ISO 11290-2:2017
(Main)Microbiology of the food chain - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. - Part 2: Enumeration method
Microbiology of the food chain - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. - Part 2: Enumeration method
ISO 11290-2:2017 specifies a horizontal method for - the enumeration of L. monocytogenes, and - the enumeration of Listeria spp. (including L. monocytogenes). ISO 11290-2:2017 is applicable to - products intended for human consumption and for the feeding of animals, and - environmental samples in the area of food production and food handling.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes et de Listeria spp. — Partie 2: Méthode de dénombrement
ISO 11290-2:2017 spécifie une méthode horizontale pour: - le dénombrement de L. monocytogenes; et - le dénombrement de Listeria spp. (y compris L. monocytogenes). ISO 11290-2:2017 s'applique aux: - produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale; et - échantillons de l'environnement de production et de distribution des aliments.
General Information
Relations
Overview
ISO 11290-2:2017 - Microbiology of the food chain - Part 2: Enumeration method - specifies a horizontal laboratory procedure for the enumeration of Listeria monocytogenes and Listeria spp. in food, feed and food‑production environment samples. The standard defines the five key stages of the method (initial suspension, surface plating, incubation, confirmation and enumeration) and sets out requirements for media, equipment, sampling and result expression.
Key topics and technical requirements
- Scope: Enumeration of L. monocytogenes and Listeria spp. (including L. monocytogenes) in products intended for human/animal consumption and environmental samples from food production/handling areas.
- Principle: Prepare initial suspension and perform surface plating (Agar Listeria - Ottaviani and Agosti), incubate and confirm presumptive colonies, then calculate colony‑forming units (cfu) per g, mL, cm2 or per sampling device.
- Sampling & preparation: Follow ISO 6887 (sample preparation and decimal dilutions) and ISO 7218 for general laboratory practice. Primary suspension media referenced (e.g., buffered peptone water, half‑Fraser broth) are described in the standard.
- Incubation: Plates incubated at 37 °C with examination after 24 h and again after a further 24 h (the document also references incubator ranges and optional conditions).
- Confirmation: Presumptive colonies require morphological and/or biochemical confirmation; certain tests (microscopy, catalase, CAMP) are noted as optional in this edition.
- Results & performance: Enumeration is based on the number of confirmed colonies; the standard includes performance characteristics, validation data and statistical repeatability/reproducibility information.
- Safety & quality: Recommends testing in laboratories with biosafety level 2 conditions, and adherence to ISO 11133 for culture media quality and ISO 7218 for laboratory requirements. Quality assurance and reporting requirements are specified.
Applications and who uses it
ISO 11290-2:2017 is used by:
- Food and feed manufacturers (QA/QC teams) for routine product testing.
- Environmental monitoring programs in food-processing facilities (surface swabs).
- Contract microbiology laboratories conducting regulatory or customer testing.
- Public health and regulatory agencies for food safety surveillance and compliance.
Practical uses include enumeration in ready‑to‑eat (RTE) foods, dairy, meat, seafood, processed foods, animal feed and environmental hygiene verification.
Related standards
- ISO 11290-1 (detection method for Listeria)
- ISO 6887 (sample preparation and dilutions)
- ISO 7218 (general microbiology laboratory requirements)
- ISO 11133 (culture media preparation and performance)
ISO 11290-2:2017 is a core reference for laboratories and food safety professionals seeking a harmonized, validated approach to Listeria enumeration in the food chain.
Frequently Asked Questions
ISO 11290-2:2017 is a standard published by the International Organization for Standardization (ISO). Its full title is "Microbiology of the food chain - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. - Part 2: Enumeration method". This standard covers: ISO 11290-2:2017 specifies a horizontal method for - the enumeration of L. monocytogenes, and - the enumeration of Listeria spp. (including L. monocytogenes). ISO 11290-2:2017 is applicable to - products intended for human consumption and for the feeding of animals, and - environmental samples in the area of food production and food handling.
ISO 11290-2:2017 specifies a horizontal method for - the enumeration of L. monocytogenes, and - the enumeration of Listeria spp. (including L. monocytogenes). ISO 11290-2:2017 is applicable to - products intended for human consumption and for the feeding of animals, and - environmental samples in the area of food production and food handling.
ISO 11290-2:2017 is classified under the following ICS (International Classification for Standards) categories: 07.100.30 - Food microbiology. The ICS classification helps identify the subject area and facilitates finding related standards.
ISO 11290-2:2017 has the following relationships with other standards: It is inter standard links to ISO 15597:2001, ISO 5359:2014/Amd 1:2017, ISO 11290-2:1998, ISO 11290-2:1998/Amd 1:2004. Understanding these relationships helps ensure you are using the most current and applicable version of the standard.
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11290-2
Second edition
2017-05
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the detection
and enumeration of Listeria
monocytogenes and of Listeria spp. —
Part 2:
Enumeration method
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes et de
Listeria spp. —
Partie 2: Méthode de dénombrement
Reference number
©
ISO 2017
© ISO 2017, Published in Switzerland
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
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ii © ISO 2017 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 2
4.1 General . 2
4.2 Initial suspension . 2
4.3 Surface plating . 2
4.4 Incubation . 2
4.5 Confirmation . 3
4.6 Enumeration . 3
5 Culture media and reagents . 3
6 Equipment and consumables . 3
7 Sampling . 3
8 Preparation of test sample . 4
9 Procedure. 4
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions . 4
9.2 Inoculation and incubation . 4
9.3 Enumeration of characteristic colonies . 4
9.4 Confirmation of L. monocytogenes or Listeria spp. . 5
9.4.1 Selection of colonies for confirmation . 5
9.4.2 Confirmation of L. monocytogenes . 6
9.4.3 Confirmation of Listeria spp. . 9
9.5 Interpretation of morphological and physiological properties and of the
biochemical reactions .10
9.6 Additional characterization of isolated strains (optional) .10
10 Expression of results .10
11 Performance characteristics of the method .10
11.1 Method validation study .10
11.2 Repeatability limit .11
11.3 Reproducibility limit .11
12 Test report .11
13 Quality assurance .12
Annex A (normative) Diagram of procedure .13
Annex B (normative) Composition and preparation of media and reagents .14
Annex C (informative) Distinction of Listeria spp. from other genera .22
Annex D (informative) Reactions for the identification of Listeria species .23
Annex E (informative) Results of interlaboratory studies for enumeration of
Listeria monocytogenes .25
Bibliography .28
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,
as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the
Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www . i so .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical
Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the
agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 11290-2:1998), which has been technically
revised. It also incorporates the amendment ISO 11290-2:1998/Amd.1:2004.
The main changes, compared to ISO 11290-2:1998, are the following.
— The enumeration of Listeria monocytogenes has been modified as listed below.
— Primary suspension with buffered peptone water, half-Fraser broth with or without supplements,
and all appropriate diluents referred to in ISO 6887 (all parts).
— Resuscitation step deleted.
— Microscopic aspect, catalase and CAMP test for confirmation are optional.
— Inclusion of new performance characteristics.
— Moreover, enumeration of Listeria spp. has been included in the scope and the title changed
accordingly.
A list of parts in the ISO 11290 series can be found on the ISO website.
iv © ISO 2017 – All rights reserved
Introduction
The main changes, listed in the foreword, introduced in this document compared to ISO 11290-2:1998
[28]
are considered as major (see ISO 17468 ). The technical changes were assessed and were considered
to have no significant effect on the method performance characteristics or test results.
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate
in every detail for certain products for which it may be necessary to use different or specific methods.
Nevertheless, in all cases, this horizontal method is intended to be applied as far as possible and
deviations from this only be made for justified technical reasons.
When this document is next reviewed, account will be taken of all information then available regarding
the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from it in
the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate, and for certain groups of products
International Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this
horizontal method. It is hoped that when such standards are reviewed they will be changed to comply
with this document so that eventually the only remaining departures from this horizontal method will
be those necessary for well-established technical reasons.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 11290-2:2017(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the detection and enumeration of Listeria monocytogenes
and of Listeria spp. —
Part 2:
Enumeration method
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests
for detecting L. monocytogenes and Listeria spp. are only undertaken in properly equipped
laboratories, under the control of a skilled microbiologist, and that great care is taken in the
disposal of all incubated materials. Persons using this document should be familiar with
normal laboratory practice. This document does not purport to address all of the safety aspects,
if any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate
safety and health practices. In particular, it is strongly recommended that tests for detecting
L. monocytogenes are undertaken in laboratories providing biosafety level 2 conditions. It is
strongly recommended that female laboratory staff are made aware of the particular risk to the
developing foetus presented by infection of the mother through exposure to L. monocytogenes
and Listeria spp., and that pregnant personnel and persons with recognized underlying
conditions or diseases that impair cell-mediated immunity do not manipulate cultures of
L. monocytogenes and Listeria spp.
1 Scope
This document specifies a horizontal method for
— the enumeration of L. monocytogenes, and
— the enumeration of Listeria spp. (including L. monocytogenes).
This document is applicable to
— products intended for human consumption and for the feeding of animals, and
— environmental samples in the area of food production and food handling.
It is possible that certain additionally described Listeria species may not be enumerated or confirmed
[3],[6],[9],[11]
by this method.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
ISO 11290-1, Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of
Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 1: Detection method
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
3.1
Listeria monocytogenes
microorganisms which form typical colonies on solid selective media described and which display the
morphological, physiological and biochemical characteristics described when the analysis is carried
out in accordance with this document
3.2
enumeration of Listeria monocytogenes
determination of the number of colony-forming units (cfu) of Listeria monocytogenes, per gram, per
millilitre, per square centimetre, or per sampling device when the analysis is carried out in accordance
with this document
3.3
Listeria spp.
microorganisms which form typical colonies on solid selective media and which display the
morphological, physiological and biochemical characteristics described when tests are carried out in
accordance with this document
3.4
enumeration of Listeria spp.
determination of the number of colony-forming units (cfu) of Listeria spp per gram, per millilitre, per
square centimetre, or per sampling device, when the analysis is carried out in accordance with this
document
4 Principle
4.1 General
Within the limits of this document, the enumeration of L. monocytogenes and of Listeria spp. requires
five successive steps, as described in the flowchart in Annex A.
4.2 Initial suspension
Preparation of the initial suspension in an appropriate diluent according to the sample type.
4.3 Surface plating
[13],[14]
Surface plating on Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti of a specified quantity of the
test sample for liquid products or of the initial suspension for other products and/or decimal dilutions
if required.
4.4 Incubation
Incubation of the Petri dishes at 37 °C and examination after 24 h and after a further 24 h.
2 © ISO 2017 – All rights reserved
4.5 Confirmation
Confirmation of presumptive colonies of L. monocytogenes and/or of presumptive Listeria spp. by means
of appropriate morphological and/or biochemical tests.
4.6 Enumeration
From the number of confirmed colonies, calculation of the number of L. monocytogenes and/or of
Listeria spp. per gram, per millilitre, per square centimetre, or per sampling device.
5 Culture media and reagents
For current laboratory practices, refer to ISO 11133.
Composition of culture media and reagents and their preparation are described in Annex B.
6 Equipment and consumables
Usual microbiological laboratory apparatus (as specified in ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave).
As specified in ISO 7218.
6.2 Drying cabinet or incubator, capable of being maintained between 25 °C and 50 °C.
6.3 Incubators, capable of operating at 37 °C ± 1 °C and 25 °C ± 1 °C (optional).
6.4 Water bath, capable of operating at 47 °C to 50 °C.
6.5 Sterile loops, approximately 3 mm in diameter or 10 µl, and inoculating needle or wire.
6.6 Glass or plastic spreaders, sterile.
6.7 pH meter, capable of being read to the nearest 0,01 pH unit at 25 °C, enabling measurements to be
made which are accurate to ± 0,1 pH unit.
6.8 Total-delivery graduated pipettes or automatic pipettes, of nominal capacities 1 ml and 10 ml.
6.9 Petri dishes, of diameter 90 mm and/or 140 mm.
6.10 Microscope, preferably with phase-contrast, and with slides and cover slips.
6.11 Refrigerator, capable of operating at 5 °C ± 3 °C.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. If there is no specific International
Standard dealing with sampling of the product concerned, it is recommended that the parties
concerned come to an agreement on this subject. For food and feed samples, refer to ISO/TS 17728. For
[23]
environmental samples, use ISO 18593 and see Reference .
It is important that the laboratory receives a sample which is truly representative and has not been
damaged or changed during transport or storage (see ISO 7218).
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with the specific International Standard dealing with the product
concerned [see ISO 6887 (all parts) and ISO 18593]. If there is no specific International Standard, it is
recommended that the parties concerned come to an agreement on this subject.
9 Procedure
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions
Buffered peptone water, as well as other appropriate diluents referred to in ISO 6887 (all parts) and any
specific International Standard appropriate to the product concerned, may be used as diluent for the
initial suspension.
Half-Fraser broth (as specified in ISO 11290-1), supplemented with selective agents or not, may be used
as a diluent for the initial suspension when both the detection method (as specified in ISO 11290-1) and
this enumeration method are carried out on the same test sample. The selective agents should be added
(if required) to the suspension preferentially after enumeration, prior to the detection method.
If supplemented half-Fraser is used, inoculate the plates as soon as possible, up to 45 min.
9.2 Inoculation and incubation
9.2.1 Distribute, by means of a sterile pipette (6.8), 0,1 ml of the initial suspension (or sample if liquid)
and 0,1 ml of further decimal dilutions each inoculated onto the surface of a small dish (90 mm) of Agar
Listeria according to Ottaviani and Agosti (see B.2).
When, for certain products, it is desirable to estimate low numbers of L. monocytogenes and/or Listeria
spp., the limits of detection may be raised by a factor of 10 by examining 1 ml of the test sample if the
initial product is liquid, or 1 ml of the initial suspension for the other products. Distribute the 1 ml of
inoculum either on the surface of a large Petri dish (140 mm) or over the surface of three small dishes
(90 mm), dried beforehand if necessary in the incubator (6.2). If only the initial suspension is used, also
prepare duplicate plates using an additional three small Petri dishes or one large dish of medium (see
ISO 7218).
Repeat the procedure using 0,1 ml of the initial suspension (or sample if liquid) and 0,1 ml of further
decimal dilutions if necessary each inoculated onto the surface of a small dish (90 mm) of agar medium.
9.2.2 Carefully spread the inoculum as quickly as possible over the surface of the agar plate without
touching the sides of the dish with the spreader (6.6). Use a fresh sterile spreader for each dilution. Leave
the plates closed and upright for about 15 min at ambient temperature for the inoculum to be absorbed
into the agar.
It is possible to use the same spreader for all the dishes of a given sample, by beginning with the higher
dilution.
9.2.3 Incubate the Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti plates prepared in 9.2.2 inverted at
37 °C (6.3) for 24 h ± 2 h and for an additional incubation at 37°C for 24 ± 2h.
9.3 Enumeration of characteristic colonies
9.3.1 After incubation for 24 h ± 2 h (before excessive development of colonies with large and
overlapping opaque halos, which may make reading difficult), and for an additional 24 h ± 2 h (which
may allow better development of colonies and of an opaque halo), examine the Petri dishes (9.2.3) for
the presence of presumptive colonies of L. monocytogenes (see 9.3.2) and/or Listeria spp. (see 9.3.3).
4 © ISO 2017 – All rights reserved
9.3.2 Consider as L. monocytogenes the blue-green colonies surrounded by an opaque halo (typical
colonies). Colonies of L. ivanovii are also blue-green and surrounded by an opaque halo.
NOTE 1 Some strains of L. monocytogenes exposed to stress conditions, particularly acid stress, may show a
very weak halo (or even no halo).
NOTE 2 Some rare L. monocytogenes are characterized by a slow PIPLC (phosphatidyl inositol phospholipase
C) activity. Such bacteria are detected when the total duration of incubation is more than, for example, 4 days.
[10]
Some of these strains could be pathogenic. No L. monocytogenes strains have been described as PIPLC negative.
9.3.3 Consider as presumptive Listeria spp. the blue-green colonies with or without opaque halo.
NOTE Some organisms other than Listeria spp. may produce blue colonies on this medium. See Annex C.
9.3.4 Count all the colonies presumed to be L. monocytogenes (9.3.2) on each Petri dish containing
less than 150 L. monocytogenes characteristic colonies, or less than 360 L. monocytogenes characteristic
colonies if 140 mm Petri dishes are used.
9.3.5 Count all the colonies presumed to be Listeria spp. (9.3.3.) on each Petri dish containing less than
150 Listeria spp. characteristic colonies, or less than 360 Listeria spp. characteristic colonies if 140 mm
Petri dishes are used.
In case of mixed cultures of blue-green colonies with or without opaque halo, or in case of blue-
green colonies with large and overlapping opaque halos, it is preferable to count the colonies on each
Petri dish containing less than 100 Listeria spp. characteristic colonies, or less than 240 Listeria spp.
characteristic colonies if 140 mm Petri dishes are used.
9.4 Confirmation of L. monocytogenes or Listeria spp.
9.4.1 Selection of colonies for confirmation
9.4.1.1 Consider each group of three 90 mm Petri dishes used for the initial suspension as one dish.
If on one dish there are fewer than five presumptive colonies, take all of them for confirmation.
9.4.1.2 For confirmation of presumptive L. monocytogenes, take from each Petri dish, representing each
dilution, five colonies in total, representative for each colony type (e.g. with large halo and small halo).
Streak the selected colonies onto the surface of pre-dried plates of a non-selective agar, for example
blood agar, nutrient agar, tryptone soya yeast extract agar (TSYEA) (B.1) in a manner which will allow
isolated colonies to develop.
Use of blood agar for pure culture enables interpretation of haemolysis, when positive, already at
that stage (see 9.4.2.5 and Annex D). If streaking on blood agar does not show haemolysis, then the
haemolysis test shall be done by stabbing (9.4.2.5.2) or in liquid medium (9.4.2.5.3).
Place the Petri dishes in the incubator set at 37°C for 18 h to 24 h or until growth is satisfactory.
If the colonies are not isolated, pick a typical L. monocytogenes colony onto another non-selective dish.
Carry out the following tests (9.4.2) from colonies of a pure culture on the non-selective agar.
9.4.1.3 For confirmation of presumptive Listeria spp. take, from each Petri dish, representing each
dilution, five colonies in total, representative for each colony type (e.g. large and small colonies, with or
without halo).
For confirmation of Listeria spp. use plates of TSYEA.
Streak the selected colonies onto the surface of pre-dried plates of TSYEA (B.1), in a manner which will
allow isolated colonies to develop.
Place the Petri dishes in the incubator set at 37°C for 18 h to 24 h or until growth is satisfactory.
Typical colonies on TSYEA of Listeria spp. are 1 mm to 2 mm in diameter, convex, colourless and opaque
with an entire edge. When the plates are held to the light (artificial or natural) at about 45 degree angle,
colonies exhibit a blue-grey colour and a granular surface.
If the colonies are not isolated, pick a typical Listeria spp. colony onto another non-selective dish.
Carry out the following tests (9.4.3) from typical colonies of a pure culture on TSYEA.
9.4.2 Confirmation of L. monocytogenes
9.4.2.1 General
Carry out the confirmation tests for L. monocytogenes. Appropriate positive and negative control strains
for each of the confirmation tests shall be used.
Perform at minimum the mandatory tests as listed (in bold) in Table 1.
Table 1 — Confirmation tests for L. monocytogenes
Tests L. monocytogenes confirmation tests Results
Mandatory Beta-haemolysis (9.4.2.4) +
L-Rhamnose (9.4.2.7) +
D-Xylose (9.4.2.7) -
Optional Microscopic aspect (9.4.3.4) Slim short rods or coccobacilli
Catalase (9.4.2.2) +
Motility at 25 °C (9.4.2.3) +
CAMP test (9.4.2.6) +
Details on results for confirmation tests can be found in Annex D.
NOTE An alternative procedure as mentioned in ISO 7218 can be used to confirm the isolate as Listeria
monocytogenes, providing the suitability of the relevant procedure is verified.
If shown to be reliable, miniaturized galleries for the biochemical identification of Listeria monocytogenes
may be used (see ISO 7218).
Rare strains of L. monocytogenes do not show beta-haemolysis or a positive reaction to the CAMP
test under the conditions described in this document. If typical colonies on Agar Listeria according to
Ottaviani and Agosti with PIPLC activity even if it is low, are negative for haemolysis, it is recommended
to perform additional tests (e.g. Gram stain, catalase, motility, CAMP test, PCR), in order to determine
whether this isolate is a non-haemolytic L. monocytogenes.
9.4.2.2 Catalase reaction (optional)
Take an isolated colony obtained in 9.4.1 and suspend it in a drop of hydrogen peroxide solution (B.3)
on a slide. The immediate formation of gas bubbles indicates a positive reaction.
NOTE A catalase reaction performed from a colony originating from a blood agar can sometimes lead to
false-positive results.
6 © ISO 2017 – All rights reserved
9.4.2.3 Motility test (optional)
Take an isolated colony obtained in 9.4.1 and suspend it in a tube containing a non-selective nutrient
liquid medium.
Incubate in the incubator (6.3) set at 25 °C for 8 h to 24 h until the medium turns cloudy.
Take a drop of the above culture using a loop (6.5) onto a clean glass microscope slide. Place a cover slip
on top and examine it under a microscope (6.10).
Listeria spp. (including L. monocytogenes) appear as slim, short rods with tumbling motility.
Cultures grown at a temperature above 25 °C may fail to exhibit this motion. Always compare them to a
known culture. Cocci, large rods or rods with rapid swimming motility are not Listeria spp.
As an alternative test for motility, using an inoculating needle (6.5), dilute in sterile water (or other
appropriate diluent) a fragment of isolated colony obtained on non-selective agar. Listeria spp.
(including L. monocytogenes) appear as slim, short rods with tumbling motility.
As another alternative test for motility, using an inoculating needle (6.5), stab the motility agar (B.4)
with a culture taken from a typical colony obtained in 9.4.1. Incubate at 25 °C for 48 h ± 2 h.
Examine for growth around the stab. Listeria spp. are motile, giving a typical umbrella-like growth
pattern. If growth is not sufficient, incubate for up to an additional five days and observe the stab again.
[3],[6],[9],[11],[20],[24],[25]
NOTE Some new Listeria species have been recently isolated. Most of them are not
motile in the motility agar.
9.4.2.4 Microscopic aspect (optional)
Make a microscopic preparation (e.g. Gram stain, wet microscopy) from an isolated colony obtained in
9.4.1. Listeria spp. (including L. monocytogenes) appear as Gram-positive (if this stain is performed),
slim, short rods or coccobacilli, with tumbling motility when originating from a fresh culture.
For Gram stain microscopic preparation see ISO 7218.
9.4.2.5 Haemolysis tests
9.4.2.5.1 General
Choose one of the haemolysis tests (9.4.2.5.2 or 9.4.2.5.3).
NOTE There exist rare strains of L. monocytogenes which do not show β-haemolysis or a positive reaction to
the CAMP test under the conditions described in this document.
9.4.2.5.2 Haemolysis on blood agar
If the morphological and physiological characteristics are indicative of Listeria spp., inoculate blood
agar plates (B.5) to determine the haemolytic reaction.
Dry the agar surface well before use. Take an isolated colony obtained in 9.4.1 using a wire (6.5), then stab
a section of agar. Repeat for each culture. On the same plate if possible, stab positive (L. monocytogenes)
and negative (L. innocua) control cultures. For example, L. monocytogenes 4b WDCM 00021, or
L. monocytogenes 1/2a WDCM 00109 and L. innocua WDCM 00017 may be used.
After incubation at 37 °C (6.3) for 24 h ± 2 h, examine the test strains and controls. L. monocytogenes
shows narrow, clear, light zones of haemolysis; L. innocua shows no clear zone around the stab.
L. seeligeri shows mostly a weak zone of haemolysis. L. ivanovii usually shows wide, clearly delineated
zones of haemolysis. Examine the plates in bright light to compare test cultures with controls.
NOTE 1 The haemolytic reaction is more readily seen by removing any colony growth on the surface of the
agar around the inoculum mark.
NOTE 2 The haemolysis test can be performed by stabbing the blood agar plate used for the CAMP test.
9.4.2.5.3 Haemolysis reaction using red blood corpuscles
The haemolytic reaction may also be carried out using red blood corpuscles as follows.
Disperse the colony in 150 µl of a non-selective liquid nutrient medium, incubate at 37 °C (6.3) for 2 h.
Add 150 μl of a suspension of red blood corpuscles (B.7). Incubate at 37 °C (6.3) for 15 min to 60 min,
then refrigerate at 5 °C (6.11) for approximately 2 h. Examine for haemolytic activity. If the reaction is
not definite, leave at 5 °C (6.11) for up to 24 h ± 2 h. A sedimentation of red blood corpuscles (formation
of a red point at the bottom of the tubes) indicates a negative reaction.
Include positive and negative controls. For control strains see 9.4.2.5.2.
9.4.2.6 CAMP test (optional)
If the result of the haemolysis test is difficult to interpret, the CAMP test is recommended to demonstrate
clearly that haemolysis is due to listeriolysin activity.
A β-haemolytic strain of Staphylococcus aureus (e.g. WDCM 00034) and a strain of Rhodococcus equi (e.g.
WDCM 0028) are required to undertake the CAMP test. Not all strains of S. aureus are suitable for the
CAMP test. Streak each of the S. aureus and R. equi cultures in single lines across the blood agar plate
(B.5 or B.8.4) so that the two cultures are parallel and diametrically opposite (see Figure 1). A thin,
even inoculum is required. This can be obtained by using an inoculation loop or a wire (6.5) held at
right angles to the agar.
Streak a well isolated colony of the strain under test (9.4.1.) in a similar fashion at right angles to these
cultures so that the test culture and S. aureus and R. equi cultures do not touch but at their closest are
about 1 mm to 2 mm apart. Several test strains may be streaked on the same plate.
Key
1 narrow band of ß-haemolysis 4 L. monocytogenes
2 no haemolysis 5 L. innocua
3 wide band of ß-haemolysis 6 L. ivanovii
Figure 1 — Inoculation and interpretation of CAMP test plates
The vertical lines in Figure 1 represent streaks of S. aureus (S) and R. equi (R). Horizontal lines represent
streaks of the test cultures. Hatched areas indicate the locations of enhanced haemolysis.
8 © ISO 2017 – All rights reserved
The dotted area indicates the zone of influence of the S. aureus culture.
Simultaneously, streak control cultures of L. monocytogenes, L. innocua and L. ivanovii. For example,
L. monocytogenes 4b WDCM 00021, L. monocytogenes 1/2a WDCM 00109, L. innocua WDCM 00017 and
L. ivanovii WDCM 00018 may be used. For maintaining stock cultures see ISO 11133. If blood agar (B.5)
is used, incubate the plates at 37 °C for 18 h to 24 h.
If double-layer plates (B.8.4) are used, incubate at 37 °C for 12 h to 18 h.
The positive reaction with R. equi is seen as a wide (5 mm to 10 mm) “arrow-head” of haemolysis. The
reaction is considered as negative if a small zone of weak haemolysis extends only about 1 mm at the
intersection of the test strain with the diffusion zone of the R. equi culture.
A positive reaction with S. aureus appears as a small zone of enhanced haemolysis extending only about
2 mm from the test strain and within the weakly haemolytic zone due to growth of the S. aureus culture.
Large zones of haemolysis do not occur in the area of S. aureus and L. monocytogenes.
9.4.2.7 Carbohydrate utilization
Using a loop (6.5), inoculate each of the carbohydrate utilization broths (B.9) with the cultures obtained
from the non-selective agar (9.4.1). Incubate at 37 °C. Positive reactions (acid formation) are indicated
by a yellow colour and occur mostly within 24 h to 48 h for microvolumes tubes, and up to five days
for macrovolumes tubes. L-Rhamnose and D-Xylose are used for the confirmation of L. monocytogenes,
which is L-Rhamnose positive and D-Xylose negative (see Annex D).
[12][15]
NOTE There exist rare strains of L. monocytogenes which do not ferment L-Rhamnose.
For microvolumes, reactions are more rapid. The level of inoculation compared to the total volume is
an important factor. For each chosen protocol, it is important to verify the time taken to obtain a yellow
coloration. It is advised to use controls. For example L. monocytogenes 4b WDCM 00021, L. innocua
WDCM 00017 and L. ivanovii WDCM 00018 may be used. Maintain stock cultures as specified in
ISO 11133.
9.4.3 Confirmation of Listeria spp.
9.4.3.1 General
Carry out the confirmation tests for Listeria spp. from typical colonies (9.4.1.3). Appropriate positive
and negative control strains for each of the confirmation tests shall be used.
Perform at minimum the mandatory tests as listed (in bold) in Table 2.
For further tests, if identification of species of Listeria is required, see Annex D.
Table 2 — Confirmation tests for Listeria spp.
Tests Listeria spp. Results
Mandatory Microscopic aspect (9.4.2.2) Slim short rods or coccobacilli
Catalase (9.4.2.2) +
Optional VP test (9.4.3.5) +
Motility at 25°C (9.4.2.3) +
NOTE 1 An alternative procedure as mentioned in ISO 7218 can be used to confirm the isolate as Listeria spp.,
providing the suitability of the relevant procedure is verified.
NOTE 2 It is possible that some new Listeria species recently isolated may not correspond to this scheme in
particular for motility, VP test and growth at 37°C (see, for example, References [3], [6], [9], [11], [20], [24] and [25]).
9.4.3.2 Catalase reaction
Take an isolated colony obtained in 9.4.1 and perform the test as described in 9.4.2.2.
9.4.3.3 Motility test (optional)
Take an isolated colony obtained in 9.4.1 and perform the test as described in 9.4.2.3.
9.4.3.4 Microscopic aspect
Take an isolated colony obtained in 9.4.1 and perform the test as described in 9.4.2.4.
9.4.3.5 Voges – Proskauer (VP) reaction (optional)
Using a loop (6.5), inoculate a tube containing 3 ml of the VP medium (B.10.1). Incubate at 37 °C for
24 h ± 2 h. After incubation add 0,6 ml of 5 % α-naphthol solution (B.10.2) and 0,2 ml of 40 % potassium
hydroxide solution (B.10.3). Shake well, slope the tube (to increase the area of the air-liquid interface).
Examine after 15 min and 1 h. A positive reaction is indicated by a strong red colour. Listeria spp. are
VP positive.
[3],[6],[9],[11],[20],[24],[25]
NOTE Some new Listeria species have been recently isolated. Most of them are VP
negative.
9.5 Interpretation of morphological and physiological properties and of the
biochemical reactions
All Listeria spp. are small, Gram-positive rods or coccobacilli that give a positive reaction in the
catalase test.
L. monocytogenes are confirmed according to tests listed in Table 1 and Listeria spp. are confirmed
according to tests listed in Table 2.
9.6 Additional characterization of isolated strains (optional)
Isolates which are considered to be L. monocytogenes (9.5) may be sent for further characterization to a
recognized national or regional Listeria Reference Laboratory, or (if not available) to the World Health
Organization Collaborating Centres for Listeria. The dispatch shall be accompanied by all possible
information concerning the strain(s).
For further tests, if identification of species of Listeria is required, see Annex D.
10 Expression of results
See ISO 7218.
Calculate and report the counts in cfu per gram, per millilitre, per square centimetre, or per sampling
device for L. monocytogenes and/or Listeria spp. depending on the purpose of the assay.
11 Performance characteristics of the method
11.1 Method validation study
Results of the interlaboratory study to determine the precision of the method are summarized
in Annex E. Repeatability and reproducibility limits were determined using five types of food
contaminated at various levels. The values derived from the interlaboratory study may not be applicable
to concentration ranges and food types other than those given in Annex E.
10 © ISO 2017 – All rights reserved
11.2 Repeatability limit
The absolute difference between two independent single (log -transformed) test results (number
of cfu per gram or per millilitre) or the ratio of the higher to the lower of the two test results on the
normal scale, obtained using the same method on identical test material in the same laboratory by the
same operator using the same apparatus within the shortest feasible time interval, will in no more than
5 % of cases exceed the repeatability limit r.
As a general indication of repeatability limit (r), the following values (medians of values per matrix and
contamination level, see Annex E) may be used when testing food samples in general (except powdered
infant formulae):
r = 0,30, range [0,19; 0,40] (expressed as a difference between log -transformed test results), or
r = 1,99, range [1,55; 2,50] (expressed as a ratio between test results).
EXAMPLE A test result of 100 or 1,0 × 10 or log 2,00 cfu per gram of food product was observed in a
given laboratory. Under repeatability conditions, the difference between log -transformed results should not be
greater than ± 0,30 log units. So the result from a second test result of the same sample should be between 1,70
(2,00 - 0,30) and 2,30 (2,00 + 0,30) log units. For non log-transformed results, the ratio between the first test
result and the second test result from the same sample should not be greater than 1,99. So the second test result
should be between 50 (= 100/1,99) and 199 (=100 × 1,99) cfu per gram.
11.3 Reproducibility limit
The absolute difference between two single (log -transformed) test results (number of cfu per gram or
per millilitre) or the ratio of the higher to the lower of the two test results on the normal scale, obtained
using the same method on identical test material in different laboratories with different operators
using different equipment, will in no more than 5 % of cases exceed the reproducibility limit R.
As a general indication of reproducibility limit (R), the following values (medians of values per matrix
and contamination level, see Annex E) may be used when testing food samples in general (except
powdered infant formulae):
R = 0,43, range [0,25; 0,54](expressed as a difference between log -transformed test results), or
R = 2,68, range [1,79; 3,47] (expressed as a ratio between test results).
EXAMPLE 1 A test result of 100 or 1,0 × 10 or log 2,00 cfu per gram of food product was observed in a
first laboratory. Under reproducibility conditions, the difference between log -transformed results should not
be greater than ± 0.43 log units. So the results from a second laboratory should be between 1,57 (2
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11290-2
Deuxième édition
2017-05
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la recherche et le
dénombrement de Listeria
monocytogenes et de Listeria spp. —
Partie 2:
Méthode de dénombrement
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of
Listeria spp. —
Part 2: Enumeration method
Numéro de référence
©
ISO 2017
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Tel. +41 22 749 01 11
Fax +41 22 749 09 47
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ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Suspension mère . 2
4.3 Ensemencement en surface . 2
4.4 Incubation . 2
4.5 Confirmation . 3
4.6 Dénombrement . 3
5 Milieux de culture et réactifs . 3
6 Matériel et consommables . 3
7 Échantillonnage . 3
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
9 Mode opératoire. 4
9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions . 4
9.2 Inoculation et incubation . 4
9.3 Dénombrement des colonies caractéristiques . 5
9.4 Confirmation de L. monocytogenes ou Listeria spp. . 5
9.4.1 Sélection des colonies pour confirmation . 5
9.4.2 Confirmation de L. monocytogenes . 6
9.4.3 Confirmation de Listeria spp. . 10
9.5 Interprétation des propriétés morphologiques et physiologiques et des
réactions biochimiques.11
9.6 Caractérisation supplémentaire de souches isolées (facultative) .11
10 Expression des résultats.11
11 Caractéristiques de performance de la méthode .11
11.1 Étude de validation de la méthode .11
11.2 Limite de répétabilité .11
11.3 Limite de reproductibilité .12
12 Rapport d’essai .12
13 Assurance qualité .12
Annexe A (normative) Logigramme du mode opératoire .13
Annexe B (normative) Composition et préparation des milieux et des réactifs .14
Annexe C (informative) Distinction de Listeria spp. des autres genres .22
Annexe D (informative) Réactions pour l’identification des espèces de Listeria .23
Annexe E (informative) Résultats des études interlaboratoires pour le dénombrement de
Listeria monocytogenes .25
Bibliographie .28
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien
suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ foreword .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires
— Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le
comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, de l’Organisation
internationale de normalisation (ISO), conformément à l’accord de coopération technique entre l’ISO et
le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 11290-2:1998) qui a fait l’objet
d’une révision technique. Elle intègre également l’amendement ISO 11290-2:1998/Amd.1:2004.
Les principales modifications par rapport à ISO 11290-2:1998 sont les suivantes.
— Le dénombrement de Listeria monocytogenes a été modifiée comme indiqué ci-dessous.
— Suspension mère en eau peptonée tamponnée, bouillon Fraser-demi avec ou sans suppléments, et
tout diluant approprié auquel il est fait référence dans l’ISO 6887 (toutes les parties).
— Suppression de l’étape de revivification.
— L’aspect microscopique, la réaction à la catalase et le test de CAMP sont facultatifs pour la
confirmation.
— Inclusion de nouvelles caractéristiques de performance.
— En outre, le dénombrement des Listeria spp. a été inclus dans le domaine d’application et le titre
modifié en conséquence.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 11290 est disponible sur le site web de l’ISO.
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés
Introduction
Les principales modifications, énumérées dans l’avant-propos, introduites dans ce document
[28
comparativement à l’ISO 11290-2:1998, sont considérées comme majeures (voir l’ISO 17468 ). Les
modifications techniques ont été évaluées et considérées comme n’ayant pas d’effet significatif sur les
caractéristiques de performance de la méthode ou sur les résultats des essais.
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est possible que cette méthode horizontale
ne convienne pas exactement, dans tous ses détails, pour certains produits pour lesquels il peut être
nécessaire d’employer des méthodes différentes ou spécifiques. Néanmoins, cette méthode horizontale
est destinée à être appliquée chaque fois qu’il sera possible et l’on n’aura recours à des dérogations que
pour des raisons techniques justifiées.
Lorsque le présent document sera réexaminé, il sera tenu compte de tous les renseignements disponibles
à ce moment-là, à savoir dans quelle mesure cette méthode horizontale aura été suivie et les raisons
pour lesquelles il aura été nécessaire d’y déroger dans le cas de produits particuliers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut être réalisée de façon immédiate et, pour certains
groupes de produits, des Normes internationales et/ou des normes nationales qui ne concordent pas
avec cette présente méthode horizontale existent peut-être déjà. Lorsque de telles normes viendront en
révision, il serait souhaitable de les aligner avec le présent document et de ne conserver que les seules
divergences justifiées indispensables pour des raisons techniques bien établies.
NORME INTERNATIONALE ISO 11290-2:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la recherche et le dénombrement de
Listeria monocytogenes et de Listeria spp. —
Partie 2:
Méthode de dénombrement
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel
que les essais de détection des L. monocytogenes et Listeria spp. ne soient réalisés que dans
des laboratoires équipés à cet effet, sous le contrôle d’un microbiologiste expérimenté, et
qu’un grand soin soit pris lors de l’élimination de tous les éléments incubés. Il convient que
les utilisateurs du présent document maîtrisent les pratiques courantes de laboratoire. Le
présent document ne prétend pas aborder la totalité des aspects liés à la sécurité qui pourraient
découler de son utilisation. Il est de la responsabilité de l’utilisateur d’établir les pratiques de
sécurité et de santé appropriées. Il est en particulier fortement recommandé que les essais de
recherche de L. monocytogenes soient réalisés dans des laboratoires appliquant des conditions
de biosécurité de niveau 2. II est fortement recommandé que le personnel de laboratoire féminin
soit informé du risque particulier pour le fœtus en développement dû à l’infection de la mère par
le biais d’une exposition aux L. monocytogenes et Listeria spp., et que les femmes enceintes ainsi
que le personnel de laboratoire souffrant de pathologies sous-jacentes ou affectant l’immunité
cellulaire ne manipulent pas les cultures de L. monocytogenes et Listeria spp.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode horizontale pour:
— le dénombrement de L. monocytogenes; et
— le dénombrement de Listeria spp. (y compris L. monocytogenes).
Le présent document s’applique aux:
— produits destinés à la consommation humaine ou à l’alimentation animale; et
— échantillons de l’environnement de production et de distribution des aliments.
Il est possible que cette méthode ne permette pas de dénombrer ou de confirmer certaines espèces de
[3],[6],[9],[11]
Listeria récemment décrites .
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
ISO 11290-1, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la recherche et le
dénombrement de Listeria monocytogenes et de Listeria spp. — Partie 1: Méthode de recherche
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/ .
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp.
3.1
Listeria monocytogenes
micro-organismes formant des colonies typiques sur des milieux sélectifs solides et possédant les
caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques décrites lorsque les essais sont
effectués conformément au présent document
3.2
dénombrement de Listeria monocytogenes
détermination du nombre d’unités formant colonies (UFC) de Listeria monocytogenes, par gramme,
par millilitre, par centimètre carré ou par dispositif de prélèvement, lorsque l’analyse est exécutée
conformément au présent document
3.3
Listeria spp.
micro-organismes formant des colonies typiques sur des milieux sélectifs solides et possédant les
caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques décrites lorsque les essais sont
effectués conformément au présent document
3.4
dénombrement de Listeria spp.
détermination du nombre d’unités formant colonies (UFC) de Listeria spp., par gramme, par millilitre,
par centimètre carré ou par dispositif de prélèvement, lorsque l’analyse est exécutée conformément au
présent document
4 Principe
4.1 Généralités
Dans le cadre du présent document, le dénombrement de L. monocytogenes et de Listeria spp. nécessite
cinq étapes successives, comme décrit dans le logigramme de l’Annexe A.
4.2 Suspension mère
Préparation de la suspension mère dans un diluant approprié selon le type d’échantillon.
4.3 Ensemencement en surface
[13],[14]
Ensemencement en surface sur gélose Listeria selon Ottaviani et Agosti , d’une quantité
déterminée de l’échantillon pour essai si le produit est liquide, ou de la suspension mère dans le cas
d’autres produits et/ou de dilutions décimales si nécessaire.
4.4 Incubation
Incubation des boîtes de Petri à 37 °C et examen après 24 h et après 24 h supplémentaires.
2 © ISO 2017 – Tous droits réservés
4.5 Confirmation
Confirmation des colonies présumées de L. monocytogenes et/ou de Listeria spp. par des essais
morphologiques et/ou biochimiques appropriés.
4.6 Dénombrement
À partir du nombre de colonies confirmées, calcul du nombre de L. monocytogenes et/ou de Listeria spp.
par gramme, par millilitre, par centimètre carré ou par dispositif de prélèvement.
5 Milieux de culture et réactifs
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l’ISO 11133.
La composition des milieux de culture et des réactifs et leur préparation sont décrites à l’Annexe B.
6 Matériel et consommables
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (comme précisé dans l’ISO 7218) et, en particulier, ce
qui suit.
6.1 Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave).
Comme spécifié dans l’ISO 7218.
6.2 Enceinte de séchage ou étuve, pouvant être maintenue à une température comprise entre 25 °C
et 50 °C.
6.3 Étuves, réglables à 37 °C ± 1 °C et 25 °C ± 1 °C (facultatives).
6.4 Bain d’eau, réglable de 47 °C à 50 °C.
6.5 Anses bouclées stériles d’environ 3 mm de diamètre ou de 10 µl, et aiguille ou fil à ensemencer.
6.6 Étaleurs en verre ou en matière plastique, stériles.
6.7 pH-mètre, ayant une précision de lecture de ±0,01 unité pH à 25 °C, permettant de réaliser des
mesures précises à ±0,1 unité pH.
6.8 Pipettes graduées à écoulement total ou pipettes automatiques, de capacités nominales de
1 ml et 10 ml.
6.9 Boîtes de Petri, de 90 mm et/ou 140 mm de diamètre.
6.10 Microscope, de préférence à contraste de phase, avec lames et lamelles couvre-objet.
6.11 Réfrigérateur, réglable à 5 °C ± 3 °C.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode indiquée dans le présent document. S’il n’existe aucune
Norme internationale spécifique pour l’échantillonnage du produit concerné, il convient que les parties
concernées se mettent d’accord à ce sujet. Pour les échantillons d’aliments, consulter l’ISO/TS 17728.
Pour les échantillons d’environnement, voir l’ISO 18593 et voir la Référence [23].
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou
modifié lors du transport ou du stockage (voir l’ISO 7218).
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la Norme internationale spécifique appropriée
au produit concerné [voir l’ISO 6887 (toutes les parties) et l’ISO 18593]. S’il n’existe pas de Norme
internationale spécifique, il est recommandé que les parties concernées se mettent d’accord à ce sujet.
9 Mode opératoire
9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions
De l’eau peptonée tamponnée, aussi bien qu’un autre diluant approprié décrit dans l’ISO 6887 (toutes
les parties) ou dans la Norme internationale spécifique du produit concerné, peut être utilisée comme
diluant pour la suspension mère.
Le bouillon Fraser-demi (comme précisé dans l’ISO 11290-1), avec ou sans supplément d’agents
sélectifs, peut être utilisé comme diluant pour la suspension mère lorsque la méthode de recherche
(comme précisée dans l’ISO 11290-1) et la présente méthode de dénombrement sont réalisées sur le
même échantillon pour essai. Il convient d’ajouter les agents sélectifs (si nécessaire) à la suspension, de
préférence après le dénombrement et avant la méthode de recherche.
Si le bouillon Fraser-demi avec supplément est utilisé, ensemencer les boîtes le plus tôt possible, et
jusqu’à 45 min.
9.2 Inoculation et incubation
9.2.1 Répartir, à l’aide d’une pipette stérile (6.8), 0,1 ml de la suspension mère (ou de l’échantillon s’il
s’agit d’un liquide) et 0,1 ml des dilutions décimales suivantes, chacune ensemencée à la surface d’une
petite boîte (90 mm) de gélose Listeria selon Ottaviani et Agosti (voir B.2).
Lorsque, pour certains produits, il est souhaitable d’estimer de faibles nombres de L. monocytogenes
et/ou de Listeria spp., les limites de détection peuvent être augmentées d’un facteur 10 en examinant
1 ml de l’échantillon pour essai si le produit initial est liquide ou 1 ml de la suspension mère pour
les autres produits. Répartir le volume de 1 ml d’inoculum sur la surface d’une grande boîte de Petri
(140 mm) ou sur la surface de trois petites boîtes (90 mm), préalablement séchées si nécessaire dans
une étuve (6.2). Si uniquement la suspension mère est ensemencée, préparer alors des boîtes en double
en utilisant trois autres petites boîtes de Petri ou une autre grande boîte de milieu (voir l’ISO 7218).
Répéter l’opération en utilisant 0,1 ml de la suspension mère (ou de l’échantillon s’il s’agit d’un liquide)
et 0,1 ml des dilutions décimales suivantes, si nécessaire, chacune ensemencée à la surface d’une petite
boîte (90 mm) de milieu gélosé.
9.2.2 Étaler soigneusement l’inoculum le plus rapidement possible sur la surface de la boîte de gélose
en évitant de toucher les bords de la boîte avec l’étaleur (6.6). Utiliser un nouvel étaleur stérile pour
chaque dilution. Laisser les boîtes fermées couvercle au-dessus pendant environ 15 min à température
ambiante pour permettre à l’inoculum d’être absorbé dans la gélose.
Il est possible d’utiliser le même étaleur pour toutes les boîtes d’un échantillon donné, en commençant
par la dilution la plus élevée.
9.2.3 Incuber les boîtes de gélose Listeria selon Ottaviani et Agosti préparées en 9.2.2 retournées à
37 °C (6.3) pendant 24 h ± 2 h et pour une incubation supplémentaire à 37 °C pendant 24 h ± 2 h.
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9.3 Dénombrement des colonies caractéristiques
9.3.1 Après incubation pendant 24 h ± 2 h (avant tout développement excessif de colonies avec
des halos opaques de grande taille et se chevauchant, susceptibles de rendre la lecture difficile), et
pendant 24 h ± 2 h supplémentaires (qui peuvent favoriser le développement de colonies et d’un halo
opaque), examiner les boîtes de Petri (9.2.3) pour détecter les colonies présumées de L. monocytogenes
(voir en 9.3.2) et/ou de Listeria spp. (voir 9.3.3).
9.3.2 Considérer comme L. monocytogenes les colonies bleues-vertes entourées d’un halo opaque
(colonies typiques). Les colonies de L. ivanovii sont également bleues-vertes et entourées d’un halo opaque.
NOTE 1 Certaines souches de L. monocytogenes exposées à des conditions de stress, en particulier à un stress
acide, peuvent être entourées d’un halo très faible (ou même ne montrer aucun halo).
NOTE 2 De rares souches de L. monocytogenes sont caractérisées par une activité PI-PLC (phosphatidylinositol
phospholipase C) lente. De telles bactéries sont détectées lorsque la durée totale de l’incubation est plus longue,
[10]
par exemple 4 jours. Certaines de ces souches peuvent être pathogènes . Aucune souche de L. monocytogenes
n’a été décrite comme étant négative à la phosphatidylinositol phospholipase C.
9.3.3 Considérer comme des Listeria spp. présomptives les colonies bleues-vertes avec ou sans
halo opaque.
NOTE Certains organismes autres que Listeria spp. peuvent donner des colonies bleues sur ce milieu. Voir
l’Annexe C.
9.3.4 Compter toutes les colonies présumées de L. monocytogenes (9.3.2) dans chaque boîte de Petri
contenant moins de 150 colonies caractéristiques de L. monocytogenes, ou moins de 360 colonies
caractéristiques de L. monocytogenes si des boîtes de Petri de 140 mm sont utilisées.
9.3.5 Compter toutes les colonies présumées de Listeria spp. (9.3.3.) dans chaque boîte de
Petri contenant moins de 150 colonies caractéristiques de Listeria spp., ou moins de 360 colonies
caractéristiques de Listeria spp. si des boîtes de Petri de 140 mm sont utilisées.
En cas de cultures mixtes de colonies bleues-vertes avec ou sans halo opaque, ou en cas de colonies
bleues-vertes avec des halos opaques de grande taille et se chevauchant, il est préférable de compter
les colonies dans chaque boîte de Petri contenant moins de 100 colonies caractéristiques de Listeria
spp., ou moins de 240 colonies caractéristiques de Listeria spp. si des boîtes de Petri de 140 mm sont
utilisées.
9.4 Confirmation de L. monocytogenes ou Listeria spp.
9.4.1 Sélection des colonies pour confirmation
9.4.1.1 Considérer chaque groupe de trois boîtes de Petri de 90 mm utilisé pour la suspension mère
comme une boîte.
Si une boîte présente moins de cinq colonies présumées, les prélever toutes pour la confirmation.
9.4.1.2 Pour la confirmation de L. monocytogenes présumées, prélever, à partir de chaque boîte de
Petri, représentant chaque dilution, cinq colonies au total, représentatives de chaque type de colonie
(par exemple, avec un halo de grande taille et avec un halo de petite taille).
Isoler les colonies sélectionnées à la surface de boîtes préalablement séchées de gélose non sélective,
par exemple de la gélose au sang, de la gélose nutritive, de la gélose tryptone soja et extrait de levure
(TSYEA) (B.1), de façon à permettre le développement de colonies isolées.
L’utilisation de gélose au sang en culture pure permet d’interpréter l’hémolyse, si positive, dès ce
stade (voir 9.4.2.5 et Annexe D). Si l’isolement sur gélose au sang ne présente pas d’hémolyse, alors la
recherche de l’hémolyse doit être réalisée par piqûre (9.4.2.5.2) ou dans un milieu liquide (9.4.2.5.3).
Placer les boîtes de Petri dans l’étuve réglée à 37 °C pendant 18 h à 24 h ou jusqu’à un développement
satisfaisant.
Si les colonies ne sont pas isolées, repiquer une colonie typique de L. monocytogenes sur une autre boîte
non sélective.
Effectuer les essais suivants (9.4.2) à partir de colonies d’une culture pure sur gélose non sélective.
9.4.1.3 Pour la confirmation de Listeria spp. présumées, prélever, à partir de chaque boîte de Petri,
représentant chaque dilution, cinq colonies au total, représentatives de chaque type de colonie (par
exemple, colonies de grande taille et de petite taille, avec ou sans halo).
Pour la confirmation de Listeria spp., utiliser des boîtes de TSYEA.
Isoler les colonies sélectionnées sur la surface de boîtes de TSYEA (B.1) préalablement séchées, de façon
à permettre le développement de colonies isolées.
Placer les boîtes de Petri dans l’étuve réglée à 37 °C pendant 18 h à 24 h ou jusqu’à un développement
satisfaisant.
Les colonies typiques de Listeria spp. Sur TSYEA, sont de 1 mm à 2 mm de diamètre, convexes, incolores
et opaques à bords réguliers. Lorsque les boîtes sont placées à la lumière (artificielle ou naturelle) à un
angle de 45 degrés environ, les colonies présentent une couleur bleu-gris et une surface granuleuse.
Si les colonies ne sont pas isolées, repiquer une colonie typique de Listeria spp. sur une autre boîte non
sélective.
Effectuer les essais suivants (9.4.3) à partir de colonies typiques d’une culture pure sur TSYEA.
9.4.2 Confirmation de L. monocytogenes
9.4.2.1 Généralités
Effectuer les essais de confirmation de L. monocytogenes. Des souches témoins positives et négatives
appropriées doivent être utilisées pour chaque test de confirmation.
Effectuer au moins les essais obligatoires répertoriés (en gras) dans le Tableau 1.
Tableau 1 — Essais de confirmation de L. monocytogenes
Essais Essais de confirmation de L. monocytogenes Résultats
Obligatoires Bêta-hémolyse (9.4.2.4) +
L-Rhamnose (9.4.2.7) +
D-Xylose (9.4.2.7) -
Facultatifs Aspect microscopique (9.4.3.4) Bacilles fins et courts ou coccobacilles
Catalase (9.4.2.2) +
Mobilité à 25 °C (9.4.2.3) +
Test de CAMP (9.4.2.6) +
Des détails sur les résultats des essais de confirmation sont disponibles dans l’Annexe D.
NOTE Un autre mode opératoire comme mentionné dans l’ISO 7218 peut être utilisé pour confirmer que
l’isolat appartient à l’espèce Listeria monocytogenes, à condition de vérifier que le mode opératoire est bien
approprié.
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Il est possible d’utiliser des galeries d’identification miniaturisées pour l’examen biochimique des
Listeria monocytogenes, si leur fiabilité est démontrée (voir l’ISO 7218).
De rares souches de L. monocytogenes ne présentent pas de bêta-hémolyse ou de réaction positive au
test de CAMP dans les conditions décrites dans le présent document. Si des colonies typiques sur gélose
Listeria selon Ottaviani et Agosti avec une activité PI-PLC, même faible, sont négatives pour l’hémolyse,
il est recommandé d’effectuer d’autres essais (par exemple, coloration de Gram, catalase, mobilité, test
de CAMP, PCR) afin de déterminer si cet isolat est une L. monocytogenes non hémolytique.
9.4.2.2 Réaction de la catalase (facultative)
Prélever une colonie isolée obtenue en 9.4.1 et la mettre en suspension sur une lame dans une goutte de
solution de peroxyde d’hydrogène (B.3). La formation immédiate de bulles de gaz indique une réaction
positive.
NOTE Une réaction de la catalase effectuée à partir d’une colonie originaire d’une gélose au sang peut parfois
donner des résultats faux positifs.
9.4.2.3 Examen de la mobilité (facultatif)
Prélever une colonie isolée obtenue en 9.4.1 et la mettre en suspension dans un tube contenant un
milieu liquide nutritif non sélectif.
Incuber dans une étuve (6.3) réglée à 25 °C pendant 8 h à 24 h jusqu’à ce que le milieu devienne trouble.
Prélever une goutte de la culture précédente, à l’aide d’une anse bouclée (6.5), sur une lame propre de
microscope. Recouvrir avec une lamelle et examiner au microscope (6.10).
Les Listeria spp. (y compris L. monocytogenes) apparaissent sous forme de bacilles fins et courts, et sont
animées d’une mobilité en «pirouette».
Ce type de mobilité n’est parfois pas constaté pour les cultures incubées à une température supérieure
à 25 °C. Comparer toujours le résultat avec une culture connue. Les coques, les grands bacilles ou les
bacilles qui se déplacent rapidement ne sont pas des Listeria spp.
Pour examiner la mobilité, il est également possible, en utilisant un inoculateur (6.5), de prélever un
fragment de colonie isolée obtenue sur gélose non sélective et de le diluer dans de l’eau stérile (ou tout
autre diluant approprié). Les Listeria spp. (y compris L. monocytogenes) apparaissent sous forme de
bacilles fins et courts, et sont animées d’une mobilité en « pirouette ».
Une autre possibilité pour examiner la mobilité est d’ensemencer, par piqûre avec un fil droit (6.5),
une gélose mobilité (B.4) à partir d’une culture d’une colonie typique obtenue en 9.4.1. Incuber à 25 °C
pendant 48 h ± 2 h.
Examiner le développement autour de la piqûre. Les Listeria spp. sont mobiles et donnent une culture
typique en forme de parapluie. Si le développement n’est pas suffisant, incuber jusqu’à cinq jours
supplémentaires et observer à nouveau la piqûre.
[3],[6],[9],[11],[20],[24],[25]
NOTE Certaines nouvelles espèces de Listeria ont été isolées récemment . La plupart
d’entre elles ne sont pas mobiles dans la gélose mobilité.
9.4.2.4 Aspect microscopique (facultatif)
Effectuer une préparation microscopique (par exemple, coloration de Gram, état frais) sur une colonie
isolée obtenue en 9.4.1. Les Listeria spp. (y compris L. monocytogenes) apparaissent sous forme de
bacilles fins et courts Gram positifs (si cette coloration est réalisée) ou de coccobacilles animés d’une
mobilité «en pirouette» lorsqu’ils proviennent d’une culture fraîche.
Pour la préparation microscopique destinée à la coloration de Gram, voir l’ISO 7218.
9.4.2.5 Recherche de l’hémolyse
9.4.2.5.1 Généralités
Choisir l’une des méthodes de recherche de l’hémolyse (9.4.2.5.2 ou 9.4.2.5.3).
NOTE Il existe de rares souches de L. monocytogenes qui ne présentent pas de β-hémolyse ou de réaction
positive au test de CAMP dans les conditions décrites dans le présent document.
9.4.2.5.2 Hémolyse sur gélose au sang
Si les caractéristiques physiologiques et morphologiques indiquent la présence éventuelle de
Listeria spp., inoculer les boîtes de gélose au sang (B.5) pour observer la réaction hémolytique.
Avant emploi, sécher soigneusement la surface de la gélose. À l’aide d’un fil droit (6.5), prélever une
colonie isolée obtenue en 9.4.1 puis ensemencer par piqûre une section de gélose. Répéter l’opération
pour chaque culture. Si possible dans la même boîte, ensemencer simultanément par piqûre les
cultures témoins positives (L. monocytogenes) et négatives (L. innocua). Par exemple, L. monocytogenes
4b WDCM 00021 ou L. monocytogenes 1/2a WDCM 00109 et L. innocua WDCM 00017 peuvent être
utilisées.
Après incubation à 37 C (6.3) pendant 24 h ± 2 h, examiner les souches d’essai et les souches témoins.
Les L. monocytogeneses présentent des zones étroites, claires et légères d’hémolyse; les L. innocua ne
présentent pas de zone claire autour de la piqûre. Les L. seeligeri présentent la plupart du temps une
faible zone d’hémolyse. Les L. ivanovii présentent habituellement de larges zones d’hémolyse nettement
délimitées. Examiner les boîtes sous une lumière vive pour comparer les cultures d’essai aux témoins.
NOTE 1 La réaction hémolytique est mieux observée en enlevant toute colonie qui s’est développée à la surface
de la gélose autour de la piqûre d’inoculum.
NOTE 2 La recherche de l’hémolyse peut être effectuée en ensemençant par piqûre la boîte de gélose au sang
utilisée pour le test de CAMP.
9.4.2.5.3 Réaction hémolytique à l’aide d’hématies
La réaction hémolytique peut également être déterminée en utilisant des hématies de la façon suivante.
Disperser la colonie dans 150 µl d’un milieu nutritif liquide non sélectif et incuber à 37 °C (6.3) pendant
2 h. Ajouter 150 µl d’une suspension d’hématies (B.7). Incuber à 37 °C (6.3) pendant 15 min à 60 min,
puis réfrigérer à 5 °C (6.11) pendant 2 h environ. Examiner la réaction d’hémolyse. Si la réaction est non
définie, laisser à 5 °C (6.11) jusqu’à 24 h ± 2 h. Une sédimentation des hématies (formation d’un point
rouge au fond des tubes) indique une réaction négative.
Inclure les témoins positifs et négatifs. Pour les souches témoins, voir en 9.4.2.5.2.
9.4.2.6 Test de CAMP (facultatif)
Si le résultat de la recherche de l’hémolyse est difficile à interpréter, il est recommandé d’effectuer le
test de CAMP pour démontrer clairement que l’hémolyse est due à l’activité de la listériolysine.
Une souche β-hémolytique de Staphylococcus aureus (par exemple, WDCM 00034) et une souche de
Rhodococcus equi (par exemple, WDCM 0028) sont nécessaires pour effectuer le test de CAMP. Toutes
les souches de S. aureus ne sont pas adaptées au test de CAMP. Ensemencer une strie à partir de chacune
des cultures de S. aureus et R. equi d’un bord à l’autre de la boîte de gélose au sang (B.5 ou B.8.4) afin que
les deux cultures soient parallèles et diamétralement opposées (voir la Figure 1). Il est nécessaire que
l’inoculum soit étroit et régulier. Pour cela, pendant l’ensemencement, maintenir l’anse bouclée ou le fil
droit (6.5) perpendiculaire à la gélose.
De façon similaire et perpendiculairement à ces cultures, ensemencer une colonie bien isolée de
la souche d’essai (9.4.1) de manière que la culture d’essai et les cultures de S. aureus et R. equi ne se
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touchent pas mais ne soient éloignées que de 1 mm à 2 mm environ. Plusieurs souches d’essai peuvent
être ensemencées dans la même boîte.
Légende
1 bande étroite de ß-hémolyse 4 L. monocytogenes
2 pas d’hémolyse 5 L. innocua
3 bande large de ß-hémolyse 6 L. ivanovii
Figure 1 — Inoculation et interprétation des boîtes pour le test de CAMP
Les lignes verticales de la Figure 1 représentent les stries de S. aureus (S) et R. equi (R). Les lignes
horizontales représentent les stries des cultures d’essai. Les parties hachurées indiquent le
développement de zones d’hémolyse.
La partie en pointillés indique la zone d’influence de la culture de S. aureus.
Ensemencer en même temps des cultures témoins de L. monocytogenes, L. innocua et L. ivanovii. Par
exemple, L. monocytogenes 4b WDCM 00021, L. monocytogenes 1/2a WDCM 00109, L. innocua WDCM
00017 et L. ivanovii WDCM 00018 peuvent être utilisées. Pour la conservation des cultures mères, voir
l’ISO 11133. Si la gélose au sang (B.5) est utilisée, incuber les boîtes à 37 °C pendant 18 h à 24 h.
Si des boîtes à double couche (B.8.4) sont utilisées, les incuber à 37 °C pendant 12 h à 18 h.
La réaction positive avec R. equi se traduit par la présence d’une large zone d’hémolyse (5 mm à 10 mm)
en «pelle». De petites zones de faible hémolyse s’étendant sur seulement environ 1 mm, à l’intersection
de la souche d’essai avec la zone de diffusion de la culture de R. equi, sont considérées comme des
réponses négatives.
Une réaction positive avec S. aureus apparaît sous la forme d’un développement d’une petite zone
d’hémolyse ne s’étendant que sur 2 mm environ de la souche d’essai et dans la zone légèrement
hémolytique due à la croissance de la culture de S. aureus. Il ne se produit pas de larges zones d’hémolyse
dans la zone entre S. aureus et L. monocytogenes.
9.4.2.7 Utilisation des glucides
Inoculer, à l’aide d’une anse bouclée (6.5), chaque bouillon pour l’utilisation des glucides (B.9) avec
les cultures obtenues à partir de la gélose non sélective (9.4.1). Incuber à 37 °C. La formation d’une
coloration jaune indique une réaction positive (formation d’acide) qui se produit généralement au
bout de 24 h à 48 h pour les tubes à microvolume et jusqu’à cinq jours pour les tubes à macrovolume.
Le L-Rhamnose et le D-Xylose sont utilisés pour confirmer la présence de L. monocytogenes, qui sont
positives au L-Rhamnose et négatives au D-Xylose (voir l’Annexe D).
[12][15]
NOTE Il existe de rares souches de L. monocytogenes qui ne fermentent pas le L-Rhamnose .
En microvolumes, les réactions sont plus rapides. Le niveau d’inoculation par rapport au volume total
est un facteur important. Pour chaque protocole choisi, il est important de vérifier le temps pris pour
obtenir une coloration jaune. Il est conseillé d’utiliser des témoins. Par exemple, L. monocytogenes 4b
WDCM 00021, L. innocua WDCM 00017 et L. ivanovii WDCM 00018 peuvent être utilisés. Conserver les
cultures mères comme indiqué dans l’ISO 11133.
9.4.3 Confirmation de Listeria spp.
9.4.3.1 Généralités
Effectuer les essais de confirmation de Listeria spp. à partir de colonies typiques (9.4.1.3). Des souches
témoins positives et négatives appropriées doivent être utilisées pour chaque essai de confirmation.
Effectuer au moins les essais obligatoires répertoriés (en gras) dans le Tableau 2.
Si l’identification des espèces de Listeria est exigée, voir l’Annexe D pour les essais supplémentaires à
réaliser.
Tableau 2 — Essais de confirmation de Listeria spp.
Essais Listeria spp. Résultats
Obligatoires Aspect microscopique (9.4.2.2) Bacilles fins et courts ou coccobacilles
Catalase (9.4.2.2) +
Facultatifs Test VP (9.4.3.5) +
Mobilité à 25 °C (9.4.2.3) +
NOTE 1 Un autre mode opératoire tel que mentionné dans l’ISO 7218 peut être utilisé pour confirmer que
l’isolat appartient aux Listeria spp., à condition de vérifier que le mode opératoire est bien approprié.
NOTE 2 Il est possible que certaines nouvelles espèces de Listeria récemment isolées ne correspondent pas à
ce schéma, en particulier pour la mobilité, le test VP et la croissance à 37 °C (voir, par exemple, les Références [3],
[6], [9], [11], [20], [24] et [25]).
9.4.3.2 Réaction de la catalase
Prélever une colonie isolée obtenue en 9.4.1 et réaliser l’essai comme décrit dans 9.4.2.2.
9.4.3.3 Examen de la mobilité (facultatif)
Prélever une colonie isolée obtenue en 9.4.1 et réaliser l’essai comme décrit dans 9.4.2.3.
9.4.3.4 Aspect microscopique
Prélever une colonie isolée obtenue en 9.4.1 et réaliser l’essai comme décrit dans 9.4.2.4.
9.4.3.5 Réaction de Voges–Proskauer (VP) (facultatif)
À l’aide d’une anse bouclée (6.5), inoculer un tube contenant 3 ml du milieu VP (B.10.1). Incuber à 37 °C
pendant 24 h ± 2 h. Après incubation, ajouter 0,6 ml de solution d’α-naphtol à 5 % (B.10.2) et 0,2 ml de
solution d’hydroxyde de potassium à 40 % (B.10.3). Bien agiter et incliner le tube (pour augmenter la
zone d’interface air-liquide). Examiner après 15 min et 1 h. Une couleur rouge prononcée indique une
réaction positive. Les Listeria spp. sont positives au test VP.
[3],[6],[9],[11],[20],[24],[25]
NOTE Certaines nouvelles espèces de Listeria ont été isolées récemment . La plupart
d’entre elles sont négatives au test VP.
10 © ISO 2017 – Tous
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記事のタイトル: ISO 11290-2:2017 - 食品チェーンの微生物学 - リステリア・モノサイトゲネスおよびリステリア種の検出と数え上げのための水平法 - 第2部: 数え上げ法 記事の内容: ISO 11290-2:2017は、L. monocytogenesおよびリステリア種（L. monocytogenesを含む）の数え上げのための水平法を規定しています。ISO 11290-2:2017は、人間の摂取用製品および動物の飼料、および食品生産および取り扱いのエリアにおける環境サンプルに適用されます。
기사 제목: ISO 11290-2:2017 - 식품 유형의 미생물학적 과정 - 리스테리아 목놈 락토바실러 종의 검출 및 계수를 위한 수평 방법 - 파트 2: 계수 방법 기사 내용: ISO 11290-2:2017은 리스테리아 목놈 락토바실러 종과 리스테리아 종의 검출과 계수를 위한 수평 방법을 규정합니다. ISO 11290-2:2017은 인간의 소비를 위한 제품과 동물 사료, 그리고 식품 생산 및 핸들링 영역에서의 환경 샘플에 적용됩니다.
기사 제목: ISO 11290-2:2017 - 식품 연쇄의 미생물학 - 리스테리아 목을 모노시토제네스 및 리스테리아 종의 탐지와 열거에 대한 수평 방법 - 제2부: 열거 방법 기사 내용: ISO 11290-2:2017은 L. monocytogenes 및 Listeria spp. (L. monocytogenes 포함)의 열거에 대한 수평 방법을 명시하고 있다. ISO 11290-2:2017은 인간 소비용 제품과 동물 사료를 포함한 환경 샘플과 식품 생산 및 처리 영역에서 적용된다.
記事のタイトル：ISO 11290-2:2017 - 食品連鎖の微生物学的方法 - リステリアモノサイトゲネスおよびリステリア種の検出と数え上げのための水平法 - 第2部: 数え上げ法 記事の内容：ISO 11290-2:2017は、リステリアモノサイトゲネスおよびリステリア種（リステリアモノサイトゲネスを含む）の検出と数え上げのための水平法を規定しています。ISO 11290-2:2017は、人間の消費および動物の餌に適用される製品、および食品の生産および取り扱いの領域での環境サンプルに適用されます。
The article discusses ISO 11290-2:2017, which is a standard method for detecting and counting Listeria monocytogenes and Listeria spp. in food and environmental samples. This method is applicable to products for human consumption and animal feed, as well as samples from food production and handling areas.
The article discusses ISO 11290-2:2017, which is a standard that provides a method for detecting and counting Listeria monocytogenes and Listeria spp. in food and environmental samples. It is relevant for products meant for human consumption and animal feed, as well as in food production and handling areas.
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