ISO 17174:2024
(Main)Molecular biomarker analysis — DNA barcoding of fish and fish products using defined mitochondrial cytochrome b and cytochrome c oxidase I gene segments
Molecular biomarker analysis — DNA barcoding of fish and fish products using defined mitochondrial cytochrome b and cytochrome c oxidase I gene segments
This document specifies a method for the identification of single fish and fish fillets to the level of genus or species. It allows the identification of a large number of commercially important fish species using DNA barcoding. This method was validated on raw fish. Laboratory experience indicates additional applicability to processed fish products (e.g. cold smoked, hot smoked, salted, frozen, cooked, fried and deep-fried samples). The described method is usually unsuitable for the analysis of highly processed foods (e.g. tins of fish with highly degraded DNA where the fragment lengths are not sufficient for amplification of the targets). Furthermore, it does not apply to complex fish products containing mixtures of two or more fish species. The identification of fish species is carried out by PCR amplification of either a segment of the mitochondrial cytochrome b gene (cytb) or the cytochrome c oxidase I gene (cox1, syn COI), or both, followed by sequencing of the PCR products and subsequent sequence comparison with entries in databases.
Analyse de biomarqueurs moléculaires — Codes-barres d’ADN de poissons et de produits à base de poisson à l’aide de segments de gènes mitochondriaux de cytochrome b et cytochrome c oxydase I
Le présent document spécifie une méthode d’identification au niveau du genre ou de l’espèce des poissons individuels et des filets de poisson. Il permet l’identification d’un grand nombre d’espèces de poissons à forte importance commerciale au moyen de codes-barres d’ADN. Cette méthode a été validée sur des poissons crus. L’expérience menée en laboratoire indique une applicabilité supplémentaire aux produits à base de poisson après transformation (fumage à froid ou à chaud, salage, congélation, cuisson, friture, etc.). De manière générale, la méthode décrite est inadaptée à l’analyse d’aliments hautement transformés (comme les poissons en conserve dont l’ADN est fortement dégradé et dont les longueurs des fragments se révèlent insuffisantes pour l’amplification des cibles). En outre, la méthode présentée ici ne s’applique pas aux produits complexes à base de poisson qui mélangent deux espèces de poissons et plus. L’identification des espèces de poisson s’effectue par amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR : Polymerase Chain Reaction) d’un segment du gène du cytochrome b mitochondrial (cytb), du gène du cytochrome c oxydase I (cox1 ou COI) ou des deux, suivie d’un séquençage des produits de la PCR et d’une comparaison des séquences aux entrées de bases de données.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 17174
First edition
Molecular biomarker analysis —
2024-09
DNA barcoding of fish and
fish products using defined
mitochondrial cytochrome b
and cytochrome c oxidase I gene
segments
Analyse de biomarqueurs moléculaires — Codes-barres d’ADN de
poissons et de produits à base de poisson à l’aide de segments de
gènes mitochondriaux de cytochrome b et cytochrome c oxydase I
Reference number
© ISO 2024
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on
the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below
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CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: +41 22 749 01 11
Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Symbols and abbreviated terms. 3
5 Principle . 3
6 Reagents and materials . 3
7 Apparatus . 5
8 Procedure . 5
8.1 Sample preparation .5
8.2 DNA extraction .5
8.3 PCR .5
8.3.1 General .5
8.3.2 PCR setup .5
8.3.3 PCR controls .6
8.3.4 Thermal cycling .7
8.4 Evaluation of PCR products . .7
8.5 Evaluation of the PCR results .7
9 Sequencing . 8
9.1 Sequencing of PCR products .8
9.2 Evaluation of sequence data .8
9.3 Comparison of the sequence with public databases .9
9.3.1 General .9 ®
9.3.2 Sequence comparison of cytb and/or cox1 DNA sequences with GenBank .9
9.3.3 Sequence comparison of cox1 DNA sequences with BOLD.10
10 Interpretation of database query results . 10
11 Validation status and performance criteria .11
11.1 Collaborative study for the identification of fish species based on cytb sequence analysis .11
11.2 Collaborative study for the identification of fish species based on cox1 sequence analysis . 12
12 Test report .13
Annex A (informative) Practical laboratory experiences with the amplifiability of cytb and
cox1 segments from tested fish species. 14
Bibliography . 17
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee 34, Food products, Subcommittee SC 16, Horizontal
methods for molecular biomarker analysis, in collaboration with the European Committee for Standardization
(CEN) Technical Committee CEN/TC 460, Food authenticity, in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
Food safety is a key aspect in terms of consumer protection. In the last three decades, globalization has
taken place in the trade of food. Fish trade channels are becoming steadily longer and more complicated so
that sophisticated traceability tools are needed to ensure food safety. Correct food labelling is a prerequisite
to ensure safe fish products and fair trade as well as to minimize illegal, unreported and unregulated
(IUU) fishing. In particular, the fact that fish is increasingly being processed in export countries makes
the identification of species by morphological characteristics impossible. The development of reliable,
harmonized and standardized protocols for the authentication of fish products is necessary to ensure
consumer protection and the detection of potential food fraud.
v
International Standard ISO 17174:2024(en)
Molecular biomarker analysis — DNA barcoding of fish and
fish products using defined mitochondrial cytochrome b and
cytochrome c oxidase I gene segments
1 Scope
This document specifies a method for the identification of single fish and fish fillets to the level of genus
or species. It allows the identification of a large number of commercially important fish species using DNA
barcoding.
This method was validated on raw fish. Laboratory experience indicates additional applicability to processed
fish products (e.g. cold smoked, hot smoked, salted, frozen, cooked, fried and deep-fried samples).
The described method is usually unsuitable for the analysis of highly processed foods (e.g. tins of fish
with highly degraded DNA where the fragment lengths are not sufficient for amplification of the targets).
Furthermore, it does not apply to complex fish products containing mixtures of two or more fish species.
The identification of fish species is carried out by PCR amplification of either a segment of the mitochondrial
cytochrome b gene (cytb) or the cytochrome c oxidase I gene (cox1, syn COI), or both, followed by sequencing
of the PCR products and subsequent sequence comparison with entries in databases.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 16577, Molecular biomarker analysis — Vocabulary for molecular biomarker analytical methods in
agriculture and food production
ISO 20813, Molecular biomarker analysis — Methods of analysis for the detection and identification of animal
species in foods and food products (nucleic acid-based methods) — General requirements and definitions
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
alignment
sequence alignment
arrangement of nucleic acid sequences or protein sequences according to regions of similarity
Note 1 to entry: Alignment is a process or result of matching up the nucleotide residues of two or more biological
sequences to achieve maximal levels of identity (3.3).
[SOURCE: ISO 16577:2022, 3.7.18, modified — “alignment” was added as the preferred term; Note 1 to entry
was added.]
3.2
FASTA format
text-based format for representing either nucleotide sequences or amino acid (protein) sequences, in which
nucleotides or amino acids are represented using single-letter codes
Note 1 to entry: A sequence in FASTA format begins with a single-line description, followed by lines of sequence data.
The description line (defline) is distinguished from the sequence data by a greater-than (“>”) symbol at the beginning.
It is recommended that all lines of text be shorter than 80 characters in length.
Note 2 to entry: An example sequence in FASTA format is:
Note 3 to entry: Blank lines are not allowed in the middle of FASTA input. Sequences are represented in the standard
IUB/IUPAC amino acid and nucleic acid codes, with these exceptions:
— lower-case letters are accepted and are mapped into upper-case;
— a single hyphen or dash can be used to represent a gap of indeterminate length.
It is common to end the sequence with an “*” (asterisk) character and to leave a blank line between the description and
the sequence.
[SOURCE: ISO 16577:2022, 3.1.2, modified — Example in Note 2 to entry was replaced; the third list item in
Note 3 to entry was deleted.]
3.3
identity
extent to which two (nucleotide or amino acid) sequences have the same residues at the same positions in an
alignment (3.1)
Note 1 to entry: Identity is often expressed as a percentage.
Note 2 to entry: In the sequence database of the Barcode of Life (BOLD), the term "similarity" is used instead of identity.
3.4
introgressed DNA
allele from one species incorporated in the gene pool of another, divergent species
Note 1 to entry: Introgression has usually happened via hybridization and backcrossing of individuals belonging to
different species.
3.5
query
sequence (or other type of search term) that is compared to entries in a database
3.6
query coverage
percentage of the query (3.5) covered by alignment (3.1) to the database sequence
4 Symbols and abbreviated terms
bp base pairs
Glu glutamic acid, glutamate
tRNA transfer RNA
cox1, COI cytochrome c oxidase I gene
cytb cytochrome b gene
DNA deoxyribonucleic acid
RNA ribonucleic acid
dNTP deoxyribonucleotide triphosphate
A adenine
C cytosine
G guanine
I inosine
R purine base (adenine or guanine)
T thymine
Y pyrimidine base (cytosine or thymine)
IUU illegal, unreported and unregulated
PCR polymerase chain reaction
5 Principle
DNA is extracted from fish and fish products applying a suitable method. Segments of approximately 460
base pairs of cytb and/or approximately 650 base pairs of cox1 are amplified by PCR. For the amplification
of the cytb segment a set of two primers is used. Amplification of cox1 uses a set of four primers to ensure
the amplification of DNA of as many fish species as possible. Some of the used primers include ambiguous
bases to increase the number of species detected by the two methods. The nucleotide sequences of the PCR
products are determined by a suitable DNA sequencing method (e. g. Sanger sequencing). The two PCR
primers used to generate the cytb amplicon are also used for sequencing. The cox1 primers have M13 tails
that enable sequencing of the cox1 amplicons using M13 sequencing primers. The determined sequence is
evaluated by comparison to sequence entries in databases, thus allowing the assignment to a fish species or
genus according to the degree of identity with available sequences.
The decision whether the cytb or cox1 segment or both are used for fish identification depends on the
declared fish species, especially the applicability of the PCR method for the fish species and the availability
of comparative sequences in the public databases.
6 Reagents and materials
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized molecular biology grade and
distilled, demineralized water or water of equivalent purity, in accordance with ISO 20813. Laboratory
organization shall follow ISO 20813.
1)
6.1 Thermostable DNA polymerase .
1)
6.2 PCR reaction buffer (including MgCl or with separate MgCl solution) .
2 2
6.3 dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP and dTTP).
NOTE dNTP can also be part of a commercial PCR master mix.
6.4 Oligonucleotides (see Tables 1 and 2).
NOTE 1 The abbreviations of the DNA bases in Tables 1 and 2 are based on the recommendations for unambiguous,
[4]
uniform, and consistent nomenclature, published by the International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC).
[1]
Table 1 — Oligonucleotides for amplification of the cytb gene region
Name DNA sequence of oligonucleotide
L14735 5’-AAA AAC CAC CGT TGT TAT TCA ACT A-3’
H15149ad 5’-GCI CCT CAR AAT GAY ATT TGT CCT CA-3’
NOTE 2 Laboratory experience has shown that M13 tails can also be used with cytb primers.
[2][3]
Table 2 — Oligonucleotides for amplification of the cox1 gene region
a
Name DNA sequence of oligonucleotide
VF2_t1 5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT CAA CCA ACC ACA AAG ACA TTG GCA C-3’
FishF2_t1 5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT CGA CTA ATC ATA AAG ATA TCG GCA C-3’
FishR2_t1 5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACA CTT CAG GGT GAC CGA AGA ATC AGA A-3’
FR1d_t1 5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACA CCT CAG GGT GTC CGA ARA AYC ARA A-3’
a
M13 tails of the primers are highlighted in bold and italic.
6.5 Trehalose.
6.6 Agarose.
6.7 DNA size standard.
6.8 Sequencing primers (see Table 3).
[3]
Table 3 — Sequencing primers for cox1 PCR products
Name DNA sequence of oligonucleotide
M13F (−21) 5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3’
M13R (−27) 5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’ ®
1) During the collaborative studies, the Maxima Hot Start PCR Master Mix (2 ×) of Fermentas GmbH (ready-to -use
PCR buffer solution including thermostable DNA polymerase) was used for the cytb amplification and the BIOTAQ™ DNA
polymerase of Bioline with 10 × reaction buffer and separate MgCl solution for the cox1 amplification. In addition to ®
the recommended BIOTAQ™ DNA polymerase, other mastermixes and polymerases were successfully used. Maxima
Hot Start PCR Master Mix (2 ×) of Fermentas GmbH (ready-to-use PCR buffer solution including thermostable DNA
polymerase) and BIOTAQ™ DNA polymerase of Bioline are examples of suitable products available commercially. This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of
these products.
7 Apparatus
In addition to standard laboratory equipment, the following apparatus should be used.
7.1 UV-spectrophotometer or fluorometer, to determine the concentration of DNA.
7.2 Thermocycler.
7.3 Gel electrophoresis device.
7.4 Gel documentation system.
7.5 DNA sequencer.
8 Procedure
8.1 Sample preparation
The test portion used for DNA extraction shall be representative of the laboratory sample, for example, using
the following guidance. In samples that consist of processed materials (e.g. convenience foods), single fish
pieces shall be analysed separately. For the analysis of samples composed of several pieces (e.g. bags with
different fillets), test portions for every putative fish species are taken and analysed separately. To minimize
the risk of amplifying adhering contaminants, test sample material shall not be taken from the surface of the
[7]
laboratory sample, see also ISO 20813 and ISO 22949-1 .
8.2 DNA extraction
[5]
General instructions and measures specified in ISO 21571:2005 should be followed for the extraction of
[5]
DNA from the test sample. For example, the DNA extraction methods specified in ISO 21571:2005, Annex A,
can be used. Commercial kits can be used for the extraction and purification of DNA, if their applicability for
the extraction of DNA from fish has been experimentally confirmed.
8.3 PCR
8.3.1 General
Universal primers are used for amplification of segments of mitochondrial cytb and cox1. The primer
H15149ad is a universal primer with fish-specific adaptations that binds to the cytb section. L14735 binds to
[1]
a section in the neighbouring highly conserved tRNA-Glu gene. The primers used for amplification of the
[2][3]
mitochondrial cox1 fragment were designed to the 5’ region of the cox1 of fish.
Both primer sets have been tested against a very broad taxonomic range of fish species. It is currently
known that, with some exceptions, the primer pair L14735/H15149ad did not react with samples labelled as
[6]
barramundi (Lates calcarifer) or Nile perch (Lates niloticus). The cox1 primer set has only failed in a small
[2]
minority of cases (< 5 % of species tested).
8.3.2 PCR setup
The method was validated for a total volume of 25 µl (cytb) or 20 µl (cox1) per PCR. The reagents given in
Tables 4 and 5 shall be used for the cytb and cox1 PCR, respectively.
Reagents shall be completely thawed and should be centrifuged briefly before usage. A PCR reagent mixture
is prepared containing all PCR components in the given concentrations except for the DNA extract or the
controls. The amount of PCR mixture prepared depends on the total volume per PCR and the total number of
reactions including a sufficient pipetting reserve.
Positive PCR results are expected when using a DNA concentration of approximately 1 ng DNA per μl of the
final solution [25 ng (cytb) or 20 ng (cox1)].
To improve the PCR result, the DNA quantity can be increased (e.g. to increase the yield of PCR product) or
decreased (e.g. to avoid PCR inhibition).
Table 4 — Components for the cytb PCR
Reagent (stock solution) Final composition in the reaction solution
PCR buffer 1 ×
a
MgCl 1,5 mmol/l
a
dNTP mix 0,2 mmol/l for each dNTP
Primer L14735 500 nmol/l
Primer H15149ad 500 nmol/l
Thermostable DNA polymerase 0,5 units to 1 unit
Water Add to obtain final volume
Sample DNA Approximately 1 ng/µl
a
Use a reagent only if one is not already included in the PCR buffer.
Table 5 — Components for the cox1 PCR
Reagent (stock solution) Final composition in the reaction solution
a
Trehalose 5 %
PCR buffer 1 ×
b
MgCl 2,5 mmol/l
b
dNTP mix 0,2 mmol/l for each dNTP
Primer VF2_t1 100 nmol/l
Primer FishF2_t1 100 nmol/l
Primer FishR2_t1 100 nmol/l
Primer FR1d_t1 100 nmol/l
Thermostable DNA polymerase 0,5 units
Water Add to obtain final volume
Sample DNA Approximately 1 ng/µl
a
Optional.
b
Use a reagent only if one is not already included in the PCR buffer.
Mix the PCR reagent mixture, centrifuge briefly and split into the individual reactions. Pipette the DNA
extracts to be examined or the PCR controls (see 8.3.3) into the different reaction solutions.
For further information on PCR controls, see also ISO 20813.
8.3.3 PCR controls
In addition to the reaction setups for the samples to be analysed, an amplification reagent control and an
extraction blank control in accordance with ISO 20813 shall be included.
A positive DNA target control (see ISO 20813) can be used to demonstrate the ability of the PCR to amplify
the target sequence. As positive control material, genomic DNA extracted from a known fish species or an
available plasmid containing the target sequence can be used.
If a sample shows no amplification in both targets, an inhibition control reaction should be performed to
exclude an inhibition of the PCR as the cause (see ISO 20813). This can be done either by dilution of sample
DNA or by using an internal inhibition control assay.
Additional PCR controls can be used, see ISO 20813.
8.3.4 Thermal cycling
Transfer the reaction setups into the thermal cycler and start the temperature-time programme. The
temperature-time programmes as outlined in Tables 6 and 7 have been successfully used in the collaborative
studies.
NOTE The use of different reagent conditions and thermocyclers can require specific optimization. The time for
initial denaturation depends on the thermostable DNA polymerase used.
Table 6 — Temperature-time programme for the cytb PCR
Step Parameter Temperature Time Cycles
Initial DNA denaturation and
1 activation of the hot-start DNA 95 °C 15 min 1
polymerase (if used)
Denaturation 95 °C 40 s
2 Amplification Annealing 50 °C 80 s 35
Elongation 72 °C 80 s
3 Final elongation 72 °C 10 min 1
Table 7 — Temperature-time programme for the cox1 PCR
Step Parameter Temperature Time Cycles
Initial DNA denaturation and
1 activation of the hot-start DNA 94 °C 2 min 1
polymerase (if used)
Denaturation 94 °C 30 s
2 Amplification Annealing 52 °C 40 s 35
Elongation 72 °C 60 s
3 Final elongation 72 °C 10 min 1
After the PCR thermal cycling is finished, follow with the evaluation of the PCR products or store samples in
the refrigerator until further analysis.
8.4 Evaluation of PCR products
The PCR product should be assessed for quality, and its quantity estimated (e.g. by agarose gel
electrophoresis).
Gel electrophoresis of DNA in an agarose gel is a standard technique in molecular biology. Therefore, only
general conditions that need to be adapted to each laboratory are suggested.
A volume of 1 µl to 10 µl of each PCR product is separated in, for example, an agarose gel of suitable
concentration (e.g. a mass fraction of 1 % to 2 % per volume) and evaluated with a gel documentation system.
In one lane, an appropriate DNA size standard is included for comparison. For the cytb PCR a product of
approximately 460 bp and for the cox1 PCR a product of approximately 700 bp (which includes M13 tails)
should be clearly visible after gel electrophoresis.
No amplicons should be visible for the amplification reagent control and the extraction blank control. For
the positive DNA target control, PCR products of the expected size should be visible.
8.5 Evaluation of the PCR results
The cytb PCR or the cox1 PCR or both can show a positive or a negative result for amplification of the target
sequence(s).
©
...
Norme
internationale
ISO 17174
Première édition
Analyse de biomarqueurs
2024-09
moléculaires — Codes-barres
d’ADN de poissons et de produits
à base de poisson à l’aide de
segments de gènes mitochondriaux
de cytochrome b et cytochrome c
oxydase I
Molecular biomarker analysis — DNA barcoding of fish and
fish products using defined mitochondrial cytochrome b and
cytochrome c oxidase I gene segments
Numéro de référence
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Symboles et termes abrégés . 3
5 Principe. 3
6 Réactifs et matériels . 4
7 Appareillage . 5
8 Mode opératoire . 5
8.1 Préparation de l’échantillon .5
8.2 Extraction d’ADN .5
8.3 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) .5
8.3.1 Généralités .5
8.3.2 Déroulement de la PCR .6
8.3.3 Témoins de PCR .7
8.3.4 Cycle thermique.7
8.4 Évaluation des ADN amplifiés .7
8.5 Évaluation des résultats de la PCR .8
9 Séquençage . 8
9.1 Séquençage des ADN amplifiés .8
9.2 Évaluation des données de séquençage .9
9.3 Comparaison de la séquence avec les bases de données publiques .9
9.3.1 Généralités .9 ®
9.3.2 Comparaison de séquences d’ADN de cytb et/ou cox1 avec GenBank .10
9.3.3 Comparaison de séquences d’ADN de cox1 avec BOLD .10
10 Interprétation des résultats de la requête de base de données .11
11 État de validation et critères de performance .12
11.1 Étude comparative interlaboratoires pour l’identification d’espèces de poisson à partir
du séquençage du cytb . 12
11.2 Étude comparative interlaboratoires pour l’identification d’espèces de poisson à partir
du séquençage du cox1 . . 13
12 Rapport d’essai . 14
Annexe A (informative) Expériences pratiques de laboratoire sur l’amplifiabilité des segments
de cytb et de cox1 sur les espèces de poisson soumises à l’essai .16
Bibliographie . 19
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de tout
droit de propriété revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas reçu
notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois, il y a lieu
d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations plus récentes
sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse www.iso.org/brevets.
L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de brevet.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 16,
Méthodes horizontales pour l’analyse de biomarqueurs moléculaires, en collaboration avec le comité technique
CEN/TC 460, Authenticité des aliments, du Comité européen de normalisation (CEN), conformément à l’Accord
de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
La sécurité des denrées alimentaires est un aspect essentiel de la protection du consommateur. Au cours
des trois dernières décennies, la mondialisation s’est imposée dans le commerce des produits alimentaires.
Les circuits commerciaux du poisson deviennent de plus en plus longs et complexes, imposant donc l’emploi
d’outils de traçabilité évolués pour garantir la sécurité des denrées alimentaires. L’étiquetage correct des
produits alimentaires est un prérequis pour garantir la sécurité et le commerce équitable des produits à
base de poisson ainsi que pour réduire le plus possible la pêche illicite, non déclarée et non réglementée
(INN). En particulier, la transformation du poisson s’effectue de plus en plus dans les pays exportateurs, ce
qui rend impossible l’identification des espèces par leurs caractéristiques morphologiques. L’élaboration de
protocoles fiables, harmonisés et normalisés d’authentification des produits de la pêche est indispensable
pour garantir la protection des consommateurs et la détection des fraudes alimentaires potentielles.
v
Norme internationale ISO 17174:2024(fr)
Analyse de biomarqueurs moléculaires — Codes-barres
d’ADN de poissons et de produits à base de poisson à l’aide
de segments de gènes mitochondriaux de cytochrome b et
cytochrome c oxydase I
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode d’identification au niveau du genre ou de l’espèce des poissons
individuels et des filets de poisson. Il permet l’identification d’un grand nombre d’espèces de poissons à forte
importance commerciale au moyen de codes-barres d’ADN.
Cette méthode a été validée sur des poissons crus. L’expérience menée en laboratoire indique une applicabilité
supplémentaire aux produits à base de poisson après transformation (fumage à froid ou à chaud, salage,
congélation, cuisson, friture, etc.).
De manière générale, la méthode décrite est inadaptée à l’analyse d’aliments hautement transformés
(comme les poissons en conserve dont l’ADN est fortement dégradé et dont les longueurs des fragments se
révèlent insuffisantes pour l’amplification des cibles). En outre, la méthode présentée ici ne s’applique pas
aux produits complexes à base de poisson qui mélangent deux espèces de poissons et plus.
L’identification des espèces de poisson s’effectue par amplification par réaction de polymérisation en
chaîne (PCR : Polymerase Chain Reaction) d’un segment du gène du cytochrome b mitochondrial (cytb), du
gène du cytochrome c oxydase I (cox1 ou COI) ou des deux, suivie d’un séquençage des produits de la PCR et
d’une comparaison des séquences aux entrées de bases de données.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 16577, Analyse de biomarqueurs moléculaires — Vocabulaire pour les méthodes d’analyse de biomarqueurs
moléculaires dans l’agriculture et la production agroalimentaire
ISO 20813, Analyse moléculaire de biomarqueurs — Méthodes d'analyse pour la détection et l'identification
des espèces animales dans les aliments et les produits alimentaires (méthodes basées sur l'utilisation des acides
nucléiques) — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 16577 ainsi que les suivants
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes :
— ISO Online browsing platform : disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia : disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
alignement
alignement de séquence
disposition des séquences d’acide nucléique ou de séquences protéiques en fonction des régions de similarité
Note 1 à l'article: L’alignement est un processus ou un résultat de mise en correspondance de résidus de nucléotides de
deux séquences biologiques ou plus afin d’obtenir des niveaux maximaux d’identité (3.3).
[SOURCE: : ISO 16577:2022, 3.7.18, modifié — Le terme « alignement » a été ajouté comme terme
recommandé ; la Note 1 à l’article a été ajoutée.]
3.2
format FASTA
format de texte permettant de représenter soit des séquences de nucléotides soit des séquences (protéiques)
d’acides aminés à l’aide de codes à un seul caractère
Note 1 à l'article: Une séquence au format FASTA commence par une description d’une seule ligne, suivie des lignes
de données de la séquence. La ligne de description (defline) se distingue des données de séquence par le symbole
« supérieur » (>) à son début. Il est recommandé que toutes les lignes de texte contiennent moins de 80 caractères.
Note 2 à l'article: Voici un exemple de séquence au format FASTA :
Note 3 à l'article: Il n’est pas autorisé de laisser de lignes vides au milieu d’une séquence au format FASTA. Les séquences
sont représentées selon les codes d’acides nucléiques et d’acides aminés normalisés de l’IUB/IUPAC, à l’exception de ce
qui suit :
— les lettres minuscules sont acceptées, elles sont ensuite retranscrites en majuscules ;
— un seul tiret ou trait d’union peut être utilisé pour représenter un espace libre d’une longueur indéterminée.
Il est courant de terminer la séquence par un « * » (astérisque) et de laisser une ligne blanche entre la
description et la séquence.
[SOURCE: : ISO 16577:2022, 3.1.2, modifié — L’exemple de la Note 2 à l’article a été remplacé ; le troisième
élément de la liste de la Note 3 à l’article a été supprimé.]
3.3
identité
mesure dans laquelle deux séquences de nucléotides ou d’aminoacides présentent les mêmes résidus dans
les mêmes positions d’un alignement (3.1)
Note 1 à l'article: L’identité est le plus souvent exprimée en pourcentage.
Note 2 à l'article: Dans la base de données des séquences de BOLD (Barcode of Life), le terme « similarité » est utilisé à
la place d’identité.
3.4
ADN introgressé
allèle provenant d’une espèce et incorporé dans le patrimoine génétique d’une autre espèce différente de la
première
Note 1 à l'article: L’introgression est généralement la conséquence de l’hybridation et du rétrocroisement d’individus
appartenant à des espèces différentes.
3.5
requête
séquence (ou tout autre type de terme de recherche) qui est comparée à toutes les entrées d’une base de données
3.6
couverture de requête
pourcentage de la requête (3.5) couvert par l’alignement (3.1) avec la séquence de la base de données
4 Symboles et termes abrégés
pb paires de bases
Glu acide glutamique, glutamate
ARNt ARN de transfert
cox1, COI gène du cytochrome c oxydase I
cytb gène du cytochrome b
ADN acide désoxyribonucléique
ARN acide ribonucléique
dNTP désoxyribonucléotide triphosphate
A adénine
C cytosine
G guanine
I inosine
R base purique (adénine ou guanine)
T thymine
Y base pyrimidique (cytosine ou thymine)
INN illicite, non déclarée et non réglementée
PCR réaction de polymérisation en chaîne
5 Principe
L’ADN est extrait des poissons et des produits à base de poisson à l’aide d’une méthode adaptée. Des segments
d’environ 460 paires de bases de cytb et/ou d’environ 650 paires de bases de cox1 sont amplifiés par réaction
de polymérisation en chaîne (PCR). Pour l’amplification du segment de cytb, un ensemble de deux amorces
est utilisé. L’amplification de cox1 utilise un ensemble de quatre amorces pour assurer l’amplification de
l’ADN du plus grand nombre possible d’espèces de poissons. Certaines des amorces utilisées comprennent
des bases ambiguës pour augmenter le nombre d’espèces détectées par les deux méthodes. Les séquences
des nucléotides des produits de la PCR sont déterminées à l’aide d’une méthode adaptée de séquençage de
l’ADN (comme la méthode de Sanger). Les deux amorces PCR utilisées pour générer l’amplicon cytb sont
également utilisées pour le séquençage. Les amorces de cox1 ont des terminaisons M13 qui permettent le
séquençage des amplicons cox1 à l’aide d’amorces de séquençage M13. La séquence déterminée est évaluée
par comparaison avec les entrées des bases de données de séquence pour permettre son attribution à une
espèce ou à un genre de poisson en fonction du degré d’identité avec les séquences disponibles.
Le choix de l’utilisation de segments de cytb, de cox1 ou des deux pour l’identification du poisson dépend
de l’espèce de poisson déclarée, en particulier de la facilité d’application de la méthode PCR à l’espèce de
poisson considérée et de la disponibilité des séquences de comparaison dans les bases de données publiques.
6 Réactifs et matériels
Pendant l’analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité reconnue et
appropriés à la biologie moléculaire et de l’eau déminéralisée, distillée ou de l’eau de pureté équivalente,
conformément à l’ISO 20813. L’organisation du laboratoire doit suivre l’ISO 20813.
1)
6.1 ADN polymérase thermostable .
1)
6.2 Tampon de réaction PCR (avec MgCl ou avec solution MgCl séparée) .
2 2
6.3 Mélange dNTP (dATP, dCTP, dGTP et dTTP).
NOTE Les dNTP peuvent également faire partie d’un master mix commercial pour la PCR.
6.4 Oligonucléotides (voir les Tableaux 1 et 2).
NOTE 1 Les abréviations des bases d’ADN dans les Tableaux 1 et 2 sont basées sur les recommandations
pour une nomenclature univoque, uniforme et cohérente, publiées par l’International Union of Pure and Applied
[4]
Chemistry (IUPAC) .
[1]
Tableau 1 — Oligonucléotides pour l’amplification de la région du gène cytb
Nom Séquence ADN de l’oligonucléotide
L14735 5’-AAA AAC CAC CGT TGT TAT TCA ACT A-3’
H15149ad 5’-GCI CCT CAR AAT GAY ATT TGT CCT CA-3’
NOTE 2 L’expérience menée en laboratoire a montré que les terminaisons M13 peuvent également être utilisées
avec des amorces de cytb.
[2][3]
Tableau 2 — Oligonucléotides pour l’amplification de la région du gène cox1
a
Nom Séquence ADN de l’oligonucléotide
VF2_t1 5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT CAA CCA ACC ACA AAG ACA TTG GCA C-3’
FishF2_t1 5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT CGA CTA ATC ATA AAG ATA TCG GCA C-3’
FishR2_t1 5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACA CTT CAG GGT GAC CGA AGA ATC AGA A-3’
FR1d_t1 5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACA CCT CAG GGT GTC CGA ARA AYC ARA A-3’
a
Les terminaisons M13 des amorces sont en gras et italique.
6.5 Tréhalose
6.6 Agarose
1) Au cours des études comparatives interlaboratoires, la solution tampon pour PCR prête à l’emploi comprenant ®
de l’ADN polymérase thermostable Maxima Hot Start PCR Master Mix (2 ×) de Fermentas GmbH a été utilisée pour
l’amplification de cytb. L’amplification de cox1 a été réalisée avec de l’ADN polymérase BIOTAQ™ de Bioline, un tampon
de réaction 10 × et une solution MgCl séparée. En plus des ADN polymérases BIOTAQ™ recommandés, d’autres
« mastermix » et polymérases ont été utilisés avec succès. La solution tampon pour PCR prête à l’emploi comprenant ®
de l’ADN polymérase thermostable Maxima Hot Start PCR Master Mix (2 ×) de Fermentas GmbH et l’ADN polymérase
BIOTAQ™ de Bioline sont des exemples de produits appropriés disponibles sur le marché. Cette information est donnée
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve l’emploi des produits ainsi
désignés.
6.7 Étalon de taille d’ADN
6.8 Amorces de séquençage (voir le Tableau 3).
[3]
Tableau 3 — Amorces de séquençage pour les produits de PCR cox1
Nom Séquence ADN de l’oligonucléotide
M13F (−21) 5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3’
M13R (−27) 5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’
7 Appareillage
En plus du matériel courant de laboratoire, il convient d’utiliser l’appareillage suivant.
7.1 Spectromètre UV ou fluoromètre pour déterminer la concentration d’ADN.
7.2 Thermocycleur
7.3 Dispositif d’électrophorèse sur gel
7.4 Système de documentation sur gel
7.5 Séquenceur d’ADN
8 Mode opératoire
8.1 Préparation de l’échantillon
La prise d’essai utilisée pour l’extraction de l’ADN doit être représentative de l’échantillon de laboratoire,
par exemple, en suivant les recommandations suivantes. Dans les échantillons qui se composent de
matières transformées (comme les plats préparés), les morceaux individuels de poisson doivent être
analysés séparément. Pour les échantillons composés de plusieurs morceaux, comme des sachets contenant
différents filets, les portions pour essai de chaque espèce de poisson présumée sont prélevées et analysées
séparément. Afin de réduire le plus possible le risque d’amplifier des contaminants adhérents, les matériaux
de l’échantillon d’essai ne doivent pas être prélevés à la surface de l’échantillon de laboratoire, voir également
[7]
l’ISO 20813 et l’ISO 22949-1 .
8.2 Extraction d’ADN
[5]
Il convient de respecter les instructions et les mesures générales spécifiées dans l’ISO 21571:2005 pour
l’extraction de l’ADN de l’échantillon d’essai. Par exemple, les méthodes d’extraction de l’ADN spécifiées
[5]
dans l’ISO 21571:2005, Annexe A , peuvent être utilisées. Il est possible d’utiliser des kits du commerce
pour l’extraction et la purification de l’ADN, si leur applicabilité pour l’extraction de l’ADN des poissons a été
confirmée expérimentalement.
8.3 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
8.3.1 Généralités
Des amorces universelles sont utilisées pour l’amplification de segments de cytb et de cox1 mitochondriaux.
L’amorce H15149ad est une amorce universelle avec des adaptations propres aux poissons qui se lie à la
[1]
section de cytb. L14735 se lie à une section au voisinage du gène hautement conservé ARNt-Glu . Les
amorces employées pour l’amplification du fragment de cox1 mitochondrial ont été conçues pour la région 5’
[2][3]
du cox1 des poissons .
Les deux ensembles d’amorces ont été soumis à essai par rapport à une très large gamme taxonomique
d’espèces de poissons. Il est actuellement établi que, à quelques exceptions près, la paire d’amorces L14735/
H15149ad n’a pas réagi sur des échantillons étiquetés barramundi (Lates calcarifer) ou perche du Nil (Lates
[6]
niloticus) . L’ensemble d’amorces de cox1 n’a échoué que dans une petite minorité de cas (< 5 % des espèces
[2]
soumises à essai) .
8.3.2 Déroulement de la PCR
La méthode a été validée pour un volume total de 25 µl (cytb) ou de 20 µl (cox1) par PCR. Les réactifs indiqués
dans les Tableaux 4 et 5 doivent être utilisés pour la PCR du cytb et du cox1, respectivement.
Les réactifs doivent être entièrement décongelés et il convient de les centrifuger brièvement avant utilisation.
Un mélange réactif pour PCR est préparé à partir de tous les composants de PCR dans les concentrations
indiquées, à l’exception de l’extrait d’ADN ou des témoins. La quantité du mélange pour PCR préparé dépend
du volume total par PCR et du nombre total de réactions, en prévoyant une réserve de pipetage suffisante.
Des résultats positifs de PCR sont prévisibles dès lors que la concentration en ADN est proche de 1 ng d’ADN
par μl de la solution finale [25 ng (cytb) ou 20 ng (cox1)].
Pour améliorer les résultats de la PCR, la quantité d’ADN peut être augmentée, par exemple pour accroître la
quantité d’ADN amplifié, ou réduite, par exemple pour éviter l’inhibition de la PCR.
Tableau 4 — Composants pour la PCR du cytb
Réactif (solution mère) Composition finale de la solution de réaction
Tampon PCR 1 ×
a
MgCl 1,5 mmol/l
a
Mélange dNTP 0,2 mmol/l de chaque dNTP
Amorce L14735 500 nmol/l
Amorce H15149ad 500 nmol/l
ADN polymérase thermostable 0,5 à 1 unité
Eau Ajouter pour l’obtention du volume final
Échantillon d’ADN Environ 1 ng/µl
a
Réactif à n’utiliser que s’il n’est pas déjà inclus dans le tampon PCR.
Tableau 5 — Composants pour la PCR du cox1
Réactif (solution mère) Composition finale de la solution de réaction
a
Tréhalose 5 %
Tampon PCR 1 ×
b
MgCl 2,5 mmol/l
b
Mélange dNTP 0,2 mmol/l de chaque dNTP
Amorce VF2_t1 100 nmol/l
Amorce FishF2_t1 100 nmol/l
Amorce FishR2_t1 100 nmol/l
Amorce FR1d_t1 100 nmol/l
ADN polymérase thermostable 0,5 unité
Eau Ajouter pour l’obtention du volume final
Échantillon d’ADN Environ 1 ng/µl
a
Facultatif.
b
Réactif à n’utiliser que s’il n’est pas déjà inclus dans le tampon PCR.
Mélanger les réactifs pour PCR, centrifuger brièvement et répartir pour les réactions individuelles. Pipeter
les extraits d’ADN à étudier ou les témoins de PCR (voir 8.3.3) dans les différentes solutions de réaction.
Pour plus d’informations sur les témoins de PCR, voir également l’ISO 20813.
8.3.3 Témoins de PCR
En plus des réactions préparées pour les échantillons à analyser, un témoin de réactif d’amplification et un
témoin négatif d’extraction conformément à l’ISO 20813 doivent être inclus.
Un témoin positif d’ADN cible (voir l’ISO 20813) peut être utilisé pour démontrer la capacité de la PCR à
amplifier la séquence cible. Il est possible d’utiliser, en tant que substance de témoin positif, l’ADN génomique
extrait d’une espèce connue de poisson ou un plasmide disponible contenant la séquence cible.
Si un échantillon ne présente aucune amplification pour les deux cibles, il convient de réaliser une réaction
de témoin d’inhibition pour exclure qu’une inhibition de la PCR en soit la cause (voir l’ISO 20813). Pour cela,
il est possible soit de diluer l’échantillon d’ADN, soit de réaliser un essai de témoin d’inhibition interne.
Des témoins de PCR supplémentaires peuvent être utilisés, voir l’ISO 20813.
8.3.4 Cycle thermique
Transférer les réactions préparées dans le thermocycleur et commencer le programme température/temps.
Les programmes température/temps comme décrits dans les Tableaux 6 et 7 ont été utilisés avec succès
dans les études comparatives interlaboratoires.
NOTE L’emploi de différentes conditions de réactifs et des thermocycleurs peut exiger une optimisation spécifique.
La durée de la dénaturation initiale dépend de l’ADN polymérase thermostable utilisée.
Tableau 6 — Programme température/temps pour la PCR du cytb
Étape Paramètre Température Temps Cycles
Dénaturation initiale de l’ADN et activa-
1 tion de l’ADN polymérase à démarrage à 95 °C 15 min 1
chaud « Hot start » (le cas échéant)
Dénaturation 95 °C 40 s
2 Amplification Hybridation 50 °C 80 s 35
Allongement 72 °C 80 s
3 Allongement final 72 °C 10 min 1
Tableau 7 — Programme température/temps pour la PCR du cox1
Étape Paramètre Température Temps Cycles
Dénaturation initiale de l’ADN et
activation de l’ADN polymérase à
1 94 °C 2 min 1
démarrage à chaud « Hot start »
(le cas échéant)
Dénaturation 94 °C 30 s
2 Amplification Hybridation 52 °C 40 s 35
Allongement 72 °C 60 s
3 Allongement final 72 °C 10 min 1
Une fois le cycle thermique de la PCR terminé, procéder ensuite à l’évaluation des produits PCR ou conserver
les échantillons au réfrigérateur jusqu’à analyse ultérieure.
8.4 Évaluation des ADN amplifiés
Il convient d’évaluer la qualité du produit PCR et d’estimer sa quantité (par exemple, par électrophorèse sur
gel d’agarose).
L’électrophorèse sur gel d’agarose de l’ADN est une technique usuelle de biologie moléculaire et seules des
conditions générales à adapter par chaque laboratoire sont donc suggérées ici.
Un volume de 1 µl à 10 µl de chaque produit PCR est séparé dans un gel d’agarose, par exemple,
de concentration adaptée (une fraction massique de 1 % à 2 % par volume, par exemple) et évalué avec un
système de documentation sur gel. L’un des puits contient un étalon approprié de taille d’ADN aux fins de
comparaison. Pour la PCR de cytb, il convient qu’un ADN amplifié d’environ 460 pb soit clairement visible
après l’électrophorèse sur gel, contre 700 pb pour la PCR de cox1 (ce qui inclut les terminaisons M13).
Il convient qu’aucun amplicon du témoin de réactif d’amplification ni du témoin négatif d’extraction ne soit
visible. Pour le témoin positif d’ADN cible, il convient qu’un ADN amplifié de la taille prévue soit visible.
8.5 Évaluation des résultats de la PCR
La PCR de cytb, la PCR de cox1 ou les deux peuvent présenter un résultat positif ou négatif d’amplification de
la ou des séquences cibles.
En fonction des résultats de la PCR, les mesures à prendre sont les suivantes :
— si l’échantillon est positif pour l’une des deux cibles (cytb et/ou cox1), l’étape suivante est le séquençage
de l’un ou l’autre ADN amplifié (voir 9.1) ;
— si l’échantillon est négatif pour les cibles, que les résultats des témoins sont acceptables et que l’échantillon
n’a présenté aucune inhibition (8.3.3), il est possible que l’un des cas suivants s’applique :
— les amorces ne s’apparie
...
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