ISO 10253:2024

Norme
internationale
ISO 10253
Quatrième édition
Qualité de l’eau — Essai d’inhibition
2024-07
de la croissance des algues
marines avec Skeletonema sp. et
Phaeodactylum tricornutum
Water quality — Marine algal growth inhibition test with
Skeletonema sp. and Phaeodactylum tricornutum
Numéro de référence
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2024
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant‑propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 2
5 Matériels . 3
5.1 Organismes d’essai.3
5.2 Réactifs .4
5.2.1 Eau . .4
5.2.2 Solution d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium .4
5.2.3 Eau de mer synthétique .4
5.2.4 Solution mère nutritive .5
6 Appareillage . 6
7 Mode opératoire . 6
7.1 Préparation du milieu de croissance .6
7.2 Préparation de la préculture et de l’inoculum .7
7.3 Sélection des concentrations de l’essai .7
7.4 Préparation des solutions mères de substance d’essai .7
7.5 Préparation des lots d’essai et des témoins .7
7.6 Incubation .8
7.7 Mesurages .8
8 Critères de validité . 8
9 Interprétation des données . 9
9.1 Tracé des courbes de croissance . .9
9.2 Calcul du pourcentage d’inhibition .9
9.3 Détermination des valeurs de CE(r) .10
x
10 Expression des résultats . 10
11 Interprétation des résultats . 10
12 Rapport d’essai . 10
Annexe A (informative) Préparation des gammes de dilution des mélanges en eau de mer
(effluents ou élutriats) . .12
Annexe B (informative) Mode opératoire d’essai à partir d’inocula algaux de conservation,
avec mesurage direct de la croissance algale en cuve spectrophotométrique .13
Annexe C (informative) Données de performance .20
Annexe D (informative) Essai d’inhibition de la croissance des algues marines avec
Phaeodactylum tricornutum dans des microplaques 24 puits .21
Bibliographie .30

iii
Avant‑propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de propriété revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n'avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l'adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion de
l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 230, Analyse de l'eau, du Comité
européen de normalisation (CEN) conformément à l'Accord de coopération technique entre l'ISO et le CEN
(Accord de Vienne).
Cette quatrième édition annule et remplace la troisième édition (ISO 10253:2016), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes :
— dans le Tableau 2, K PO a été remplacé par K HPO dans la solution mère 3 ;
3 4 2 4
— l’Annexe D a été ajoutée pour décrire l’essai d’inhibition de la croissance des algues marines avec
Phaeodactylum tricornutum dans des microplaques 24 puits;
— dans le Tableau A.1, l'étape de dilution 5 a été remplacé par étape de dilution 6.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.

iv
Norme internationale ISO 10253:2024(fr)
Qualité de l’eau — Essai d’inhibition de la croissance des
algues marines avec Skeletonema sp. et Phaeodactylum
tricornutum
AVERTISSEMENT — Il convient que les utilisateurs du présent document maîtrisent les pratiques
courantes de laboratoire. Le présent document ne prétend pas couvrir tous les problèmes de sécurité
potentiels associés à son utilisation. Il est de la responsabilité de l’utilisateur de mettre en place des
pratiques d’hygiène et de sécurité adéquates.
IMPORTANT — Il est indispensable que les essais menés conformément au présent document le
soient par du personnel qualifié.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de détermination de l’inhibition de la croissance des algues
marines unicellulaires Skeletonema sp. et Phaeodactylum tricornutum provoquée par des substances
et des mélanges présents dans l’eau de mer ou par des échantillons d’eau environnementale (effluents,
élutriats, etc.).
Cette méthode peut être utilisée pour soumettre à l’essai des substances facilement solubles dans l’eau et qui
ne sont pas sensiblement dégradées ou éliminées d’autre manière du milieu d’essai.
NOTE En appliquant les modifications décrites dans l’ISO 14442 et l’ISO 5667–16, il est possible d’évaluer par cet
essai les effets inhibiteurs des matières organiques et inorganiques peu solubles, des composés volatils, des composés
métalliques, des effluents, des échantillons d’eaux marines et des élutriats de sédiments.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 5667-16, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques des
échantillons
ISO 14442, Qualité de l'eau — Lignes directrices pour essais d'inhibition de la croissance algale avec des matières
peu solubles, des composés volatils, des métaux et des eaux résiduaires
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes :
— ISO Online browsing platform : disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia : disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/

3.1
densité cellulaire
nombre de cellules par unité de volume du milieu
−1
Note 1 à l'article: La densité cellulaire est exprimée en x cellules ml .
3.2
taux de croissance spécifique
µ
taux proportionnel de l’augmentation de la densité cellulaire (3.1) par unité de temps :
1 dx
μ =×
x dt
où
x est la densité cellulaire, exprimée en cellules par millilitre ;
t est le temps, exprimé en jours.
−1
Note 1 à l'article: Le taux de croissance spécifique est exprimé en inverse de jours (j ).
3.3
milieu de croissance
mélange d’eau de mer et de nutriments utilisé pour les précultures et les témoins
3.4
milieu d’essai
mélange d’eau de mer, de nutriments [milieu de croissance (3.3)] et de matériel d’essai dans lequel sont
incubées les cellules algales
3.5
lot d’essai
mélange d’eau de mer, de nutriments et de matériel d’essai [milieu d’essai (3.4)] inoculé avec les algues
3.6
témoin
mélange d’eau de mer et de nutriments [milieu de croissance (3.3)] sans matériel d’essai, inoculé avec les algues
3.7
concentration efficace
CE(r)x
concentration de la substance d’essai qui entraîne une réduction de x % du taux de croissance spécifique (3.2)
par rapport à celui des témoins
Note 1 à l'article: La valeur de CE est déterminée à partir du taux de croissance spécifique (r).
4 Principe
Des souches monospécifiques d’algues sont cultivées pendant plusieurs générations dans un milieu défini
contenant une plage de concentrations de la substance d’essai, préparées en mélangeant des quantités
adéquates de concentré de nutriments, d’eau de mer et de solutions mères de la substance d’essai, et un
inoculum de cellules algales à croissance exponentielle. Les solutions d’essai sont incubées pendant une
période de (72 ± 2) h, pendant laquelle la densité cellulaire est mesurée dans chacune des solutions à
intervalles réguliers au moins toutes les (24 ± 2) h. L’inhibition est mesurée en tant que réduction du taux de
croissance spécifique, par rapport aux cultures témoins cultivées dans des conditions identiques.

5 Matériels
5.1 Organismes d’essai
Utiliser l’une quelconque des algues marines suivantes :
a) Skeletonema sp. (CCAP 1077/1C, NIVA BAC 1) ; ou
b) Phaeodactylum tricornutum Bohlin (CCAP 1052/1A, SAG 1090-1a, NIVA BAC 2).
NOTE 1 Les éditions du présent document antérieures à 2016 conseillaient d’utiliser deux souches de Skeletonema
costatum. Une étude taxonomique du genre Skeletonema indique que plusieurs souches identifiées à l’origine comme
S. costatum peuvent en réalité appartenir à d’autres espèces. À la lumière de cette étude, et dans le but d’assurer
une continuité par rapport aux souches acceptées jusqu’ici, la référence Skeletonema costatum a été remplacée par
Skeletonema sp. depuis l’édition 2016 afin d’éviter la non‑conformité des laboratoires susceptibles d’utiliser des
souches différentes.
Ces algues sont des espèces importantes et largement représentées du phytoplancton (phylum Bacillariophyta)
dans les zones estuariennes et côtières.
Les algues sous la forme de cultures algales monospécifiques, non axéniques sont disponibles auprès des
1)
sources suivantes .
NIVA
Norwegian Institute for Water Research
Gaustadaléen 21
N 0349 Oslo
Norvège
CCAP
Dunstaffnage Marine Laboratory
P O Box 3 Oban
Argyll PA37 1QA
Royaume-Uni
SAG
Experimental Phycology and Culture Collection of Algae at the University of Goettingen (EPSAG)
Nikolausberger Weg 18
37073 Goettingen
Allemagne
1) Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement
que l’ISO approuve ces fournisseurs. Les cultures mères ne sont pas des produits commerciaux, mais elles sont fournies
par les sources indiquées, et elles sont testées et validées pour la méthode décrite. Des produits équivalents peuvent être
utilisés s’il peut être démontré qu’ils permettent d’obtenir les mêmes résultats.

Les cultures mères peuvent être conservées dans le milieu décrit en 7.1. Il est nécessaire de procéder
à des repiquages réguliers. Des intervalles hebdomadaires peuvent se révéler nécessaires dans le cas
de Skeletonema sp., alors que des intervalles de deux ou trois semaines peuvent suffire dans le cas de
Phaeodactylum tricornutum. Les cultures mères peuvent aussi être conservées pendant des périodes plus
longues dans des milieux algaux plus riches tels que ceux recommandés par la collection de souches ou
dans un milieu de croissance concentré (neuf fois) (Annexe D). Il est recommandé de conserver la culture
mère dans le milieu décrit en 7.1 et dans une phase de croissance exponentielle, juste avant de préparer la
préculture pour essai comme décrit en 7.2.
NOTE 2 Il est possible de conserver des cultures concentrées de la diatomée Phaeodactylum tricornutum pendant
plusieurs mois sans qu’elle perde sa viabilité. Les cultures mères pour les essais de toxicité peuvent aisément être
2)
préparées à partir des cultures concentrées ainsi conservées .
5.2 Réactifs
5.2.1 Eau
Toute eau utilisée pour la préparation de l’eau de mer synthétique, du milieu de croissance et des solutions
de substance d’essai doit être déionisée ou d’une pureté équivalente. Veiller tout particulièrement à éviter
la contamination de l’eau par des substances inorganiques ou organiques pendant la préparation et la
conservation. Il ne faut pas utiliser de matériel fabriqué avec du cuivre.
5.2.2 Solution d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium
En cas d’ajustement du pH nécessaire (7.1, 7.4), utiliser une solution d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de
sodium :
— acide chlorhydrique – HCl, par exemple c(HCl) = 1 mol/l ; ou
— hydroxyde de sodium – NaOH, c(NaOH) = 1 mol/l.
5.2.3 Eau de mer synthétique
Pour la culture et l’essai de Phaeodactylum tricornutum, le milieu de croissance (7.1) est obtenu en ajoutant
des nutriments à de l’eau de mer naturelle [salinité = (30 ± 5) g/kg] ou synthétique (salinité approximative =
33 g/kg). Dans le cas de Skeletonema sp., l’utilisation d’eau de mer naturelle peut être nécessaire pour la
perpétuation des souches à long terme et peut aussi se révéler nécessaire pour le milieu d’essai, car un milieu
d’eau de mer synthétique ne permet pas toujours d’assurer la croissance minimale satisfaisant aux critères
de qualité de l’essai. Si de l’eau de mer naturelle est utilisée, il faut veiller à ce qu’elle ne soit pas polluée.
Préparer l’eau de mer synthétique d’après la composition indiquée dans le Tableau 1
(salinité approximative = 33 g/kg). Tous les produits chimiques utilisés doivent être de qualité analytique.
2) Des cultures concentrées de Phaeodactylum tricornutum peuvent être obtenues auprès de MicroBioTests Inc.
Mariakerke-Gent, Belgique. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale
et ne signifie nullement que l’ISO approuve ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il peut être
démontré qu’ils permettent d’obtenir les mêmes résultats.

Tableau 1 — Eau de mer synthétique
Sel Concentration de sel dans l’eau de mer synthétique
g/l
NaCl 22,0
MgCl ⋅6H O 9,7
2 2
Na SO (anhydre) 3,7
2 4
CaCl (anhydre) 1,0
KCl 0,65
NaHCO 0,20
H BO 0,023
3 3
Filtrer l’eau de mer (qu’elle soit synthétique ou naturelle) sur une membrane filtrante de 0,45 μm pour
éliminer les particules et les algues. La salinité de l’eau de mer (synthétique) peut être mesurée à l’aide d’un
réfractomètre, par exemple.
5.2.4 Solution mère nutritive
Préparer trois solutions mères nutritives avec de l’eau, selon les compositions indiquées dans le Tableau 2.
Tableau 2 — Solutions mères nutritives
Nutriment Concentration dans la solution mère Concentration finale dans la
solution d’essai
Solution mère 1
FeCl ⋅6H O 48 mg/l 149 µg/l (Fe)
3 2
MnCl ⋅4H O 144 mg/l 605 µg/l (Mn)
2 2
ZnSO ⋅7H O 45 mg/l 150 µg/l (Zn)
4 2
CuSO ⋅5H O 0,157 mg/l 0,6 µg/l (Cu)
4 2
CoCl ⋅6H O 0 404 mg/l 1,5 µg/l (Co)
2 2
H BO 1 140 mg/l 3,0 mg/l (B)
3 3
Na EDTA 1 000 mg/l 15,0 mg/l
Solution mère 2
Chlorhydrate de thiamine 50 mg/l 25 µg/l
Biotine 0,01 mg/l 0,005 µg/l
Vitamine B (cyanocobalamine) 0,10 mg/l 0,05 µg/l
Solution mère 3
K HPO 2,46 g/l 2,46 mg/l ; 0,438 mg/l P
2 4
NaNO 50,0 g/l 50,0 mg/l ; 8,24 mg/l N
Na SiO ⋅5H O 14,9 g/l 14,9 mg/l ; 1,97 mg/l Si
2 3 2
NOTE Lors de la préparation de la solution mère 3, des difficultés peuvent survenir au moment de la solubilisation des silicates
avec du K HPO . Par conséquent, une solution de 14,9 g/l Na SiO ⋅5H O peut être préparée séparément en tant que « solution
2 4 2 3 2
mère 4 ». Dans ce cas, ajouter 1 ml de cette solution lors de la préparation du milieu de croissance (7.1).
Ces solutions mères doivent être diluées (voir 7.1 et l’Annexe A) afin d’obtenir les concentrations finales des
nutriments dans les solutions d’essai.
Tous les produits chimiques utilisés doivent être des réactifs de qualité reconnue.
Stériliser les solutions mères par filtration sur membrane de 0,2 μm. Il est aussi permis de stériliser les
solutions mères 1 et 3 en autoclave à 120 °C pendant au moins 15 min.
Conserver les solutions mères à l’abri de la lumière à (5 ± 3) °C pendant deux mois au maximum.

6 Appareillage
Tout le matériel entrant en contact avec le milieu d’essai doit être fabriqué en verre ou à partir d’un matériau
chimiquement inerte.
Utiliser le matériel de laboratoire usuel, outre ce qui suit.
6.1 Enceinte ou pièce à température contrôlée, avec un tube fluorescent blanc fournissant un éclairage
uniforme continu, convenant aux exigences de luminosité spécifiées pour l’essai en 7.6.
6.2 Appareillage pour le mesurage de la densité cellulaire des algues, de préférence un compteur de
particules ou un microscope sur cellule de comptage (cellule de numération de Neubauer modifiée).
Sinon, déterminer l’état de la croissance des cultures algales par un mode opératoire indirect, en utilisant par
exemple un fluorimètre (par exemple fluorescence in vitro, voir la Référence [4]), lorsqu’il est suffisamment
sensible et s’il est démontré que sa corrélation avec la densité cellulaire est suffisamment élevée.
L’appareillage utilisé doit être capable de mesurer exactement les densités cellulaires aussi faibles que la
densité cellulaire de l’inoculum et de faire la distinction entre la croissance algale et les effets perturbateurs,
par exemple présence de particules et couleur de l’échantillon.
L’Annexe D décrit un mode opératoire permettant de réaliser l’essai dans des microplaques 24 puits avec
détermination de la fluorescence chlorophyllienne in vivo de la croissance algale de l’espèce Phaeodactylum
tricornutum dans un lecteur de microplaques.
4 −1
Des spectrophotomètres peuvent être suffisamment sensibles pour mesurer 10 cellules algales ml à
condition qu’une longueur de trajet suffisante (jusqu’à 10 cm) puisse être utilisée. Cependant, cette technique
est particulièrement sensible aux interférences des matières en suspension et des substances colorées à de
faibles densités cellulaires.
L’Annexe B décrit un mode opératoire pour le mesurage spectrophotométrique de la densité cellulaire des algues.
6.3 Flacons de culture, par exemple des flacons coniques d’une capacité de 250 ml, avec des bouchons
perméables à l’air.
6.4 Appareillage pour filtration sur membrane, filtres de diamètre moyen de pore de 0,2 µm et 0,45 µm.
6.5 Autoclave.
6.6 pH‑mètre.
6.7 Appareil de mesure de la salinité, par exemple un réfractomètre.
7 Mode opératoire
7.1 Préparation du milieu de croissance
Ajouter 15 ml de solution mère nutritive 1, 0,5 ml de solution mère nutritive 2 et 1 ml de solution mère
nutritive 3 (Tableau 2) à environ 900 ml d’eau de mer naturelle ou synthétique (5.2.3), puis compléter à 1 l
avec la même eau de mer (5.2.3).
Ajuster le pH à 8,0 ± 0,2 en ajoutant une solution diluée d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium
(5.2.2).
NOTE La complexation de métaux lourds par une concentration relativement élevée d’EDTA présente dans le
milieu nutritif peut empêcher l’essai sur les effluents contenant des métaux lourds. Pour obtenir des recommandations,
voir l’ISO 14442.
7.2 Préparation de la préculture et de l’inoculum
Il est nécessaire de démarrer une préculture deux à quatre jours avant le début de l’essai (voir la Note 2
en 5.1).
Ajouter suffisamment de cellules de la culture mère au milieu de croissance (7.1) pour obtenir une densité
3 −1 4 −1
cellulaire suffisamment faible de, par exemple, 2 × 10 cellules algales ml à 10 cellules algales ml
pour trois jours de préculture, afin de conserver la croissance exponentielle jusqu’au début de l’essai.
La préculture doit être incubée dans les mêmes conditions que celles de l’essai. Mesurer la densité cellulaire
de la préculture juste avant l’utilisation, pour calculer le volume adéquat de l’inoculum.
7.3 Sélection des concentrations de l’essai
Il convient d’exposer les algues aux concentrations de la substance d’essai dans une suite géométrique
de raison inférieure ou égale à 3,2 (par exemple raison de 1,8 : 1,0 mg/l, 1,8 mg/l, 3,2 mg/l, 5,8 mg/l et
10,4 mg/l).
Il convient de choisir les concentrations de manière à obtenir au moins une inhibition au-dessous et une
inhibition au-dessus de la valeur prévue pour le paramètre CE(r) . De plus, il convient d’inclure au moins
x
deux niveaux d’inhibition entre 10 % et 90 % pour fournir des données pour l’analyse de régression.
NOTE La meilleure façon de déterminer une plage de concentrations adéquate consiste à effectuer un essai
préliminaire de détection de plage, couvrant plusieurs ordres de grandeur de différence entre les concentrations
d’essai. La répétition des concentrations d’essai n’est pas exigée pour l’essai préliminaire.
7.4 Préparation des solutions mères de substance d’essai
Préparer les solutions mères en dissolvant la substance d’essai dans le milieu de croissance (7.1).
Certaines modifications sont nécessaires lorsque la substance d’essai ne se dissout pas facilement dans le
milieu d’essai, comme décrit dans l’ISO 14442 et l’ISO 5667-16.
Utiliser un milieu de croissance concentré tel que spécifié à l’Annexe A et, si nécessaire, lors des essais sur
des échantillons d’eau (effluents, élutriats, etc.), afin d’éviter toute inhibition de la croissance en raison d’une
salinité trop faible Utiliser des sels d’eau de mer (5.2.3) pour ajuster la salinité de l’échantillon à celle du milieu
de croissance. L’Annexe A fournit un exemple de protocole de dilution pour les échantillons d’eau de mer.
Procéder à l’essai sans ajuster le pH après addition de la substance d’essai. Cependant, certaines substances
peuvent avoir un effet toxique en raison d’une acidité ou d’une basicité extrême. Afin de déterminer la toxicité
d’une substance indépendamment du pH, ajuster le pH de la solution mère (avant la gamme de dilution) à
8,0 ± 0,2, au moyen d’une solution d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium (5.2.2). Il convient que la
concentration en acide ou en base soit telle que le changement de volume soit le plus petit possible.
7.5 Préparation des lots d’essai et des témoins
Préparer les lots d’essai en mélangeant des volumes adéquats de solutions mères de substance d’essai (7.4),
de milieu de croissance (7.1) et d’inoculum (7.2) dans les récipients d’essai. Le volume total, la concentration
en nutriments ajoutés au milieu de croissance et la densité cellulaire doivent être les mêmes dans tous les
lots d’essai.
La densité cellulaire initiale doit être suffisamment faible pour permettre une croissance exponentielle
dans la culture témoin pendant toute la durée de l’essai ou, a minima, pendant le laps de temps requis pour
atteindre une augmentation d’un facteur 16 de la densité cellulaire, sans dérive du pH supérieure à 1,0 unité
de pH (voir l’Article 8). Par conséquent, les densités cellulaires initiales ne doivent pas dépasser 10 cellules
−1
algales ml .
Une plus faible densité cellulaire initiale (de trois à cinq fois inférieure) est recommandée pour
Skeletonema sp. en raison de son volume cellulaire plus important et de son taux de croissance plus élevé.
Prendre en considération la formation de chaînes par Skeletonema sp. lors de la détermination de la densité
cellulaire initiale.
Préparer trois réplicats au moins pour chaque concentration de substance d’essai. Ajouter, à six autres
récipients, uniquement du milieu de croissance et de l’inoculum sans substance d’essai. Ces récipients
servent de témoins.
Le cas échéant (par exemple, échantillons environnementaux, colorés ou turbides), préparer une seule
gamme de concentrations de la substance d’essai, un seul récipient à chaque fois, sans algue pour servir de
fond pour les déterminations de la densité cellulaire.
Le dispositif expérimental peut être modifié, sur la base de considérations statistiques, pour augmenter le
nombre de concentrations et réduire le nombre de réplicats par concentration.
Mesurer le pH des échantillons de chaque concentration de la solution d’essai et des témoins.
7.6 Incubation
Les récipients d’essai doivent être suffisamment recouverts pour éviter toute contamination aérienne et
pour réduire l’évaporation de l’eau ; ils ne doivent cependant pas être étanches, pour permettre le passage du
CO vers l’intérieur des récipients. Incuber les récipients d’essai à une température nominale de 20 °C, sous
une lumière blanche continue. La température ne doit pas varier de plus de 2 °C au cours de l’essai. Le débit
de fluence des photons au niveau moyen des solutions d’essai doit être uniforme et se trouver dans la plage
2 2
de 60 µmol/m s à 120 µmol/m s, lorsqu’il est mesuré dans la gamme des longueurs d’onde efficaces du
point de vue photosynthétique de 400 nm à 700 nm au moyen d’un récepteur approprié.
NOTE 1 Il est important de noter que la méthode de mesurage, en particulier le type de récepteur (détecteur),
influe sur la valeur mesurée. Les récepteurs sphériques (qui réagissent à la lumière directe et réfléchie en provenance
de tous les angles au-dessus et au-dessous du plan de mesurage) et les récepteurs « cosinus » (qui réagissent à la lumière
en provenance de tous les angles au-dessus du plan de mesurage) sont préférés aux récepteurs unidirectionnels et
permettent de meilleures lectures dans le cas d’une source lumineuse multipoints du type décrit dans la Note 2.
NOTE 2 L’intensité lumineuse spécifiée ci‑dessus peut être obtenue en utilisant entre quatre et sept tubes fluorescents
(puissance nominale de 30 W) blanc universel, de type naturel, c’est-à-dire d’un étalon de couleur 2 (d’une température
de couleur de 4 300 K) selon l’IEC 60081 à une distance d’environ 0,35 m du milieu de culture algale.
NOTE 3 En ce qui concerne les instruments de mesurage de la lumière étalonnés en lux, une plage équivalente de
3 000 lx à 6 000 lx est acceptable pour l’essai.
Agiter les cultures doucement et en continu afin de maintenir les cellules en suspension libre et de faciliter le
transfert de matière de CO de l’air vers l’eau, et de ce fait réduire la dérive de pH.
7.7 Mesurages
Mesurer la densité cellulaire dans chaque récipient, y compris les témoins, au moins toutes les (24 ± 2) h.
Ces mesurages sont généralement effectués sur de faibles volumes qui sont extraits de la solution d’essai et
qui n’y sont pas replacés. Il convient de mélanger vigoureusement les lots d’essai avant le mesurage.
L’essai doit avoir une durée de (72 ± 2) h. À la fin de l’essai, mesurer le pH de chaque lot d’essai (7.5) et
des témoins (7.5). Confirmer l’apparition des cellules et l’identité de l’organisme d’essai au moyen d’un
microscope.
8 Critères de validité
L’essai est considéré comme valable si les conditions suivantes sont remplies.
a) La densité cellulaire témoin doit avoir augmenté d’un facteur supérieur à 16 en 72 h. Cette augmentation
−1
correspond à un taux de croissance spécifique (9.2) de 0,9 j .
NOTE Le taux de croissance des algues dans les conditions spécifiées peut varier selon les différentes
souches des espèces. Les résultats des essais de validation interlaboratoires indiquent que des taux de croissance
−1
supérieurs à 1,0 j sont généralement obtenus avec les deux espèces.
b) Il convient que le coefficient de variation des taux de croissance spécifiques témoins ne dépasse pas 7 %.

c) Le pH témoin ne doit pas avoir augmenté de plus de 1,0 au cours de l’essai.
Des variations de pH au cours de l’essai peuvent avoir une influence significative sur les résultats ;
par conséquent, la limite est fixée à ± 1,0 unité. Il convient de toujours maintenir ces variations au niveau le
plus faible possible, par exemple, par agitation continue pendant l’essai.
9 Interprétation des données
9.1 Tracé des courbes de croissance
Mettre en tableau les mesures de la densité cellulaire ou d’autres paramètres corrélés avec la densité
cellulaire dans les milieux d’essai, en fonction de la concentration de l’échantillon soumis à l’essai et de
l’instant de mesurage.
Tracer une courbe de croissance pour chaque concentration d’essai et chaque témoin, sous la forme d’un
graphique du logarithme de la densité cellulaire moyenne en fonction du temps. Une courbe de croissance
linéaire indique une croissance exponentielle alors qu’une stabilisation indique que les cultures sont entrées
dans une phase stationnaire.
Si les cultures témoins présentent un taux de croissance en déclin vers la fin de la période d’exposition,
les cultures inhibées peuvent avoir tendance à rattraper les témoins, indiquant, à tort, un effet diminué
de l’inhibition de la croissance. Dans ce cas, réaliser les calculs du taux de croissance et de l’inhibition de
la croissance sur la base des derniers mesurages compris dans la période de croissance exponentielle des
cultures témoins.
9.2 Calcul du pourcentage d’inhibition
Calculer d’abord le taux de croissance spécifique moyen, μ, pour chaque culture d’essai, à l’aide de la
Formule (1) :
lnNN−ln
L 0
μ = (1)
tt−
L 0
où
t est l’instant du début de l’essai ;
t est l’instant de la fin de l’essai ou l’instant du dernier mesurage compris dans la période de crois-
L
sance exponentielle dans le témoin (9.1) ;
N est la densité cellulaire nominale initiale ;
N est la densité cellulaire mesurée à l’instant t .
L L
Sinon, déterminer le taux de croissance à partir de la pente de la droite de régression sur le tracé du
logarithme de la densité cellulaire moyenne en fonction du temps (9.1).
Calculer les valeurs moyennes de μ pour le témoin. Calculer le pourcentage d’inhibition pour chaque flacon
d’essai individuel à l’aide de la Formule (2) :
μμ−
c i
I = ×100 (2)
μi
μ
c
où
I est le pourcentage d’inhibition (taux de croissance) pour le flacon d’essai i ;
μi
μ est le taux de croissance pour le flacon d’essai i ;
i
est le taux de croissance moyen pour le témoin.
μ
c
9.3 Détermination des valeurs de CE(r)
x
Pour chaque flacon individuel, mettre en tableau et tracer la courbe de la variation du pourcentage
d’inhibition (I ) en fonction de la concentration d’essai suivant une échelle logarithmique. Si la dispersion
μi
des points est grande, reporter les moyennes des réplicats avec les écarts-types correspondants.
Ajuster un modèle non linéaire adapté aux points des données expérimentales par une analyse de régression
(voir les Références [2],[5] et[6]) afin de déterminer les valeurs de CE(r) , de préférence avec leur intervalle
x
de confiance.
Si les données sont trop rares ou trop incertaines pour une analyse de régression ou si les inhibitions semblent
ne pas suivre une relation régulière de réponse à la concentration (effet de stimulation, par exemple), une
méthode graphique peut être appliquée. Dans ce cas, tracer une courbe lissée à main levée pour représenter
la relation de réponse à la concentration et lire les valeurs de CE(r) à partir de ce graphique.
x
10 Expression des résultats
Indiquer les valeurs de CE et de CE basées sur le taux de croissance en tant que CE(r) et CE(r) . De
10 50 10 50
plus, indiquer clairement le laps de temps utilisé pour la détermination, par exemple CE(r) (de 0 h à 72 h).
Exprimer les valeurs de CE(r) et CE(r) , généralement en milligrammes par litre (mg/l), en millilitres par
10 50
litre (ml/l), ou en %.
11 Interprétation des résultats
Les valeurs de CE et de CE sont des données toxicologiques dérivées d’une expérience en laboratoire
10 50
réalisée dans des conditions normalisées définies. Elles fournissent une indication des risques potentiels,
mais ne peuvent être utilisées directement pour prévoir des effets dans le milieu naturel. Lors de
l’interprétation des valeurs de CE et de CE , tenir compte de la forme des courbes de croissance.
10 50
Certains aspects de ces courbes (par exemple, démarrage différé de la croissance, bonne croissance initiale
ne se maintenant pas) peuvent aider à indiquer le mode d’action de la substance toxique concernée.
12 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit au minimum contenir les informations suivantes :
a) la méthode d’essai utilisée, avec une référence au présent document, à savoir l’ISO 10253:2024 ;
b) toutes les données nécessaires à l’identification de l’échantillon soumis à l’essai, par exemple les données
d’identification chimique de la substance d’essai ;
c) l’organisme d’essai : espèce, origine, numéro de la souche, méthode de culture ;
d) les détails de l’essai :
— la date de début et la durée ;
— la méthode de préparation ;
— les concentrations nominales et mesurées soumises à l’essai ;
— la composition du milieu ;
— l’origine de l’eau de mer et sa salinité ;

— l’appareillage pour la culture et le mode opératoire de l’incubation ;
— l’intensité lumineuse et la qualité de la lumière ;
— la température dans une enceinte ou un incubateur à température contrôlée ;
— le pH des solutions d’essai au début et à la fin de l’essai ;
— la méthode de mesurage de la densité cellulaire et, le cas échéant, la méthode pour corriger les
valeurs de fond ;
e) les résultats :
— la densité cellulaire pour chaque récipient d’essai et à chaque point de mesurage ;
— la densité cellulaire moyenne pour chaque concentration d’essai (et témoin) à chaque point de
mesurage ;
— les courbes de croissance (logarithme de la densité cellulaire en fonction du temps) ;
— la relation entre la concentration et l’effet (valeurs du pourcentage d’inhibition en fonction de la
concentration) dans un tableau ou sur un graphique : par exemple, le pourcentage d’inhibition en
ordonnée selon une échelle de probits en fonction de la concentration en abscisse selon une échelle
logarithmique ;
— la valeur de CE(r) et sa méthode de détermination ;
— la valeur de CE(r) et sa méthode de détermination ;
— les autres effets observés ;
— le cas échéant, les résultats des témoins positifs et la carte de contrôle.

Annexe A
(informative)
Préparation des gammes de dilution des mélanges en eau de mer
(effluents ou élutriats)
A.1 Généralités
Lors d’essais sur les mélanges en eau de mer (eaux résiduaires ou élutriats) sous forme d’une gamme de
dilution, il convient d’utiliser de l’eau de mer naturelle ou synthétique (voir 5.2.3) en tant qu’eau de dilution
et que les concentrations de nutriments ajoutés soient les mêmes pour toutes les dilutions et égales à la
concentration d’essai finale indiquée en 5.2.3. Pour cette raison, il est recommandé d’utiliser un milieu de
croissance concentré.
A.2 Préparation du milieu de croissance concentré
Ajouter 135 ml de solution mère 1, 4,5 ml de solution mère 2 et 9 ml de solution mère 3 à environ 700 ml
d’eau de mer naturelle ou synthétique (5.2.3), puis compléter à 1 l avec cette même eau de mer.
Ajuster le pH à 8,0 ± 0,2 en ajoutant une solution diluée d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium
(5.2.2).
A.3 Préparation de la gamme de dilution du milieu d’essai
Préparer la gamme de dilution du milieu d’essai en mélangeant des volumes de milieu de croissance concentré
(A.2), d’inoculum (7.2), d’échantillon (effluent ou élutriats) et de l’eau de dilution (eau de mer naturelle ou
synthétique 5.2.3) dans les récipients d’essai en respectant les indications du Tableau A.1. Il convient que le
volume total soit le même dans tous les récipients.
Pour d’autres instructions relatives à la densité cellulaire initiale et au dispositif expérimental, suivre 7.5.
Tableau A.1 — Préparation des gammes de dilution – Concentration du lot d’essai et témoin
Dilution Étape de dilution Inoculum Échantillon Eau de mer Milieu de croissance Volume
D (7.2) (7.4) (5.2.3) concentré (A.2) final
ml ml ml ml ml
1 pour 1,25 1 10 80 ‒ 10 100
1 pour 2 2 10 50 30 10 100
1 pour 3 3 10 33,33 46,67 10 100
1 pour 4 4 10 25 55 10 100
1 pour 6 6 10 16,67 63,33 10 100
1 pour 8 8 10 12,5 67,5 10 100
1 pour 12 12 10 8,33 71,67 10 100
1 pour 16 16 10 6,25 73,75 10 100
1 pour 24 24 10 4,17 75,83 10 100
1 pour 32 32 10 3,13 76,88 10 100
Lot témoin 10 ‒ 80 10 100
-----------
...