ISO/TS 17919:2013

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 17919
Première édition
2013-11-01
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Réaction de
polymérisation en chaîne (PCR)
pour la détection de micro-
organismes pathogènes dans les
aliments — Détection des clostridies
productrices de neurotoxine
botulique de type A, B, E et F
Microbiology of the food chain — Polymerase chain reaction (PCR)
for the detection of food-borne pathogens — Detection of botulinum
type A, B, E and F neurotoxin-producing clostridia
Numéro de référence
©
ISO 2013
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Symboles et termes abrégés . 2
4.1 Symboles . 2
4.2 Termes abrégés . 2
5 Principes . 2
5.1 Généralités . 2
5.2 Enrichissement microbien . 2
5.3 Extraction des acides nucléiques . 2
5.4 Amplification par PCR. 2
5.5 Détection des produits PCR . 2
5.6 Confirmation . 3
6 Réactifs . 3
6.1 Généralités . 3
6.2 Milieux de culture . 3
6.3 Extraction des acides nucléiques . 4
6.4 Réactifs pour la PCR. 5
7 Appareillage et matériel . 5
7.1 Généralités . 5
7.2 Matériel pour la préparation des échantillons avant enrichissement . 5
7.3 Matériel pour l’enrichissement microbien . 6
7.4 Matériel utilisé pour l’extraction des acides nucléiques . 6
7.5 Matériel utilisé pour la PCR . 6
7.6 Matériel utilisé pour la détection des produits PCR . 6
8 Échantillonnage . 7
9 Mode opératoire. 7
9.1 Préparation de l’échantillon avant enrichissement . 7
9.2 Enrichissement microbien . 7
9.3 Préparation des acides nucléiques . 8
9.4 Amplification par PCR. 9
9.5 Confirmation d’un résultat PCR positif . 9
Annexe A (normative) Schéma du mode opératoire .11
Annexe B (informative) Réactions de PCR multiplex pour la détection de gènes codant les types A,
B, E et F de la neurotoxine botulique utilisant une électrophorèse en gel d’agarose .12
Annexe C (informative) Essais pour la détection des gènes codant les types A, B, E et F de
neurotoxine botulique utilisant la PCR en temps réel .30
Annexe D (informative) Préparation des spores de C. botulinum .42
Bibliographie .48
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives
ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.
Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
Dans d’autres circonstances, en particulier lorsqu’il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d’autres types de documents:
— une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts
dans un groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 %
des membres votants du comité dont relève le groupe de travail;
— une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d’un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l’objet d’un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour
trois nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu’une ISO/PAS
ou ISO/TS a été confirmée, elle fait l’objet d’un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa
transformation en Norme internationale soit de son annulation.
L’ISO/TS 17919 a été élaborée par le Comité européen de normalisation (CEN) comité technique
CEN/TC 275 Analyse des produits alimentaires — Méthodes horizontales, en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à l’Accord de
coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
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Introduction
Les clostridies productrices de neurotoxine botulique sont ubiquitaires dans l’environnement. Elles sont
à l’origine du botulisme, une affection neuroparalytique sévère due à l’action de neurotoxines botuliques
(BoNT). À ce jour, sept sérotypes différents de BoNT (types A à G) ainsi qu’un certain nombre de leurs
sous-types ont été identifiés.
Les principales BoNT responsables du botulisme chez l’Homme sont celles du type A (BoNT/A), du
type B (BoNT/B), du type E (BoNT/E) et du type F (BoNT/F) et la présente Spécification technique
traite des gènes codant ces toxines. Les clostridies productrices de BoNT des types A, B, E et F sont
classées en quatre groupes distincts sur le plan physiologique (Groupe I Clostridium botulinum, Groupe II
C. botulinum, C. baratii, C. butyricum).
L’Organisation internationale de normalisation (ISO) attire l’attention sur le fait qu’il est déclaré que la
conformité avec les dispositions du présent document peut impliquer l’utilisation de brevets.
L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à la portée de ces droits de propriété.
Le détenteur de ces droits de propriété a donné l’assurance à l’ISO qu’il consent à négocier des licences
avec des demandeurs du monde entier, soit gratuites, soit à des termes et conditions raisonnables et non
discriminatoires. À ce propos, la déclaration du détenteur des droits de propriété est enregistrée à l’ISO.
Des informations peuvent être demandées à:
Applied Biosystems, LLC
Scott Miller, Legal Department
5781 Van Allen Way
CARLSBAD
CA 92008
États-Unis
Tel: +1 760 476 4387
Fax: +1 760 476 6048
email: Scott.miller@lifetechnologies.com
L’attention est d’autre part attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent
faire l’objet de droits de propriété autres que ceux qui ont été mentionnés ci-dessus. L’ISO ne saurait être
tenue pour responsable de l’identification de ces droits de propriété en tout ou partie.
L’ISO (www.iso.org/brevets) tient à jour des bases de données en ligne des droits de propriété relatifs à
ses documents. Les utilisateurs sont invités à consulter les bases de données pour avoir l’information la
plus à jour sur les droits de propriété.
SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 17919:2013(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Réaction de
polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection de
micro-organismes pathogènes dans les aliments —
Détection des clostridies productrices de neurotoxine
botulique de type A, B, E et F
1 Domaine d’application
La présente Spécification technique spécifie une méthode horizontale de détection moléculaire des
clostridies portant les gènes A, B, E et F de neurotoxine botulique par réaction de polymérisation en
chaîne (PCR). Cette méthode détecte les gènes, et non les toxines. Par conséquent, un résultat positif
n’est pas nécessairement synonyme de présence de ces toxines dans l’échantillon examiné. La présente
Spécification technique s’applique aux produits destinés à être consommés par l’Homme, aux aliments
pour animaux et aux échantillons environnementaux.
La réaction de PCR de détection des séquences génétiques codant ces types particuliers de toxine est
décrite dans les Annexes B et C.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de
la suspension mère et des dilutions décimales
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments et de l’eau — Préparation, production, stockage et essais de
performance des milieux de culture
ISO 20837, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection des
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences relatives à la préparation des échantillons
pour la détection qualitative
ISO 20838:2006, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection
des micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences relatives à l’amplification et à la détection
pour les méthodes qualitatives
ISO 22174, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 22174 s’appliquent.
4 Symboles et termes abrégés
4.1 Symboles
c concentration de la substance
ρ concentration massique
φ fraction volumique
w fraction massique
4.2 Termes abrégés
BoNT botulinum neurotoxin (neurotoxine botulique)
5 Principes
5.1 Généralités
La méthode comprend les étapes consécutives suivantes:
a) enrichissement microbien (voir 5.2);
b) extraction des acides nucléiques (voir 5.3);
c) amplification (voir 5.4);
d) détection des produits PCR (voir 5.5);
e) confirmation (voir 5.6).
NOTE Une PCR en temps réel combine les étapes c) à e).
5.2 Enrichissement microbien
Le nombre de clostridies productrices de BoNT (spores ou cellules végétatives) à détecter est augmenté
par incubation favorisant leur germination et leur développement dans un milieu nutritif liquide non
sélectif, à savoir le bouillon tryptone-peptose-glucose à l’extrait de levure dans des conditions anaérobies.
5.3 Extraction des acides nucléiques
Les cellules bactériennes sont séparées du milieu nutritif et sont lysées, puis les acides nucléiques sont
extraits afin d’être analysés par PCR.
5.4 Amplification par PCR
L’acide nucléique extrait est transféré au mélange PCR et l’amplification est effectuée dans un
thermocycleur.
5.5 Détection des produits PCR
Les produits PCR sont détectés par électrophorèse en gel ou une autre méthode appropriée.
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5.6 Confirmation
L’identité des produits PCR doit être confirmée par une méthode appropriée (par exemple séquençage,
hybridation ou analyse de restriction).
6 Réactifs
6.1 Généralités
Pour toutes les étapes 5.1 b) à e), utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et
des consommables adaptés aux applications de biologie moléculaire, tel que spécifié dans l’ISO 20837
et l’ISO 20838.
Les exigences relatives aux réactifs spécifiées dans l’ISO 20838:2006, Article 5, s’appliquent.
6.2 Milieux de culture
6.2.1 Généralités
Suivre l’ISO 11133 pour la préparation, la production et les essais de performance des milieux de culture.
6.2.2 Diluant
[9]-[13]
Suivre l’ISO 6887-1 et la partie pertinente de l’ISO 6887 traitant du produit à examiner.
6.2.3 Milieu d’enrichissement non sélectif, bouillon tryptone-peptone-glucose-extrait de levure
(bouillon TPGY) (Référence [7])
6.2.3.1 Généralités
Un autre milieu d’enrichissement non sélectif validé peut être utilisé à condition que l’équivalence de ses
performances soit démontrée.
6.2.3.2 Composition et pH
Tryptone 50 g
Peptone 5 g
Extrait de levure 20 g
d-Glucose 4 g
Thioglycolate de sodium, HSCH COONa 1 g
Eau qsp 1 000 ml
pH 7,0 ± 0,2
6.2.3.3 Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau par ébullition. Après stérilisation, ajuster le pH à 7,0 ± 0,2 à 25 °C.
Verser la base dans des fioles ou flacons de capacité appropriée. Stériliser pendant 15 min à 121 °C.
Conserver au réfrigérateur à 5 °C ± 3 °C. Jeter tout le milieu qui n’a pas été utilisé dans les 4 semaines
suivant la préparation.
6.2.4 Bouillon TPGY tamponné — uniquement pour les aliments acides et acidifiants
6.2.4.1 Solution mère (tampon phosphate)
6.2.4.1.1 Solution 1
Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté [NaH PO , H O] 138 g
2 4 2
Eau qsp 1 000 ml
6.2.4.1.2 Solution 2
Hydrogénophosphate de disodium [Na HPO ] 142 g
2 4
Eau qsp 1 000 ml
6.2.4.1.3 Préparation
Dissoudre les composants dans l’eau par ébullition. À 250 ml de la solution 1, ajouter la solution 2 jusqu’à
ce que le pH atteigne 7,2. Conserver au réfrigérateur à 5 °C ± 3 °C.
6.2.4.2 Préparation du milieu complet
Dissoudre les composants spécifiés pour la base (6.2.3.2) dans 500 ml d’eau par ébullition. Ajouter 100 ml
de tampon phosphate (6.2.4.1). La concentration finale en phosphate du milieu complet est de 0,1 mol/l.
Ajouter de l’eau pour un volume final de 1 000 ml. Verser le milieu complet dans des fioles ou flacons de
capacité appropriée. Stériliser pendant 15 min à 121 °C. Conserver au réfrigérateur à 5 °C ± 3 °C. Jeter
tout le milieu qui n’a pas été utilisé dans les 4 semaines suivant la préparation.
6.3 Extraction des acides nucléiques
6.3.1 Chloroforme, CHCl .
6.3.2 Éthanol, φ(C H OH) = 96 %.
2 5
6.3.3 Acide éthylènediaminetétraacétique, sel disodique (Na EDTA), C H N O Na .
2 10 14 2 8 2
6.3.4 Bromure d’hexadécyltriméthylammonium (CTAB), C H BrN.
19 42
6.3.5 Acide chlorhydrique, φ(HCl) = 37 %.
6.3.6 Isopropanol, CH CH(OH)CH .
3 3
6.3.7 Protéinase-K, approximativement 20 unités/mg de lyophilisat.
6.3.8 Chlorure de sodium, NaCl.
6.3.9 Hydroxyde de sodium, NaOH.
6.3.10 Tris(hydroxyméthyle) aminométhane (tris), C H NO .
4 11 3
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6.3.11 Tampon d’extraction au CTAB, ρ(CTAB) = 20 g/l, c(NaCl) = 1,4 mol/l, c(tris) = 0,1 mol/l,
c(Na EDTA) = 0,02 mol/l.
Ajuster à pH 8,0 avec HCl ou NaOH.
6.3.12 Tampon de précipitation au CTAB, ρ(CTAB) = 5 g/l, c(NaCl) = 0,04 mol/l.
6.3.13 Solution de chlorure de sodium, c(NaCl) = 1,2 mol/l.
6.3.14 Solution d’éthanol, φ(C H OH) = 70 %.
2 5
6.3.15 Solution de protéinase-K, ρ = 20 mg/ml, dissous dans de l’eau stérile.
Ne pas stériliser à l’autoclave. Conserver à −20 °C, mais éviter les décongélations/congélations répétées.
6.3.16 Tampon tris-EDTA(TE), c(tris) = 0,01 mol/l, c(Na EDTA) = 0,001 mol/l.
Ajuster à pH 8,0 avec HCl ou NaOH.
6.4 Réactifs pour la PCR
6.4.1 ADN polymérase thermostable, comme spécifié dans l’ISO 20838 et l’ISO 22174.
6.4.2 Désoxynucléotidetriphosphates (dNTP), contenant dATP, dCTP, dGTP et dTTP ou dUTP, comme
spécifié dans l’ISO 20838 et l’ISO 22174.
6.4.3 Solution tampon pour la PCR, comme spécifié dans l’ISO 20838 et l’ISO 22174.
La solution tampon pour la PCR contient habituellement l’ADN polymérase. Elle est susceptible de
contenir ou pas du MgCl dont la concentration est spécifiée par le fabricant. Les teneurs finales en
MgCl dépendent de la méthode et sont, par conséquent, mentionnées dans les annexes. Des réactifs
prêts à l’emploi peuvent être disponibles dans le commerce. Si cela est le cas. suivre les instructions
d’utilisation du fabricant.
6.4.4 Amorces et sondes
Les amorces et les sondes utilisées pour la détection particulière des séquences de gènes de neurotoxines
sont répertoriées dans les Annexes B et C.
7 Appareillage et matériel
7.1 Généralités
Matériel courant de microbiologie (voir l’ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.
7.2 Matériel pour la préparation des échantillons avant enrichissement
7.2.1 Bain-marie, pouvant être maintenu à 50 °C ± 1 °C.
7.2.2 Centrifugeuse, pour tubes à centrifuger de 50 ml et de 100 ml et avec accélération réglable
jusqu’à 12 000g.
7.2.3 Filtre à membrane, filtre de nitrocellulose, taille des pores 0,45 µm.
7.2.4 Tubes à centrifuger, d’une capacité de 50 ml et de 100 ml.
7.3 Matériel pour l’enrichissement microbien
7.3.1 Bains-marie, pouvant être maintenus à 30 °C ± 1 °C, 65 °C ± 1 °C et 100 °C ± 1 °C.
7.3.2 Jarre ou enceinte anaérobie, pouvant être maintenue à 30 °C ± 1 °C, conformément à l’ISO 7218.
7.3.3 Incubateur, pouvant fonctionner à 30 °C ± 1 °C.
7.3.4 Fioles ou flacons, de capacité appropriée.
7.4 Matériel utilisé pour l’extraction des acides nucléiques
Matériel approprié conformément à l’ISO 20837 et, en particulier, ce qui suit.
7.4.1 Tubes pour centrifugeuse, d’une capacité de 1,5 ml et de 2,0 ml.
7.4.2 Bloc chauffant, avec une vitesse d’agitation comprise entre 300 r/min et 1 400 r/min.
7.4.3 Pipettes graduées et pointes à filtres, pour des volumes compris entre 1 µl et 1 000 µl.
7.4.4 Centrifugeuse, pour des tubes à essai d’une capacité de 1,5 ml et 2,0 ml, par exemple
microcentrifugeuse, pouvant atteindre une accélération de 12 000g.
7.4.5 Mélangeur, par exemple de type vortex.
7.5 Matériel utilisé pour la PCR
Matériel approprié selon la méthode et, en particulier, ce qui suit.
7.5.1 Pipettes et pointes à filtres, d’une capacité comprise entre 1 µl et 1 000 µl.
7.5.2 Tubes pour centrifugeuse, d’une capacité de 1,5 ml et 2,0 ml.
7.5.3 Microtubes de PCR à parois fines (tubes à essai de 0,2 ml ou de 0,5 ml), microplaques PCR
multipuits ou autre matériel adapté.
7.5.4 Thermocycleur.
7.6 Matériel utilisé pour la détection des produits PCR
Matériel approprié selon la méthode et, en particulier, ce qui suit.
7.6.1 PCR par analyse en point final
7.6.1.1 Système pour électrophorèse en gel horizontal.
7.6.1.2 Alimentation électrique.
7.6.1.3 Révélateur à ultraviolets (UV) ou caisson à UV.
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7.6.1.4 Système de documentation de gel.
7.6.2 PCR en temps réel
7.6.2.1 Thermocycleur de PCR en temps réel.
7.6.2.2 Logiciel de détection et d’analyse approprié.
8 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Spécification technique.
S’il n’existe aucune Norme internationale traitant de l’échantillonnage du produit concerné, il est
recommandé que les parties concernées concluent un accord à ce sujet.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou
modifié lors du transport ou du stockage.
9 Mode opératoire
9.1 Préparation de l’échantillon avant enrichissement
9.1.1 Généralités
Voir Figure A.1.
Il est recommandé d’analyser au moins 25 g, notamment pour les échantillons de miel. Cependant, si
l’approvisionnement est limité, des tailles d’échantillon plus petites peuvent être utilisées.
9.1.2 Préparation de l’échantillon
[9]-[13]
Préparer et homogénéiser l’échantillon conformément à l’ISO 6887-1 et aux parties de l’ISO 6887
correspondant à la matrice concernée.
9.1.3 Préparation des échantillons de miel
Placer le récipient contenant le miel au bain-marie (7.2.1) à 50 °C ± 1 °C pendant 30 min pour ramollir le
miel. Retourner le récipient plusieurs fois pour mélanger l’échantillon.
Peser 25 g ± 2 g de miel dans un tube de centrifugeuse stérile d’une capacité de 100 ml (7.2.4) et ajouter au
minimum 50 ml d’eau distillée ou déionisée stérile contenant 1 % (fraction volumique) de polysorbate 80,
préchauffée à 50 °C ± 1 °C. Mélanger jusqu’à obtenir une solution homogène. Centrifuger le mélange
à 12 000g (7.2.2) pendant 30 min. Retirer avec précaution le surnageant et le passer dans un filtre à
membrane de 0,45 µm (7.2.3). Si le filtre se bouche, filtrer tout surnageant restant à l’aide d’un filtre neuf.
Conserver tous les filtres pour les prochaines étapes. Conserver temporairement le sédiment à 5 ± 3 °C.
9.2 Enrichissement microbien
9.2.1 Inoculation
9.2.1.1 Généralités
Retirer l’oxygène dissous du milieu d’enrichissement (6.2) par ébullition pendant 10 min à 15 min au
bain-marie (7.3.1).
Si l’échantillon est acide ou acidifiant, le bouillon d’enrichissement doit être préparé conformément à 6.2.4.
9.2.1.2 Inoculation de la prise d’essai
9.2.1.2.1 Cas de l’analyse des cellules végétatives et des spores
Ajuster la température du milieu d’enrichissement à 30 °C ± 1 °C au bain-marie (7.3.1). Transférer la
−1
prise d’essai dans le milieu d’enrichissement dégazé de manière à obtenir une dilution finale de 10 .
9.2.1.2.2 Cas de l’analyse des spores uniquement
Ajuster la température du milieu d’enrichissement à 65 °C ± 1 °C au bain-marie (7.3.1). Transférer la
prise d’essai dans le milieu d’enrichissement préchauffé de manière à obtenir une dilution finale de
−1
10 à 65 °C ± 1 °C. Après inoculation, maintenir la fiole ou le flacon à 65 °C ± 1 °C pendant 10 min
supplémentaires, puis refroidir rapidement à 30 °C ± 1 °C au bain-marie (7.3.1).
9.2.1.3 Inoculation des prises d’essai de miel
Ajuster la température du bouillon d’enrichissement à 65 °C ± 1 °C (7.3.1). Transférer le sédiment (9.1.3)
dans une fiole ou un flacon (7.3.4) et le ou les filtres (9.1.3) dans une seconde fiole ou un second flacon
(7.3.4), chacun(e) contenant au moins 10 ml du bouillon d’enrichissement chauffé, et dans tous les cas,
s’assurer que la quantité de liquide est suffisante pour recouvrir les filtres. Incuber les deux fioles ou
flacons à 65 °C ± 1 °C pendant 10 min au bain-marie (7.3.1).
NOTE Les échantillons de miel ne sont analysés que pour les spores.
9.2.2 Incubation
Incuber en conditions anaérobies (7.3.2) à 30 °C ± 1 °C. Après 24 h ± 2 h d’incubation, retirer 1 ml de la
culture pour l’analyse PCR et revenir immédiatement en conditions anaérobies.
Si le résultat de la première PCR est négatif, continuer l’incubation dans les mêmes conditions pendant
48 h ± 2 h supplémentaires, puis transférer 1 ml de la culture dans une fiole ou un flacon (7.3.4) contenant
9 ml de bouillon d’enrichissement (6.2.3). Incuber en conditions anaérobies (7.3.2) à 30 °C ± 1 °C pendant
18 h ± 2 h et procéder à une deuxième analyse PCR.
9.2.3 Témoins de processus
Les témoins de processus positifs et négatifs doivent être inclus conformément à l’ISO 22174.
Un exemple de méthode de préparation des spores est donné dans l’Annexe D.
9.3 Préparation des acides nucléiques
9.3.1 Généralités
Un mode opératoire d’extraction des acides nucléiques approprié pour les bactéries à Gram positif doit
être utilisé.
Un exemple de mode opératoire est donné en 9.3.2 à 9.3.4. Ce mode opératoire comprend une étape de
lyse — lyse thermique en présence de CTAB — suivie de plusieurs étapes d’extraction visant à éliminer
les inhibiteurs, tels que les polysaccharides et les protéines.
Une fois la prise d’essai de la matrice préparée, appliquer le protocole d’extraction et de purification de
l’ADN spécifié en 9.3.2 à 9.3.4.
Il est nécessaire d’adapter les masses et les volumes de tampon proportionnellement à la taille
sélectionnée de la prise d’essai.
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9.3.2 Extraction de l’échantillon
Transférer 1 000 µl de la culture (9.2.2) dans un tube de microcentrifigeuse (7.4.1). Centrifuger (7.4.4)
pendant 5 min à environ 12 000g. Jeter la phase supérieure (aqueuse).
Ajouter au culot 500 µl de tampon d’extraction au CTAB (6.3.11) préchauffé (65 °C) et mélanger
doucement jusqu’à ce que le culot soit lysé. Incuber pendant 30 min à 65 °C, sous agitation (7.4.2). Ajouter
20 µl de solution de protéinase-K (6.3.7), agiter doucement le tube et incuber pendant 30 min à 65 °C,
sous agitation (7.4.2). Centrifuger pendant 10 min à environ 12 000g. Transvaser le surnageant dans un
nouveau tube, ajouter 0,7 à 1 volume de chloroforme (6.3.1) et mélanger vigoureusement.
Centrifuger pendant 15 min à environ 12 000g. Transvaser la phase supérieure (aqueuse) dans un
nouveau tube.
9.3.3 Précipitation au CTAB
Ajouter 2 volumes du tampon de précipitation au CTAB (6.3.12). Incuber pendant 60 min à température
ambiante sans agitation. Centrifuger pendant 15 min à 12 000 g. Jeter le surnageant. Dissoudre l’ADN
précipité en ajoutant 350 µl de solution de NaCl (6.3.13). Ajouter 350 µl de chloroforme (6.3.1) et mélanger
vigoureusement. Centrifuger pendant 10 min à 12 000 g. Transvaser la phase aqueuse dans un nouveau tube.
NOTE La précipitation au CTAB n’est pas nécessaire pour toutes les matrices, seulement pour les matrices
riches en protéines et en polysaccharides. Une purification sur phase solide de l’ADN (par exemple en utilisant des
colonnes de séparation) est également possible à la condition que les résultats soient équivalents.
9.3.4 Précipitation de l’ADN
Ajouter 0,6 volume d’isopropanol (6.3.6), mélanger doucement en retournant le tube et laisser le tube à
température ambiante pendant 20 min. Centrifuger pendant 15 min à 12 000g. Éliminer le surnageant.
Ajouter 500 µl de solution d’éthanol (6.3.14) dans le tube et le retourner plusieurs fois. Cette étape
est essentielle car elle permet de garantir le retrait total du CTAB. Centrifuger pendant 10 min à 12
000g. Éliminer le surnageant. Sécher le culot d’ADN et le dissoudre à nouveau dans 100 µl d’un tampon
approprié, par exemple, tampon TE (6.3.16). Il s’agit de la solution mère maître d’ADN. L’ADN peut être
conservé à −20 °C jusqu’à utilisation.
9.4 Amplification par PCR
Différents modes opératoires d’amplification par PCR peuvent être utilisés. La détection du produit de
PCR peut être effectuée soit sur gel, soit par détection du signal de fluorescence.
Toutes les exigences concernant l’amplification par PCR sont spécifiées dans l’ISO 20838.
Des exemples de méthodes de PCR par analyse en point final sont décrits dans l’Annexe B et des exemples
de méthodes de PCR par analyse en temps réel dans l’Annexe C.
9.4.1 Témoins PCR
Les témoins de PCR doivent être conformes à l’ISO 22174.
9.4.2 Détection des produits PCR
Différents modes opératoires de détection des produits PCR peuvent être utilisés. Des exemples pour
les méthodes de PCR par analyse en point final sont décrits dans l’Annexe B et des exemples pour les
méthodes de PCR en temps réel dans l’Annexe C.
9.5 Confirmation d’un résultat PCR positif
Suivre le mode opératoire spécifié dans l’ISO 20838.
9.5.1 Interprétation des résultats
Il convient que les résultats obtenus, incluant les témoins spécifiés dans l’ISO 22174, ne soient pas
ambigus et que les témoins génèrent les résultats attendus. Dans le cas contraire, le mode opératoire
doit être repris du début.
Le résultat PCR est:
a) positif, si un produit PCR particulier a été détecté et confirmé et que tous les témoins donnent les
résultats attendus;
b) négatif dans les limites de détection, si aucun produit PCR particulier n’a été détecté et que tous les
témoins donnent les résultats attendus.
Un résultat PCR positif n’est pas nécessairement synonyme de présence de neurotoxines botuliques.
Pour confirmer la présence de neurotoxines, des méthodes adaptées visant directement les toxines
doivent être appliquées.
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Annexe A
(normative)
Schéma du mode opératoire
Préparer un échantillon (9.1.1)
Prise d’essai
x g ou x ml
Bouillon d’enrichissement 9 x ml (6.2.3)
Incuber dans des conditions anaérobies à 30 °C ± 1 °C pendant 24 h ± 2 h (7.3.2)
Prélever 1 ml de la culture en vue d’une analyse PCR puis remettre en conditions anaérobies
Résultat négatif en PCR
Résultat positif en PCR
Incuber pendant 48 h ± 2 h supplémentaires
dans des conditions anaérobies (7.3.2)
Transférer 1 ml de la culture dans 9 ml
de bouillon d’enrichissement (6.2.3)
Incuber dans des conditions anaérobies à
30 °C ± 1 °C pendant 18 h ± 2 h (7.3.2)
Seconde analyse PCR
Figure A.1
Annexe B
(informative)
Réactions de PCR multiplex pour la détection de gènes codant
les types A, B, E et F de la neurotoxine botulique utilisant une
électrophorèse en gel d’agarose
B.1 Méthode 1
B.1.1 Introduction
Le présent article décrit une méthode d’amplification et de détection propre aux gènes codant les types A,
B, E et F de neurotoxine botulique avec détection des produits PCR par électrophorèse en gel d’agarose.
En ce qui concerne les restrictions, voir B.1.7.6.
B.1.2 Caractéristiques de performance
B.1.2.1 Généralités
La méthode a été validée pour de l’ADN extrait de différentes souches de référence des types A, B, E et F
de C. botulinum et d’échantillons naturellement contaminés.
La méthode apparaît dans les Références[1][2] et [5].
B.1.2.2 Évaluation théorique de la méthode
Une évaluation théorique a été menée en effectuant une recherche de similitudes de séquences dans la
base de données GenBank/EMBL/DDBJ, l’EMBL étant le Laboratoire européen de biologie moléculaire
et DDBJ, la base de données ADN du Japon, (Référence [16], 2009-09-20). Le résultat de la recherche n’a
confirmé une identité complète que pour les séquences cibles attendues.
B.1.2.3 Sélectivité
B.1.2.3.1 Essai d’inclusivité
L’inclusivité de la méthode a été soumise à essai sur 86 souches de type A de C. botulinum, 70 souches
de type B de C. botulinum, 15 souches de type E de C. botulinum/butyricum et 6 souches de type F de
C. botulinum, voir Tableau B.1.
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Tableau B.1 — Inclusivité de la réaction de PCR multiplex utilisant les souches cibles
Type de gène de neurotoxine botulique
Nombre de
détecté
Souche, type et sous-type
souches
Type A Type B Type E Type F
a
C. botulinum type A sous-type A1 3 3 0 0 0
b
C. botulinum type A sous-type A2 9 9 0 0 0
c
C. botulinum type A sous-type A3 1 1 0 0 0
d
C. botulinum type A sous-type A5 4 4 0 0 0
e
C. botulinum type A sous-type indéterminé 69 69 0 0 0
f
C. botulinum type Ba sous-type A4 1 1 1 0 0
g
C. botulinum type Ab sous-type A2 4 4 4 0 0
h
C. botulinum type B 70 0 70 0 0
i
C. botulinum type E 4 0 0 4 0
j
C. butyricum type E 11 0 0 11 0
k
C. botulinum type F 6 0 0 0 6
a
Souches issues de la collection nationale de cultures types C. botulinum (NCTC 4587), C. botulinum souche 62A, C.
botulinum NCTC 7272.
b
Souches isolées par le Centre national de référence pour le botulisme (ou collection NRCB pour National Reference
Centre for Botulism), situé en Italie.
c
C. botulinum NCTC 2012 Loch Maree.
d
Souches C. botulinum de l’Institut de recherche sur l’alimentation (ou IFR pour Institute of Food Research), Royaume-
Uni.
e
64 souches de la collection NRCB et 5 souches issues du Laboratoire de conseil sur les bactéries anaérobies (ou CLAB
pour Consultant Laboratory for Anaerobic Bacteria) de l’Université de Leipzig, Allemagne.
f
Souche 657Ba de C. botulinum issue de l’IFR, Royaume-Uni.
g
Souches isolées par le NRCB, Italie.
h
C. botulinum NCTC 7273 et 69 souches issues de la collection NRCB.
i
3 souches issues du CLAB et 1 souche issue du NRCB.
j
7 souches isolées en Italie par le NRCB, 4 souches mises à disposition par la Référence [17].
k
C. botulinum NCTC 10281, 3 souches isolées en Italie par le NRCB, 2 souches isolées en Allemagne par le CLAB.
B.1.2.3.2 Essai d’exclusivité
L’exclusivité de la méthode a été soumise à essai sur 34 organismes non cibles, voir Tableau B.2. Aucune
réaction croisée n’a été observée avec ces bactéries non cibles.
Tableau B.2 — Exclusivité de la PCR multiplex utilisant des bactéries non cibles
Type de gène de neurotoxine botulique détecté
Nombre de
a
Souches
souches
Type A Type B Type E Type F
C. sporogenes WDCM 00008 1 0 0 0 0
C. perfringens (WDCM 00007 et souches
3 0 0 0 0
sauvages)
C. carnis NCTC 13036 1 0 0 0 0
C. histolyticum NCTC 503 1 0 0 0 0
C. butyricum NCTC 7423 1 0 0 0 0
C. barati NCTC 10986 1 0 0 0 0
Bacillus subtilis WDCM 00003 1 0 0 0 0
B. cereus (NCTC 11143 et souches sauvages) 3 0 0 0 0
Campylobacter spp. thermophiles (souches
2 0 0 0 0
sauvages)
Escherichia coli (WDCM 00013 et souches
3 0 0 0 0
sauvages)
Salmonella spp. (WDCM 00030 et souche
2 0 0 0 0
sauvage)
Listeria spp. (WDCM 00017 et WDCM 00109) 2 0 0 0 0
Brochotrix thermospacta WDCM 00071 1 0 0 0 0
Enterococcus faecalis WDCM 00087 1 0 0 0 0
Citrobacter freundii WDCM 00078 1 0 0 0 0
Pseudomonas spp. (souches sauvages) 3 0 0 0 0
Yersinia enterocolitica (souches sauvages) 3 0 0 0 0
Lactobacillus fermentum (souches sauvages) 1 0 0 0 0
Aspergillus spp. (souches sauvages) 2 0 0 0 0
Saccharomyces cervisiae (souche sauvage) 1 0 0 0 0
a
WDCM = World Data Centre for Microorganisms (Centre mondial de données pour les micro-organismes).
B.1.2.4 Sensibilité
B.1.2.4.1 Essais de sensibilité utilisant des échantillons artificiellement contaminés (Réfé-
rence [2])
La limite de détection a été évaluée en mesurant les différents niveaux d’inoculum d’échantillons
artificiellement contaminés (0,1 ufc à 10 ufc et 10 ufc à 100 ufc avant enrichissement) dans 10 g de
matrices alimentaires différentes (poisson en conserve, saucisses en conserve et miel) étudiées
en utilisant la méthode par culture (Référence [1]). D’après les résultats, le taux de faux positif de la
méthode utilisant des échantillons artificiellement contaminés est de 0 % et le taux de faux négatifs est
de 0 %. La limite de détection de la méthode décrite est comprise entre 1 ufc et 10 ufc ou spores dans
10 g avant enrichissement.
B.1.2.4.2 Essais de sensibilité en utilisant des échantillons naturellement contaminés (Réfé-
rence [2])
La limite de détection a été évaluée sur 382 échantillons naturellement contaminés (par exemple miel,
légumes et viandes en conserve) en utilisant un essai biologique sur souris comme méthode de référence.
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D’après les résultats, le taux de faux positifs de la méthode utilisant des échantillons naturellement
contaminés est de 0 % et le taux de faux négatifs est de 0 %.
NOTE Les expériences ont été effectuées sur des prises d’essai de 10 g.
B.1.2.5 Témoins analytiques
Tous les essais ont également été effectués sur des témoins de processus positifs et négatifs et, pour la
réaction de PCR, sur des témoins internes d’amplification (TIA) décrits en B.1.6.
B.1.2.6 Instruments et réactifs
1) 2)
® ®
La validation a été effectuée avec les thermocycleurs MyCycler et Mastercycler Gradient en
®3)
utilisant le mélange maître 2× Multiplex qPCR MasterMix (Référence [1]) et le MasterMix donné dans
le Tableau B.7 (Références [2] et [5]).
B.1.3 Principe
Les fragments d’ADN propres aux gènes codant les types A, B, E et F de BoNT ainsi qu’un témoin interne
d’amplification homologue sont amplifiés par PCR multiplex en utilisant huit amorces. La détection des
produits PCR est effectuée par électrophorèse en gel d’agarose.
B.1.4 Réactifs
B.1.4.1 Généralités
En ce qui concerne la qualité des réactifs à utiliser, voir l’ISO 22174.
B.1.4.2 Réactifs pour la PCR
B.1.4.2.1 Eau exempte de nucléase.
4)
B.1.4.2.2 Solution tampon pour la PCR, 10× .
La solution tampon pour la PCR est habituellement fournie avec l’ADN polymérase, qui est susceptible
de contenir ou pas du MgCl dont la concentration est spécifiée par le fabricant. Les teneurs finales en
MgCl dépendent de la méthode et sont, par conséquent, répertoriées dans le Tableau B.7. Des réactifs
prêts à l’emploi peuvent être disponibles dans le commerce. Si cela est le cas, suivre les instructions
d’utilisation du fabricant.
B.1.4.2.3 Solution de MgCl , c(MgCl ) = 25 mmol/l.
2 2
B.1.4.2.4 ADN polymérase thermostable (pour les PCR activées par chauffage ou PCR «hot start»), 5 UI/µl. ®
1) MyCycler est l’appellation commerciale d’un produit fourni par BioRad. Cette information est donnée
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils
conduisent aux mêmes résultats. ®
2) Mastercycler Gradient est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Eppendorf. Cette information est
donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils
conduisent aux mêmes résultats. ®
3) 2× Multiplex qPCR MasterMix est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Qiagen. Cette information
est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou
recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désig
...