ISO 5509:2000
(Main)Animal and vegetable fats and oils — Preparation of methyl esters of fatty acids
Animal and vegetable fats and oils — Preparation of methyl esters of fatty acids
Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation des esters méthyliques d'acides gras
La présente Norme internationale spécifie des méthodes de préparation des esters méthyliques d'acides gras.Elle comprend des méthodes de préparation des esters méthyliques d'acides gras à partir des corps gras d'origines animale et végétale, des acides gras et des savons. Afin de répondre à différentes exigences, trois méthodes de méthylation sont spécifiées, à savoir:a) la méthode au trifluorure de bore (BF3) (voir l'article 3);b) la méthode à l'hydroxyde de triméthylsulfonium (TMSH) (voir l'article 4);c) la méthode de transestérification (voir l'article 5).Les esters méthyliques ainsi obtenus peuvent être utilisés dans diverses méthodes d'analyse exigeant des produits dérivés de ce type, telles que la chromatographie en phase gazeuse (CPG), la chromatographie en couche mince (CCM) ou la spectrométrie à infrarouge (IR).
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 5509
Second edition
2000-04-01
Animal and vegetable fats and oils —
Preparation of methyl esters of fatty acids
Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation des esters
méthyliques d'acides gras
Reference number
ISO 5509:2000(E)
©
ISO 2000
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 5509:2000(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but shall not
be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In downloading this
file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat accepts no liability in this
area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation parameters
were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In the unlikely event
that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
© ISO 2000
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means, electronic
or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or ISO's member body
in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 � CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 734 10 79
E-mail copyright@iso.ch
Web www.iso.ch
Printed in Switzerland
ii © ISO 2000 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 5509:2000(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 5509 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Agricultural food products,
Subcommittee SC 11, Animal and vegetable fats and oils.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 5509:1978), which has been technically revised.
Annex A forms a normative part of this International Standard. Annex B is for information only.
© ISO 2000 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 5509:2000(E)
Introduction
ISO 5509 contains three different procedures to prepare methyl esters.
The general method is the BF method which is applicable to oils and fats and free fatty acids but which is less
3
applicable to caproic acid (C6) and not applicable to butyric acid (C4). The application field is GLC, TLC and IR.
Two alternative methods not involving BF are given using trimethylsulfonium hydroxide and potassium hydroxide
3
in methanol. Both methods are rapid methods for GLC analysis only.
The second method (trimethylsulfonium hydroxide method), which is for GLC analyses only, can be used for all fats
and oils including milk fat and milk fat containing blends. In the case of short fatty acids (C4 to C8) the use of an
internal standard is recommended.
The third method (trans-esterification method) can be used for neutral oils and fats, and can also be used for the
quantitative analysis of oils and fats with short-chain fatty acids down to butyric acid (C4). For the determination of
C4 and/or C6, only the internal standard method is maintained.
The principal new approach in this revision is the use of isooctane as solvent instead of hexane or pentane. This is
based on references [1] and [2], which showed better results especially for the BF method when using isooctane.
3
iv © ISO 2000 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 5509:2000(E)
Animal and vegetable fats and oils — Preparation of methyl esters
of fatty acids
1 Scope
This International Standard specifies methods of preparing the methyl esters of fatty acids.
It includes methods for preparing fatty acid methyl esters from animal and vegetable fats and oils, fatty acids and
soaps. To cover different requirements, three methylation methods are specified, as follows:
a) boron trifluoride (BF ) method (see clause 3);
3
b) trimethylsulfonium hydroxide (TMSH) method (see clause 4);
c) trans-esterification method (see clause 5).
Methyl esters so produced are used in various analytical procedures requiring such derivatives, for example gas-
liquid chromatography (GLC), thin-layer chromatography (TLC) and infrared spectrometry (IR).
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods.
3 General method using boron trifluoride
WARNING — The method described involves the use of potentially hazardous reagents. Normal
precautions shall be taken for eye protection and for protection from the dangers of corrosive chemical
burns.
Boron trifluoride is poisonous. For this reason, it is not recommended that the analyst prepare the
methanolic solution of boron trifluoride from methanol and boron trifluoride. (See A.1 in annex A.)
3.1 Principle
The glycerides are saponified with methanolic sodium hydroxide. The soaps are converted into methyl esters by
reaction with a boron trifluoride/methanol complex.
For analysis of pure fatty acids and soaps, saponification with sodium hydroxide is not necessary and esters can be
prepared directly by reaction with boron trifluoride.
© ISO 2000 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 5509:2000(E)
3.2 Applicability
This method is to be preferred for most oils, fats and derivatives (fatty acids, soaps) with the exception of milk fats
and of fats containing fatty acids with specific groups.
During esterification, compounds containing the following configurations may be totally or partially decomposed:
� keto, epoxy, hydroxy, hydroperoxy groupings;
� cyclopropyl and cyclopropenyl groups;
� acetylenic fatty acids.
If the fatty matter contains such compounds in only very small amounts (e.g. cottonseed oil), the method can be
applied; otherwise the method described in clause 4 or 5 should be followed.
For gas chromatography, the optimum recovery of the methyl esters from the reaction mixture is obtained by using
isooctane. However, only about 75 % of the methyl caproate (C6) present will be recovered.
3.3 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade.
3.3.1 Water, complying with grade 3 of ISO 3696.
3.3.2 Sodium hydroxide, methanolic solution, approximately 0,5 mol/l.
Dissolve 2 g of sodium hydroxide in 100 ml of methanol containing not more than 0,5 % (mass fraction) of water. If
the solution has to be stored for a considerable time, a small amount of white precipitate of sodium carbonate may
be formed; this has no effect on the preparation of the methyl esters.
1�
3.3.3 Boron trifluoride (BF ), methanolic solution, 12 % to 15 % (mass fraction) .See A.1.
3
3.3.4 Isooctane (2,2,4-trimethylpentane), of chromatographic quality. See A.2.
WARNING — Isooctane is flammable and a fire risk. Explosive limits in air are 1,1 % to 6,0 % (volume
fraction). It is toxic by ingestion and inhalation. Use a properly operating fume hood when working with
this solvent.
3.3.5 Sodium chloride, saturated aqueous solution.
3.3.6 Sodium sulfate, anhydrous.
3.3.7 Nitrogen, having an oxygen content less than 5 mg/kg.
3.3.8 Hexane, of chromatographic quality, for dry methyl esters only. See A.2. Light petroleum, boiling range
40 °C to 60 °C, redistilled and residue-free, with a bromine value less than 1, may be used.
3.3.9 Methyl red, 1 g/l solution in 60 % (volume fraction) ethanol.
1� 14 %, 20 % (Merck No. 8.01663) and 50 % solutions are available commercially. This information is given for the
convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of these products.
2 © ISO 2000 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 5509:2000(E)
3.4 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
3.4.1 Flask, of capacity 50 ml or 100 ml, with ground neck and fitted with a ground glass stopper.
3.4.2 Reflux condenser, of 20 cm to 30 cm effective length, with a ground joint to fit the flask (3.4.1).
3.4.3 Boiling aid, fat-free.
3.4.4 Graduated or automatic pipette, of capacity at least 10 ml, and fitted with a rubber bulb.
3.4.5 Vial, of capacity 4 ml, with screw cap.
3.4.6 Separating funnels, of capacity 250 ml, for dry methyl esters only.
3.4.7 Rotary evaporator.
3.4.8 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 0,001 g.
3.5 Preparation of test sample
The test sample shall be liquid, dry and clear. Proceed in accordance with ISO 661, but heat the sample to just
above the melting point.
3.6 Procedure
WARNING — Because of the toxic character of boron trifluoride, perform the methylation under a
ventilated hood. It is essential to wash all glassware with water immediately after use.
3.6.1 Test portion
Use Table 1 to select the appropriate size of flask and quantities of reagents and solvents required to methylate the
amount of test portion chosen.
Table 1
Test Flask NaOH solution BF solution Solvent
3
portion (3.4.1) (3.3.2) (3.3.4) or (3.3.8)
(3.3.3)
Purpose
mg ml ml ml
ml
100 to 250 50 4 5 1to3
GLC
250 to 500 50 6 7 2to5
500 to 750 100 8 9 4to8
IR/TLC
750 to 1 000 100 10 12 7to10
3.6.2 Saponification
3.6.2.1 For fats and oils, start the method at 3.6.2.2.
For fatty acids and soaps, start the method at 3.6.2.3.
3.6.2.2 Introduce the test portion into the appropriate flask. See Table 1 and annex A. Add the appropriate
amount (see Table 1) of the methanolic sodium hydroxide solution (3.3.2) and a boiling aid (3.4.3). Fit the
condenser (3.4.2) to the flask.
If the fatty acids contain more than two double bonds, remove the air from the flask by flushing the flask with dry
nitrogen (3.3.7) immediately prior to the reflux for a few minutes.
© ISO 2000 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 5509:2000(E)
Boil under reflux until the droplets of fat disappear, swirling the flask gently every 30 s to 1 min to prevent a solid
ring of sodium hydroxide forming around the walls of the flask. This usually takes 5 min to 10 min, but in certain
exceptional cases it may take longer. See A.3 and A.4. Add the appropriate amount (see Table 1) of the methanolic
boron trifluoride solution (3.3.3) through the top of the condenser.
Proceed in accordance with either 3.6.3 or 3.6.4.
3.6.2.3 Introduce the test portion into the appropriate flask (see Table 1). Add the appropriate amount (see
Table 1) of the methanolic boron trifluoride solution (3.3.3) into the flask. Fit the condenser (3.4.2) to the flask.
Proceed in accordance with either 3.6.3 or 3.6.4.
3.6.3 Preparation of the methyl esters in isooctane solution (mainly for gas liquid chromatography purposes)
3.6.3.1 Continue boiling for 3 min. In the case of oils with long-chain fatty acids, such as fish oils, continue
boiling for 30 min.
3.6.3.2 Add the appropriate amount (see Table 1) of isooctane (3.3.4) to the boiling mixture through the top of
the condenser.
3.6.3.3 Remove the flask from the heat source and remove the reflux condenser. IMMEDIATELY, without
allowing the flask to cool, add 20 ml of sodium chloride solution (3.3.5). Stopper the flask and shake it vigorously for
at least 15 s.
3.6.3.4 Add more of the saturated sodium chloride solution (3.3.5) to bring the liquid level of the mixture into
the neck of the flask. Allow the two phases to separate.
3.6.3.5 Transfer 1 ml to 2 ml of the upper isooctane layer into a 4 ml vial (3.4.5) and add a small amount of
anhydrous sodium sulfate (3.3.6) to remove any traces of water.
The isooctane solution thus obtained may be injected as follows:
a) directly onto a packed column for gas-liquid chromatography (see A.5);
b) after appropriate dilution with isooctane for capillary column systems prior to the injection (see A.6);
c) after dilution with a lower boiling solvent such as heptane for the special case of capillary on-column injection.
3.6.4 Preparation of dry methyl esters (for TLC or IR spectroscopy)
3.6.4.1 Continue boiling for 3 min.
3.6.4.2 Add the appropriate amount (see Table 1) of hexane (3.3.8) to the boiling mixture through the top of
the condenser.
3.6.4.3 Remove the flask from the heat source and remove the reflux condenser. IMMEDIATELY, without
allowing the flask to cool, add 20 ml sodium chloride solution (3.3.5). Stopper the flask and shake it vigorously for at
least 15 s.
3.6.4.4 Transfer the saline solution and hexane layer to a 250 ml separation funnel (3.4.6). Add about 30 ml of
the saturated sodium chloride solution. Allow the two phases to separate. Retain the hexane solution. Extract the
saline solution twice with 50 ml portions of hexane (3.3.8).
3.6.4.5 Combine the hexane solution and the two extracts and wash them with 20 ml portions of water (3.3.1)
until no free acid is obtained, using the methyl red solution (3.3.9) as indicator.
Dry over anhydrous sodium sulfate (3.3.6). Filter the solution and evaporate the solvent cautiously on a water bath
under a stream of nitrogen (3.3.7) or use a rotary evaporator (3.4.7).
If the remaining portion contains a considerable amount of short-chain methyl esters (C6 to C10), a substantial loss
of these can hardly be avoided. For test portions less than 500 mg, it is preferable to reduce proportionally the
volumes of sodium chloride solution, solvent and water. See A.6.
4 © ISO 2000 – All rights reserved
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 5509:2000(E)
4 Trimethylsulfonium hydroxide (TMSH) method
WARNING — The method described involves the use of potentially hazardous reagents. Normal
precautions shall be taken for eye protection and for protection from the dangers of corrosive chemical
burns. Trimethylsulfonium hydroxide may be poisonous.
4.1 Principle
The test sample is dissolved in t-butyl methyl ether and the methyl esters are prepared by trans-esterification with
trimethylsulfonium hydroxide (TMSH). Immediate injection in the gas chromatograph at an injector temperature of
above 250 °C. In the presence of short-chain fatty acids (4 to 8 carbon atoms), the use of valeric acid methyl ester
is recommended as an internal standard (see 4.2).
4.2 Applicability
This rapid method is only for the preparation of methyl esters for GLC. It is applicable to all fats and oils including
milk fat and blends containing milk fat. Isomerization of unsaturated fatty acids has not been observed.
The method can be applied to compounds containing the chemical configurations listed in 3.2, but it is not known
whether an entire conversion into methyl esters will take place. Also free fatty acids are only esterified by about
70%to80%.
Lipids containing hydroxy groups are partially converted to the corresponding O-methyl ether derivatives which may
interfere with fatty acid methyl esters (FAME) in GLC separation. Therefore the TMSH derivatization method is not
recommended without limitation for lipids containing hydroxy groups. On the other hand it may be of some
diagnostic value for the analysis of such lipids by GLC/mass spectrometry.
The TMSH procedure cannot be applied when cold-on-column injection is used in GLC analysis. Moreover the use
of polar stationary phases (cyanopropyl siloxanes) is not recommended.
For the determination of short-chain fatty acids (C4 to C8), the use of valeric acid methyl ester (methyl pentanoate)
as an internal standard is recommended, provided there is no valeric acid in the sample.
4.3 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade.
4.3.1 t-Butylmethylether.
2�
4.3.2 Trimethylsulfonium hydroxide (TMSH) , methanolic solution, 0,2 mol/l.
The solution remains stable for at least 2 months if stored at 4 °C in small quantities in a closed tube.
NOTE Reference [3] gives a method of preparation.
4.3.3 Internal standard stock solution, for butyric and/or caproic acid determination only.
Weigh, to the nearest 0,1 mg, about 250 mg of valeric acid methyl ester into a 50 ml volumetric flask. Use
isooctane to dissolve the sample and to dilute to the mark.
4.3.4 Internal standard reference solution, for butyric and/or caproic acid determination only.
Add 10 ml of stock solution (4.3.3) to a 100 ml volumetric flask and dilute to the mark with isooctane. Calculate the
concentration of this reference solution. See A.8.
2� Trimethylsulfonium hydroxide (Article 70152) is available from Macherey-Nagel GmbH Co., D-52313 Düren. This
information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO
of this product.
© ISO 2000 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 5509:2000(E)
4.3.5 Petroleum ether.
4.3.6 Sodium sulfate, anhydrous.
4.4 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
4.4.1 Test tubes, of capacity 2 ml, with ground glass stoppers (autosampler vials).
4.4.2 Graduated pipettes, of capacity 1 000�l.
4.4.3 Volumetric flasks, of capacities 50 ml and 100 ml.
4.4.4 Fluted filter paper.
4.4.5 Rotary evaporator.
4.5 Preparation of test sample
The test sample shall be liquid, dry and clear. Proceed in accordance with ISO 661, but heat the sample to just
above the melting point.
4.6 Procedure
4.6.1 Test portion
Weigh into the test tube (4.4.1) 10 mg� 2 mg of the test portion.
In the case of samples with higher water content, use a larger test portion.
Melt solid samples carefully at a temperature of approx. 10 °C above their melting point and mix. Avoid
overheating.
Dissolve samples containing water in petroleum ether (4.3.5) and dry them for 30 min by addition of anhydrous
sodium sulfate (4.3.6). Remove the drying agent by filtration through a fluted filter paper and wash the residue
carefully with petroleum ether. Remove the solvent with the aid of a rotary evaporator (4.4.5).
4.6.2 Preparation of methyl esters
4.6.2.1 Using a pipette (4.4.2), add 500�l t-butyl methyl ether and dissolve the sample, gently warming if
necessary.
For butyric and/or caproic acid determination, add 500�l of the internal standard reference solution (4.3.4) instead
of 500�lofthe t-butyl methyl ether.
4.6.2.2 To this solution add, using a pipette (4.4.2), 250�l of TMSH solution (4.3.2) and shake vigorously for
about 30 s. See A.7.
4.6.2.3 The obtained solution (4.6.2.2) is ready for injection in the gas chromatograph. As the methyl esters
of free fatty acids are only formed during injection, an injector temperature of at least 250 °C is required. See A.2
and A.7.
If it is necessary to dilute the solution prior to injection, use a mixture of t-butyl methyl ether (4.3.1) and methanol
(9+1) to avoid precipitation of TMSH.
6 © ISO 2000 – All rights reserved
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 5509:2000(E)
5 Trans-esterification method
WARNING — The method described involves the use of potentially hazardous reagents. Normal
precautions shall be taken for eye protection and for protection from the dangers of corrosive chemical
burns. Methanolic potassium hydroxide solution is poisonous.
5.1 Principle
The glycerides are dissolved in isooctane and converted to methyl esters by trans-esterification with potassium
hydroxide. After the reaction has finished, the potassium hydroxide is neutralized with sodium hydrogen sulfate to
prevent saponification of the methyl esters.
5.2 Applicability
This rapid method is applicable to edible fats and oils containing fatty acids down to C4, having a free fatty acids
content (FFA) of not greater than 2 %, and for the determination of butyric acid (C4) or caproic acid (C6) by GLC by
using an internal standard.
For samples with a higher FFA, an excess of potassium hydroxide should be used. As free fatty acids and soaps
are not esterified by potassium hydroxide, the method can be used to obtain methyl esters of the glyceride part of
the sample only.
The method can be a
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 5509
Deuxième édition
2000-04-01
Corps gras d'origines animale et
végétale — Préparation des esters
méthyliques d'acides gras
Animal and vegetable fats and oils — Preparation of methyl esters of fatty
acids
Numéro de référence
ISO 5509:2000(F)
©
ISO 2000
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 5509:2000(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier peut
être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence autorisant
l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées acceptent de fait la
responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute responsabilité en la
matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info du
fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir l'exploitation de
ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation, veuillez en informer le
Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
© ISO 2000
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l’ISO à
l’adresse ci-après ou du comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 � CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax. + 41 22 734 10 79
E-mail copyright@iso.ch
Web www.iso.ch
ImpriméenSuisse
ii © ISO 2000 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 5509:2000(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments de la présente Norme internationale peuvent faire
l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 5509 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits agricoles
alimentaires, sous-comité SC 11, Corps gras d'origines animale et végétale.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 5509:1978), dont elle constitue une révision
technique.
L’annexe A constitue un élément normatif de la présente Norme internationale. L’annexe B est donnée uniquement
à titre d’information.
© ISO 2000 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 5509:2000(F)
Introduction
L'ISO 5509 décrit trois modes opératoires différents destinés à la préparation des esters méthyliques.
La méthode générale est la méthode au BF , qui peut s'appliquer aux corps gras et aux acides gras libres, mais
3
qui convient moins bien à l'acide caproïque (C6) et ne s'applique pas à l'acide butyrique (C4). Le domaine
d'application est la CPG, la CCM et l'IR.
Deux méthodes alternatives ne faisant pas intervenir le BF sont présentées, utilisant l'hydroxyde de
3
triméthylsulfonium et l'hydroxyde de potassium dans le méthanol. Toutes deux sont des méthodes rapides
destinées uniquement à l'analyse par CPG.
La deuxième méthode (méthode à l’hydroxyde de triméthylsulfonium), destinée uniquement à l'analyse par CPG,
peut être employée pour tous les corps gras, y compris les corps gras laitiers et les corps gras laitiers en mélange.
Dans le cas des acides gras à chaînes courtes (C4 à C8), il est conseillé d'avoir recours à un étalon interne.
La troisième méthode (méthode de transestérification), qui peut s'appliquer aux corps gras neutres, est également
utilisable pour l'analyse quantitative des corps gras contenant des acides gras à chaînes courtes descendant
jusqu'à l'acide butyrique (C4). La méthode utilisant l'étalon interne est maintenue uniquement dans le cas de la
détermination de C4 et/ou de C6.
Principalement, la nouvelle approche abordée dans la présente révision consiste à employer l'iso-octane comme
solvant, au lieu de l'hexane ou du pentane. Cette méthode repose sur les publications référencées [1] et [2] qui
démontrent que l'on obtient de meilleurs résultats, notamment pour la méthode au BF , lorsque l'iso-octane est
3
utilisé.
iv © ISO 2000 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 5509:2000(F)
Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation des
esters méthyliques d'acides gras
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie des méthodes de préparation des esters méthyliques d'acides gras.
Elle comprend des méthodes de préparation des esters méthyliques d'acides gras à partir des corps gras
d'origines animale et végétale, des acides gras et des savons. Afin de répondre à différentes exigences, trois
méthodes de méthylation sont spécifiées, à savoir:
a) la méthode au trifluorure de bore (BF ) (voir l'article 3);
3
b) la méthode à l'hydroxyde de triméthylsulfonium (TMSH) (voir l'article 4);
c) la méthode de transestérification (voir l'article 5).
Les esters méthyliques ainsi obtenus peuvent être utilisés dans diverses méthodes d'analyse exigeant des produits
dérivés de ce type, telles que la chromatographie en phase gazeuse (CPG), la chromatographie en couche mince
(CCM) ou la spectrométrie à infrarouge (IR).
2 Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s’applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 661, Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation de l'échantillon pour essai.
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai.
3 Méthode générale utilisant le trifluorure de bore
AVERTISSEMENT — La méthode décrite implique l'utilisation de réactifs présentant un danger potentiel.
Les précautions habituelles doivent être prises pour la protection des yeux et contre les risques de
brûlures par les produits chimiques corrosifs.
Le trifluorure de bore est un composé toxique. C'est pourquoi il n'est pas recommandé à l'analyste de
préparer la solution méthanolique de trifluorure de bore à partir de méthanol et de trifluorure de bore. (Voir
l’article A.1 de l'annexe A.)
© ISO 2000 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 5509:2000(F)
3.1 Principe
Saponification des glycérides avec de l'hydroxyde de sodium méthanolique. Conversion des savons en esters
méthyliques par réaction avec un complexe de trifluorure de bore/méthanol.
Dans le cas d'analyses portant sur des acides gras purs et des savons, la saponification à l'hydroxyde de sodium
n'est pas nécessaire et les esters peuvent être préparés directement par réaction avec le trifluorure de bore.
3.2 Champ d’application
Cette méthode est recommandée pour la plupart des corps gras et produits dérivés (acides gras, savons),
à l'exception des corps gras laitiers et des graisses renfermant des acides gras avec des groupes spécifiques.
Durant l'estérification, les composés contenant les configurations suivantes peuvent subir une décomposition totale
ou partielle:
� groupes céto, époxy, hydroxy, hydroperoxy;
� groupes cyclopropyliques et cyclopropényliques;
� acides gras acétyléniques.
Si la matière grasse ne renferme de tels composés qu'en très faible proportion (par exemple l'huile de coton), la
méthode peut être utilisée; dans le cas contraire, il convient d'adopter la méthode décrite à l'article 4 ou à l'article 5.
Dans le cas de la chromatographie en phase gazeuse, les esters méthyliques issus du mélange réactif sont
récupérés de façon optimale avec l'iso-octane. Toutefois, le caproate de méthyle (C6) présent n'est récupéré qu'à
concurrence de 75 % environ.
3.3 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
3.3.1 Eau, de qualité 3, conformément à l’ISO 3696.
3.3.2 Hydroxyde de sodium, solution méthanolique, à environ 0,5 mol/l.
Dissoudre 2 g d'hydroxyde de sodium dans 100 ml de méthanol contenant au plus 0,5 % (fraction massique) d'eau.
En cas de conservation nécessaire de la solution pendant une longue période, une petite quantité de précipité
blanc de carbonate de sodium est susceptible de se former; ce phénomène n'influe pas sur la préparation des
esters méthyliques.
1)
3.3.3 Trifluorure de bore (BF ), solution méthanolique, de 12 % à 15 % (fraction massique) . Voir l’article A.1.
3
3.3.4 Iso-octane (2,2,4-triméthylpentane), de qualité chromatographique. Voir l’article A.2.
AVERTISSEMENT — L’iso-octane est un produit inflammable et présente un risque incendie. Il explose
spontanément au contact de l’air à une concentration comprise entre 1,1 % (fraction volumique) et
6,0 % (fraction volumique). Il est très toxique à l’ingestion comme à l’inhalation. Manipuler ce solvant sous
une hotte aspirante en bon état de marche.
3.3.5 Chlorure de sodium, solution aqueuse saturée.
1) Des solutions à 14 %, à 20 % (produit fourni par Merck, réf. 8.01663) et à 50 % sont disponibles dans le commerce. Cette
information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO
approuve ou recommande l'emploi exclusif des produits ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est
démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats.
2 © ISO 2000 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 5509:2000(F)
3.3.6 Sulfate de sodium,anhydre.
3.3.7 Azote, à teneur en oxygène inférieure à 5 mg/kg.
3.3.8 Hexane, de qualité chromatographique, destiné uniquement aux esters méthyliques secs. Voir l’article A.2.
Il est possible d'utiliser de l’éther de pétrole ayant un point d'ébullition compris entre 40 °C et 60 °C, redistillé et
exempt de résidus, et présentant un indice de brome inférieur à 1.
3.3.9 Rouge de méthyle, solution à 1 g/l dans de l'éthanol à 60 % (fraction volumique).
3.4 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
3.4.1 Ballon, de 50 ml ou 100 ml de capacité, à col rond et équipé d'un bouchon en verre rodé.
3.4.2 Réfrigérant à reflux, de 20 cm à 30 cm de longueur utile, équipé d'un rodage adaptable au ballon (3.4.1).
3.4.3 Régulateur d'ébullition, exempt de matières grasses.
3.4.4 Pipette graduée, d'une contenance d'au moins 10 ml et munie d'une poire pour pipette, ou pipette
automatique.
3.4.5 Flacon, de 4 ml de capacité, muni d'un bouchon à vis.
3.4.6 Ampoules à décanter, de 250 ml de capacité, destinées uniquement aux esters méthyliques secs.
3.4.7 Évaporateur rotatif.
3.4.8 Balance analytique, capable de peser à 0,001 g près.
3.5 Préparation de l'échantillon pour essai
L'échantillon pour essai doit être liquide, sec et limpide. Opérer conformément à l'ISO 661, mais en chauffant
l'échantillon juste au-dessus de son point de fusion.
3.6 Mode opératoire
AVERTISSEMENT — En raison du caractère toxique du trifluorure de bore, réaliser la méthylation sous une
hotte ventilée. Il est primordial de nettoyer toute la verrerie avec de l'eau immédiatement après emploi.
3.6.1 Prise d'essai
Consulter le Tableau 1 pour sélectionner les dimensions adéquates des ballons ainsi que les quantités de réactifs
et de solvants nécessaires à la méthylation de la prise d'essai choisie.
Tableau 1
Procédé Prise d'essai Ballon Solution de NaOH Solution de BF Solvant
3
(3.4.1) (3.3.2) (3.3.3) (3.3.4) ou (3.3.8)
mg ml ml ml ml
CPG 100 à 250 50 4 5 1 à 3
250 à 500 50 6 7 2 à 5
IR/CCM 500 à 750 100 8 9 4 à 8
750 à 1 000 100 10 12 7 à 10
© ISO 2000 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 5509:2000(F)
3.6.2 Saponification
3.6.2.1 Dans le cas des corps gras, commencer la méthode en 3.6.2.2.
Dans le cas des acides gras et des savons, commencer la méthode en 3.6.2.3.
3.6.2.2 Introduire la prise d'essai dans le ballon approprié. Voir le Tableau 1 et l’annexe A. Ajouter la quantité
adéquate (voir Tableau 1) de solution méthanolique d'hydroxyde de sodium (3.3.2) ainsi que le régulateur
d'ébullition (3.4.3). Adapter le réfrigérant (3.4.2) au ballon.
En présence d'acides gras contenant plus de deux doubles liaisons, éliminer l'air contenu dans le ballon par
barbotage d'azote sec (3.3.7) dans la solution, pendant quelques minutes juste avant le reflux.
Porter à ébullition sous reflux jusqu'à disparition des gouttelettes de matière grasse, en tournant doucement le
ballon toutes les 30 s à 1 min afin d’éviter qu’un anneau solide d’hydroxyde de sodium ne se forme sur les parois
du ballon. La durée de cette opération oscille généralement entre 5 min et 10 min, mais dans certains cas
exceptionnels, cela peut prendre plus de temps. Voir les articles A.3 et A.4. Ajouter la quantité appropriée (voir
Tableau 1) de solution méthanolique de trifluorure de bore (3.3.3) par le haut du réfrigérant.
Procéder comme indiqué en 3.6.3 ou en 3.6.4, selon les cas.
3.6.2.3 Introduire la prise d'essai dans le ballon approprié (voir Tableau 1). Ajouter dans le ballon la quantité
adéquate (voir Tableau 1) de solution méthanolique de trifluorure de bore (3.3.3). Adapter le réfrigérant (3.4.2) au
ballon.
Procéder comme indiqué en 3.6.3 ou en 3.6.4, selon les cas.
3.6.3 Préparation des esters méthyliques en solution d'iso-octane (principalement pour les besoins de la
chromatographie en phase gazeuse)
3.6.3.1 Poursuivre l'ébullition pendant 3 min. Dans le cas des huiles contenant de longues chaînes d'acides
gras, telles que les huiles de poisson, poursuivre l'ébullition durant 30 min.
3.6.3.2 Ajouter, dans le mélange en ébullition, la quantité appropriée (voir Tableau 1) d'iso-octane (3.3.4) par
le haut du réfrigérant.
3.6.3.3 Retirer le ballon de la source de chaleur et débrancher le réfrigérant à reflux. Ajouter
IMMÉDIATEMENT, sans laisser le ballon refroidir, 20 ml de solution de chlorure de sodium (3.3.5). Boucher le
ballon et agiter vigoureusement celui-ci pendant au moins 15 s.
3.6.3.4 Poursuivre l'ajout de solution saturée de chlorure de sodium (3.3.5) afin d'amener la hauteur du liquide
au niveau du col du ballon. Laisser s'opérer la séparation des deux phases.
3.6.3.5 Transvaser 1 ml à 2 ml de la couche supérieure d'iso-octane dans un flacon de 4 ml (3.4.5) et ajouter
une petite quantité de sulfate de sodium anhydre (3.3.6) pour éliminer les traces d'eau.
La solution d'iso-octane ainsi obtenue peut être injectée de la manière suivante:
a) directement dans la colonne remplie [pour la chromatographie en phase gazeuse (voir l’article A.5)];
b) après dilution appropriée avec de l'iso-octane, avant injection [pour les systèmes à colonnes capillaires (voir
l’article A.6)];
c) après dilution de la solution à l'aide d'un solvant à point d'ébullition moins élevé, tel que l'heptane (dans le cas
particulier de l'injection «on column»).
4 © ISO 2000 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 5509:2000(F)
3.6.4 Préparation des esters méthyliques secs (pour CCM ou spectroscopie IR)
3.6.4.1 Poursuivre l'ébullition pendant 3 min.
3.6.4.2 Ajouter, dans le mélange en ébullition, la quantité appropriée (voir Tableau 1) d'hexane (3.3.8) par le
haut du réfrigérant.
3.6.4.3 Retirer le ballon de la source de chaleur et débrancher le réfrigérant à reflux. Ajouter
IMMÉDIATEMENT, sans laisser le ballon refroidir, 20 ml de solution de chlorure de sodium (3.3.5). Boucher le
ballon et agiter vigoureusement celui-ci pendant au moins 15 s.
3.6.4.4 Transvaser la solution saline et la couche d'hexane dans une ampoule à décanter de 250 ml (3.4.6).
Ajouter environ 30 ml de solution saturée de chlorure de sodium. Laisser s'opérer la séparation des deux phases.
Retenir la solution d'hexane. Extraire à deux reprises la solution saline à l'aide de portions d'hexane (3.3.8) de
50 ml.
3.6.4.5 Réunir la solution d'hexane ainsi que les deux extraits et les laver avec des portions de 20 ml d'eau
(3.3.1) jusqu'à ce qu'un acide libre ne soit plus obtenu, en utilisant comme indicateur la solution de rouge de
méthyle (3.3.9).
Sécher avec du sulfate de sodium anhydre (3.3.6). Filtrer la solution et faire évaporer le solvant avec précaution,
sur un bain d'eau sous courant d'azote (3.3.7), ou à l’aide de l’évaporateur rotatif (3.4.7).
Si la portion résiduelle contient une quantité considérable d'esters méthyliques à chaînes courtes (C6 à C10), il est
difficile d'éviter que des pertes substantielles de ces dernières ne se produisent. Dans le cas de prises d'essai
inférieures à 500 mg, il est préférable de réduire proportionnellement les volumes de solution de chlorure de
sodium, de solvant et d'eau. Voir l’article A.6.
4 Méthode à l'hydroxyde de triméthylsulfonium (méthode TMSH)
AVERTISSEMENT — La méthode décrite implique l'utilisation de réactifs présentant un danger potentiel.
Les précautions habituelles doivent être prises pour la protection des yeux et contre les risques de
brûlures par les produits chimiques corrosifs. Dans certaines conditions, l’hydroxyde de triméthyl-
sulfonium peut être toxique.
4.1 Principe
Dissolution de l'échantillon pour essai dans de l'éther de méthyle t-butyle et préparation des esters méthyliques par
transestérification avec de l'hydroxyde de triméthylsulfonium (TMSH). Injection immédiate dans le chromatographe
en phase gazeuse, à une température d’injection supérieure à 250 °C. En présence d'acides gras à chaînes
courtes (4 à 8 atomes de carbone), il est conseillé d'utiliser de l'ester méthylique d'acide pentanoïque (valérique)
comme étalon interne (voir 4.2).
4.2 Champ d’application
Cette méthode rapide est uniquement valable pour la préparation des esters méthyliques destinés à la CPG. Elle
convient à tous les corps gras, y compris les corps gras laitiers et les corps gras laitiers en mélange.
L'isomérisation des acides gras non saturés n'a pas été observée.
La méthode peut être appliquée aux composés contenant les configurations chimiques énumérées en 3.2, mais on
ignore s’il y a une conversion totale en esters méthyliques. De même, les acides gras libres ne sont estérifiés qu'à
hauteur de 70 % à 80 % environ.
Les lipides contenant des groupes hydroxy sont en partie convertis dans leurs dérivés esters méthyliques O
correspondants, ce qui peut interférer avec les esters méthyliques d’acides gras (FAME) pendant la séparation
chromatographique CPG. La méthode de dérivation TMSH n’est de ce fait pas recommandée s’il n’y a pas de limite
fixée à la quantité de lipides contenant des groupes hydroxy. D’autre part, elle peut avoir une certaine valeur de
diagnostic pour l’analyse de ces lipides par CPG couplée à la spectrométrie de masse.
© ISO 2000 – Tous droits réservés 5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 5509:2000(F)
La méthode TMSH ne peut être appliquée si l’analyse CPG se fait par injection directement sur la colonne. Il n’est
pas recommandé d’utiliser des phases stationnaires polaires (cyanopropyl siloxanes).
Pour la détermination des acides gras à chaînes courtes (C4 à C8), il est conseillé d'utiliser de l'ester méthylique
d'acide valérique (pentanoate de méthyle) comme étalon interne, à condition que l’échantillon lui-même ne
contienne pas d’acide valérique.
4.3 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
4.3.1 Éther de méthyle t-butyle.
2)
4.3.2 Hydroxyde de triméthylsulfonium (TMSH) , solution méthanolique, à 0,2 mol/l.
La solution reste stable pendant au moins deux mois si elle est conservée à 4 °C en petites quantités, à l'intérieur
d'un tube fermé.
NOTE La référence [3] donne une méthode pour la préparation du TMSH.
4.3.3 Solution-mère d'étalon interne, destinée uniquement à la détermination de l'acide butyrique et/ou
caproïque.
Peser, à 0,1 mg près, environ 250 mg de pentanoate de méthyle dans une fiole graduée de 50 ml. Utiliser de l'iso-
octane pour dissoudre l'échantillon et diluer jusqu'au trait.
4.3.4 Solution de référence d'étalon interne, destinée uniquement à la détermination de l'acide butyrique et/ou
caproïque.
Ajouter 10 ml de solution-mère (4.3.3) dans une fiole graduée de 100 ml et diluer jusqu'au trait avec de l'iso-octane.
Calculer la concentration de cette solution de référence. Voir l’article A.8.
4.3.5 Éther de pétrole.
4.3.6 Sulfate de sodium, anhydre.
4.4 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
4.4.1 Tubes à essai, de 2 ml de capacité, munis de bouchons en verre rodés (flacons autoéchantillonneurs).
4.4.2 Pipettes graduées, de 1 000 μl de capacité.
4.4.3 Fioles graduées, de 50 ml et 100 ml de capacité.
4.4.4 Papier-filtre ondulé.
4.4.5 Évaporateur rotatif.
2) L’hydroxyde de triméthylsulfonium est un produit commercial (réf. 70152) disponible auprès de Machery-Nagel GmbH,
D-5213 Düren. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie
nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif des produits ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent
être utilisés s'il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
6 © ISO 2000 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 5509:2000(F)
4.5 Préparation de l'échantillon pour essai
L'échantillon pour essai doit être liquide, sec et limpide. Opérer conformément à l'ISO 661, mais en chauffant
l'échantillon juste au-dessus de son point de fusion.
4.6 Mode opératoire
4.6.1 Prise d'essai
Peser 10 mg� 2 mg de la prise d'essai dans un tube à essai (4.4.1).
Si la teneur en eau des échantillons est plus élevée, utiliser une prise d’essai plus importante.
Faire fondre les échantillons solides avec précaution, à une température supérieure d'environ 10 °C à leur point de
fusion et homogénéiser. Éviter les chaleurs excessives.
Dissoudre les échantillons contenant de l'eau dans de l'éther de pétrole (4.3.5) et les sécher pendant 30 min en
ajoutant du sulfate de sodium anhydre (4.3.6). Éliminer l'agent de séchage par filtration à travers un papier-filtre
ondulé et laver soigneusement le résidu avec de l'éther de pétrole. Éliminer le solvant au moyen d'un évaporateur
rotatif (4.4.5).
4.6.2 Préparation des esters méthyliques
4.6.2.1 À l'aide d'une pipette (4.4.2), ajouter 500 μl d'éther de méthyle t-butyle et dissoudre l'échantillon, en
chauffant modérément si nécessaire.
Pour la détermination des acides butyrique et/ou caproïque, remplacer les 500 μl d’éther de méthyle t-butyle par
500 μl de la solution de référence d’étalon interne (4.3.4).
4.6.2.2 À l'aide d'une pipette (4.4.2), ajouter à cette solution 250 μl de solution de TMSH (4.3.2) et agiter
vigoureusement pendant environ 30 s. Voir l’article A.7.
4.6.2.3 La solution obtenue (4.6.2.2) est prête pour l'injection dans le chromatographe en phase gazeuse. Du
fait que les esters méthyliques ne se forment que pendant l'injection, il est nécessaire que la température de
l'injecteur soit d’au moins de 250 °C. Voir les articles A.2 et A.7.
S’il s’avère nécessaire de diluer la solution avant l’injection, utiliser un mélange d’éther de méthyle t-butyle (4.3.1)
et de méthanol (9+1) pour éviter un précipité de TMSH.
5 Méthode de transestérification
AVERTISSEMENT — La méthode décrite implique la manipulation de réactifs potentiellement dangereux.
Les mesures habituelles de protection doivent être prises tant pour les yeux que pour éviter tout risque de
brûlures par produits chimiques corrosifs. La solution méthanolique d’hydroxyde de potassium est
toxique.
5.1 Principe
Dissolution des glycérides dans l'iso-octane et conversion en esters méthyliques par transestérification avec de
l'hydroxyde de potassium. Une fois la réaction terminée, neutralisation de l'hydroxyde de potassium avec de
l'hydrogénosulfate de sodium, afin d'éviter la saponification des esters méthyliques.
© ISO 2000 – Tous droits réservés 7
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 5509:2000(F)
5.2 Champ d’application
Cette méthode rapide est applicable aux corps gras comestibles contenant des acides gras descendant jusqu'à
C4, dont la teneur en acides gras libres (FFA) n'excède pas 2 % et qui sont destinés à la détermination de l'acide
butyrique (C4) ou caproïque (C6) par CPG à l'aide d'un étalon interne.
Dans le cas d'échantillons présentant une teneur en FFA supérieure, il convient d'utiliser de l'hydroxyde de
potassium en excès. Étant donné que les acides gras libres et les savons ne sont pas estérifiés par l'hydroxyde de
potassium, la méthode est utilisable uniquement pour obtenir les esters méthyliques de la portion de glycérides
contenue dans l'échantillon.
La méthode peut être appliquée aux composés contenant les configurations chimiques énumérées en 3.2, mais on
ignore s’il y a une conversion totale en esters méthyliques.
5.3 Réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
5.3.1 Hydroxyde de potassium, solution méthanolique, à environ 2 mol/l.
Du fait que l'hydroxyde de potassium contient en pratique environ 15 % d'eau, procéder comme suit.
Dissoudre, en chauffant modérément, 13,1 g d'hydroxyde de potassium dans 100 ml de méthanol absolu.
Ajouter à la solution une quantité de sulfate de sodium anhydre permettant de la sécher. Filtrer pour obtenir une
solution limpide. En cas de conservation nécessaire de la solution pendant une longue période, une petite quantité
de précipité blanc de carbonate de sodium est susceptible de se former; ce phénomène n'influe pas sur la
préparation des esters méthyliques, à condition d'utiliser le liquide limpide surnageant.
5.3.2 Iso-octane (2,2,4-triméthylpentane), de qualité chromatographique. Voir l’article A.2.
5.3.3 Hydrogénosulfate de sodium monohydraté.
5.3.4 Solution-mère d'étalon interne, destinée uniquement à la détermination de l'acide butyrique et/ou
caproïque.
Peser, à 0,1 mg près, environ 250 mg d'ester méthylique d'acide valérique (pentanoate de méthyle) dans une fiole
graduée de 50 ml. Utiliser de l'iso-octane (5.3.2) pour dissoudre l'échantillon et diluer jusqu'au trait.
5.3.5 Solution de référence d'étalon interne, destinée uniquement à la détermination de l'acide butyrique et/ou
caproïque.
Ajouter 10 ml de solution-mère (5.3.4) dans une fiole graduée de 100 ml et diluer jusqu’au trait avec de l'iso-octane
(5.3.2). Calculer la concentration de cette solution de référence. Voir l’article A.8.
5.4 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.4.1 Tube à essai, de 5 ml de capacité, muni d'un bouchon en verre rodé.
5.4.2 Pipette graduée ou distributeur, de 4 ml de capacité, et/ou une pipette volumétrique de 4 ml de
capacité.
5.4.3 Pipette, de 200 μl de capacité, ou pipette automatique.
5.4.4 Flacon, de 4 ml de capacité, muni d'un bouchon à vis.
5.4.5 Fioles graduées, de 50 ml et 100 ml de capacité.
8 © ISO 2000 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 5509:2000(F)
5.5 Préparation de l'échantillon pour essai
L'échantillon pour essai doit être liquide, sec et limpide. Opérer conformément à l'ISO 661, mais en chauffant
l'échantillon juste au-dessus de son point de fusion.
5.6 Mode opératoire
5.6.1 Prise d'essai
Peser environ 60 mg de la prise d'essai et les introduire dans le tube à essai (5.4.1). Pour la détermination de
l’acide butyrique et/ou caproïque, peser la prise d'essai à 0,1 mg près.
5.6.2 Préparation des esters méthyliques
5.6.2.1 À l'aide de la pipette ou du distributeur (5.4.2), ajouter 4 ml d'iso-octane (5.3.2) et dissoudre
l'échantillon, en chauffant modérément si nécessaire.
Pour la détermination de l'acide butyrique et/ou caproïque, utiliser une pipette volumétrique (5.4.5) pour ajouter
4,00 ml de solution de référence (5.3.5) à la place de l'iso-octane.
5.6.2.2 À l'aide d'une pipette automatique (5.4.3), ajouter 200 μl de solution méthanolique d'hydroxyde de
potassium (5.3.1) et boucher le tube à essai. Agiter vigoureusement le mélange pendant environ 30 s. Après une
opacification initiale due à la séparation du glycérol, le mélange réactif s'éclaircit.
5.6.2.3 Ajouter à la solution en
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.