.3.2 Calcul du pourcentage de réponse maximale . 15
9.3.3 Calcul de la courbe dose-effet . 15
10 Critères de validité .16
10.1 Critères de validité pour l’essai . 16
10.2 Critères de validité pour les échantillons . 16
11 Critères d’évaluation .16
12 Rapport d’essai .16
Annexe A (informative) Réglages du luminomètre .18
Annexe B (informative) Préparation de la plaque .19
Annexe C (informative) Caractéristiques et détails de l’essai biologique .20
Annexe D (informative) Configuration d’essai pour les produits chimiques et les extraits .22
Annexe E (informative) Préparation d’une gamme de dilution .24
Annexe F (informative) Données de performance .25
Annexe G (informative) Évaluation statistique .35
Annexe H (informative) Calcul des équivalents 17β- œstradiol .36
iii
Annexe I (informative) Mesurage de la plus faible dilution sans effet (LID) d’eaux
résiduaires — Évaluation simplifiée pour les essais d’eaux résiduaires .38
Bibliographie .41
iv
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/patents).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/iso/foreword.html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité
SC 5, Méthodes biologiques.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 19040 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
v
NORME INTERNATIONALE ISO 19040-3:2018(F)
Qualité de l'eau — Détermination du potentiel oestrogène
de l'eau et des eaux résiduaires —
Partie 3:
Essai in vitro sur cellules humaines avec gène rapporteur
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les
pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il relève de la responsabilité
de l’utilisateur d’établir des pratiques de santé et de sécurité appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément au présent
document soient effectués par du personnel dûment formé.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode permettant de déterminer le potentiel œstrogénique de
l'eau et des eaux résiduaires au moyen d’un essai avec gène rapporteur utilisant des cellules humaines
transfectées de façon stable. Cet essai avec gène rapporteur se fonde sur l’activation du récepteur des
œstrogènes humains alpha.
Cette méthode est applicable:
— aux eaux douces;
— aux eaux résiduaires;
— aux extraits aqueux et lixiviats;
— aux éluats de sédiments (eau douce);
— aux eaux interstitielles;
— aux solutions aqueuses contenant des substances uniques ou des mélanges chimiques;
— à l’eau potable;
— la limite de quantification (LDQ) de cette méthode pour l’analyse directe d’échantillons d’eau est
comprise entre 0,3 ng/l et 1 ng/l d’équivalents 17β-œstradiol (EEQ) sur la base des résultats de
l’essai interlaboratoires international (voir l’Annexe F). Le domaine de mesure supérieur a été évalué
[sur la base des résultats de l’essai interlaboratoires international (voir le Tableau F.3)] jusqu’à un
niveau de 75 ng d’EEQ/l. Les échantillons présentant un potentiel œstrogénique supérieur à ce
seuil doivent être dilués pour une quantification valable. L’extraction et la préconcentration des
échantillons d’eau peuvent s’avérer nécessaires, si leur potentiel œstrogénique est inférieur à la LDQ
donnée.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— Plateforme de consultation en ligne de l’ISO: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/ .
3.1
milieu de culture
substances nutritives se présentant sous une forme et une phase (liquide ou solidifiée) favorisant la
croissance cellulaire
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 24, modifiée — «cellulaire» remplace «microbiologique »]
3.2
niveau de dilution
D
dénominateur du coefficient de dilution (le numérateur étant 1) d’un mélange d’eau ou d’eaux
résiduaires et d’eau de dilution en tant que nombre entier
Note 1 à l'article: Pour de l’eau ou pour des eaux résiduaires non diluées, ce coefficient est par définition de 1→1.
La valeur D correspondante la plus petite possible est 1. Dans le présent document, la flèche indique la transition
entre le volume total initial et le volume total final.
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 28]
3.3
eau de dilution
eau stérile ajoutée à l’échantillon soumis à essai afin de préparer une série définie de dilutions
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7]
3.4
EC
concentration efficace d’un composé produisant 50 % d’un effet
Note 1 à l'article: Au sens du présent document, la EC est la concentration efficace d’un composé qui induit 50 %
de l’activité maximale du gène rapporteur qui peut être atteinte par ce composé.
3.5
extrait
échantillon pour essai après extraction et élimination éventuelle du milieu d’extraction
3.6
blanc de terrain
récipient préparé dans le laboratoire, utilisant comme réactif de l’eau ou toute autre matrice de blanc,
et destiné à être emporté par le personnel d’échantillonnage pour être exposé à l’environnement
dans lequel l’échantillonnage est effectué afin de vérifier l’absence de contamination au cours de
l’échantillonnage
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
3.7
taux d’induction
rapport de la valeur moyenne de puits ayant une activité accrue du gène rapporteur mesurée sur les
plaques traitées avec une dose de l’échantillon pour essai ou avec un témoin positif, à la valeur moyenne
des puits correspondants traités avec le témoin négatif à l’aide des mêmes cellules, dans des conditions
identiques
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 43, modifiée — «puits ayant une activité accrue du gène rapporteur
mesurée» remplace «colonies mutantes dénombrées»; «puits correspondants» remplace «plaques
correspondantes»; «rapport» remplace «différence»; «cellules» remplace «souche »]
3.8
limite de quantification
LDQ
valeur la plus faible d’une caractéristique à déterminer pouvant être mesurée avec un niveau acceptable
d’exactitude et de fidélité
[SOURCE: ISO 15839:2003, 3.18]
3.9
plus faible dilution sans effet
LID
plus faible dilution dans un lot d’essai qui ne présente aucun effet, c’est-à-dire aucune augmentation
statistiquement significative de l’activité du gène rapporteur par rapport au témoin négatif
[SOURCE: ISO 11350:2012, 3.4, modifiée — «augmentation de l’activité du gène rapporteur» remplace
«augmentation du nombre de puits de révertants »]
3.10
témoin négatif
eau de dilution sans l’échantillon pour essai
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 51]
3.11
nombre de passages
nombre de repiquages de cellules dans un nouveau récipient de culture (flacon de culture cellulaire ou
microplaque)
3.12
composé de référence
composé avec une ou plusieurs valeurs de propriété suffisamment reproductibles et bien établies pour
permettre l’étalonnage de la méthode de mesure
[SOURCE: ISO 7405:2008, 3.6, modifiée —« composé » remplace «produit»; «l’étalonnage de la méthode
de mesure» remplace «l’utilisation du produit ou de la substance pour l’étalonnage d’un appareil,
l’évaluation d’une méthode de mesure, ou pour l’attribution de valeurs à des produits».]
3.13
unités de lumière relative
RLU
niveau d’activité du gène rapporteur tel que mesuré par la lumière produite à l’aide d’un luminomètre,
exprimé en unités de lumière relative
3.14
activité du gène rapporteur
activité quantitative d’un gène fixé au promoteur d’un autre gène
3.15
culture mère
culture congelée afin de conserver les caractéristiques de la lignée cellulaire
[SOURCE: ISO 21427-2:2006, 13, modifiée — «de la lignée cellulaire» remplace «des cellules V79 »]
3.16
repiquage
transfert d’une partie d’une culture cellulaire dans un nouveau récipient de culture cellulaire pendant
la culture cellulaire
3.17
échantillon pour essai
portion non diluée, diluée ou préparée autrement d’un échantillon soumis à l’essai, après exécution
de toutes les étapes de préparation, telles que la centrifugation, la filtration, l’homogénéisation,
l’ajustement du pH et la détermination de la force ionique
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92]
4 Interférences
Les effets toxiques présents dans les échantillons pour essai peuvent entraîner une réduction de la
viabilité des cellules et donc une réduction de la réponse cellulaire mesurée. En conséquence, les effets
œstrogéniques d’un échantillon peuvent être masqués par des effets toxiques aigus et conduire à des
résultats d’essai faux négatifs (voir l’Article 9 pour de plus amples informations). Dans ce cas, il convient
de diluer l’échantillon jusqu’à ce qu’aucune cytotoxicité ne soit plus observée (consulter le manuel de
l’essai de cytotoxicité utilisé).
L’utilisation de dispositifs et/ou flacons d’échantillonnage inappropriés peut avoir une influence sur le
résultat d’essai, car l’adsorption éventuelle de composés actifs sur les surfaces conduit à des résultats
faux négatifs. D’autre part, des composés actifs peuvent être libérés dans l’échantillon par les flacons
d’échantillonnage, en particulier si le matériel utilisé est en plastique, et des résultats faux positifs
peuvent être générés. Voir l’Article 7 pour de plus amples informations.
Une salinité élevée peut provoquer des effets toxiques dus à la pression osmotique résultante. Les
cellules ER(α) CALUX (Références [10] à [16]) tolèrent une conductivité de l’échantillon pouvant
aller jusqu’à 34,000 µS/cm (salinité de 1,0 % en fraction massique). Les contaminations bactériennes
et fongiques peuvent avoir une influence négative sur la réponse des cellules. Par conséquent, des
antibiotiques sont ajoutés au milieu de culture cellulaire. La contamination des cellules est évaluée par
un examen visuel (au microscope) lors des essais de l’échantillon. Voir l’Article 9 pour de plus amples
informations.
Lorsque des échantillons filtrés sont soumis à essai afin d’éliminer les bactéries de l’échantillon, des
particules solides sont également séparées de l’échantillon. Ainsi, les substances ayant une activité
œstrogénique qui sont adsorbées sur les particules peuvent ne pas être détectées.
Des composés antiœstrogéniques et d’autres composés inhibiteurs non toxiques peuvent masquer les
effets œstrogéniques. La présence de composés interférents peut être évaluée à l’aide d’échantillons
dopés avec une quantité définie d’un composé œstrogénique ayant des propriétés définies (par exemple
17β-œstradiol) provoquant une induction connue du système d’essai.
Les composés ayant des propriétés œstrogéniques peuvent être présents sous forme de conjugués
inactifs. Une déconjugaison chimique peut être nécessaire pour quantifier le potentiel œstrogénique
global d’un échantillon.
5 Principe
La signalisation induite par le récepteur des œstrogènes (ER) est essentielle dans l’action des
œstrogènes et le mécanisme de signalisation du récepteur des œstrogènes est bien établi. La liaison
des œstrogènes à leur récepteur active ce dernier, qui se lie à des séquences de reconnaissance dans
les régions promotrices des gènes cibles, appelées éléments de réponse aux œstrogènes (ERE). Ces ERE
ont été liés à un élément promoteur et à un gène induisant la transcription de la protéine luciférase
facilement mesurable. Dans ces cellules, le récepteur activé par le ligand activera la transcription de
la luciférase, et la protéine luciférase transcrite émettra une lumière lorsqu’un substrat sera ajouté. Le
signal augmente en fonction de la dose du fait des concentrations croissantes de ligand. L’activité de la
luciférase dans les lysats cellulaires est mesurée à l’aide d’un luminomètre permettant d’obtenir des
mesures fiables, sensibles et quantitatives.
6 Appareillage et matériel
Outre le matériel généralement présent dans un laboratoire pour la culture cellulaire, l’appareillage et
le matériel suivants sont nécessaires. Pour des dispositifs d’échantillonnage appropriés, voir l’Article 8.
6.1 Hotte à flux laminaire, standard: «risque biologique».
6.2 Bain-marie, 37 °C.
6.3 Incubateur à CO , 5 % CO , 37 °C, humidité 100 %.
2 2
6.4 Microscope à contraste de phase inversé.
6.5 Congélateur, au moins ≤ −18 °C et ≤ −70 °C.
6.6 Agitateur pour microplaques.
6.7 Centrifugeuse.
6.8 Balance de laboratoire.
6.9 Pipettes stériles, 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml et 25 ml, en verre ou en plastique.
6.10 Pipeteur.
6.11 Flacons de culture cellulaire, 75 cm avec bouchons filtrants.
6.12 Récipients en plastique stériles, 12 ml et 50 ml avec bouchon stérile.
6.13 Plaques stériles à 12 puits.
6.14 Pipette à canaux multiples à répétition (pipette à répétition), avec embouts de 5 ml et 10 ml.
6.15 Pipettes, 1 μl, 50 μl, 200 μl et 1 000 μl, à embouts stériles.
6.16 Pipettes à canaux multiples, jusqu’à 50 μl et jusqu’à 300 μl.
6.17 Plaques stériles en polystyrène à 96 puits, à fond plat et couvercle transparents, appropriées
pour la culture cellulaire, volume 300 μl par puits.
6.18 Luminomètre pour microplaques avec deux injecteurs, pour l’addition de substrat et de
réactif d’arrêt.
6.19 Compteur de cellules ou hématimètre.
6.20 pH-mètre.
6.21 Flacons cryogéniques, stériles, 2 ml.
6.22 Récipient d’azote liquide pour le stockage à long terme des cellules.
6.23 Filtre, en acétate de cellulose, diamètre des pores 0,45 µm.
7 Réactifs, cellules et milieux
7.1 Réactifs
Dans la mesure du possible, utiliser des produits chimiques de «qualité réactif». Si les (différents)
hydrates utilisés diffèrent des composés spécifiés, s’assurer que la masse appropriée du composé
principal est employée.
7.1.1 Sulfoxyde de diméthyle (DMSO).
7.1.2 Glycérol pour biologie moléculaire, ≥ 99 %, masse moléculaire: 92,09 g/mol, CAS: 56-81-5.
7.1.3 17β-œstradiol, ≥ 98 %, C H O , masse moléculaire: 272,38 g/mol, CAS: 50-28-2.
18 24 2
7.1.4 Sel d’acide éthylène-diamine-tétraacétique (EDTA), CAS: 6381-92-6.
7.1.5 Trypsine, CAS: 9002-07-7.
7.1.6 Sérum fœtal bovin (FCS).
7.1.7 Milieu DMEM/F12 avec rouge de phénol comme indicateur de pH.
7.1.8 Acides aminés non essentiels (100x).
7.1.9 Pénicilline-streptomycine (100x), concentration utilisée 5 000 unités de pénicilline par
ml/5 000 μg de streptomycine par ml.
7.1.10 Tampon phosphate salin pH 7,2 (PBS), sans calcium ni magnésium.
7.1.11 Adénosine-5’-triphosphate (ATP), CAS: 34369-07-8.
7.1.12 Acide trans-1,2-diaminocyclohexane-N,N,N’,N’-tétraacétique monohydraté (CDTA),
CAS: 125572-95-4.
7.1.13 Dithiothréitol (DTT), CAS: 3483-12-3.
7.1.14 2-amino-2-(hydroxyl-méthyl)-1,3-propanediol (TRIS), CAS: 77-86-1.
7.1.15 Dextrane T500.
7.1.16 Charbon actif.
7.1.17 Coenzyme A, qualité acide libre, CAS: 85-61-0.
7.1.18 D-luciférine, sel sodique, CAS: 103404-75-7.
7.1.19 Hydroxycarbonate de magnésium pentahydraté, C H Mg O , CAS: 56378-72-4.
4 2 5 14
7.1.20 Sulfate de magnésium, CAS: 7487-88-9.
7.1.21 Bicarbonate de sodium, CAS: 144-55-8.
7.1.22 Milieu de culture cellulaire en poudre, Sigma, D2902, sans rouge de phénol ni bicarbonate de
sodium.
7.1.23 Tricine, CAS: 5704-04-1.
7.1.24 Acétone, (pureté «pour analyses »), CAS: 67-64-1.
7.1.25 Hydroxyde de sodium, masse moléculaire 40,00 g/mol, CAS: 1310-73-2.
7.1.26 Triton X-100, CAS: 9002-93-1.
7.1.27 Solution d’acide chlorhydrique, 1 M (HCl), masse moléculaire 36,46 g/mol, CAS: 7647-01-0.
7.2 Eau, qualité 3, telle que définie dans l’ISO 3696; une eau dont la conductivité est inférieure ou
égale à 5 µS/cm est acceptable.
Lorsqu’une eau stérile est nécessaire, la stériliser à l’autoclave ou par filtration (acétate de
cellulose, 0,2 µm). L’eau telle que spécifiée ici est également utilisée pour la dilution progressive de
l’échantillon pour essai.
7.3 Lignée cellulaire.
Lignée cellulaire humaine génétiquement modifiée, exprimant le récepteur des œstrogènes humains
(hERα et/ou hERβ) et contenant un plasmide rapporteur pour la luciférase. Des descriptions plus
détaillées des lignées cellulaires individuelles sont données dans l’Annexe C.
7.4 Milieu.
Utiliser toujours des solutions, une verrerie, etc. stériles. Effectuer tous les modes opératoires dans
des conditions d’asepsie et dans l’environnement stérile d’une hotte à flux laminaire (standard pour
les risques biologiques). Si un passage à l’autoclave est nécessaire, toujours effectuer cette opération
pendant 20 min à (121 ± 2) °C. Couvrir légèrement les récipients; ne jamais les fermer hermétiquement.
7.4.1 Milieu de culture cellulaire.
Introduire 5,4 ml d’acides aminés non essentiels (7.1.8), 42 ml de FCS (7.1.6) et 1 ml de
pénicillinestreptomycine (7.1.9) dans un flacon contenant 500 ml de milieu DMEM/F12 avec du rouge
de phénol. Il convient de conserver le milieu de culture cellulaire préparé à 4 °C pendant huit semaines
au maximum.
7.4.2 Milieu de congélation.
Ajouter 1 ml d’acides aminés non essentiels, 10 ml de DMSO, 20 ml de FCS et 1 ml de
pénicillinestreptomycine (7.1.9) à 68 ml de milieu DMEM/F12 avec du rouge de phénol. Répartir des
lots de 20 ml de façon stérile dans des tubes stériles. Il convient de conserver le milieu de congélation
préparé à (−20 ± 1) °C jusqu’à son utilisation et de le conserver sur de la glace lors de l’utilisation.
7.4.3 Milieu d’essai concentré.
7.4.3.1 Milieu d’essai concentré 3x.
Dissoudre le contenu d’un flacon de milieu de culture cellulaire en poudre (7.1.22) dans 250 ml d’eau (à
température ambiante), puis dissoudre 3,7 g de bicarbonate de sodium (7.1.21) dans la même solution.
Ajuster le pH à 7,4 à l’aide d’une solution de HCl 1 mol/l ou de NaOH 1 mol/l. Compléter au volume final
de 300 ml avec de l’eau et stériliser par filtration. Ajouter 12 ml d’acides aminés non essentiels (7.1.8),
55 ml de sérum appauvri (7.4.8) et 37 ml de pénicilline-streptomycine (7.1.9). Il convient de conserver
les milieux préparés à (4 ± 1) °C pendant huit semaines au maximum.
7.4.3.2 Milieu d’essai concentré 1x.
Diluer 100 ml du milieu d’essai concentré 3x avec 200 ml d’eau et stériliser par filtration. Il convient de
conserver les milieux préparés à (4 ± 1) °C pendant huit semaines au maximum.
7.4.4 Solution de trypsine.
Ajouter 20 ml de trypsine (7.1.5) à 980 ml de PBS (7.1.10) et ajouter 0,2 g d’EDTA (7.1.4). Stériliser la
solution de trypsine par filtration et la diviser en aliquotes de 50 ml. La date de péremption est de
3 mois à compter du jour de la préparation. Conserver les tubes de trypsine à −20 °C.
7.4.5 Réactif d’arrêt.
Dissoudre 8,0 g d’hydroxyde de sodium dans un litre d’eau déminéralisée pour obtenir une concentration
finale de 0,2 M.
7.4.6 Mélange de substrat.
Dissoudre complètement de la tricine (7.1.23) et du sulfate de magnésium (7.1.20) dans 500 ml d’eau
déminéralisée jusqu’à ce que la solution soit transparente et incolore. Ajouter les autres produits
chimiques du Tableau 1 et 400 ml d’eau. Ajuster le pH à 7,8 à l’aide d’une solution 1 mol/l de HCl et/
ou de NaOH. Ajuster à un volume final de 1 l. Conserver à (–20 ± 1) °C pendant 3 mois au maximum ou
à (−80 ± 1) °C pendant 12 mois au maximum.
Tableau 1 — Préparation du mélange de substrat (1 000 ml)
Composé Masse Masse moléculaire Molarité
g g/mol Mmol/l
Tricine 3,58 179,2 20
C H Mg O 0,52 485,69 1,1
4 2 5 14
MgSO4 0,31 120,37 2,6
EDTA 0,037 372,23 0,10
DTT 5,14 154,2 33,3
Coenzyme A 0,21 767,6 0,27
Luciférine 0,15 320,32 0,47
ATP 0,29 551,1 0,53
7.4.7 Mélange de lyse
Dissoudre complètement les composés indiqués dans le Tableau 2 dans 500 ml d’eau déminéralisée.
Ajuster le pH à 7,8 à l’aide de solutions de HCl à 1 mol/l et/ou de NaOH à 1 mol/l. Ajuster le volume
final à 1 l et diviser en aliquotes de 40 ml. Conserver à ≤ –18 °C (modifier pour tous les problèmes de T)
pendant 1 an au maximum ou à 4 °C pendant un mois au maximum.
Tableau 2 — Composition du mélange de lyse (1 000 ml)
Composé Masse Volume Masse moléculaire Concentration
g ml
Tris 3,0 121,1 25 mmol/l
DTT 0,31 154,2 2,0 mmol/l
CDTA 0,73 364,35 2,0 mmol/l
Glycérol 100 10 %
Triton X-100 10 1 %
7.4.8 Sérum fœtal bovin appauvri
Dissoudre 0,6 g de Tris (7.1.14) dans 50 ml d’eau déminéralisée dans un bécher en verre de 500 ml et
ajuster le pH à 8,0. Ajouter 450 ml d’eau déminéralisée, 0,25 g de Dextrane T500 (7.1.15) et 2,5 g de
charbon actif (7.1.16). Fermer le bécher et agiter le mélange pendant toute une nuit à 4 °C. Décongeler
également un flacon de FCS (7.1.6) pendant toute une nuit à 4 °C.
Le jour suivant, transférer 200 ml de FCS décongelé dans un flacon en verre stérile et chauffer
pendant 30 min à 56 °C au bain-marie. Transférer la suspension de charbon dans 12 tubes de
centrifugation de 50 ml et centrifuger les tubes pendant 20 min à 1 000 g. Décanter le surnageant.
Répartir le FCS dans six tubes avec des culots de charbon et remettre en suspension. Incuber cette
suspension pendant 45 min à 45 °C tout en agitant. Centrifuger les tubes pendant 20 min à 1 000 g et
décanter le sérum dans les 6 autres tubes avec des culots de charbon frais. Incuber cette suspension
pendant encore 45 min à 45 °C tout en agitant. Centrifuger les tubes pendant 20 min à 1 000 g et décanter
le sérum dans les 6 tubes propres. Centrifuger à nouveau pendant 20 min à 1 000 g pour éliminer le
charbon résiduel. Regrouper le sérum, stériliser par filtration et diviser en aliquotes de 55 ml. Conserver
à −20 °C pendant six mois au maximum.
7.4.9 Solution mère de 17β-œstradiol (E2).
Dissoudre 13,6 mg de 17β-œstradiol (E2) (7.1.3) dans 10 ml de DMSO (7.1.1). Diluer la solution mère
1 000x, par exemple en ajoutant à la pipette 1 ml à 9 ml de DMSO et ensuite 1 ml à 99 ml de DMSO
(concentration finale de la solution mère: 5,0E-6 M). Conserver des aliquotes de 1 ml à ≤ −18 °C.
8 Échantillonnage et échantillons
8.1 Généralités
Le présent document décrit les exigences spécifiques relatives à l’échantillonnage en vue de la
détermination de l’activité œstrogénique dans des échantillons d’eau. Pour des informations générales
sur l’échantillonnage, se reporter à l’ISO 5667-16.
8.2 Flacons et matériel d’échantillonnage
Utiliser des flacons en verre (verre borosilicaté) propres, de préférence avec des bouchons
en polypropylène ou des bouchons revêtus de polytétrafluoroéthylène (PTFE). Pour éviter la
photodégradation des composés présentant un intérêt, utiliser de préférence des flacons en verre
ambré. Lorsque des flacons en verre transparent sont utilisés, envelopper les flacons d’une feuille
d’aluminium ou les conserver dans un récipient sombre.
En variante, des flacons en aluminium ou en acier inoxydable (tous deux non revêtus) peuvent être
utilisés. S’assurer qu’un matériau autre que le verre borosilicaté n’a pas d’incidence sur les résultats.
8.3 Nettoyage préalable des flacons et du matériel
Après le mode opératoire de nettoyage de routine, effectuer un nettoyage complémentaire des flacons et
des bouchons comme suit: rincer les flacons et bouchons propres trois fois avec une quantité minimale
d’acétone (7.1.24). Laisser l’acétone résiduelle s’évaporer (par exemple dans une étuve). Après le
séchage, fermer immédiatement les flacons. Rincer trois fois toute la verrerie, les spatules, etc. entrant
en contact avec l’échantillon avec une quantité minimale d’acétone (7.1.24). Laisser l’acétone résiduelle
s’évaporer.
8.4 Mode opératoire d’échantillonnage
Pendant l’échantillonnage, utiliser des gants en nitrile à usage unique. Ne pas appliquer de crème sur les
mains avant l’échantillonnage et éviter tout contact entre la peau et l’échantillon. Utiliser uniquement
un matériel en verre, PTFE, aluminium ou acier inoxydable.
Remplir complètement les flacons. Tenir compte d’une dilatation éventuelle de l’échantillon en cas de
variation de température. Si les échantillons doivent être congelés dans le cadre de leur conservation,
les flacons ne doivent pas être complètement remplis afin d’éviter tout bris pouvant survenir en raison
de la dilatation de la glace durant le processus de congélation et décongélation.
Ne pas utiliser de produits chimiques pour stabiliser les échantillons.
Réfrigérer les échantillons à une température comprise entre 2 °C et 8 °C ou les congeler à une
température ≤ −18 °C.
8.5 Transport des échantillons
Livrer les échantillons au laboratoire dès que possible après l’échantillonnage.
Pendant le transport, conserver le conteneur d’échantillons à l’abri du gel, de la casse, de la lumière,
d’une augmentation de température et d’une contamination externe.
Des méthodes de réfrigération ou de congélation doivent être appliquées aux échantillons si une
durée plus importante est requise pour le transport et la conservation. Il convient de commencer la
réfrigération dès que possible après l’échantillonnage, par exemple dans des glacières contenant de la
glace, des blocs réfrigérants ou des éléments réfrigérants. Un dispositif de réfrigération dans le véhicule
de transport est également approprié. Une température de réfrigération pendant le transport comprise
entre 2 °C et 8 °C s’est avérée appropriée. La température de refroidissement suggérée s’applique à
l’environnement de l’échantillon (par exemple à l’intérieur de la boîte froide), et non à l’échantillon lui-
même.
Si l’échantillon est congelé, éviter sa décongélation (en le transportant par exemple sur de la glace
carbonique). Si de la glace carbonique est choisie pour le transport, il convient d’envelopper les flacons
dans du papier ou un film à bulles d’air pour éviter tout contact direct avec la glace carbonique.
8.6 Prétraitement de l’échantillon
Il est préférable d’analyser les échantillons sous leur forme non filtrée immédiatement après
l’échantillonnage en raison de la perte possible d’activité œstrogénique associée aux particules. La
décision concernant la filtration de l’échantillon (par exemple acétate de cellulose, diamètre des
pores de 0,45 μm) doit être prise par le laboratoire en charge de l’essai en fonction de l’application et
de l’expérience acquise avec le type d’échantillon étudié. Dans tous les cas, indiquer dans le rapport
si l’échantillon soumis à essai a été filtré ou non. Des informations complémentaires sur les impacts
éventuels d’une filtration sur des échantillons ayant une activité œstrogénique sont données dans les
Références [20] et[21].
Ajuster le pH de l’échantillon à 7,2 ± 0,2 à l’aide d’une solution de HCl (7.1.27) ou de NaOH (7.1.25).
Choisir les concentrations d’acide ou de base de telle sorte que les volumes ajoutés soient aussi faibles
que possible. Éviter toute surtitration. L’ajustement du pH de l’échantillon peut avoir une incidence sur
l’échantillon. Consigner dans le rapport tous les changements visibles provoqués par l’ajustement du pH
(ISO 5667-16).
8.7 Conservation des échantillons
Soumettre à essai les échantillons immédiatement après l’échantillonnage. Si cela n’est pas possible,
conserver les échantillons d’eau à une température comprise entre 2 °C et 8 °C (<7 j) ou inférieure
à −18 °C (pendant deux mois au maximum). Pour des essais multiples, diviser à l’avance les grands
échantillons en prises appropriées car les échantillons décongelés ne peuvent être utilisés que le jour
même. Éviter de décongeler et recongeler les échantillons plus d’une fois avant l’analyse. Décongeler
l’échantillon à l’abri de la lumière à une température maximale de 25 °C (par exemple, au bain-marie) ou
pendant toute une nuit à une température comprise entre 2 °C et 8 °C. Ne pas décongeler les échantillons
au micro-onde.
La conservation de l’échantillon peut avoir un impact sur son activité œstrogénique. Les variations
possibles dépendent de l’échantillon. Spécifier la durée et les conditions de stockage de l’échantillon sur
la base de l’expérience acquise avec le type d’échantillon considéré. Des informations complémentaires
sur les impacts éventuels de la conservation sur des échantillons ayant une activité œstrogénique sont
données dans les Références [22] et[23].
9 Mode opératoire
9.1 Entretien de la culture cellulaire
Toutes les étapes sont réalisées dans des conditions stériles en utilisant une hotte à flux laminaire.
9.1.1 Congélation des cellules
Trypsiner les cellules sub-confluentes comme indiqué en 9.1.3 et les remettre en suspension dans 10 ml
de milieu de culture cellulaire (7.4.1). Avant de procéder à la congélation des cellules, préparer à l’avance
un flacon cryogénique: Étiqueter chaque flacon cryogénique, type de cellule, numéro de lot, nombre
de passages, date de congélation. Suivre le nombre de passages. Transférer les cellules dans un tube
de culture cellulaire de 12 ml. Centrifuger les cellules (250 x g, 5 min), éliminer le milieu surnageant
et remettre en suspension les cellules dans 4 ml de milieu de congélation glacé (7.4.2). Mélanger les
cellules et le milieu de congélation 3 fois au maximum. Transférer 1 ml de cette suspension cellulaire
dans des flacons cryogéniques (6.21) sur de la glace, fermer rapidement les flacons. Placer les flacons
cryogéniques dans une boîte en polystyrène, couvrir les flacons cryogéniques avec un tissu pour
faciliter la congélation progressive des cellules et conserver à –80 °C pendant une nuit. Le jour suivant,
transférer les flacons cryogéniques dans un récipient d’azote liquide pour un stockage à long terme.
9.1.2 Démarrage d’une nouvelle culture cellulaire
Décongeler rapidement à 37 °C les cellules conservées dans l’azote liquide. Transférer la suspension
cellulaire dans un tube de 15 ml et ajouter goutte à goutte 10 ml de milieu de culture cellulaire réfrigéré.
Centrifuger la suspension cellulaire (250 x g, 5 min) et éliminer le surnageant. Remettre en suspension
les cellules dans 10 ml de milieu de culture (température ambiante), transférer dans un nouveau flacon
de culture cellulaire (6.11) et incuber jusqu’à sub-confluence dans un incubateur à CO (5 % de CO ,
2 2
37 °C, 100 % d’humidité).
9.1.3 Culture des cellules
Retirer les cellules d’un flacon de culture cellulaire de l’incubateur. Éliminer le milieu de culture
cellulaire et laver les cellules deux fois avec environ 5 ml de PBS (7.1.10). Ajouter 2 ml de trypsine aux
cellules, remuer et éliminer la trypsine. Laisser les cellules dans l’incubateur pour les trypsiner jusqu’à
ce que les cellules se détachent de la surface (environ 2 min). Remettre en suspension les cellules dans
10 ml de milieu de culture cellulaire, transférer une petite partie dans un nouveau flacon de culture
cellulaire [voir le taux de repiquage défini dans l’Annexe C, compter les cellules si nécessaire à l’aide
d’un compteur de cellules (6.19)]. Ajouter du milieu de culture cellulaire pour atteindre un volume final
de 10 ml et placer le flacon de culture cellulaire dans l’incubateur à CO .
9.2 Mode opératoire d’essai sur cellules humaines avec gène rapporteur
IMPORTANT — Après avoir décongelé les cellules d’une culture mère, les repiquer deux à trois
fois avant d’utiliser les cellules dans l’essai.
Le mode opératoire prend deux jours: ensemencement des cellules le jour 1 et exposition le jour 2.
Après exposition, les cellules sont incubées pendant 24 h. Une plaque peut recevoir 10 dilutions d’un
même échantillon. Une courbe dose-effet du composé de référence est incluse sur chaque plaque. Toutes
les étapes sont réalisées dans des conditions stériles en utilisant une hotte à flux laminaire.
9.2.1 Ensemencement des cellules (jour 1)
Éliminer les cellules sub-confluentes (confluence de 85 % à 95 %) des flacons de culture cellulaire
par digestion enzymatique (trypsine/EDTA) (9.1.3) et remettre en suspension dans un milieu d’essai
concentré 1x (7.4.3). Transférer la
...

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NORME INTERNATIONALE
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Date: 2022-10-01
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ISO/TC 147/SC 5
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Qualité de l’eau l'eau — Détermination du potentiel œstrogéniqueoestrogène de Style Definition: RefNorm
l’eaul'eau et des eaux résiduaires en fonction des agonistes et des antagonistes du Style Definition: Body Text_Center
récepteur des œstrogènes — Partie 3: Essai in vitro sur cellules humaines avec
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gène rapporteur
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Water quality — Determination of the estrogenic potential of water and waste water
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related to agonists and antagonists of the estrogen receptor — Part 3: In vitro human
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cell-based reporter gene assay
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Bold
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Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
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Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
copyright@iso.org
www.iso.org
ii
Sommaire Page
Avant-propos . Error! Bookmark not defined.
1 Domaine d’application . Error! Bookmark not defined.
2 Références normatives . Error! Bookmark not defined.
3 Termes et définitions . Error! Bookmark not defined.
4 Interférences . Error! Bookmark not defined.
5 Principe . Error! Bookmark not defined.
6 Appareillage et matériel. Error! Bookmark not defined.
7 Réactifs, cellules et milieux . Error! Bookmark not defined.
8 Échantillonnage et échantillons . Error! Bookmark not defined.
8.1 Généralités . Error! Bookmark not defined.
8.2 Flacons et matériel d’échantillonnage . Error! Bookmark not defined.
8.3 Nettoyage préalable des flacons et du matériel . Error! Bookmark not defined.
8.4 Mode opératoire d’échantillonnage . Error! Bookmark not defined.
8.5 Transport des échantillons . Error! Bookmark not defined.
8.6 Prétraitement de l’échantillon . Error! Bookmark not defined.
8.7 Conservation des échantillons . Error! Bookmark not defined.
9 Mode opératoire . Error! Bookmark not defined.
9.1 Entretien de la culture cellulaire . Error! Bookmark not defined.
9.1.1 Congélation des cellules . Error! Bookmark not defined.
9.1.2 Démarrage d’une nouvelle culture cellulaire . Error! Bookmark not defined.
9.1.3 Culture des cellules . Error! Bookmark not defined.
9.2 Mode opératoire d’essai sur cellules humaines avec gène rapporteur . Error! Bookmark not
defined.
9.2.1 Ensemencement des cellules (jour 1) . Error! Bookmark not defined.
9.2.2 Préparation de la référence E2 (jour 2) . Error! Bookmark not defined.
9.2.3 Préparation des dilutions d’échantillon (jour 2) . Error! Bookmark not defined.
9.2.4 Blanc de terrain. Error! Bookmark not defined.
9.2.5 Exposition des cellules (jour 2). Error! Bookmark not defined.
9.2.6 Récolte des cellules (jour 3) . Error! Bookmark not defined.
9.2.7 Mesurage de la luminescence (jour 3) . Error! Bookmark not defined.
9.3 Analyse des données . Error! Bookmark not defined.
9.3.1 Calcul de l’induction du gène rapporteur . Error! Bookmark not defined.
9.3.2 Calcul du pourcentage de réponse maximale . Error! Bookmark not defined.
9.3.3 Calcul de la courbe dose-effet . Error! Bookmark not defined.
10 Critères de validité . Error! Bookmark not defined.
10.1 Critères de validité pour l’essai . Error! Bookmark not defined.
10.2 Critères de validité pour les échantillons . Error! Bookmark not defined.
11 Critères d’évaluation . Error! Bookmark not defined.
12 Rapport d’essai . Error! Bookmark not defined.
Annexe A (informative) Réglages du luminomètre . Error! Bookmark not defined.
Annexe B (informative) Préparation de la plaque . Error! Bookmark not defined.
Annexe C (informative) Caractéristiques et détails de l’essai biologique . Error! Bookmark not
defined.
iii
Annexe D (informative) Configuration d’essai pour les produits chimiques et les extraits . Error!
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Annexe E (informative) Préparation d’une gamme de dilution . Error! Bookmark not defined.
Annexe F (informative) Données de performance . Error! Bookmark not defined.
Annexe G (informative) Évaluation statistique . Error! Bookmark not defined.
Annexe H (informative) Calcul des équivalents 17β- œstradiol . Error! Bookmark not defined.
Annexe I (informative) Mesurage de la plus faible dilution sans effet (LID) d’eaux
résiduaires — Évaluation simplifiée pour les essais d’eaux résiduaires . Error! Bookmark
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Bibliographie . Error! Bookmark not defined.
iv
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en
général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit
de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales
et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la
normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/patents).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/iso/foreword.html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 19040 se trouve sur le site web de l’ISO. Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
v
NORME INTERNATIONALE ISO 19040-3:2018(F)

Qualité de l’eau l'eau — Détermination du potentiel
œstrogéniqueoestrogène de l’eaul'eau et des eaux résiduaires
en fonction des agonistes et des antagonistes du récepteur des
œstrogènes — Partie 3: Essai in vitro sur cellules humaines
avec gène rapporteur
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les pratiques
courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les problèmes de sécurité
qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il relève de la responsabilité de l’utilisateur d’établir des
pratiques de santé et de sécurité appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément au présent document
soient effectués par du personnel dûment formé.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode permettant de déterminer le potentiel œstrogénique de l'eau
et des eaux résiduaires au moyen d’un essai avec gène rapporteur utilisant des cellules humaines
transfectées de façon stable. Cet essai avec gène rapporteur se fonde sur l’activation du récepteur des
œstrogènes humains alpha. L’essai détecte la fraction du potentiel œstrogénique ou de l’œstrogénicité
d’un échantillon qui est induite par les molécules interagissant avec le récepteur; il ne répond pas aux
molécules ayant des modes d’action qui ne passent pas directement par le récepteur comme les
modulateurs de la stéroïdogenèse, du transport ou de la clairance des stéroïdes sexuels.
Cette méthode est applicable:
— aux eaux douces;
— aux eaux résiduaires;
— aux extraits aqueux et lixiviats;
— aux éluats de sédiments (eau douce);
— aux eaux interstitielles;
— aux solutions aqueuses contenant des substances uniques ou des mélanges chimiques;
— à l’eau potable;
— la limite de quantification (LDQ) de cette méthode pour l’analyse directe d’échantillons d’eau est
comprise entre 0,3 ng/l et 1 ng/l d’équivalents 17β-œstradiol (EEQ) sur la base des résultats de
l’essai interlaboratoires international (voir l’Annexe F). Le domaine de mesure supérieur a été évalué
[sur la base des résultats de l’essai interlaboratoires international (voir le Tableau F.3)] jusqu’à un
niveau de 75 ng d’EEQ/l. Les échantillons présentant un potentiel œstrogénique supérieur à ce seuil
doivent être dilués pour une quantification valable. L’extraction et la préconcentration des
échantillons d’eau peuvent s’avérer nécessaires, si leur potentiel œstrogénique est inférieur à la LDQ
donnée.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des exigences
du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non
datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
Commented [eXtyles2]: The match came back with a
different title. The original title was: Eau pour laboratoire à
usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— Plateforme de consultation en ligne de l’ISO: disponible à l’adresse https://www.iso.org/obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https://www.electropedia.org/.
3.1
milieu de culture
substances nutritives se présentant sous une forme et une phase (liquide ou solidifiée) favorisant la
croissance cellulaire
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 24, modifiée — «cellulaire» remplace «microbiologique »] Commented [eXtyles3]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced

3.2
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
niveau de dilution
Formatted: Pattern: Clear
D
Formatted: Pattern: Clear
dénominateur du coefficient de dilution (le numérateur étant 1) d’un mélange d’eau ou d’eaux résiduaires
et d’eau de dilution en tant que nombre entier
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Note 1 à l’article: Pour de l’eau ou pour des eaux résiduaires non diluées, ce coefficient est par définition de 1→1. La
valeur D correspondante la plus petite possible est 1. Dans le présent document, la flèche indique la transition entre
le volume total initial et le volume total final.
Commented [eXtyles4]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 28]
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
3.3
Formatted: Pattern: Clear
eau de dilution
Formatted: Pattern: Clear
eau stérile ajoutée à l’échantillon soumis à essai afin de préparer une série définie de dilutions
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7]
Formatted: Pattern: Clear
3.4
Formatted: Pattern: Clear
CE
Formatted: Pattern: Clear
concentration efficace d’un composé produisant 50 % d’un effet
Formatted: Pattern: Clear
Note 1 à l’article: Au sens du présent document, la CE est la concentration efficace d’un composé qui induit 50 %
de l’activité maximale du gène rapporteur qui peut être atteinte par ce composé.
3.5
extrait
échantillon pour essai après extraction et élimination éventuelle du milieu d’extraction
3.6
blanc de terrain
récipient préparé dans le laboratoire, utilisant comme réactif de l’eau ou toute autre matrice de blanc, et
destiné à être emporté par le personnel d’échantillonnage pour être exposé à l’environnement dans
lequel l’échantillonnage est effectué afin de vérifier l’absence de contamination au cours de
l’échantillonnage
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.7
Formatted: Pattern: Clear
taux d’induction
Formatted: Pattern: Clear
rapport de la valeur moyenne de puits ayant une activité accrue du gène rapporteur mesurée sur les
plaques traitées avec une dose de l’échantillon pour essai ou avec un témoin positif, à la valeur moyenne
des puits correspondants traités avec le témoin négatif à l’aide des mêmes cellules, dans des conditions
identiques
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 43, modifiée — «puits ayant une activité accrue du gène rapporteur Formatted: Pattern: Clear
mesurée» remplace «colonies mutantes dénombrées»; «puits correspondants» remplace «plaques
Formatted: Pattern: Clear
correspondantes»; «rapport» remplace «différence»; «cellules» remplace «souche »]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.8
limite de quantification Commented [eXtyles5]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
LDQ
valeur la plus faible d’une caractéristique à déterminer pouvant être mesurée avec un niveau acceptable
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
d’exactitude et de fidélité
[SOURCE: ISO 15839:2003, 3.18] Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.9
Formatted: Pattern: Clear
plus faible dilution sans effet
Formatted: Pattern: Clear
LID
plus faible dilution dans un lot d’essai qui ne présente aucun effet, c’est-à-dire aucune augmentation
statistiquement significative de l’activité du gène rapporteur par rapport au témoin négatif
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 11350:2012, 3.4, modifiée — «augmentation de l’activité du gène rapporteur» remplace
Formatted: Pattern: Clear
«augmentation du nombre de puits de révertants »]
Formatted: Pattern: Clear
3.10
Formatted: Pattern: Clear
témoin négatif
Commented [eXtyles6]: The reference is to a withdrawn
eau de dilution sans l’échantillon pour essai
standard which has been replaced

ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 51]
Formatted: Pattern: Clear
3.11
Formatted: Pattern: Clear
nombre de passages
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
nombre de repiquages de cellules dans un nouveau récipient de culture (flacon de culture cellulaire ou
microplaque)
3.12
composé de référence
composé avec une ou plusieurs valeurs de propriété suffisamment reproductibles et bien établies pour
permettre l’étalonnage de la méthode de mesure
[SOURCE: ISO 7405:2008, 3.6, modifiée —« composé » remplace «produit»; «l’étalonnage de la méthode Formatted: Pattern: Clear
de mesure» remplace «l’utilisation du produit ou de la substance pour l’étalonnage d’un appareil,
Formatted: Pattern: Clear
l’évaluation d’une méthode de mesure, ou pour l’attribution de valeurs à des produits».]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.13
unités de lumière relative Commented [eXtyles7]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
RLU
niveau d’activité du gène rapporteur tel que mesuré par la lumière produite à l’aide d’un luminomètre,
ISO 7405:2018, Médecine bucco-dentaire — Évaluation de
exprimé en unités de lumière relative
la biocompatibilité des dispositifs médicaux utilisés en
médecine bucco-dentaire
3.14
activité du gène rapporteur
activité quantitative d’un gène fixé au promoteur d’un autre gène
3.15
culture mère
culture congelée afin de conserver les caractéristiques de la lignée cellulaire
[SOURCE: ISO 21427-2:2006, 13, modifiée — «de la lignée cellulaire» remplace «des cellules V79 »] Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.16
Formatted: Pattern: Clear
repiquage
Formatted: Pattern: Clear
transfert d’une partie d’une culture cellulaire dans un nouveau récipient de culture cellulaire pendant la
culture cellulaire
3.17
échantillon pour essai
portion non diluée, diluée ou préparée autrement d’un échantillon soumis à l’essai, après exécution de
toutes les étapes de préparation, telles que la centrifugation, la filtration, l’homogénéisation, l’ajustement
du pH et la détermination de la force ionique
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92] Commented [eXtyles8]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced

4 Interférences
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
Formatted: Pattern: Clear
Les effets toxiques présents dans les échantillons pour essai peuvent entraîner une réduction de la
Formatted: Pattern: Clear
viabilité des cellules et donc une réduction de la réponse cellulaire mesurée. En conséquence, les effets
œstrogéniques d’un échantillon peuvent être masqués par des effets toxiques aigus et conduire à des
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résultats d’essai faux négatifs (voir l’Article 9 pour de plus amples informations). Dans ce cas, il convient
Formatted: Pattern: Clear
de diluer l’échantillon jusqu’à ce qu’aucune cytotoxicité ne soit plus observée (consulter le manuel de
Formatted: Pattern: Clear
l’essai de cytotoxicité utilisé).
L’utilisation de dispositifs et/ou flacons d’échantillonnage inappropriés peut avoir une influence sur le
résultat d’essai, car l’adsorption éventuelle de composés actifs sur les surfaces conduit à des résultats
faux négatifs. D’autre part, des composés actifs peuvent être libérés dans l’échantillon par les flacons
d’échantillonnage, en particulier si le matériel utilisé est en plastique, et des résultats faux positifs
peuvent être générés. Voir l’Article 7 pour de plus amples informations. Formatted: Pattern: Clear
Une salinité élevée peut provoquer des effets toxiques dus à la pression osmotique résultante. Les cellules
ER(α) CALUX (Références [10] à [16]) tolèrent une conductivité de l’échantillon pouvant aller jusqu’à Formatted: Pattern: Clear
34,000 µS/cm (salinité de 1,0 % en fraction massique). Les contaminations bactériennes et fongiques
Formatted: Pattern: Clear
peuvent avoir une influence négative sur la réponse des cellules. Par conséquent, des antibiotiques sont
ajoutés au milieu de culture cellulaire. La contamination des cellules est évaluée par un examen visuel
(au microscope) lors des essais de l’échantillon. Voir l’Article 9 pour de plus amples informations.
Formatted: Pattern: Clear
Lorsque des échantillons filtrés sont soumis à essai afin d’éliminer les bactéries de l’échantillon, des
particules solides sont également séparées de l’échantillon. Ainsi, les substances ayant une activité
œstrogénique qui sont adsorbées sur les particules peuvent ne pas être détectées.
Des composés antiœstrogéniques et d’autres composés inhibiteurs non toxiques peuvent masquer les
effets œstrogéniques. La présence de composés interférents peut être évaluée à l’aide d’échantillons
dopés avec une quantité définie d’un composé œstrogénique ayant des propriétés définies (par exemple
17β-œstradiol) provoquant une induction connue du système d’essai.
Les composés ayant des propriétés œstrogéniques peuvent être présents sous forme de conjugués
inactifs. Une déconjugaison chimique peut être nécessaire pour quantifier le potentiel œstrogénique
global d’un échantillon.
5 Principe
La signalisation induite par le récepteur des œstrogènes (ER) est essentielle dans l’action des œstrogènes
et le mécanisme de signalisation du récepteur des œstrogènes est bien établi. La liaison des œstrogènes
à leur récepteur active ce dernier, qui se lie à des séquences de reconnaissance dans les régions
promotrices des gènes cibles, appelées éléments de réponse aux œstrogènes (ERE). Ces ERE ont été liés
à un élément promoteur et à un gène induisant la transcription de la protéine luciférase facilement
mesurable. Dans ces cellules, le récepteur activé par le ligand activera la transcription de la luciférase, et
la protéine luciférase transcrite émettra une lumière lorsqu’un substrat sera ajouté. Le signal augmente
en fonction de la dose du fait des concentrations croissantes de ligand. L’activité de la luciférase dans les
lysats cellulaires est mesurée à l’aide d’un luminomètre permettant d’obtenir des mesures fiables,
sensibles et quantitatives.
6 Appareillage et matériel
Outre le matériel généralement présent dans un laboratoire pour la culture cellulaire, l’appareillage et le
matériel suivants sont nécessaires. Pour des dispositifs d’échantillonnage appropriés, voir l’Article 8.
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6.1 Hotte à flux laminaire, standard: «risque biologique».
6.2 Bain-marie, 37 °C.
6.3 Incubateur à CO , 5 % CO , 37 °C, humidité 100 %.
2 2
6.4 Microscope à contraste de phase inversé.
6.5 Congélateur, au moins ≤ −18 °C et ≤ −70 °C.
6.6 Agitateur pour microplaques.
6.7 Centrifugeuse.
6.8 Balance de laboratoire.
6.9 Pipettes stériles, 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml et 25 ml, en verre ou en plastique.
6.10 Pipeteur.
6.11 Flacons de culture cellulaire, 75 cm avec bouchons filtrants.
6.12 Récipients en plastique stériles, 12 ml et 50 ml avec bouchon stérile.
6.13 Plaques stériles à 12 puits.
6.14 Pipette à canaux multiples à répétition (pipette à répétition), avec embouts de 5 ml et 10 ml.
6.15 Pipettes, 1 μl, 50 μl, 200 μl et 1 000 μl, à embouts stériles.
6.16 Pipettes à canaux multiples, jusqu’à 50 μl et jusqu’à 300 μl.
6.17 Plaques stériles en polystyrène à 96 puits, à fond plat et couvercle transparents, appropriées
pour la culture cellulaire, volume 300 μl par puits.
6.18 Luminomètre pour microplaques avec deux injecteurs, pour l’addition de substrat et de réactif
d’arrêt.
6.19 Compteur de cellules ou hématimètre.
6.20 pH-mètre.
6.21 Flacons cryogéniques, stériles, 2 ml.
6.22 Récipient d’azote liquide pour le stockage à long terme des cellules.
6.23 Filtre, en acétate de cellulose, diamètre des pores 0,45 µm.
7 Réactifs, cellules et milieux
7.1 Réactifs
Dans la mesure du possible, utiliser des produits chimiques de «qualité réactif». Si les (différents)
hydrates utilisés diffèrent des composés spécifiés, s’assurer que la masse appropriée du composé
principal est employée.
7.1.1 Sulfoxyde de diméthyle (DMSO).
7.1.2 Glycérol pour biologie moléculaire, ≥ 99 %, masse moléculaire: 92,09 g/mol, CAS: 56-81-5.
7.1.3 17β-œstradiol, ≥ 98 %, C18H24O2, masse moléculaire: 272,38 g/mol, CAS: 50-28-2.
7.1.4 Sel d’acide éthylène-diamine-tétraacétique (EDTA), CAS: 6381-92-6.
7.1.5 Trypsine, CAS: 9002-07-7.
7.1.6 Sérum fœtal bovin (FCS).
7.1.7 Milieu DMEM/F12 avec rouge de phénol comme indicateur de pH.
7.1.8 Acides aminés non essentiels (100x).
7.1.9 Pénicilline-streptomycine (100x), concentration utilisée 5 000 unités de pénicilline par
ml/5 000 μg de streptomycine par ml.
7.1.10 Tampon phosphate salin pH 7,2 (PBS), sans calcium ni magnésium.
7.1.11 Adénosine-5’-triphosphate (ATP), CAS: 34369-07-8.
7.1.12 Acide trans-1,2-diaminocyclohexane-N,N,N’,N’-tétraacétique monohydraté (CDTA),
CAS: 125572-95-4.
7.1.13 Dithiothréitol (DTT), CAS: 3483-12-3.
7.1.14 2-amino-2-(hydroxyl-méthyl)-1,3-propanediol (TRIS), CAS: 77-86-1.
7.1.15 Dextrane T500.
7.1.16 Charbon actif.
7.1.17 Coenzyme A, qualité acide libre, CAS: 85-61-0.
7.1.18 D-luciférine, sel sodique, CAS: 103404-75-7.
7.1.19 Hydroxycarbonate de magnésium pentahydraté, C H Mg O , CAS: 56378-72-4.
4 2 5 14
7.1.20 Sulfate de magnésium, CAS: 7487-88-9.
7.1.21 Bicarbonate de sodium, CAS: 144-55-8.
7.1.22 Milieu de culture cellulaire en poudre, Sigma, D2902, sans rouge de phénol ni bicarbonate de
sodium.
7.1.23 Tricine, CAS: 5704-04-1.
7.1.24 Acétone, (pureté «pour analyses »), CAS: 67-64-1.
7.1.25 Hydroxyde de sodium, masse moléculaire 40,00 g/mol, CAS: 1310-73-2.
7.1.26 Triton X-100, CAS: 9002-93-1.
7.1.27 Solution d’acide chlorhydrique, 1 M (HCl), masse moléculaire 36,46 g/mol, CAS: 7647-01-0.
7.2 Eau, qualité 3, telle que définie dans l’ISO 3696; une eau dont la conductivité est inférieure ou égale Formatted: Pattern: Clear
à 5 µS/cm est acceptable.
Formatted: Pattern: Clear
Lorsqu’une eau stérile est nécessaire, la stériliser à l’autoclave ou par filtration (acétate de
cellulose, 0,2 µm). L’eau telle que spécifiée ici est également utilisée pour la dilution progressive de
l’échantillon pour essai.
7.3 Lignée cellulaire.
Lignée cellulaire humaine génétiquement modifiée, exprimant le récepteur des œstrogènes humains
(hERα et/ou hERβ) et contenant un plasmide rapporteur pour la luciférase. Des descriptions plus
détaillées des lignées cellulaires individuelles sont données dans l’Annexe C. Formatted: Pattern: Clear
7.4 Milieu.
Utiliser toujours des solutions, une verrerie, etc. stériles. Effectuer tous les modes opératoires dans des Formatted: Not Highlight
conditions d’asepsie et dans l’environnement stérile d’une hotte à flux laminaire (standard pour les
risques biologiques). Si un passage à l’autoclave est nécessaire, toujours effectuer cette opération
pendant 20 min à (121 ± 2) °C. Couvrir légèrement les récipients; ne jamais les fermer hermétiquement.
7.4.1 Milieu de culture cellulaire.
Introduire 5,4 ml d’acides aminés non essentiels (7.1.8), 42 ml de FCS (7.1.6) et 1 ml de Formatted: Pattern: Clear
pénicillinestreptomycine (7.1.9) dans un flacon contenant 500 ml de milieu DMEM/F12 avec du rouge de
Formatted: Pattern: Clear
phénol. Il convient de conserver le milieu de culture cellulaire préparé à 4 °C pendant huit semaines au
Formatted: Pattern: Clear
maximum.
7.4.2 Milieu de congélation.
Ajouter 1 ml d’acides aminés non essentiels, 10 ml de DMSO, 20 ml de FCS et 1 ml de
pénicillinestreptomycine (7.1.9) à 68 ml de milieu DMEM/F12 avec du rouge de phénol. Répartir des lots Formatted: Pattern: Clear
de 20 ml de façon stérile dans des tubes stériles. Il convient de conserver le milieu de congélation préparé
à (−20 ± 1) °C jusqu’à son utilisation et de le conserver sur de la glace lors de l’utilisation.
7.4.3 Milieu d’essai concentré.
7.4.3.1 Milieu d’essai concentré 3x.
Dissoudre le contenu d’un flacon de milieu de culture cellulaire en poudre (7.1.22) dans 250 ml d’eau (à Formatted: Pattern: Clear
température ambiante), puis dissoudre 3,7 g de bicarbonate de sodium (7.1.21) dans la même solution.
Formatted: Pattern: Clear
Ajuster le pH à 7,4 à l’aide d’une solution de HCl 1 mol/l ou de NaOH 1 mol/l. Compléter au volume final
de 300 ml avec de l’eau et stériliser par filtration. Ajouter 12 ml d’acides aminés non essentiels (7.1.8), Formatted: Pattern: Clear
55 ml de sérum appauvri (7.4.8) et 37 ml de pénicilline-streptomycine (7.1.9). Il convient de conserver
Formatted: Pattern: Clear
les milieux préparés à (4 ± 1) °C pendant huit semaines au maximum.
Formatted: Pattern: Clear
7.4.3.2 Milieu d’essai concentré 1x.
Diluer 100 ml du milieu d’essai concentré 3x avec 200 ml d’eau et stériliser par filtration. Il convient de
conserver les milieux préparés à (4 ± 1) °C pendant huit semaines au maximum.
7.4.4 Solution de trypsine.
Ajouter 20 ml de trypsine (7.1.5) à 980 ml de PBS (7.1.10) et ajouter 0,2 g d’EDTA (7.1.4). Stériliser la
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solution de trypsine par filtration et la diviser en aliquotes de 50 ml. La date de péremption est de 3 mois
Formatted: Pattern: Clear
à compter du jour de la préparation. Conserver les tubes de trypsine à −20 °C.
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7.4.5 Réactif d’arrêt.
Dissoudre 8,0 g d’hydroxyde de sodium dans un litre d’eau déminéralisée pour obtenir une concentration
finale de 0,2 M.
7.4.6 Mélange de substrat.
Dissoudre complètement de la tricine (7.1.23) et du sulfate de magnésium (7.1.20) dans 500 ml d’eau Formatted: Pattern: Clear
déminéralisée jusqu’à ce que la solution soit transparente et incolore. Ajouter les autres produits
Formatted: Pattern: Clear
chimiques du Tableau 1 et 400 ml d’eau. Ajuster le pH à 7,8 à l’aide d’une solution 1 mol/l de HCl et/ou
Formatted: Pattern: Clear
de NaOH. Ajuster à un volume final de 1 l. Conserver à (–20 ± 1) °C pendant 3 mois au maximum ou
à (−80 ± 1) °C pendant 12 mois au maximum.
Tableau 1 — Préparation du mélange de substrat (1 000 ml)
Composé Masse Masse moléculaire Molarité
g g/mol Mmol/l
Tricine 3,58 179,2 20
C4H2Mg5O14 0,52 485,69 1,1
MgSO4 0,31 120,37 2,6
EDTA 0,037 372,23 0,10
DTT 5,14 154,2 33,3
Coenzyme A 0,21 767,6 0,27
Luciférine 0,15 320,32 0,47
ATP 0,29 551,1 0,53
7.4.7 Mélange de lyse
Dissoudre complètement les composés indiqués dans le Tableau 2 dans 500 ml d’eau déminéralisée. Formatted: Pattern: Clear
Ajuster le pH à 7,8 à l’aide de solutions de HCl à 1 mol/l et/ou de NaOH à 1 mol/l. Ajuster le volume final
à 1 l et diviser en aliquotes de 40 ml. Conserver à ≤ –18 °C (modifier pour tous les problèmes de T)
pendant 1 an au maximum ou à 4 °C pendant un mois au maximum.
Tableau 2 — Composition du mélange de lyse (1 000 ml)
Composé Masse Volume Masse moléculaire Concentration
g ml
Tris 3,0  121,1 25 mmol/l
DTT 0,31  154,2 2,0 mmol/l
CDTA 0,73  364,35 2,0 mmol/l
Glycérol  100  10 %
Triton X-100  10  1 %
7.4.8 Sérum fœtal bovin appauvri
Dissoudre 0,6 g de Tris (7.1.14) dans 50 ml d’eau déminéralisée dans un bécher en verre de 500 ml et Formatted: Pattern: Clear
ajuster le pH à 8,0. Ajouter 450 ml d’eau déminéralisée, 0,25 g de Dextrane T500 (7.1.15) et 2,5 g de
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charbon actif (7.1.16). Fermer le bécher et agiter le mélange pendant toute une nuit à 4 °C. Décongeler
Formatted: Pattern: Clear
également un flacon de FCS (7.1.6) pendant toute une nuit à 4 °C.
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Le jour suivant, transférer 200 ml de FCS décongelé dans un flacon en verre stérile et chauffer
pendant 30 min à 56 °C au bain-marie. Transférer la suspension de charbon dans 12 tubes de
centrifugation de 50 ml et centrifuger les tubes pendant 20 min à 1 000 g. Décanter le surnageant.
Répartir le FCS dans six tubes avec des culots de charbon et remettre en suspension. Incuber cette
suspension pendant 45 min à 45 °C tout en agitant. Centrifuger les tubes pendant 20 min à 1 000 g et
décanter le sérum dans les 6 autres tubes avec des culots de charbon frais. Incuber cette suspension
pendant encore 45 min à 45 °C tout en agitant. Centrifuger les tubes pendant 20 min à 1 000 g et décanter
le sérum dans les 6 tubes propres. Centrifuger à nouveau pendant 20 min à 1 000 g pour éliminer le
charbon résiduel. Regrouper le sérum, stériliser par filtration et diviser en aliquotes de 55 ml. Conserver
à −20 °C pendant six mois au maximum.
7.4.9 Solution mère de 17β-œstradiol (E2).
Dissoudre 13,6 mg de 17β-œstradiol (E2) (7.1.3) dans 10 ml de DMSO (7.1.1). Diluer la solution mère
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1 000x, par exemple en ajoutant à la pipette 1 ml à 9 ml de DMSO et ensuite 1 ml à 99 ml de DMSO
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(concentration finale de la solution mère: 5,0E-6 M). Conserver des aliquotes de 1 ml à ≤ −18 °C.
8 Échantillonnage et échantillons
8.1 Généralités
Le présent document décrit les exigences spécifiques relatives à l’échantillonnage en vue de la
détermination de l’activité œstrogénique dans des échantillons d’eau. Pour des informations générales
sur l’échantillonnage, se reporter à l’ISO 5667-16. Formatted: Pattern: Clear
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8.2 Flacons et matériel d’échantillonnage
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Utiliser des flacons en verre (verre borosilicaté) propres, de préférence avec des bouchons en
polypropylène ou des bouchons revêtus de polytétrafluoroéthylène (PTFE). Pour éviter la
photodégradation des composés présentant un intérêt, utiliser de préférence des flacons en verre ambré.
Lorsque des flacons en verre transparent sont utilisés, envelopper les flacons d’une feuille d’aluminium
ou les conserver dans un récipient sombre.
En variante, des flacons en aluminium ou en acier inoxydable (tous deux non revêtus) peuvent être
utilisés. S’assurer qu’un matériau autre que le verre borosilicaté n’a pas d’incidence sur les résultats.
8.3 Nettoyage préalable des flacons et du matériel
Après le mode opératoire de nettoyage de routine, effectuer un nettoyage complémentaire des flacons et
des bouchons comme suit: rincer les flacons et bouchons propres trois fois avec une quantité minimale
d’acétone (7.1.24). Laisser l’acétone résiduelle s’évaporer (par exemple dans une étuve). Après le
Formatted: Pattern: Clear
séchage, fermer immédiatement les flacons. Rincer trois fois toute la verrerie, les spatules, etc. entrant en
Formatted: Not Highlight
contact avec l’échantillon avec une quantité minimale d’acétone (7.1.24). Laisser l’acétone résiduelle
Formatted: Pattern: Clear
s’évaporer.
8.4 Mode opératoire d’échantillonnage
Pendant l’échantillonnage, utiliser des gants en nitrile à usage unique. Ne pas appliquer de crème sur les
mains avant l’échantillonnage et éviter tout contact entre la peau et l’échantillon. Utiliser uniquement un
matériel en verre, PTFE, aluminium ou acier inoxydable.
Remplir complètement les flacons. Tenir compte d’une dilatation éventuelle de l’échantillon en cas de
variation de température. Si les échantillons doivent être congelés dans le cadre de leur conservation, les
flacons ne doivent pas être complètement remplis afin d’éviter tout bris pouvant survenir en raison de la
dilatation de la glace durant le processus de congélation et décongélation.
Ne pas utiliser de produits chimiques pour stabiliser les échantillons.
Réfrigérer les échantillons à une température comprise entre 2 °C et 8 °C ou les congeler à une
température ≤ −18 °C.
8.5 Transport des échantillons
Livrer les échantillons au laboratoire dès que possible après l’échantillonnage.
Pendant le transport, conserver le conteneur d’échantillons à l’abri du gel, de la casse, de la lumière, d’une
augmentation de température et d’une contamination externe.
Des méthodes de réfrigération ou de congélation doivent être appliquées aux échantillons si une durée
plus importante est requise pour le transport et la conservation. Il convient de commencer la
réfrigération dès que possible après l’échantillonnage, par exemple dans des glacières contenant de la
glace, des blocs réfrigérants ou des éléments réfrigérants. Un dispositif de réfrigération dans le véhicule
de transport est également approprié. Une température de réfrigération pendant le transport comprise
entre 2 °C et 8 °C s’est avérée appropriée. La température de refroidissement suggérée s’applique à
l’environnement de l’échantillon (par exemple à l’intérieur de la boîte froide), et non à l’échantillon lui-
même.
Si l’échantillon est congelé, éviter sa décongélation (en le transportant par exemple sur de la glace
carbonique). Si de la glace carbonique est choisie pour le transport, il convient d’envelopper les flacons
dans du papier ou un film à bulles d’air pour éviter tout contact direct avec la glace carbonique.
8.6 Prétraitement de l’échantillon
Il est préférable d’analyser les échantillons sous leur forme non filtrée immédiatement après
l’échantillonnage en raison de la perte possible d’activité œstrogénique associée aux particules. La
décision concernant la filtration de l’échantillon (par exemple acétate de cellulose, diamètre des pores
de 0,45 μm) doit être prise par le laboratoire en charge de l’essai en fonction de l’application et de
l’expérience acquise avec le type d’échantillon étudié. Dans tous les cas, indiquer dans le rapport si
l’échantillon soumis à essai a été filtré ou non. Des informations complémentaires sur les impacts
éventuels d’une filtration sur des échantillons ayant une activité œstrogénique sont données dans les
Références [20] et[21]. Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Ajuster le pH de l’échantillon à 7,2 ± 0,2 à l’aide d’une solution de HCl (7.1.27) ou de NaOH (7.1.25).
Formatted: Pattern: Clear
Choisir les concentrations d’acide ou de base de telle sorte que les volumes ajoutés soient aussi faibles
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que possible. Éviter toute surtitration. L’ajustement du pH de l’échantillon peut avoir une incidence sur
l’échantillon. Consigner dans le rapport tous les changements visibles provoqués par l’ajustement du pH
(ISO 5667-16). Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
8.7 Conservation des échantillons
Soumettre à essai les échantillons immédiatement après l’échantillonnage. Si cela n’est pas possible,
conserver les échantillons d’eau à une température comprise entre 2 °C et 8 °C (<7 j) ou inférieure
à −18 °C (pendant deux mois au maximum). Pour des essais multiples, diviser à l’avance les grands
échantillons en prises appropriées car les échantillons décongelés ne peuvent être utilisés que le jour
même. Éviter de décongeler et recongeler les échantillons plus d’une fois avant l’analyse. Décongeler
l’échantillon à l’abri de la lumière à une température maximale de 25 °C (par exemple, au bain-marie) ou
pendant toute une nuit à une température comprise entre 2 °C et 8 °C. Ne pas décongeler les échantillons
au micro-onde.
La conservation de l’échantillon peut avoir un impact sur son activité œstrogénique. Les variations
possibles dépendent de l’échantillon. Spécifier la durée et les conditions de stockage de l’échantillon sur
la base de l’expérience acquise avec le type d’échantillon considéré. Des informations complémentaires
sur les impacts éventuels de la conservation sur des échantillons ayant une activité œstrogénique sont
données dans les Références [22] et[23]. Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
9 Mode opératoire
9.1 Entretien de la culture cellulaire
Toutes les étapes sont réalisées dans des conditions stériles en utilisant une hotte à flux laminaire.
9.1.1 Congélation des cellules
Trypsiner les cellules sub-confluentes comme indiqué en 9.1.3 et les remettre en suspension dans 10 ml Formatted: Pattern: Clear
de milieu de culture cellulaire (7.4.1). Avant de procéder à la congélation des cellules, préparer à l’avance
Formatted: Pattern: Clear
un flacon cryogénique: Étiqueter chaque flacon cryogénique, type de cellule, numéro de lot, nombre de
passages, date de congélation. Suivre le nombre de passages. Transférer les cellules dans un tube de
culture cellulaire de 12 ml. Centrifuger les cellules (250 x g, 5 min), éliminer le milieu surnageant et
remettre en suspension les cellules dans 4 ml de milieu de congélation glacé (7.4.2). Mélanger les cellules
et le milieu de congélation 3 fois au maximum. Transférer 1 ml de cette sus
...