ISO 19040-1:2018

NORME ISO
INTERNATIONALE 19040-1
Première édition
2018-08
Qualité de l'eau — Détermination du
potentiel œstrogénique de l'eau et des
eaux résiduaires —
Partie 1:
Essai d'œstrogénicité sur levures
(Saccharomyces cerevisiae)
Water quality — Determination of the estrogenic potential of water
and waste water —
Part 1: Yeast estrogen screen (Saccharomyces cerevisiae)
Numéro de référence
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Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 4
5 Interférences . 4
6 Appareillage et matériel .5
7 Réactifs, milieux et souche d’essai . 6
8 Échantillonnage et échantillons .10
8.1 Généralités . 10
8.2 Flacons et matériel d’échantillonnage . 10
8.3 Nettoyage préalable des flacons et du matériel . 11
8.4 Mode opératoire d’échantillonnage . 11
8.5 Transport des échantillons . 11
8.6 Prétraitement des échantillons . 11
8.7 Conservation des échantillons .12
9 Mode opératoire .12
9.1 Préparation de cryo-cultures pour une conservation à long terme .12
9.2 Culture d’une nuit . 12
9.3 Configuration d’essai pour des échantillons aqueux . 13
9.3.1 Préparation .13
9.3.2 Préparation de la gamme de dilution de référence .13
9.3.3 Témoin négatif . 14
9.3.4 Réplicat à blanc . 14
9.3.5 Dilution de l’échantillon . 14
9.3.6 Blanc de terrain . 14
9.3.7 Préparation de la plaque . 15
9.3.8 Inoculation de la plaque d’essai. 15
9.4 Mesurage . 16
9.4.1 Mesurage de la densité cellulaire . 16
9.4.2 Mesurage de l’activité du gène rapporteur . 16
9.5 Calcul de l’absorbance corrigée et de l’induction du gène rapporteur. 17
9.6 Calcul de la croissance relative . 18
9.7 Estimation de la EC du composé de référence par interpolation linéaire . 18
10 Critères de validité .18
11 Critères d’évaluation .19
12 Rapport d’essai .19
Annexe A (normative) Sélection de la souche .20
Annexe B (informative) Préparation de la plaque .21
Annexe C (informative) Schéma de principe de l’essai .22
Annexe D (informative) Configuration d’essai pour les produits chimiques et les extraits .23
Annexe E (informative) Préparation d’une gamme de dilution .27
Annexe F (informative) Données de performances .28
Annexe G (informative) Utilisation d’autres souches de levure obtenues à partir de
Saccharomyces cerevisiae . .41
Annexe H (informative) Évaluation statistique . 44
iii
Annexe I (informative) Calcul des équivalents 17β- œstradiol .46
Annexe J (informative) Mesurage de la plus faible dilution sans effet (LID) d’eaux
résiduaires — Évaluation simplifiée pour les essais d’eaux résiduaires .49
Bibliographie .51
iv
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/iso/fr/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité
SC 5, Méthodes biologiques.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 19040 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
v
NORME INTERNATIONALE ISO 19040-1:2018(F)
Qualité de l'eau — Détermination du potentiel
œstrogénique de l'eau et des eaux résiduaires —
Partie 1:
Essai d'œstrogénicité sur levures ( Saccharomyces
cerevisiae)
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les
pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il relève de la responsabilité
de l’utilisateur d’établir des pratiques de santé et de sécurité appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément au présent
document soient effectués par du personnel dûment formé.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode permettant de déterminer le potentiel œstrogénique de
l’eau et des eaux résiduaires au moyen d’un essai avec gène rapporteur à l’aide de souches de levure
génétiquement modifiées Saccharomyces cerevisiae. Cet essai avec gène rapporteur se fonde sur
l’activation du récepteur des œstrogènes humains alpha.
Cette méthode est applicable:
— aux eaux douces;
— aux eaux résiduaires;
— aux extraits aqueux et lixiviats;
— aux éluats de sédiments (eau douce);
— aux eaux interstitielles;
— aux solutions aqueuses contenant des substances uniques ou des mélanges chimiques;
— à l’eau potable.
La limite de quantification (LDQ) de cette méthode pour l’analyse directe d’échantillons d’eau est
comprise entre 8 ng/l et 15 ng/l d’équivalents 17β-œstradiol (EEQ) sur la base des résultats de l’essai
interlaboratoires international (voir l’Annexe F). Le seuil supérieur de la gamme dynamique pour
cet essai est compris entre 120 ng/l et 160 ng/l d’équivalent 17β-œstradiol (EEQ). Les échantillons
présentant un potentiel œstrogénique supérieur à ce seuil doivent être dilués pour une quantification
valable. L’extraction et la préconcentration des échantillons d’eau peuvent s’avérer nécessaires, si leur
potentiel œstrogénique est inférieur à la LDQ donnée.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
ISO 7027, Qualité de l’eau — Détermination de la turbidité
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/ .
3.1
réplicat à blanc
réplicat supplémentaire ne contenant pas d’organisme d’essai mais traité de la même façon que les
autres réplicats d’un échantillon
[SOURCE: ISO 10872:2010, 3.5]
3.2
milieu de culture
substances nutritives se présentant sous une forme et une phase (liquide ou solidifiée) favorisant la
croissance microbiologique
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 24]
3.3
niveau de dilution
D
dénominateur du coefficient de dilution (le numérateur étant 1) d’un mélange d’eau ou d’eaux
résiduaires et d’eau de dilution en tant que nombre entier
Note 1 à l'article: Pour de l’eau ou pour des eaux résiduaires non diluées, ce coefficient est par définition de 1→1.
La valeur D correspondante la plus petite possible est 1. Dans le présent document, la flèche indique la transition
entre le volume total initial et le volume total final.
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 28]
3.4
eau de dilution
eau ajoutée à l’échantillon soumis à essai afin de préparer une série définie de dilutions
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7]
3.5
concentration efficace 50 %
EC
concentration d’un composé produisant 50 % d’un effet
Note 1 à l'article: Au sens du présent document, la EC est la concentration d’un composé qui induit 50 % de
l’activité maximale du gène rapporteur qui peut être atteinte par ce composé.
3.6
blanc de terrain
récipient préparé dans le laboratoire, utilisant comme réactif de l’eau ou toute autre matrice de blanc,
et destiné à être emporté par le personnel d’échantillonnage pour être exposé à l’environnement
dans lequel l’échantillonnage est effectué afin de vérifier l’absence de contamination au cours de
l’échantillonnage
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
3.7
taux d’induction
rapport du signal moyen mesuré après l’exposition à une dose de l’échantillon pour essai ou à un témoin
positif et du signal moyen mesuré pour le témoin négatif dans les mêmes conditions expérimentales
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 43, modifiée — «absorbance corrigée» remplace «colonies mutantes»;
«puits» remplace «plaques correspondantes», «rapport» remplace «différence».]
3.8
inoculum
fraction d’une culture de micro-organismes utilisée pour démarrer une nouvelle culture ou une
préculture à croissance exponentielle dans un nouveau milieu de culture
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 44]
3.9
limite de quantification
LDQ
valeur la plus faible d’une caractéristique à déterminer pouvant être mesurée avec un niveau acceptable
d’exactitude et de fidélité
[SOURCE: ISO 15839:2003, 3.18]
3.10
plus faible dilution sans effet
LID
plus faible dilution dans un lot d’essai qui ne présente aucun effet, c’est-à-dire aucune augmentation
statistiquement significative de l’activité du gène rapporteur par rapport au témoin négatif
[SOURCE: ISO 11350:2012, 3.4, modifiée — «augmentation de l’activité du gène rapporteur» remplace
«augmentation du nombre de puits de révertants».]
3.11
témoin négatif
eau de dilution sans l’échantillon pour essai
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 51]
3.12
culture d’une nuit
culture commencée en fin d’après-midi et dont l’incubation dure toute une nuit, afin qu’elle puisse être
utilisée le matin suivant à des fins, par exemple, d’inoculation d’une préculture
Note 1 à l'article: La procédure de réalisation d’une culture d’une nuit est décrite en 9.2.
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 54, modifiée — suppression de: «généralement environ 16 h».]
3.13
composé de référence
composé avec une ou plusieurs valeurs de propriété suffisamment reproductibles et bien établies pour
permettre l’étalonnage de la méthode de mesure
[SOURCE: ISO 7405:2008, 3.6, modifiée —« composé » remplace «produit»; «l’étalonnage de la méthode
de mesure» remplace «l’utilisation du produit ou de la substance pour l’étalonnage d’un appareil,
l’évaluation d’une méthode de mesure, ou pour l’attribution de valeurs à des produits».]
3.14
activité du gène rapporteur
activité quantitative d’un gène fixé au promoteur d’un autre gène
3.15
culture mère
culture d’une souche d’organismes maintenue dans certaines conditions afin de conserver ses
caractéristiques d’origine, telles que les séquences des nucléotides
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 87]
3.16
échantillon pour essai
portion non diluée, diluée ou préparée autrement d’un échantillon soumis à l’essai, après exécution
de toutes les étapes de préparation, telles que la centrifugation, la filtration, l’homogénéisation,
l’ajustement du pH et la détermination de la force ionique
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92]
4 Principe
L’essai d’œstrogénicité sur levures (YES) est un essai avec gène rapporteur qui peut être utilisé pour
mesurer l’activation du récepteur alpha des œstrogènes humains (hERα) en présence d’un échantillon
contenant des composés qui activent le récepteur des œstrogènes (ER).
Ainsi, le dosage détecte l’activité œstrogénique de l’ensemble de l’échantillon dans son état réel comme
une mesure intégratrice incluant les effets additifs, synergique et antagoniste possibles du mélange sur
l’ensemble du processus d’expression du gène rapporteur.
Le principe fondamental de ces essais est expliqué dans les Références [10] et [11]. Le récepteur hERα
s’exprime de façon hétérologue dans la cellule de levure sous le contrôle d’un promoteur induit par
le cuivre. Le récepteur des œstrogènes appartient à la famille des récepteurs nucléaires d’hormones.
Lorsque des agonistes du récepteur des œstrogènes pénètrent dans la cellule de levure, ils se lient
à la protéine réceptrice des œstrogènes et induisent ainsi son changement conformationnel. En
conséquence, deux protéines réceptrices forment un dimère récepteur qui est transloquée vers le noyau.
Cette activation du récepteur des œstrogènes est mesurée par l’induction du gène rapporteur lacZ qui
code l’enzyme β-galactosidase. Le gène lacZ est fusionné avec un promoteur contenant des éléments
de réponse aux œstrogènes (ERE) et est ainsi contrôlé par l’activité du récepteur d’œstrogènes. L’ER
dimère se lie au promoteur et active ainsi l’expression et la sécrétion de la β-galactosidase. Enfin,
l’activité de la β-galactosidase en tant que mesure du potentiel œstrogénique de l’échantillon est
déterminée en utilisant un substrat approprié dont le clivage génère un produit de réaction coloré. Le
produit de réaction peut être mesuré par photométrie. Voir l’Annexe C pour un schéma du principe de
l’essai.
5 Interférences
Les échantillons colorés ou troubles peuvent interférer avec la détection photométrique de la densité
cellulaire et/ou la détection du produit de réaction de l’enzyme rapportrice β-galactosidase (voir
l’Article 10 pour de plus amples informations).
Les effets toxiques de l’échantillon pour essai peuvent entraîner une réduction des cellules viables et une
réduction du signal mesurable. En conséquence, les effets œstrogéniques d’un échantillon peuvent être
masqués par des effets toxiques aigus et conduire à des résultats d’essai faux négatifs (voir Article 10
pour de plus amples informations).
Une salinité élevée peut provoquer des effets toxiques dus à la pression osmotique résultante. La
conductivité de l’échantillon est une mesure de sa salinité. La souche de levure construite par McDonnell
et al. (Référence [10]) tolère une conductivité de l’échantillon pouvant aller jusqu’à 34 000 µS/cm.
La croissance bactérienne dans les puits d’essai est évaluée par le réplicat à blanc (3.1). Voir l’Article 10
pour de plus amples informations.
Lorsque des échantillons filtrés sont soumis à essai afin d’éliminer les bactéries de l’échantillon, des
particules solides sont également séparées de l’échantillon. Ainsi, les substances ayant une activité
œstrogénique qui sont adsorbées sur les particules peuvent ne pas être détectées.
Cet essai ayant une haute sensibilité, il faut éviter toute contamination du tampon, des milieux et de
l’ensemble des réactifs utilisés par des composés ayant une activité œstrogénique pour éviter d’avoir
des résultats d’essai faux positifs.
6 Appareillage et matériel
Pour des dispositifs d’échantillonnage appropriés, voir l’Article 8. Le matériel et la verrerie de
laboratoire courants sont nécessaires. En particulier, le matériel suivant est nécessaire:
6.1 Incubateur agitateur, avec minuteur et régulation de température, 30 °C ± 1 °C et 37 °C ± 1 °C.
6.2 pH-mètre.
6.3 Stérilisateur à vapeur.
6.4 Stérilisateur à sec.
6.5 Centrifugeuse, avec un rotor pour tubes de 15 ml et 50 ml jusqu’à 2 500 g et un rotor pour
plaques à 96 puits jusqu’à 2 500 g.
6.6 Agitateur vortex.
6.7 Congélateur, au moins ≤ −18 °C et ≤ −70 °C.
6.8 Filtre stérile, en acétate de cellulose, diamètre des pores 0,2 µm.
6.9 Anses d’ensemencement.
6.10 Pipette multicanaux pour usage à répétition (pipette «multistepper »).
6.11 Pipettes multicanaux, pouvant distribuer de 5 µl à 50 µl et de 50 µl à 300 µl.
6.12 Spectrophotomètre.
6.13 Plaques à 96 puits en polystyrène transparent stériles, à fond plat pour culture de
suspensions, et couvercle.
6.14 Photomètre pour microplaques à 96 puits, pour mesurage de l’absorbance à 540 nm ± 20 nm
ou à 580 nm ± 20 nm, et à 600 nm ± 20 nm.
6.15 Paillasse propre.
6.16 Boîtes de Petri, d’environ 94 mm de diamètre et d’environ 16 mm de hauteur.
6.17 Flacons cryogéniques, stériles, 1 ml, 10 ml.
6.18 Gants en nitrile à usage unique.
6.19 Membrane d’étanchéité perméable à l’air pour plaques à 96 puits.
7 Réactifs, milieux et souche d’essai
7.1 Réactifs
Dans la mesure du possible, utiliser des produits chimiques de «qualité réactif».
1)
7.1.1 Base azotée pour levure sans acides aminés .
7.1.2 α-D-Glucose, anhydre, C H O , masse moléculaire 180,15 g/mol, CAS: 50-99-7.
6 12 6
7.1.3 Adénine, C H N , masse moléculaire 135,13 g/mol, CAS: 73-24-5.
5 5 5
7.1.4 L-arginine, C H N O , masse moléculaire 174,20 g/mol, CAS: 74-79-3.
6 14 4 2
7.1.5 Acide L-aspartique, C H NO , masse moléculaire 133,10 g/mol, CAS: 56-84-8.
4 7 4
7.1.6 Sel monosodique d’acide L-glutamique monohydraté, C H NNaO , H O, masse moléculaire
5 8 4 2
(anhydre) 169,11 g/mol, CAS: 142-47-2 (sel anhydre).
7.1.7 L-histidine-HCl, C H N O ·HCl, H O, masse moléculaire 209,6 g/mol, CAS: 5934-29-2.
6 9 3 2 2
7.1.8 L-isoleucine, C H NO , masse moléculaire 131,17 g/mol, CAS: 73-32-5.
6 13 2
7.1.9 L-leucine, C H NO , masse moléculaire 131,17 g/mol, CAS: 61-90-5.
6 13 2
7.1.10 L-lysine-HCl, C H N O ·HCl, masse moléculaire 182,65 g/mol, CAS: 657-27-2.
6 14 2 2
7.1.11 L-méthionine, C H NO S, masse moléculaire 149,21 g/mol, CAS: 63-68-3.
5 11 2
7.1.12 L-phénylalanine, C H NO , masse moléculaire 165,19 g/mol, CAS: 63-91-2.
9 11 2
7.1.13 L-sérine, C H NO , masse moléculaire 105,09 g/mol, CAS: 56-45-1.
3 7 3
7.1.14 L-thréonine, C H NO , masse moléculaire 119,12 g/mol, CAS: 72-19-5.
4 9 3
7.1.15 L-tyrosine, C H NO , masse moléculaire 181,19 g/mol, CAS: 60-18-4.
9 11 3
7.1.16 L-valine, C H NO , masse moléculaire 117,15 g/mol, CAS: 72-18-4.
5 11 2
7.1.17 Sulfate de cuivre(II) pentahydraté, CuSO ·5H O, masse moléculaire 249,69 g/mol, CAS: 7758-
4 2
99-8.
7.1.18 Sel sodique d’ampicilline, C H N NaO S, masse moléculaire 371,39 g/mol, CAS: 69-52-3.
16 18 3 4
1) Une base azotée pour levures sans acides aminés contient une source d’azote telle que le sulfate d’ammonium,
des vitamines et des éléments à l’état de traces qui sont nécessaires pour la croissance des cellules de levure. Une
base azotée pour levures est utilisée afin de sélectionner les souches de levure en fonction des exigences en matière
de sources de carbone et d’acides aminés.
7.1.19 Sel de sulfate de streptomycine, C H N O ·1,5H SO , masse moléculaire 728,69 g/mol,
21 39 7 12 2 4
CAS: 3810-74-0.
7.1.20 Gélose pour microbiologie, (C H O )n, CAS: 9002-18-0.
12 18 9
7.1.21 Solution d’acide chlorhydrique, 1 M (HCl), masse moléculaire 36,46 g/mol, CAS: 7647-01-0.
7.1.22 Hydroxyde de sodium, NaOH, masse moléculaire 40,00 g/mol, CAS: 1310-73-2.
7.1.23 Éthanol, ≥ 99,8 %, CH CH OH, masse moléculaire 46,07 g/mol, CAS: 64-17-5.
3 2
7.1.24 Glycérol pour biologie moléculaire, ≥ 99 %, HOCH CH(OH)CH OH, masse moléculaire
2 2
92,09 g/mol, CAS: 56-81-5.
7.1.25 17β-œstradiol, ≥ 98 %, C H O , masse moléculaire 272,38 g/mol, CAS: 50-28-2.
18 24 2
7.1.26 Hydrogénophosphate disodique dihydraté, Na HPO ·2H O, masse moléculaire 177,99 g/mol,
2 4 2
CAS: 10028-24-7.
7.1.27 Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté, NaH PO ⋅HO, masse moléculaire
2 4 2
137,99 g/mol, CAS: 10049-21-5.
7.1.28 Chlorure de potassium, KCl, masse moléculaire 74,55 g/mol, CAS: 7447-40-7.
7.1.29 Sulfate de magnésium heptahydraté, MgSO ·7H O, masse moléculaire 246,47 g/mol,
4 2
CAS: 10034-99-8.
7.1.30 Rouge de chlorophénol-β-D-galactopyranoside (CPRG), C H Cl O S, masse moléculaire
25 22 2 10
585,41 g/mol, CAS: 99792-79-7.
7.1.31 Lyticase d’Arthrobacter luteus en poudre lyophilisée, ≥ 2 000 unités/mg de protéine,
CAS: 37340-57-1.
7.1.32 DL-dithiothréitol, HSCH CH(OH)CH(OH)CH SH, masse moléculaire 154,25 g/mol, CAS: 3483-
2 2
12-3.
7.1.33 Dodécylsulfate de sodium, CH (CH ) OSO Na, masse moléculaire 288,38 g/mol, CAS: 151-21-
3 2 11 3
3.
7.1.34 Acétone (pureté «pour analyses »), CH COCH , masse moléculaire 58,08 g/mol, CAS: 67-64-1.
3 3
7.2 Eau, qualité 3, telle que définie dans l’ISO 3696; une eau dont la conductivité est inférieure ou
égale à 5 µS/cm est acceptable.
Lorsqu’une eau stérile est nécessaire, la stériliser à l’autoclave ou par filtration (acétate de cellulose,
0,2 µm). L’eau telle que spécifiée ici est également utilisée pour la dilution progressive de l’échantillon
pour essai.
7.3 Souche d’essai.
La production de cette souche d’essai est expliquée dans les Références [10] et [11]. Elle est dérivée de
la souche Saccharomyces cerevisiae BJ3505 (pauvre en protéase, MATα, PEP4::HIS3, prb-1-delta1.6R,-
HIS3-delta200, lys2-801, trp1-delta101, ura3-52gal2can1). Cette souche comporte deux plasmides.
La construction de ces plasmides est décrite dans la Référence [10]. Le plasmide YEPE10 contient
la fusion CUP1::hER qui code le récepteur des œstrogènes humains α-cloné de la lignée cellulaire
humaine MCF-7 sous le contrôle du promoteur de métallothionéine CUP1. Ce plasmide est sélectionné via
l’auxotrophie pour le tryptophane de la souche mère. Le deuxième plasmide est le plasmide rapporteur
YRPEG3 qui contient le gène chimère 2ERE-CyC1::lacZ. Ce gène chimère exprime la β-galactosidase
(codée par lacZ) sous le contrôle du promoteur d’iso1cytochrome c de S. cerevisiae qui fusionne avec
deux copies du gène de vitellogénine A2 de Xenopus laevis. Ce plasmide est sélectionné via l’auxotrophie
pour l’uracile de la souche mère.
7.4 Milieu.
Si nécessaire, passer les milieux à l’autoclave pendant 20 min à 121 °C ± 2 °C. Couvrir légèrement les
récipients (par exemple, avec une feuille d’aluminium). Ne jamais fermer hermétiquement.
7.4.1 milieu SD 10x.
Dissoudre 67,0 g de base azotée pour levures sans acides aminés (7.1.1) et 200 g de glucose (7.1.2) dans
de l’eau (7.2) et compléter à 1 l avec de l’eau (7.2). Stériliser la solution par filtration (acétate de cellulose,
0,2 µm). Ne pas passer la solution à l’autoclave car elle contient des vitamines telles que la biotine.
Conserver la solution, par aliquotes de 50 ml, à l’abri de la lumière à ≤ −18 °C, la durée de conservation
ne devant pas dépasser 12 mois.
7.4.2 Milieu DO-McD (McDonnell) 10x.
Dissoudre
— 175 mg de L-lysine-HCl (7.1.10);
— 120 mg de L-histidine-HCl (7.1.7);
dans de l’eau (7.2) et compléter à 500 ml avec de l’eau (7.2).
Stériliser la solution par filtration (acétate de cellulose, 0,2 µm) et la conserver, par aliquotes de 40 ml, à
l’abri de la lumière à ≤ −18 °C, la durée de conservation ne devant pas dépasser 6 mois.
7.4.3 Solution de glucose.
Dissoudre
— 144 g de α-D-glucose (7.1.2)
dans de l’eau (7.2) et compléter à 500 ml avec de l’eau (7.2).
Stériliser la solution par filtration (acétate de cellulose, 0,2 µm) ou la passer à l’autoclave et la conserver
à l’abri de la lumière à une température comprise entre 2 °C et 8 °C, la durée de conservation ne devant
pas dépasser 12 mois.
7.4.4 Solution de CuSO , 10 mmol/l.
Dissoudre 250 mg de CuSO ·5H O (7.1.17) dans de l’eau (7.2) et compléter à 100 ml avec de l’eau (7.2).
4 2
Passer la solution à l’autoclave. La solution peut être conservée à température ambiante et utilisée dans
les 12 mois suivant sa préparation.
7.4.5 Solution mère d’ampicilline.
Dissoudre 1 g de sel sodique d’ampicilline (7.1.18) dans de l’eau (7.2) et compléter à 10 ml avec de
l’eau (7.2).
Stériliser la solution par filtration (acétate de cellulose, 0,2 µm) et la conserver, par aliquotes de 1 ml, à
l’abri de la lumière à ≤ –18 °C, la durée de conservation ne devant pas dépasser 12 mois.
7.4.6 Solution mère de streptomycine.
Dissoudre 1 g de sel de sulfate de streptomycine (7.1.19) dans de l’eau (7.2) et compléter à 10 ml avec de
l’eau (7.2).
Stériliser la solution par filtration (acétate de cellulose, 0,2 µm) et la conserver, par aliquotes de 1 ml, à
l’abri de la lumière à ≤ –18 °C, la durée de conservation ne devant pas dépasser 12 mois.
7.4.7 Milieu de croissance (McDonnell).
Ajouter
— 10 ml de milieu SD 10x (7.4.1);
— 10 ml de milieu DO-McD 10x (McDonnell, 7.4.2);
dans 80 ml d’eau stérile (7.2) dans des conditions stériles. Diviser le milieu en aliquotes de 20 ml.
Conserver le milieu à l’abri de la lumière soit à une température comprise entre 2 °C et 8 °C, auquel cas
la durée de conservation ne doit pas dépasser 1 semaine, soit à une température ≤ –18 °C, auquel cas la
durée de conservation ne doit pas dépasser 6 mois.
7.4.8 Milieu d’exposition (McDonnell).
Mélanger
— 4,2 ml   milieu SD 10x (7.4.1);
— 4,2 ml   milieu DO-McD (McDonnell) 10x (7.4.2);
— 1,6 ml   solution de glucose (7.4.3);
— 99 µl    solution de CuSO (7.4.4);
— 67 µl    solution mère d’ampicilline (7.4.5);
— 67 µl    solution mère de streptomycine (7.4.6).
Préparer le milieu d’exposition juste avant de l’utiliser. Il faut 5 ml de milieu d’exposition par plaque
de 96 puits.
7.4.9 Solution aqueuse d’éthanol, fraction volumique de 0,3 %.
Ajouter de l’eau (7.2) stérile à 300 µl d’éthanol (7.1.23) de sorte à obtenir un volume final de 100 ml.
7.4.10 Solution aqueuse de glycérol, fraction volumique de 30 %.
Ajouter de l’eau (7.2) à 3 ml de glycérol (7.1.24) de sorte à obtenir un volume final de 10 ml. Stériliser la
solution par filtration (acétate de cellulose, 0,2 µm) ou la passer à l’autoclave.
7.4.11 Solution mère de 17β-œstradiol (E2).
Dissoudre 50 mg de 17β-œstradiol (E2) (7.1.25) dans de l’éthanol (7.1.23) et compléter à 10 ml avec de
l’éthanol (7.1.23). Conserver la solution mère, par aliquotes de 1 ml, à l’abri de la lumière à ≤ −18 °C, la
durée de conservation ne devant pas dépasser 12 mois.
7.4.12 Tampon lacZ.
Dissoudre dans 950 ml d’eau (7.2):
— 10,67 g Na HPO ⋅2H O (7.1.26);
2 4 2
— 0,75 g KCl (7.1.28);
— 0,25 g MgSO ⋅7H O (7.1.29).
4 2
Avant l’ajustement du pH, il se peut que la solution soit trouble. Ajuster le pH à 7,0 ± 0,2 par ajout de
NaH PO ⋅H O (7.1.27) (environ 5,5 g).
2 4 2
Ajouter puis dissoudre
— 1 g de dodécylsulfate de sodium (7.1.33).
Compléter à 1 000 ml avec de l’eau (7.2). Conserver la solution à température ambiante, la durée de
conservation ne devant pas dépasser 6 mois.
7.4.13 Mélange réactionnel lacZ
Ajouter puis dissoudre par ml de tampon lacZ:
— 0,4 mg de rouge de chlorophénol-β-D-galactopyranoside (CPRG) (7.1.30);
— 250 U de lyticase (7.1.31);
— 0,154 mg de DL-dithiothréitol (7.1.32).
Il faut 6 ml de mélange réactionnel lacZ par plaque de 96 puits. Préparer le milieu réactionnel lacZ juste
avant de l’utiliser.
L’activité spécifique de la lyticase peut varier d’un lot de lyticase à l’autre. Calculer la quantité de lyticase
nécessaire pour le mélange réactionnel selon la formule suivante:
250 U
m = (1)
lyticase
A
s
où
m est la masse (mg) de lyticase pour une certaine activité spécifique A , qui est requise pour
lyticase s
1 ml de tampon lacZ;
A est l’activité spécifique de la lyticase en U/mg.
s
8 Échantillonnage et échantillons
8.1 Généralités
Cet article décrit les exigences spécifiques relatives à l’échantillonnage en vue de la détermination
de l’activité œstrogénique dans des échantillons d’eau. Pour des informations générales sur
l’échantillonnage, se reporter à l’ISO 5667-16.
8.2 Flacons et matériel d’échantillonnage
Utiliser des flacons en verre (verre borosilicaté) propres avec des bouchons revêtus de
polytétrafluoroéthylène (PTFE). Pour éviter la photodégradation des composés présentant un intérêt,
utiliser des flacons en verre ambré. Lorsque des flacons en verre transparent sont utilisés, envelopper
les flacons d’une feuille d’aluminium ou les conserver dans un récipient sombre.
En variante, des flacons en aluminium ou en acier inoxydable (tous deux non revêtus) peuvent être
utilisés. S’assurer qu’un matériau autre que le verre borosilicaté n’a pas d’incidence sur les résultats.
8.3 Nettoyage préalable des flacons et du matériel
Après le mode opératoire de nettoyage de routine, effectuer un nettoyage complémentaire des flacons et
des bouchons comme suit: rincer les flacons et bouchons propres trois fois avec une quantité minimale
d’acétone (7.1.34). Laisser l’acétone résiduelle s’évaporer (par exemple dans une étuve). Après le
séchage, fermer immédiatement les flacons. Rincer trois fois toute la verrerie, les spatules, etc. entrant
en contact avec l’échantillon avec une quantité minimale d’acétone (7.1.34). Laisser l’acétone résiduelle
s’évaporer.
8.4 Mode opératoire d’échantillonnage
Pendant l’échantillonnage, utiliser des gants en nitrile à usage unique. Ne pas appliquer de crème sur les
mains avant l’échantillonnage et éviter tout contact entre la peau et l’échantillon. Utiliser uniquement
un matériel en verre, PTFE, aluminium ou acier inoxydable.
Remplir complètement les flacons. Tenir compte d’une dilatation éventuelle de l’échantillon en cas de
variation de température. Si les échantillons doivent être congelés dans le cadre de leur conservation,
les flacons ne doivent pas être complètement remplis afin d’éviter tout bris pouvant survenir en raison
de la dilatation de la glace durant le processus de congélation et décongélation.
Ne pas utiliser de produits chimiques pour stabiliser les échantillons.
Réfrigérer les échantillons à une température comprise entre 2 °C et 8 °C ou les congeler à une
température ≤ –18 °C.
8.5 Transport des échantillons
Livrer les échantillons au laboratoire dès que possible après l’échantillonnage.
Pendant le transport, conserver le conteneur d’échantillons à l’abri du gel, de la casse, de la lumière,
d’une augmentation de température et d’une contamination externe.
Des méthodes de réfrigération ou de congélation doivent être appliquées aux échantillons si une
durée plus importante est requise pour le transport et la conservation. Il convient de commencer la
réfrigération dès que possible après l’échantillonnage, par exemple dans des glacières contenant de la
glace, des blocs réfrigérants ou des éléments réfrigérants. Un dispositif de réfrigération dans le véhicule
de transport est également approprié. Une température de réfrigération pendant le transport comprise
entre 2 °C et 8 °C s’est avérée appropriée. La température de refroidissement suggérée s’applique à
l’environnement de l’échantillon (par exemple à l’intérieur de la boîte froide), et non à l’échantillon lui-
même.
Si l’échantillon est congelé, éviter sa décongélation (en le transportant par exemple sur de la glace
carbonique). Si de la glace carbonique est choisie pour le transport, il convient d’envelopper les flacons
dans du papier ou un film à bulles d’air pour éviter tout contact direct avec la glace carbonique.
8.6 Prétraitement des échantillons
Il est préférable d’analyser les échantillons sous leur forme non filtrée immédiatement après
l’échantillonnage en raison de la perte possible d’activité œstrogénique associée aux particules. La
décision concernant la filtration de l’échantillon (par exemple acétate de cellulose, diamètre des
pores de 0,45 μm) doit être prise par le laboratoire en charge de l’essai en fonction de l’application et
de l’expérience acquise avec le type d’échantillon étudié. Dans tous les cas, indiquer dans le rapport
si l’échantillon soumis à essai a été filtré ou non. Des informations complémentaires sur les impacts
éventuels d’une filtration sur des échantillons ayant une activité œstrogénique sont données dans les
Références [12] et [13].
Ajuster le pH de l’échantillon à 7,2 ± 0,2 à l’aide d’une solution de HCl (7.1.21) ou de NaOH (7.1.22).
Choisir les concentrations d’acide ou de base de telle sorte que les volumes ajoutés soient aussi faibles
que possible. Éviter toute surtitration. L’ajustement du pH de l’échantillon peut avoir une incidence sur
l’échantillon. Consigner dans le rapport tous les changements visibles provoqués par l’ajustement du pH
(ISO 5667-16).
8.7 Conservation des échantillons
Soumettre à essai les échantillons immédiatement après l’échantillonnage. Si cela n’est pas possible,
conserver les échantillons d’eau à une température comprise entre 2 °C et 8 °C (<7 j) ou inférieure à
–18 °C (pendant deux mois au maximum). Pour des essais multiples, diviser à l’avance les grands
échantillons en prises appropriées car les échantillons décongelés ne peuvent être utilisés que le jour
même. Éviter de décongeler et recongeler les échantillons plus d’une fois avant l’analyse. Décongeler
l’échantillon à l’abri de la lumière à une température maximale de 25 °C (par exemple, au bain-marie) ou
pendant toute une nuit à une température comprise entre 2 °C et 8 °C. Ne pas décongeler les échantillons
au micro-onde.
La conservation de l’échantillon peut avoir un impact sur son activité œstrogénique. Les variations
possibles dépendent de l’échantillon. Spécifier la durée et les conditions de stockage de l’échantillon sur
la base de l’expérience acquise avec le type d’échantillon considéré. Des informations complémentaires
sur les impacts éventuels de la conservation sur des échantillons ayant une activité œstrogénique sont
données dans les Références [14] et [15].
9 Mode opératoire
9.1 Préparation de cryo-cultures pour une conservation à long terme
Conserver les aliquotes de la culture à l’abri de la lumière à –75 °C ± 5 °C, la durée de conservation
ne devant pas dépasser 12 mois. Ne pas conserver les cellules dans de l’azote liquide du fait de leur
viabilité limitée dans ce milieu.
Mesurer la densité optique de la culture après une culture d’une nuit (9.2) diluée avec le milieu de
culture (7.4.7) à 1→10 à 600 nm ± 20 nm (DO600) et calculer le nombre d’unités d’atténuation formazine
(FAU) pour la culture non diluée conformément à l’ISO 7027. Utiliser la longueur d’onde de 600 nm pour
l’étalonnage de FAU.
NOTE Un nombre de FAU d’environ 1 200 est une densité cellulaire usuelle pour une culture d’une nuit et
sert de valeur guide pour le laborantin. Si les critères de validité spécifiés à l’Article 10 sont remplis, un nombre
de FAU autre que celui donné à titre de valeur guide est acceptable.
Mélanger 3,5 ml de cette culture avec 3,5 ml d’une solution aqueuse de glycérol (7.4.10) stérile ayant
une fraction volumique de 30 % dans des conditions stériles. Congeler des aliquotes de 350 µl de la
suspension cellulaire dans des flacons cryogéniques à −75 °C ± 5 °C.
Déterminer la EC du composé de référence 17β-oestradiol avec une aliquote congelée de la nouvelle
cyo-culture conformément aux modes opératoires normalisés décrits en 9.3 et 9.4. Si la valeur de EC ,
qui est déterminée avec la nouvelle cryo-culture n’est pas valide au vu
...

ISO/TC 147/SC 5
Date: 2022-10-042018-08
ISO 19040-1:2022(F)
ISO/TC 147/SC 5
Qualité de l’eau l'eau — Détermination du potentiel œstrogéniqueoestrogénique
de l’eaul'eau et des eaux résiduaires en fonction des agonistes et des antagonistes
du récepteur des œstrogènes — Partie 1: Essai d’œstrogénicitéd'oestrogénicité
Formatted: Font: Italic
sur levures (Saccharomyces cerevisiae)
Formatted: English (United States)
Water quality — Determination of the estrogenic potential of water and waste water
Formatted: English (United States)
related to agonists and antagonists of the estrogen receptor — Part 1: Yeast estrogen
screen (Saccharomyces cerevisiae)

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peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique
ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur l’internet ou sur un Intranet, sans
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Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
copyright@iso.org
www.iso.org
ii
Sommaire Page
Avant-propos . Error! Bookmark not defined.
1 Domaine d’application . Error! Bookmark not defined.
2 Références normatives . Error! Bookmark not defined.
3 Termes et définitions . Error! Bookmark not defined.
4 Principe . Error! Bookmark not defined.
5 Interférences . Error! Bookmark not defined.
6 Appareillage et matériel. Error! Bookmark not defined.
7 Réactifs, milieux et souche d’essai . Error! Bookmark not defined.
8 Échantillonnage et échantillons . Error! Bookmark not defined.
8.1 Généralités . Error! Bookmark not defined.
8.2 Flacons et matériel d’échantillonnage . Error! Bookmark not defined.
8.3 Nettoyage préalable des flacons et du matériel . Error! Bookmark not defined.
8.4 Mode opératoire d’échantillonnage . Error! Bookmark not defined.
8.5 Transport des échantillons . Error! Bookmark not defined.
8.6 Prétraitement des échantillons . Error! Bookmark not defined.
8.7 Conservation des échantillons . Error! Bookmark not defined.
9 Mode opératoire . Error! Bookmark not defined.
9.1 Préparation de cryo-cultures pour une conservation à long terme . Error! Bookmark not
defined.
9.2 Culture d’une nuit . Error! Bookmark not defined.
9.3 Configuration d’essai pour des échantillons aqueux . Error! Bookmark not defined.
9.3.1 Préparation . Error! Bookmark not defined.
9.3.2 Préparation de la gamme de dilution de référence . Error! Bookmark not defined.
9.3.3 Témoin négatif . Error! Bookmark not defined.
9.3.4 Réplicat à blanc . Error! Bookmark not defined.
9.3.5 Dilution de l’échantillon . Error! Bookmark not defined.
9.3.6 Blanc de terrain. Error! Bookmark not defined.
9.3.7 Préparation de la plaque . Error! Bookmark not defined.
9.3.8 Inoculation de la plaque d’essai . Error! Bookmark not defined.
9.4 Mesurage . Error! Bookmark not defined.
9.4.1 Mesurage de la densité cellulaire . Error! Bookmark not defined.
9.4.2 Mesurage de l’activité du gène rapporteur . Error! Bookmark not defined.
9.5 Calcul de l’absorbance corrigée et de l’induction du gène rapporteur . Error! Bookmark not
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9.6 Calcul de la croissance relative . Error! Bookmark not defined.
9.7 Estimation de la CE50 du composé de référence par interpolation linéaire . Error! Bookmark
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10 Critères de validité . Error! Bookmark not defined.
11 Critères d’évaluation . Error! Bookmark not defined.
12 Rapport d’essai . Error! Bookmark not defined.
Annexe A (normative) Sélection de la souche . Error! Bookmark not defined.
A.1 Généralités . Error! Bookmark not defined.
iii
A.2 Plaques de gélose destinées à la sélection de la souche . Error! Bookmark not defined.
A.3 Mise en culture de la souche d’essai . Error! Bookmark not defined.
Annexe B (informative) Préparation de la plaque . Error! Bookmark not defined.
Annexe C (informative) Schéma de principe de l’essai . Error! Bookmark not defined.
Annexe D (informative) Configuration d’essai pour les produits chimiques et les extraits . Error!
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D.1 Généralités . Error! Bookmark not defined.
D.2 Extraction d’échantillons d’eau . Error! Bookmark not defined.
D.3 Essai avec des solutions organiques diluées ou des extraits . Error! Bookmark not defined.
D.4 Essai direct avec des solutions organiques ou des extraits . Error! Bookmark not defined.
D.5 Données issues de la littérature . Error! Bookmark not defined.
Annexe E (informative) Préparation d’une gamme de dilution . Error! Bookmark not defined.
Annexe F (informative) Données de performances . Error! Bookmark not defined.
F.1 Conception de l’essai interlaboratoires . Error! Bookmark not defined.
F.1.1 Généralités . Error! Bookmark not defined.
F.1.2 Description des échantillons. Error! Bookmark not defined.
F.1.3 Laboratoires ayant participé à l’essai . Error! Bookmark not defined.
F.2 Résultats de l’essai interlaboratoires . Error! Bookmark not defined.
F.2.1 Généralités . Error! Bookmark not defined.
F.2.2 Récapitulatif des concentrations en équivalents 17β-œstradiol (EEQ) . Error! Bookmark not
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F.2.3 Récapitulatif des plus faibles dilutions sans effet LID . Error! Bookmark not defined.
F.2.4 Justesse des résultats . Error! Bookmark not defined.
Annexe G (informative) Utilisation d’autres souches de levure obtenues à partir de
Saccharomyces cerevisiae . Error! Bookmark not defined.
G.1 Généralités . Error! Bookmark not defined.
G.2 Souche d’essai selon le document de Routledge et Sumpter [Référence(25)] . Error!
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G.2.1 Généralités . Error! Bookmark not defined.
G.2.2 Description de la souche . Error! Bookmark not defined.
G.2.3 Milieux . Error! Bookmark not defined.
G.2.3.1 Milieu DO-Su (Sumpter) 10x. . Error! Bookmark not defined.
G.2.3.2 Milieu de culture Su (Sumpter). . Error! Bookmark not defined.
G.2.3.3 Milieu d’exposition Su (Sumpter). . Error! Bookmark not defined.
G.2.4 Sélection de la souche . Error! Bookmark not defined.
G.2.5 Mode opératoire . Error! Bookmark not defined.
G.2.6 Critères de validité . Error! Bookmark not defined.
iv
Annexe H (informative) Évaluation statistique . Error! Bookmark not defined.
Annexe I (informative) Calcul des équivalents 17β- œstradiol . Error! Bookmark not defined.
I.1 Généralités . Error! Bookmark not defined.
I.2 Modélisation de la relation dose-effet . Error! Bookmark not defined.
I.3 Calcul des équivalents 17β-œstradiol pour les échantillons pour essai . Error! Bookmark not
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I.4 Consignation des équivalents œstradiol pour les échantillons pour essai . Error! Bookmark
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Annexe J (informative) Mesurage de la plus faible dilution sans effet (LID) d’eaux
résiduaires — Évaluation simplifiée pour les essais d’eaux résiduaires . Error! Bookmark
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J.1 Généralités . Error! Bookmark not defined.
J.2 Principe . Error! Bookmark not defined.
J.3 Préparation de dilutions en vue de l’évaluation de la LID . Error! Bookmark not defined.
J.4 Essai relatif à la LID. Error! Bookmark not defined.
J.5 Évaluation des résultats — valeur de LID, effluents . Error! Bookmark not defined.
J.6 Documentation des résultats . Error! Bookmark not defined.
Bibliographie . Error! Bookmark not defined.
v
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en
général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit
de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales
et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la
normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
.
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 19040 se trouve sur le site web de l’ISO. Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
vi
NORME INTERNATIONALE ISO 19040-1:2018(F)

Qualité de l’eau l'eau — Détermination du potentiel
œstrogéniqueoestrogénique de l’eaul'eau et des eaux
résiduaires en fonction des agonistes et des antagonistes du
récepteur des œstrogènes —
Formatted: Font: Bold
— Partie 1:
Formatted: Font: Bold
Essai d’œstrogénicitéd'oestrogénicité sur levures
Formatted: Font: Italic
(Saccharomyces cerevisiae)
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les pratiques
courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les problèmes de sécurité
qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il relève de la responsabilité de l’utilisateur d’établir des
pratiques de santé et de sécurité appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément au présent document
soient effectués par du personnel dûment formé.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode permettant de déterminer le potentiel œstrogénique de l’eau
et des eaux résiduaires au moyen d’un essai avec gène rapporteur à l’aide de souches de levure
génétiquement modifiées Saccharomyces cerevisiae. Cet essai avec gène rapporteur se fonde sur
l’activation du récepteur des œstrogènes humains alpha. L’essai détecte la fraction du potentiel
œstrogénique ou de l’œstrogénicité d’un échantillon qui est induite par les molécules interagissant avec
le récepteur; il ne répond pas aux molécules ayant des modes d’action qui ne passent pas directement par
le récepteur comme les modulateurs de la stéroïdogenèse, du transport ou de la clairance des stéroïdes
sexuels.
Cette méthode est applicable:
— aux eaux douces;
— aux eaux résiduaires;
— aux extraits aqueux et lixiviats;
— aux éluats de sédiments (eau douce);
— aux eaux interstitielles;
— aux solutions aqueuses contenant des substances uniques ou des mélanges chimiques;
— à l’eau potable.
La limite de quantification (LDQ) de cette méthode pour l’analyse directe d’échantillons d’eau est
comprise entre 8 ng/l et 15 ng/l d’équivalents 17β-œstradiol (EEQ) sur la base des résultats de l’essai
interlaboratoires international (voir l’Annexe F). Le seuil supérieur de la gamme dynamique pour cet Formatted: Pattern: Clear
essai est compris entre 120 ng/l et 160 ng/l d’équivalent 17β-œstradiol (EEQ). Les échantillons
présentant un potentiel œstrogénique supérieur à ce seuil doivent être dilués pour une quantification
valable. L’extraction et la préconcentration des échantillons d’eau peuvent s’avérer nécessaires, si leur
potentiel œstrogénique est inférieur à la LDQ donnée.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des exigences
du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non
datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
Commented [eXtyles1]: The match came back with a
different title. The original title was: Eau pour laboratoire à
usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 7027, Qualité de l’eau — Détermination de la turbidité
Commented [eXtyles2]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai

ISO 7027-2, Qualité de l'eau — Détermination de la turbidité
ISO 7027, Qualité de l’eau — Détermination de la turbidité
— Partie 2: Méthodes semi-quantitatives pour l'évaluation
de la transparence des eaux
3 Termes et définitions
ISO 7027-1, Qualité de l'eau — Détermination de la turbidité
— Partie 1: Méthodes quantitatives
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https://www.iso.org/obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https://www.electropedia.org/.
3.1
réplicat à blanc
réplicat supplémentaire ne contenant pas d’organisme d’essai mais traité de la même façon que les autres
réplicats d’un échantillon
Commented [eXtyles3]: The reference is to a withdrawn
[SOURCE: ISO 10872:2010, 3.5] standard which has been replaced

ISO 10872:2020, Qualité de l'eau et du sol — Détermination
3.2
de l'effet toxique d'échantillons de sédiment et de sol sur la
milieu de culture
croissance, la fertilité et la reproduction de Caenorhabditis
substances nutritives se présentant sous une forme et une phase (liquide ou solidifiée) favorisant la
elegans (Nematodes)
croissance microbiologique
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 24]
Formatted: Pattern: Clear
3.3
Formatted: Pattern: Clear
niveau de dilution
Commented [eXtyles4]: The reference is to a withdrawn
D
standard which has been replaced
dénominateur du coefficient de dilution (le numérateur étant 1) d’un mélange d’eau ou d’eaux résiduaires
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
et d’eau de dilution en tant que nombre entier
Formatted: Pattern: Clear
Note 1 à l’article: Pour de l’eau ou pour des eaux résiduaires non diluées, ce coefficient est par définition de 1→1. La
Formatted: Pattern: Clear
valeur D correspondante la plus petite possible est 1. Dans le présent document, la flèche indique la transition entre
Formatted: Pattern: Clear
le volume total initial et le volume total final.
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 28] Commented [eXtyles5]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced

3.4
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
eau de dilution
Formatted: Pattern: Clear
eau ajoutée à l’échantillon soumis à essai afin de préparer une série définie de dilutions
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.7]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.5
concentration efficace 50 %
CE
concentration d’un composé produisant 50 % d’un effet
Note 1 à l’article: Au sens du présent document, la CE50 est la concentration d’un composé qui induit 50 % de
l’activité maximale du gène rapporteur qui peut être atteinte par ce composé.
3.6
blanc de terrain
récipient préparé dans le laboratoire, utilisant comme réactif de l’eau ou toute autre matrice de blanc, et
destiné à être emporté par le personnel d’échantillonnage pour être exposé à l’environnement dans
lequel l’échantillonnage est effectué afin de vérifier l’absence de contamination au cours de
l’échantillonnage Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 11074:2015, 4.5.3]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.7
taux d’induction Formatted: Pattern: Clear
rapport du signal moyen mesuré après l’exposition à une dose de l’échantillon pour essai ou à un témoin
Formatted: Pattern: Clear
positif et du signal moyen mesuré pour le témoin négatif dans les mêmes conditions expérimentales
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 43, modifiée — «absorbance corrigée» remplace «colonies mutantes»;
«puits» remplace «plaques correspondantes», «rapport» remplace «différence».] Commented [eXtyles6]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced

3.8
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
inoculum
Commented [eXtyles7]: The reference is to a withdrawn
fraction d’une culture de micro-organismes utilisée pour démarrer une nouvelle culture ou une
standard which has been replaced
préculture à croissance exponentielle dans un nouveau milieu de culture

ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 44]
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.9
limite de quantification Formatted: Pattern: Clear
LDQ
Formatted: Pattern: Clear
valeur la plus faible d’une caractéristique à déterminer pouvant être mesurée avec un niveau acceptable
Formatted: Pattern: Clear
d’exactitude et de fidélité
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 15839:2003, 3.18] Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
3.10
Formatted: Pattern: Clear
plus faible dilution sans effet
Formatted: Pattern: Clear
LID
plus faible dilution dans un lot d’essai qui ne présente aucun effet, c’est-à-dire aucune augmentation
Formatted: Pattern: Clear
statistiquement significative de l’activité du gène rapporteur par rapport au témoin négatif
Formatted: Pattern: Clear
Commented [eXtyles8]: The reference is to a withdrawn
[SOURCE: ISO 11350:2012, 3.4, modifiée — «augmentation de l’activité du gène rapporteur» remplace
standard which has been replaced
«augmentation du nombre de puits de révertants».]

ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
3.11
Formatted: Pattern: Clear
témoin négatif
Formatted: Pattern: Clear
eau de dilution sans l’échantillon pour essai
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 51]
Formatted: Pattern: Clear
3.12
culture d’une nuit
culture commencée en fin d’après-midi et dont l’incubation dure toute une nuit, afin qu’elle puisse être
utilisée le matin suivant à des fins, par exemple, d’inoculation d’une préculture
Note 1 à l’article: La procédure de réalisation d’une culture d’une nuit est décrite en 9.2.
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 54, modifiée — suppression de: «généralement environ 16 h».] Commented [eXtyles9]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced

3.13
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
composé de référence
Formatted: Pattern: Clear
composé avec une ou plusieurs valeurs de propriété suffisamment reproductibles et bien établies pour
Formatted: Pattern: Clear
permettre l’étalonnage de la méthode de mesure
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 7405:2008, 3.6, modifiée —« composé » remplace «produit»; «l’étalonnage de la méthode
Formatted: Pattern: Clear
de mesure» remplace «l’utilisation du produit ou de la substance pour l’étalonnage d’un appareil,
Formatted: Pattern: Clear
l’évaluation d’une méthode de mesure, ou pour l’attribution de valeurs à des produits».]
Formatted: Pattern: Clear
3.14
Formatted: Pattern: Clear
activité du gène rapporteur
Formatted: Pattern: Clear
activité quantitative d’un gène fixé au promoteur d’un autre gène
Commented [eXtyles10]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
3.15
culture mère
ISO 7405:2018, Médecine bucco-dentaire — Évaluation de
culture d’une souche d’organismes maintenue dans certaines conditions afin de conserver ses
la biocompatibilité des dispositifs médicaux utilisés en
médecine bucco-dentaire
caractéristiques d’origine, telles que les séquences des nucléotides
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 87] Commented [eXtyles11]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced

3.16
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
échantillon pour essai
Formatted: Pattern: Clear
portion non diluée, diluée ou préparée autrement d’un échantillon soumis à l’essai, après exécution de
toutes les étapes de préparation, telles que la centrifugation, la filtration, l’homogénéisation, l’ajustement Formatted: Pattern: Clear
du pH et la détermination de la force ionique
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
[SOURCE: ISO 6107-6:2004, 92]
Commented [eXtyles12]: The reference is to a withdrawn
standard which has been replaced
4 Principe
ISO 6107:2021, Qualité de l'eau — Vocabulaire
L’essai d’œstrogénicité sur levures (YES) est un essai avec gène rapporteur qui peut être utilisé pour
Formatted: Pattern: Clear
mesurer l’activation du récepteur alpha des œstrogènes humains (hERα) en présence d’un échantillon
Formatted: Pattern: Clear
contenant des composés qui activent le récepteur des œstrogènes (ER).
Formatted: Pattern: Clear
Ainsi, le dosage détecte l’activité œstrogénique de l’ensemble de l’échantillon dans son état réel comme
Formatted: Pattern: Clear
une mesure intégratrice incluant les effets additifs, synergique et antagoniste possibles du mélange sur
l’ensemble du processus d’expression du gène rapporteur.
Le principe fondamental de ces essais est expliqué dans les Références [10] et [11]. Le récepteur hERα
Formatted: Pattern: Clear
s’exprime de façon hétérologue dans la cellule de levure sous le contrôle d’un promoteur induit par le
Formatted: Pattern: Clear
cuivre. Le récepteur des œstrogènes appartient à la famille des récepteurs nucléaires d’hormones.
Lorsque des agonistes du récepteur des œstrogènes pénètrent dans la cellule de levure, ils se lient à la
protéine réceptrice des œstrogènes et induisent ainsi son changement conformationnel. En conséquence,
deux protéines réceptrices forment un dimère récepteur qui est transloquée vers le noyau. Cette
activation du récepteur des œstrogènes est mesurée par l’induction du gène rapporteur lacZ qui code
l’enzyme β-galactosidase. Le gène lacZ est fusionné avec un promoteur contenant des éléments de
réponse aux œstrogènes (ERE) et est ainsi contrôlé par l’activité du récepteur d’œstrogènes. L’ER dimère
se lie au promoteur et active ainsi l’expression et la sécrétion de la β-galactosidase. Enfin, l’activité de la
β-galactosidase en tant que mesure du potentiel œstrogénique de l’échantillon est déterminée en utilisant
un substrat approprié dont le clivage génère un produit de réaction coloré. Le produit de réaction peut
être mesuré par photométrie. Voir l’Annexe C pour un schéma du principe de l’essai.
Formatted: Pattern: Clear
5 Interférences
Les échantillons colorés ou troubles peuvent interférer avec la détection photométrique de la densité
cellulaire et/ou la détection du produit de réaction de l’enzyme rapportrice β-galactosidase (voir
l’Article 10 pour de plus amples informations).
Formatted: Pattern: Clear
Les effets toxiques de l’échantillon pour essai peuvent entraîner une réduction des cellules viables et une
réduction du signal mesurable. En conséquence, les effets œstrogéniques d’un échantillon peuvent être
masqués par des effets toxiques aigus et conduire à des résultats d’essai faux négatifs (voir Article 10 Formatted: Pattern: Clear
pour de plus amples informations).
Une salinité élevée peut provoquer des effets toxiques dus à la pression osmotique résultante. La
conductivité de l’échantillon est une mesure de sa salinité. La souche de levure construite par McDonnell
et al. (Référence [10]) tolère une conductivité de l’échantillon pouvant aller jusqu’à 34 000 µS/cm. Formatted: Pattern: Clear
La croissance bactérienne dans les puits d’essai est évaluée par le réplicat à blanc (3.1). Voir l’Article 10 Formatted: Pattern: Clear
pour de plus amples informations.
Formatted: Pattern: Clear
Lorsque des échantillons filtrés sont soumis à essai afin d’éliminer les bactéries de l’échantillon, des
particules solides sont également séparées de l’échantillon. Ainsi, les substances ayant une activité
œstrogénique qui sont adsorbées sur les particules peuvent ne pas être détectées.
Cet essai ayant une haute sensibilité, il faut éviter toute contamination du tampon, des milieux et de
l’ensemble des réactifs utilisés par des composés ayant une activité œstrogénique pour éviter d’avoir des
résultats d’essai faux positifs.
6 Appareillage et matériel
Pour des dispositifs d’échantillonnage appropriés, voir l’Article 8. Le matériel et la verrerie de laboratoire Formatted: Pattern: Clear
courants sont nécessaires. En particulier, le matériel suivant est nécessaire:
6.1 Incubateur agitateur, avec minuteur et régulation de température, 30 °C ± 1 °C et 37 °C ± 1 °C.
6.2 pH-mètre.
6.3 Stérilisateur à vapeur.
6.4 Stérilisateur à sec.
6.5 Centrifugeuse, avec un rotor pour tubes de 15 ml et 50 ml jusqu’à 2 500 g et un rotor pour plaques
à 96 puits jusqu’à 2 500 g.
6.6 Agitateur vortex.
6.7 Congélateur, au moins ≤ −18 °C et ≤ −70 °C.
6.8 Filtre stérile, en acétate de cellulose, diamètre des pores 0,2 µm.
6.9 Anses d’ensemencement.
6.10 Pipette multicanaux pour usage à répétition (pipette «multistepper »).
6.11 Pipettes multicanaux, pouvant distribuer de 5 µl à 50 µl et de 50 µl à 300 µl.
6.12 Spectrophotomètre.
6.13 Plaques à 96 puits en polystyrène transparent stériles, à fond plat pour culture de suspensions,
et couvercle.
6.14 Photomètre pour microplaques à 96 puits, pour mesurage de l’absorbance à 540 nm ± 20 nm ou
à 580 nm ± 20 nm, et à 600 nm ± 20 nm.
6.15 Paillasse propre.
6.16 Boîtes de Petri, d’environ 94 mm de diamètre et d’environ 16 mm de hauteur.
6.17 Flacons cryogéniques, stériles, 1 ml, 10 ml.
6.18 Gants en nitrile à usage unique.
6.19 Membrane d’étanchéité perméable à l’air pour plaques à 96 puits.
7 Réactifs, milieux et souche d’essai
7.1 Réactifs
Dans la mesure du possible, utiliser des produits chimiques de «qualité réactif».
7.1.1 Base azotée pour levure sans acides aminés .
7.1.2 α-D-Glucose, anhydre, C H O , masse moléculaire 180,15 g/mol, CAS: 50-99-7.
6 12 6
7.1.3 Adénine, C H N , masse moléculaire 135,13 g/mol, CAS: 73-24-5.
5 5 5
7.1.4 L-arginine, C H N O , masse moléculaire 174,20 g/mol, CAS: 74-79-3.
6 14 4 2
7.1.5 ACIDE L-aspartique, C H NO , masse moléculaire 133,10 g/mol, CAS: 56-84-8.
4 7 4
7.1.6 SEL MONOSODIQUE D’ACIDE L-glutamique monohydraté, C H NNaO , H O, masse moléculaire
5 8 4 2
(anhydre) 169,11 g/mol, CAS: 142-47-2 (sel anhydre).
7.1.7 L-histidine-HCl, C H N O ·HCl, H O, masse moléculaire 209,6 g/mol, CAS: 5934-29-2.
6 9 3 2 2
Une base azotée pour levures sans acides aminés contient une source d’azote telle que le sulfate d’ammonium, des
vitamines et des éléments à l’état de traces qui sont nécessaires pour la croissance des cellules de levure. Une base
azotée pour levures est utilisée afin de sélectionner les souches de levure en fonction des exigences en matière de
sources de carbone et d’acides aminés.
7.1.8 L-isoleucine, C H NO , masse moléculaire 131,17 g/mol, CAS: 73-32-5.
6 13 2
7.1.9 L-leucine, C H NO , masse moléculaire 131,17 g/mol, CAS: 61-90-5.
6 13 2
7.1.10 L-lysine-HCl, C H N O ·HCl, masse moléculaire 182,65 g/mol, CAS: 657-27-2.
6 14 2 2
7.1.11 L-méthionine, C H NO S, masse moléculaire 149,21 g/mol, CAS: 63-68-3.
5 11 2
7.1.12 L-phénylalanine, C H NO , masse moléculaire 165,19 g/mol, CAS: 63-91-2.
9 11 2
7.1.13 L-sérine, C H NO , masse moléculaire 105,09 g/mol, CAS: 56-45-1.
3 7 3
7.1.14 L-thréonine, C H NO , masse moléculaire 119,12 g/mol, CAS: 72-19-5.
4 9 3
7.1.15 L-tyrosine, C H NO , masse moléculaire 181,19 g/mol, CAS: 60-18-4.
9 11 3
7.1.16 L-valine, C H NO , masse moléculaire 117,15 g/mol, CAS: 72-18-4.
5 11 2
7.1.17 Sulfate de cuivre(II) pentahydraté, CuSO ·5H O, masse moléculaire 249,69 g/mol, CAS: 7758-
4 2
99-8.
7.1.18 Sel sodique d’ampicilline, C H N NaO S, masse moléculaire 371,39 g/mol, CAS: 69-52-3.
16 18 3 4
7.1.19 Sel de sulfate de streptomycine, C H N O ·1,5H SO , masse moléculaire 728,69 g/mol,
21 39 7 12 2 4
CAS: 3810-74-0.
7.1.20 Gélose pour microbiologie, (C12H18O9)n, CAS: 9002-18-0.
7.1.21 Solution d’acide chlorhydrique, 1 M (HCl), masse moléculaire 36,46 g/mol, CAS: 7647-01-0.
7.1.22 Hydroxyde de sodium, NaOH, masse moléculaire 40,00 g/mol, CAS: 1310-73-2.
7.1.23 Éthanol, ≥ 99,8 %, CH3CH2OH, masse moléculaire 46,07 g/mol, CAS: 64-17-5.
7.1.24 Glycérol pour biologie moléculaire, ≥ 99 %, HOCH2CH(OH)CH2OH, masse moléculaire
92,09 g/mol, CAS: 56-81-5.
7.1.25 17β-œstradiol, ≥ 98 %, C H O , masse moléculaire 272,38 g/mol, CAS: 50-28-2.
18 24 2
7.1.26 Hydrogénophosphate disodique dihydraté, Na HPO ·2H O, masse moléculaire 177,99 g/mol,
2 4 2
CAS: 10028-24-7.
7.1.27 Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté, NaH PO⋅H O, masse moléculaire
2 4 2
137,99 g/mol, CAS: 10049-21-5.
7.1.28 Chlorure de potassium, KCl, masse moléculaire 74,55 g/mol, CAS: 7447-40-7.
7.1.29 Sulfate de magnésium heptahydraté, MgSO ·7H O, masse moléculaire 246,47 g/mol,
4 2
CAS: 10034-99-8.
7.1.30 Rouge de chlorophénol-β-D-galactopyranoside (CPRG), C25H22Cl2O10S, masse moléculaire
585,41 g/mol, CAS: 99792-79-7.
7.1.31 Lyticase d’Arthrobacter luteus en poudre lyophilisée, ≥ 2 000 unités/mg de protéine,
CAS: 37340-57-1.
7.1.32 DL-dithiothréitol, HSCH CH(OH)CH(OH)CH SH, masse moléculaire 154,25 g/mol, CAS: 3483-
2 2
12-3.
7.1.33 Dodécylsulfate de sodium, CH (CH ) OSO Na, masse moléculaire 288,38 g/mol, CAS: 151-21-
3 2 11 3
3.
7.1.34 Acétone (pureté «pour analyses »), CH COCH , masse moléculaire 58,08 g/mol, CAS: 67-64-1.
3 3
7.2 Eau, qualité 3, telle que définie dans l’ISO 3696; une eau dont la conductivité est inférieure ou égale
Formatted: Pattern: Clear
à 5 µS/cm est acceptable.
Formatted: Pattern: Clear
Lorsqu’une eau stérile est nécessaire, la stériliser à l’autoclave ou par filtration (acétate de cellulose,
0,2 µm). L’eau telle que spécifiée ici est également utilisée pour la dilution progressive de l’échantillon
pour essai.
7.3 Souche d’essai.
La production de cette souche d’essai est expliquée dans les Références [10] et [11]. Elle est dérivée de la
Formatted: Pattern: Clear
souche Saccharomyces cerevisiae BJ3505 (pauvre en protéase, MATα, PEP4::HIS3, prb-1-delta1.6R,- HIS3-
Formatted: Pattern: Clear
delta200, lys2-801, trp1-delta101, ura3-52gal2can1). Cette souche comporte deux plasmides. La
construction de ces plasmides est décrite dans la Référence [10]. Le plasmide YEPE10 contient la Formatted: Pattern: Clear
fusion CUP1::hER qui code le récepteur des œstrogènes humains α-cloné de la lignée cellulaire
humaine MCF-7 sous le contrôle du promoteur de métallothionéine CUP1. Ce plasmide est sélectionné via
l’auxotrophie pour le tryptophane de la souche mère. Le deuxième plasmide est le plasmide rapporteur
YRPEG3 qui contient le gène chimère 2ERE-CyC1::lacZ. Ce gène chimère exprime la β-galactosidase (codée
par lacZ) sous le contrôle du promoteur d’iso1cytochrome c de S. cerevisiae qui fusionne avec deux copies
du gène de vitellogénine A2 de Xenopus laevis. Ce plasmide est sélectionné via l’auxotrophie pour l’uracile
de la souche mère.
7.4 Milieu.
Si nécessaire, passer les milieux à l’autoclave pendant 20 min à 121 °C ± 2 °C. Couvrir légèrement les
récipients (par exemple, avec une feuille d’aluminium). Ne jamais fermer hermétiquement.
7.4.1 milieu SD 10x. Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Dissoudre 67,0 g de base azotée pour levures sans acides aminés (7.1.1) et 200 g de glucose (7.1.2) dans
Formatted: Pattern: Clear
de l’eau (7.2) et compléter à 1 l avec de l’eau (7.2). Stériliser la solution par filtration (acétate de cellulose,
Formatted: Pattern: Clear
0,2 µm). Ne pas passer la solution à l’autoclave car elle contient des vitamines telles que la biotine.
Conserver la solution, par aliquotes de 50 ml, à l’abri de la lumière à ≤ −18 °C, la durée de conservation
Formatted: Pattern: Clear
ne devant pas dépasser 12 mois.
Formatted: Pattern: Clear
7.4.2 Milieu DO-McD (McDonnell) 10x.
Dissoudre
— 175 mg de L-lysine-HCl (7.1.10);
Formatted: Pattern: Clear
— 120 mg de L-histidine-HCl (7.1.7);
Formatted: Pattern: Clear
dans de l’eau (7.2) et compléter à 500 ml avec de l’eau (7.2).
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Stériliser la solution par filtration (acétate de cellulose, 0,2 µm) et la conserver, par aliquotes de 40 ml, à
l’abri de la lumière à ≤ −18 °C, la durée de conservation ne devant pas dépasser 6 mois.
7.4.3 Solution de glucose.
Dissoudre
— 144 g de α-D-glucose (7.1.2) Formatted: Pattern: Clear
dans de l’eau (7.2) et compléter à 500 ml avec de l’eau (7.2).
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Stériliser la solution par filtration (acétate de cellulose, 0,2 µm) ou la passer à l’autoclave et la conserver
à l’abri de la lumière à une température comprise entre 2 °C et 8 °C, la durée de conservation ne devant
pas dépasser 12 mois.
7.4.4 Solution de CuSO , 10 mmol/l.
Dissoudre 250 mg de CuSO ·5H O (7.1.17) dans de l’eau (7.2) et compléter à 100 ml avec de l’eau (7.2). Formatted: Pattern: Clear
4 2
Formatted: Pattern: Clear
Passer la solution à l’autoclave. La solution peut être conservée à température ambiante et utilisée dans
Formatted: Pattern: Clear
les 12 mois suivant sa préparation.
7.4.5 Solution mère d’ampicilline.
Dissoudre 1 g de sel sodique d’ampicilline (7.1.18) dans de l’eau (7.2) et compléter à 10 ml avec de
Formatted: Pattern: Clear
l’eau (7.2).
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Stériliser la solution par filtration (acétate de cellulose, 0,2 µm) et la conserver, par aliquotes de 1 ml, à
l’abri de la lumière à ≤ –18 °C, la durée de conservation ne devant pas dépasser 12 mois.
7.4.6 Solution mère de streptomycine.
Dissoudre 1 g de sel de sulfate de streptomycine (7.1.19) dans de l’eau (7.2) et compléter à 10 ml avec de Formatted: Pattern: Clear
l’eau (7.2).
Formatted: Pattern: Clear
Formatted: Pattern: Clear
Stériliser la solution par filtration (acétate de cellulose, 0,2 µm) et la conserver, par aliquotes de 1 ml, à
l’abri de la lumière à ≤ –18 °C, la durée de conservation ne devant pas dépasser 12 mois.
7.4.7 Milieu de croissance (McDonnell).
Ajouter
— 10 ml de milieu SD 10x (7.4.1); Formatted: Pattern: Clear
— 10 ml de milieu DO-McD 10x (McDonnell, 7.4.2); Formatted: Pattern: Clear
dans 80 ml d’eau stérile (7.2) dans des conditions stériles. Diviser le milieu en aliquotes de 20 ml.
Formatted: Pattern: Clear
Conserver le milieu à l’abri de la lumière soit à une température comprise entre 2 °C et 8 °C, auquel cas la
durée de conservation ne doit pas dépasser 1 semaine, soit à une température ≤ –18 °C, auquel cas la
durée de conservation ne doit pas dépasser 6 mois.
7.4.8 Milieu d’exposition (McDonnell).
Mélanger
— 4,2 ml   milieu SD 10x (7.4.1);
Formatted: Pattern: Clear
— 4,2 ml   milieu DO-McD (McDonnell) 10x (7.4.2);
Formatted: Pattern: Clear
— 1,6 ml   solution de glucose (7.4.3);
Formatted: Pattern: Clear
— 99 µl    solution de CuSO (7.4.4);
4 Formatted: Pattern: Clear
— 67 µl    solution mère d’ampicilline (7.4.5); Formatted: Pattern: Clear
— 67 µl    solution mère de streptomycine (7.4.6). Formatted: Pattern: Clear
Préparer le milieu d’exposition juste avant de l’utiliser. Il faut 5 ml de milieu d’exposition par plaque
de 96 puits.
7.4.9 Solution aqueuse d’éthanol, fraction volumique de 0,3 %.
Ajouter de l’eau (7.2) stérile à 300 µl d’éthanol (7.1.23) de sorte à obtenir un volume final de 100 ml.
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7.4.10 Solution aqueuse de glycérol, fraction volumique de 30 %.
Ajouter de l’eau (7.2) à 3 ml de glycérol (7.1.24) de sorte à obtenir un volume final de 10 ml. Stériliser la
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solution par filtration (acétate de cellulose, 0,2 µm) ou la passer à l’autoclave.
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7.4.11 Solution mère de 17β-œstradiol (E2).
Dissoudre 50 mg de 17β-œstradiol (E2) (7.1.25) dans de l’éthanol (7.1.23) et compléter à 10 ml avec de Formatted: Pattern: Clear
l’éthanol (7.1.23). Conserver la solution mère, par aliquotes de 1 ml, à l’abri de la lumière à ≤ −18 °C, la
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durée de conservation ne devant pas dépasser 12 mois.
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7.4.12 Tampon lacZ.
Dissoudre dans 950 ml d’eau (7.2):
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— 10,67 g Na HPO⋅2H O (7.1.26);
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— 0,75 g KCl (7.1.28);
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— 0,25 g MgSO⋅7H
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