ISO 20976-2:2022
(Main)Microbiology of the food chain — Requirements and guidelines for conducting challenge tests of food and feed products — Part 2: Challenge tests to study inactivation potential and kinetic parameters
Microbiology of the food chain — Requirements and guidelines for conducting challenge tests of food and feed products — Part 2: Challenge tests to study inactivation potential and kinetic parameters
This document specifies the protocols for conducting microbiological challenge tests for inactivation studies on vegetative bacteria and bacterial spores in the raw materials and ingredients, intermediate or end products. The use of this document can be extended to yeasts which do not form mycelium.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et lignes directrices pour la réalisation des tests d'épreuve microbiologiques — Partie 2: Tests d’inactivation pour étudier le potentiel d’inactivation et les paramètres de la cinétique d’inactivation
Le présent document spécifie les protocoles de mise en œuvre de tests d’inactivation microbiologique pour les études d’inactivation sur les bactéries végétatives et les spores bactériennes dans les matières premières et les ingrédients, les produits intermédiaires ou finis. L’utilisation du présent document peut être étendue aux levures qui ne forment pas de mycélium.
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20976-2
First edition
2022-10
Microbiology of the food chain —
Requirements and guidelines for
conducting challenge tests of food and
feed products —
Part 2:
Challenge tests to study inactivation
potential and kinetic parameters
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et lignes
directrices pour la réalisation des tests d'épreuve microbiologiques —
Partie 2: Tests d’inactivation pour étudier le potentiel d’inactivation
et les paramètres de la cinétique d’inactivation
Reference number
© ISO 2022
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 5
5 Apparatus . 7
6 Culture media and reagents .7
7 Study design and sampling . 7
7.1 General . 7
7.2 Setting target reduction level for the inactivation study . 8
7.3 Number of batches. 8
7.4 Preparation of the test units . 8
7.5 Number of control units and test units . 9
8 Selection of strains . 9
9 Preparation of the inoculum . 9
9.1 General . 9
9.2 Preparation of the vegetative cells . 10
9.3 Preparation of the spores . 10
10 Inoculation of the test units .10
11 Controls . .12
11.1 Uninoculated controls .12
11.2 Inoculated controls . 12
12 Treatment of the test units .12
13 Analysis . .12
14 Expression of the results .13
14.1 General .13
14.2 Inactivation potential .13
14.3 Inactivation kinetics parameters. 14
14.3.1 General . 14
14.3.2 Primary inactivation kinetics parameters . 14
14.3.3 Secondary inactivation kinetics parameters . 15
14.4 Simulation of inactivation .15
15 Test report .16
15.1 General . 16
15.2 Aim of the study, type of challenge test and target reduction level . 16
15.3 Experimental protocol . . 17
15.4 Sample analysis . . 17
15.5 Results . . 17
15.6 Conclusions . 18
15.7 Reference documents . 18
Annex A (informative) Selection of the type and the location of inactivation study .19
Annex B (normative) Minimum number of units to prepare for the inactivation studies .20
Annex C (informative) Examples of inoculation techniques .21
Bibliography .23
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 463, Microbiology of the food chain, in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
A list of all parts in the ISO 20976 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
Under the general principles of the Codex Alimentarius on food hygiene, it is the responsibility of the
food business operators (FBOs) to control microbiological hazards in foods and to manage microbial
risks. Therefore, FBOs implement validated control measures, within the hazard analysis and critical
control point (HACCP) system, and conducts studies in order to investigate compliance with the food
safety criteria throughout the food chain.
In the framework of microbial risk assessment (MRA), several complementary approaches are developed
to estimate risks posed by pathogens or spoilage microorganisms in the food chain. MRA is adopted by
regulators under the auspices of the international agency for setting food standards. Challenge testing
is one of the recognized approaches used to validate control measures within the HACCP system, as
well as to assess microbiological safety and quality of food, food production processes, food storage
conditions, and food preparation recommendations dedicated to consumers.
Therefore, this document provides technical rules, calculations and approaches to investigate the ability
of an inoculated microorganism of concern to grow, survive or be inactivated in the raw materials,
intermediate or end products under reasonably foreseeable food processes, storage and use conditions.
The objective and the scope of the study are to determine the experimental design and the selection
of the study conditions, and to assess the extent of microbial inactivation. Regulatory authorities can
have different recommendations, and these differences have been included as much as possible. It is,
however, possible that specific requirements need to be incorporated to get a regulatory approval of
the challenge test.
As the growth and inactivation studies are clearly different, the ISO 20976 series consists of two parts,
under the general title Microbiology of the food chain — Requirements and guidelines for conducting
challenge tests of food and feed products:
— Part 1: Challenge tests to study the growth potential, lag time and the maximum growth rate;
— Part 2: Challenge tests to study inactivation potential and kinetic parameters.
The use of the ISO 20976 series involves expertise in relevant areas such as food microbiology, food
science, food processing and statistics. The statistical expertise encompasses an understanding of
sampling theory and design of experiments, statistical analysis of microbiological data, and overview of
scientifically recognized and available mathematical concepts used in predictive modelling.
For practical reasons, the term “food” includes feed.
v
INTERNATIONAL STANDARD ISO 20976-2:2022(E)
Microbiology of the food chain — Requirements and
guidelines for conducting challenge tests of food and feed
products —
Part 2:
Challenge tests to study inactivation potential and kinetic
parameters
1 Scope
This document specifies the protocols for conducting microbiological challenge tests for inactivation
studies on vegetative bacteria and bacterial spores in the raw materials and ingredients, intermediate
or end products.
The use of this document can be extended to yeasts which do not form mycelium.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
bacterial spore
resistant form of bacteria which is dormant until the germination (3.9) step
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.1]
3.2
batch
group or set of identifiable food obtained through a given process under practically identical
circumstances and produced in a given place within one defined production period
Note 1 to entry: The batch is determined by parameters established beforehand by the organization and may be
described by other terms, e.g. lot.
[10]
[SOURCE: Commission Regulation (EC) No 2073/2005, Article 2 (e) , modified — “food obtained
through” has replaced “products obtained from” and Note 1 to entry has been added.]
3.3
bulk products
products that are not separated into individual items or units
[SOURCE: ISO/TS 17728:2015, 3.3.1]
3.4
challenge test
study of the growth or inactivation of microorganism(s) artificially inoculated in a food
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.5]
3.5
control unit
unit of food identical to the test unit (3.34) but not artificially inoculated (used as a blank)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.4, modified — “inoculated” has replaced “contaminated”.]
3.6
D value
decimal reduction
time or dose required to achieve reduction of 90 % of the tested microorganism under stated conditions
(e.g. temperature, pH or chemical composition) in case of log linear inactivation kinetics (3.10)
3.7
δ value
first decimal reduction
time or dose required to achieve the first reduction of 90 % of the tested microorganism under stated
conditions (e.g.: temperature, pH or chemical composition) in case of non-log linear inactivation kinetics
(3.10)
3.8
experimental datapoint
result of analysis of a test unit (3.34) per unit mass, per unit volume, or per unit area
Note 1 to entry: The enumeration results may be expressed in log or most probable number (MPN).
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.6, modified — In the definition, “mass” has replaced “weight” and the
units have been deleted. In Note 1 to entry, “for specific cases” has been deleted and “or most probable
number (MPN)” has replaced “MPN”.]
3.9
germination
mechanism in which a bacterial spore (3.1) initiates its transformation into a vegetative cell (3.36)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.9, modified — “initiates its transformation into” has replaced “starts
becoming”.]
3.10
inactivation kinetics
change over time in the concentration of the target microorganism subjected to an inactivation process
3.11
inactivation parameter
mathematical estimate that describes the resistance/sensitivity of the target organism to the treatment
(3.35), obtained by fitting primary models (3.18) and secondary models (3.24)
Note 1 to entry: Examples of these parameters are D, δ and p for the primary models and z for the secondary
models.
3.12
inactivation potential
Δ value
log kill
log reduction
difference in the log concentration (log cfu/g or ml or cm ) of the target microorganism between an
earlier and a later time point expressed as log
Note 1 to entry: In this document, the term “inactivation potential” refers to the type of inactivation study, and
the terms “log kill” and “log reduction” refer to the result obtained.
3.13
inactivation treatment
process used to kill or inactivate the target microorganism
3.14
inoculum
microbial suspension at the desired concentration used to contaminate test units (3.34)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.12]
3.15
k value
slope of the inactivation curve
3.16
p value
parameter describing the shape of the inactivation curve
3.17
pH value
measure of the concentration of acidity or alkalinity of a material in an aqueous solution
[SOURCE: ISO 5127:2017, 3.12.2.29, modified — The notes to entry have been deleted.]
3.18
primary model
mathematical model describing the changes of microbial counts as a function of time
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.16]
3.19
organizing laboratory
laboratory with responsibility for managing the challenge tests (3.4)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.17]
3.20
pilot facility
manufacturing location used to run an experiment or test before introducing more widely
3.21
processing facility
location where products are made on a larger scale
3.22
sampling
selection of one or more units or portions of food such that the units or portions selected are
representative of that food
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.18]
3.23
sampling point
time at which the test units (3.34) are taken for analyses
Note 1 to entry: When assessing inactivation kinetics (3.10), these are represented as experimental datapoints
(3.8) on the inactivation graph.
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.19, modified — “taken for analyses” has replaced “analysed and which
are represented as experimental datapoints on the kinetics graph” and Note 1 to entry has been added.]
3.24
secondary model
mathematical model describing the effects of the inactivation process factors (e.g. temperature, pH, a )
w
on the parameters of the primary model (3.18) (e.g. D, δ)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.20, modified — “inactivation process” has replaced “environmental” and
“(e.g. D, δ)” has replaced “(e.g. growth rate)”.]
3.25
sporulation
mechanism by which vegetative cell (3.36) forms spore
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.21]
3.26
surrogate
non-pathogenic microorganism that has similar or more robust survival (3.27) capability compared to
the pathogen of concern both in the matrix and under the processing conditions being studied
3.27
survival
state of continuing to live or exist without significant increase or decrease in viability
3.28
target reduction level
target inactivation level expressed in log
3.29
t
time at which the treatment starts
3.30
t
end
time at which the treatment is finished
3.31
t
inoc
time at which the microorganism is inoculated in the food
3.32
t
xD
time of treatment needed for x log reduction of the target microorganism
3.33
test portion
measured (volume or mass) representative sample taken from the test unit (3.34) for use in the analysis
[SOURCE: ISO 6887-1:2017, 3.5, modified — “test unit for use in the analysis” has replaced “laboratory
sample for use in the preparation of the initial suspension” and Note 1 to entry has been deleted.]
3.34
test unit
measured (volume or mass) amount of the food used for inoculation, subsequent treatment (3.35) and
analysis
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.24, modified — “subsequent treatment and analysis” has been added.]
3.35
treatment
any process, formulation or product characteristics, or a combination thereof, intended to inactivate
the target microorganism
3.36
vegetative cell
state of microbial form that is capable of growing under favourable environmental conditions
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.25]
3.37
water activity
a
w
ratio of the water-vapour pressure in the foodstuff to the vapour pressure of pure water at the same
temperature
[SOURCE: ISO 18787:2017, 3.1 modified — “water-vapour pressure in the foodstuff to the vapour
pressure of pure water at” has replaced “partial water-vapour pressure in equilibrium with the product
analysed to the water-vapour saturation pressure in equilibrium with”, and the formula and the notes
to entry has been deleted]
3.38
z value
change in treatment (3.35) (e.g. temperature, pH, a ,) that induces a 10-fold change in the D value (3.6)
w
Note 1 to entry: Temperature, pH and a can be indexed to the z value to denote the treatment being assessed.
w
4 Principle
Inactivation studies are designed to determine the changes in the concentration of the target
microorganism during the challenge test. These studies can be used to assess whether there is significant
microbial inactivation in a foodstuff and to quantify the decrease in the target microorganism under a
given set of processing conditions and/or formulation of the food product. The scope and the aim of
the study shall be clearly specified (e.g. assessment/validation of the food process efficacy as a control
measure, assessment of microbial stability and survival) including the target reduction level and the
decision criteria. The experimental design shall be in accordance with that purpose and shall take
into account the steps of the process and the food chain for which microbial inactivation is assessed.
Knowledge from the FBO (e.g. on their products characteristics and production process) shall be
combined with the expertise in food microbiology and analytical sciences to ensure the robustness of
the study (see 14.3.2). Ideally, inactivation studies employ the target microorganism. In the challenge
tests studies conducted within food production facilities, a validated surrogate shall be used in place of
[26]
the target pathogen .
The organizing laboratory shall have knowledge and skills in food microbiology, food science and
technology, and statistics to design and conduct the studies, interpret the results and draw the
conclusions. The analyses shall be conducted under a quality assurance system (e.g. ISO/IEC 17025).
To conduct an inactivation challenge study, the inoculum should be prepared such that the microbial
cells or spores have been adapted to the environmental conditions that mimic the food processing
environment, thereby encouraging natural microbial response once inoculated into the food.
[14]
The same microbial strain could exhibit various shapes as a function of the treatment (see Figure 1) .
The heterogeneous shapes of microbial inactivation curves are the results of the microbial resistance
[16]
or adaptive response or cell heterogeneity .
Key
X inactivation treatment (time or dose)
Y log (N)
a
Log-linear.
b
Concave.
c
Convex or with a shoulder.
d, e
With a tail or biphasic.
f
Sigmoïdal curve.
Figure 1 — Examples of microbial inactivation curve types
There are two types of inactivation study: the inactivation potential and the inactivation kinetics of a
target microorganism.
The inactivation potential studies are most appropriate for process validation and/or product
formulation. Inactivation potential results are specific to the conditions and matrix under study. To
extrapolate to other conditions, inactivation kinetic parameters shall be used, or a new inactivation
potential study conducted.
The inactivation kinetics studies are used to characterize the inactivation of the microorganism
through the determination of inactivation parameters such as D, δ and z values. Those studies are more
complex in terms of study design, execution, results interpretation and exploitation, particularly in the
case of nonlinearity (see Figure 1) but allow to extrapolate the results to non-tested conditions within
the range of the study.
5 Apparatus
Routine microbiology labware specified in ISO 7218 shall be used. Specific labware, including the
following, can also be needed to prepare the test portions, to store them under suitable conditions, or
monitor how their characteristics change during the challenge test study.
5.1 Apparatus for packaging the samples under air, under vacuum or under a protective modified
atmosphere.
5.2 Climate-control chamber, able to reach and hold setpoint temperature to ± 1 °C and to adjust
relative humidity to ± 10 %.
5.3 pH meter, able to perform measurements to a tolerance of ± 0,1 pH units. pH meters shall give
readings to a resolution of 0,01 pH units.
5.4 a meter, meeting the requirements of ISO 18787.
w
5.5 Headspace gas analyser, to measure gas composition (e.g. O , CO ).
2 2
5.6 Logger for measuring temperature conditions of the test unit.
5.7 Logger for measuring relative humidity conditions of the test unit.
5.8 Device for measuring the inactivation treatment (e.g. dosimeter for irradiation treatment,
probe for heat treatment) of the test unit.
5.9 Apparatus (pilot facility or equipment in a laboratory) to run the inactivation treatment, which
mimic foreseeable conditions of production leading to microbial inactivation.
5.10 Industrial piece of equipment to conduct the inactivation study at the factory level.
6 Culture media and reagents
Follow current laboratory practices as specified in ISO 7218.
For the preparation and performance testing of culture media and reagents, follow the procedures
as specified in ISO 11133 and in the International Standard specific to the target microorganism. Use
relevant internationally recognized and widely accepted methods for the detection or enumeration
of injured target microorganisms (e.g. using a selective agar and non-selective agar with a dual layer
method).
7 Study design and sampling
7.1 General
The study design and sampling will depend on the target level of reduction, the process, the formulation
and the product characteristics. The factors impacting the inactivation shall be clearly identified and
their range shall be specified.
There are two types of challenge tests to study inactivation: inactivation potential and inactivation
kinetics. The aim of the study and the technologies used will determine the type (see Annex A).
For inactivation potential, test units shall be taken at a minimum at the beginning and the end of
treatment.
For inactivation kinetics, test units shall be taken at each sampling point throughout the treatment
duration. When sampling access during processing is not possible due to the equipment and/or
technology assessed, independent treatments of varying lengths can be required.
The associated expected variability will determine the number of batches and test units to be
considered (see Annex B).
The study design shall consider various sources of variability linked to:
— process characteristics (e.g. flow rate, residence time, temperature, moisture, equipment design);
— formulation and product characteristics (e.g. fat, sugar, salt, a , protein, acid, pH, particle size,
w
chemical composition, background microorganisms, preservatives concentrations, gas atmosphere);
— where relevant (e.g. studies on preservatives), transportation and storage conditions (e.g. humidity,
packaging) during the shelf-life.
The study design shall also consider the target reduction level.
7.2 Setting target reduction level for the inactivation study
Depending on the aim of the challenge test, the target reduction level shall be specified at the start
of the study. It may be related to regulatory requirements or to internal requirements. Laboratories
conducting inactivation studies in products that are subject to regulations should be aware of the most
current requirements. The target reduction level influences the inoculum level to be used. It can vary
depending on the food type (e.g. for Salmonella inactivation, a 4 log reduction has been required for
[12] [13]
the treatment of almonds and a 7 log reduction for poultry products ). To be able to analyse the
target reduction level, the limit of quantification of the analytical method used and the inoculum level
shall be appropriate.
7.3 Number of batches
The number of batches to be included in the study depends on the variability of the food production
process and food characteristics (see Annex B). The characteristics of the studied batches shall be
representative of the variability of the production process based on historical data.
A minimum number of three batches should be used for both inactivation potential and inactivation
kinetics studies. Generally, the number of batches should be increased in situations of higher variability
or uncertainty.
The use of a single batch shall be clearly justified, for example:
a) evaluating the impact of a new formulation of the food;
b) using a batch representing the most unfavourable inactivation conditions (worst case);
c) when multiple levels of the treatment will be assessed in inactivation kinetics studies.
7.4 Preparation of the test units
Test units representative of the matrix (raw materials and ingredients, intermediate or end products)
before the inactivation treatment can be either:
— aseptically-sampled portions of the bulk products from the production line;
— aseptically-sampled portions or complete content of the packaging unit(s).
The test units shall be maintained at appropriate conditions before inoculation, preferably inoculated
as close as possible to the time of production unless otherwise specified by the aim of the study. Once
inoculated, all test units, including t (see Figure 2), shall be maintained under the same appropriate
conditions, including transport and storage where necessary.
7.5 Number of control units and test units
The minimum number of units to be analysed will depend on the type of the inactivation study, the
nature of the food and the processing conditions (see Annex B).
For inactivation potential studies, the number of sample points depends on the accessibility of the
samples. In some cases, it is only possible to get samples at the start and the end of the process. In other
cases, it is possible to get intermediate samples.
For inactivation kinetics studies, it is important to have enough experimental datapoints available to
get an accurate estimation of the curve type (see Figure 1). For linear curve types, a minimum of six
sampling points is required. For nonlinear curve types, usually more sampling points are needed.
The number of units should be increased in situations of high variability or uncertainty related to
food and process characteristics. It is recommended to prepare additional units to cover unforeseen
incidents.
8 Selection of strains
Each strain used shall be characterized biochemically and/or serologically and/or genetically in
sufficient detail for its identity to be known. Strains previously isolated from the food matrix (raw
materials, ingredients, end products) or from the production environment or from clinical/food/
environmental samples in outbreaks involving the food are preferred.
The original source of all isolates should be known and they should be held in a local (e.g. laboratory
which runs the challenge test), national or international culture collection to enable them to be used in
future testing, if required. Use strains for which the inactivation parameter(s) (e.g. D, k or δ values) have
been previously determined in a similar matrix (e.g. heat, pressure, acid resistance) so as to ensure that
the selected strain(s) is/are fit for purpose. If the matrix is not similar, a preliminary study needs to be
[15]
performed to measure the resistance .
Cocktails of three to five fit for purpose strains are appropriate for inactivation potential studies. For
the inactivation kinetics, strains shall only be tested individually.
Ideally, inactivation studies would employ the target microorganism. In case of pathogens, this is
possible when the study is performed in a laboratory or in a pilot plant. However, this is not possible
in factories or food processing facilities (see Annex A). In such cases, a surrogate shall be used. The
suitability of the selected surrogate shall be justified and documented in relation to the pathogen,
food matrix and treatment under assessment. Otherwise, a specific surrogate validation study shall be
[26]
conducted and documented .
9 Preparation of the inoculum
9.1 General
In order to take into account the dilution effect when inoculating the test units, the inoculum
concentration shall be greater than the targeted log reduction. In some cases, preliminary studies need
to be taken to achieve the target inoculum level such as concentrating by centrifugation or by growing
on solid medium to minimize volume.
9.2 Preparation of the vegetative cells
Prepare the strains to obtain a standardised inoculum with physiological conditions and concentration
which are fit for purpose.
The culture should be initially grown in non-selective media and under conditions suitable for optimal
growth. This culture can be used under optimum conditions or be adapted in order to mimic conditions
of potential contamination. Examples of adaptation are pH, acid type, temperature, a , salt content,
w
sugar content, liquid or solid media and atmosphere.
The microbial concentration of the inoculum shall be estimated using internationally recognized and
widely accepted methods or alternative methods validated according to internationally accepted
protocols. This inoculum can be concentrated by centrifugation to meet the target concentration. When
using a cocktail, strains should be individually prepared and mixed in equivalent concentrations.
Additionally, microbial count of the prepared inoculum shall be confirmed at t (see Figure 2) by
inoc
enumeration on the same medium that will be used for the challenge study.
Vegetative cells are used for direct inoculation (wet inoculum) or to be prepared for further uses in dry
applications.
Dry inoculum preparation techniques can be required for studies of low moisture foods. Inoculum can
be prepared without a carrier (e.g. freeze drying, vacuum) or dried on a carrier (e.g. beads, sand, chalk,
talcum powder, flour, powdered form of the product, or a product similar to the challenge food). For
preparation of dehydrated inoculum, the microorganism can require several days to stabilize at a given
concentration. Viable counts of the stabilized dried inoculum shall be obtained prior to use.
9.3 Preparation of the spores
To prepare the spore crop, inoculate the target strain(s) into an appropriate culture medium and
incubate under conditions that will promote a high sporulation rate (e.g. aerobic/anaerobic, medium,
temperature). The length of this step will vary (from days to weeks) depending on the microbial
species or strain(s) and the sporulation conditions. The extent of sporulation shall be checked with a
microscope prior to harvesting the spores. Wash the spore crops to remove nutrients. Spores crops
should be enumerated using internationally recognized and widely accepted methods or alternative
methods validated according to internationally accepted protocols. Spore crops can then be stored at
appropriate conditions to avoid germination until needed for the challenge study.
Prior to conducting the challenge study, enumerate the spore crop on the same medium that will be
[19]
used for the challenge study after an appropriate heat treatment to inactivate the vegetative cells
[22]
. This concentration shall be adjusted to meet target criteria.
10 Inoculation of the test units
The inoculum procedure shall be described and justified. Its aim is to achieve the same target level
of studied microorganism in all test units without significantly modifying their physico-chemical
characteristics (pH, moisture and/or a included). The inoculum volume: sample mass (or sample
w
volume) ratio should not exceed 1:100. The inoculation level should be at least one log higher than the
targeted reduction level at the time of inoculation (t ). The time between inoculation (t ) and (t )
inoc inoc 0
immediately before the start of treatment should be minimized (see Figure 2).
NOTE For specific applications (e.g. low moisture food, acid food), an inoculated unit can need an
equilibration period between t and t .
inoc 0
a
If the treatment has an immediate inactivation effect to the inoculation, t shall be sampled immediately
before treatment starts. Otherwise sampling at t is conducted when the treatment starts.
b
The time between sampling and the analysis should be minimized and documented.
Figure 2 — Possible steps for inactivation studies
If the goal is to investigate microbial behaviour in the whole product, the inoculum needs to be
homogenously distributed in the units.
If the goal is to characterize microbial behaviour in a specific part (e.g. core or surface) of the product,
the inoculation should be done on this specific part.
Typically, when studying formulation and/or packaging, individual units are inoculated versus when
studying process, bulk products inoculation can be used.
Depending on the product and process under study, use an appropriate inoculation procedure (see
Annex C). For instance:
— in the core (e.g. injecting the centre of a whole ham);
— on the surface (e.g. by applying several deposits locally over the surface, by spraying of a sliced
smoked salmon, by dipping of vegetables, by coating dry product);
— throughout the product (e.g. doughs, liquids, powders);
— in one or more components of a composite product (e.g. sauce in the sandwich).
Modified atmosphere packaged food (including vacuum) can be opened, inoculated and repacked
according to 7.4 before applying the treatment. The units can also be inoculated directly by injecting
the inoculum through adhesive septum/septa so as not to affect the packaging atmosphere. In this case,
the laboratory shall ensure that the packaging remains hermetically sealed throughout the duration of
the study.
The standard deviation of the target microorganism concentration (due to inoculation heterogeneity)
at t shall not be greater than the limit of 0,3 log cfu/g, ml or cm for individual test units and
inoc, 10
0,5 log cfu/g, ml or cm for bulk test units. When analysing individually inoculated test units the
results are more precise because the entire test unit is analysed. Thus, it is recommended to verify the
concentration of inoculation at t to decide if the study is valid. If the standard deviation of the target
inoc
microorganism concentration at t is higher than the proposed limits, the study shall be repeated.
inoc
If t is the same as t , all the above shall apply to t
inoc 0 0.
11 Controls
11.1 Uninoculated controls
The aim of the uninoculated controls is to verify the representativeness of the test units in comparison
to the studied food. The food needs to be checked for relevant characteristics for the interpretation of
the results (e.g. fat, sugar, salt, a , protein, acid, pH, particle size, chemical composition, background
w
microorganisms preservatives concentrations, gas atmosphere).
The number of uninoculated controls to prepare for the inactivation challenge-test study is given in
Annex B.
11.2 Inoculated controls
The aim of the inoculated controls is to verify that the inoculation level is achieved at the time of
the inoculation (t ) and to act as a reference to prove that the treatment is causing the obtained
inoc
inactivation. Annex B provides the minimum number of inoculated controls to be prepared.
The same test units may be used for measurement of physico-chemical characteristics, ga
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 20976-2
Première édition
2022-10
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Exigences et lignes
directrices pour la réalisation des
tests d'épreuve microbiologiques —
Partie 2:
Tests d’inactivation pour étudier
le potentiel d’inactivation et
les paramètres de la cinétique
d’inactivation
Microbiology of the food chain — Requirements and guidelines for
conducting challenge tests of food and feed products —
Part 2: Challenge tests to study inactivation potential and kinetic
parameters
Numéro de référence
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 6
5 Appareillage . 7
6 Milieux de culture et réactifs .8
7 Plan de l’étude et échantillonnage .8
7.1 Généralités . 8
7.2 Définition du niveau cible de réduction pour l’étude d’inactivation . 9
7.3 Nombre de lots . 9
7.4 Préparation des unités pour essai . 9
7.5 Nombre d’unités témoins et d’unités pour essai . 10
8 Choix des souches.10
9 Préparation de l’inoculum .10
9.1 Généralités . 10
9.2 Préparation des cellules végétatives . 11
9.3 Préparation des spores . 11
10 Inoculation des unités pour essai .11
11 Témoins .13
11.1 Témoins non inoculés . 13
11.2 Témoins inoculés . 13
12 Traitement des unités pour essai .13
13 Analyse .13
14 Expression des résultats .14
14.1 Généralités . 14
14.2 Potentiel d’inactivation .15
14.3 Paramètres de la cinétique d’inactivation . 15
14.3.1 Généralités .15
14.3.2 Paramètres primaires de la cinétique d’inactivation .15
14.3.3 Paramètres secondaires de la cinétique d’inactivation . 16
14.4 Simulation de l’inactivation . 17
15 Rapport d’essai .17
15.1 Généralités . 17
15.2 Objectif de l’étude, type de test d’inactivation et niveau cible de réduction . 17
15.3 Protocole expérimental . 18
15.4 Analyse d’échantillon . 19
15.5 Résultats . 19
15.6 Conclusions . 19
15.7 Documents de référence .20
Annexe A (informative) Choix du type et du lieu de l’étude d’inactivation .21
Annexe B (normative) Nombre minimal d’unités à préparer pour les études d’inactivation .22
Annexe C (informative) Exemples de techniques d’inoculation .24
Bibliographie .26
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 463, Microbiologie de la chaîne
alimentaire, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération
technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Une liste de toutes les parties de la série ISO 20976 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
Selon les principes généraux du Codex Alimentarius sur l’hygiène alimentaire, il est de la responsabilité
des exploitants du secteur alimentaire de maîtriser les dangers microbiologiques dans les aliments et
de gérer les risques microbiens. Par conséquent, les exploitants du secteur alimentaire mettent en place
des mesures de maîtrise validées, au sein du système HACCP (analyse des dangers et points critiques
pour leur maîtrise), et conduisent des études afin d’évaluer la conformité aux critères de sécurité
alimentaire tout au long de la chaîne alimentaire.
Dans le cadre de l’évaluation des risques microbiens, plusieurs approches complémentaires sont
développées afin d’estimer les risques posés par les microorganismes pathogènes ou d’altération
dans la chaîne alimentaire. L’évaluation des risques microbiens est adoptée par les organismes de
réglementation sous les auspices de l’agence internationale chargée des normes alimentaires. Les tests
d’épreuve microbiologique font partie des approches reconnues utilisées pour valider les mesures de
maîtrise au sein du système HACCP, ainsi que pour évaluer la sécurité microbiologique et la qualité
des aliments, les procédés de production alimentaire, les conditions de stockage des aliments et les
recommandations relatives à la préparation des aliments destinées aux consommateurs.
C’est pourquoi le présent document fournit les règles techniques, calculs et approches pour l’évaluation
de la capacité d’un microorganisme inoculé à croître, survivre ou être inactivé dans les matières
premières, les produits intermédiaires ou produits finis pendant toute la durée de conservation des
produits, soit dans des conditions de transformation, de distribution, d’entreposage et d’utilisation des
aliments raisonnablement prévisibles. L’objectif et le champ de l’étude consistent à déterminer le plan
expérimental et à sélectionner les conditions de l’étude, ainsi qu’à évaluer l’importance de l’inactivation
microbienne. Les autorités réglementaires peuvent avoir des recommandations différentes et ces
différences ont été incluses dans la mesure du possible. Toutefois, il peut parfois s’avérer nécessaire
d’intégrer des exigences spécifiques pour obtenir l’approbation réglementaire du test d’épreuve
microbiologique.
Les études de croissance et d’inactivation étant clairement différentes, la série ISO 20976 est constituée
de deux parties, publiées sous le titre général Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et lignes
directrices pour la réalisation des tests d’épreuve microbiologique:
— Partie 1: Tests de croissance pour étudier le potentiel de croissance, le temps de latence et le taux de
croissance maximal;
— Partie 2: Tests d’inactivation pour étudier le potentiel d’inactivation et les paramètres de la cinétique
d’inactivation.
L’utilisation de la série ISO 20976 nécessite une expertise dans les secteurs pertinents tels que la
microbiologie des aliments, la science des aliments, la transformation des aliments et les statistiques.
L’expertise statistique englobe la compréhension de la théorie d’échantillonnage et des plans
d’expérience, l’analyse statistique des données microbiologiques et une vue d’ensemble des concepts
mathématiques scientifiquement reconnus et disponibles employés en microbiologie prévisionnelle.
Pour des raisons pratiques, le terme «aliment» inclut les aliments pour animaux.
v
NORME INTERNATIONALE ISO 20976-2:2022(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et
lignes directrices pour la réalisation des tests d'épreuve
microbiologiques —
Partie 2:
Tests d’inactivation pour étudier le potentiel d’inactivation
et les paramètres de la cinétique d’inactivation
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie les protocoles de mise en œuvre de tests d’inactivation microbiologique
pour les études d’inactivation sur les bactéries végétatives et les spores bactériennes dans les matières
premières et les ingrédients, les produits intermédiaires ou finis.
L’utilisation du présent document peut être étendue aux levures qui ne forment pas de mycélium.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
spore bactérienne
forme de résistance prise par certaines bactéries qui reste en état de dormance jusqu’à l’étape de
germination (3.9)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.1]
3.2
lot
groupe ou série de produits identifiables obtenus par un procédé donné dans des conditions
pratiquement identiques et produits dans un endroit donné et au cours d’une période de production
déterminée
Note 1 à l'article: Le lot est déterminé par des paramètres établis au préalable par l’organisation et il peut être
décrit par d’autres termes.
o [10]
[SOURCE: Règlement (CE) n 2073/2005 de la Commission, Article 2 (e) , modifié — La Note 1 à
l’article a été ajoutée et, dans la version anglaise de la norme, «food obtained through» remplace
«products obtained from».]
3.3
produits en vrac
produits qui ne sont pas séparés en individus ou en unités
[SOURCE: ISO/TS 17728:2015, 3.3.1]
3.4
test d’épreuve microbiologique
étude de la croissance ou étude de l’inactivation d’un ou plusieurs microorganismes inoculés
artificiellement dans un aliment, la première s’effectuant lors d’un test de croissance, la seconde lors
d’un test d’inactivation
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.5]
3.5
unité témoin
unité d’aliment identique à l’unité pour essai (3.34), mais qui n’est pas inoculée artificiellement (utilisée
comme blanc)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.4, modifié — «inoculée» remplace «contaminée».]
3.6
valeur D
réduction décimale
temps ou dose nécessaire pour obtenir une réduction de 90 % du microorganisme soumis à essai dans
les conditions indiquées (par exemple: température, pH ou composition chimique) dans le cas d’une
cinétique d’inactivation (3.10) log-linéaire
3.7
valeur δ
première réduction décimale
temps ou dose nécessaire pour obtenir la première réduction de 90 % du microorganisme soumis à
essai dans les conditions indiquées (par exemple: température, pH ou composition chimique) dans le
cas d’une cinétique d’inactivation (3.10) non log-linéaire
3.8
point expérimental
résultat d’analyse d’une unité pour essai (3.34) par unité de masse, par unité de volume ou par unité de
surface
Note 1 à l'article: Les résultats de dénombrement peuvent être exprimés en log ou nombre le plus probable (NPP).
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.6, modifié — Dans la définition, «masse» remplace «poids» et les unités
ont été supprimées. Dans la Note 1 à l’article, «Pour des cas spécifiques» a été supprimé et «ou nombre
le plus probable (NPP)» remplace «NPP».]
3.9
germination
mécanisme dans lequel une spore bactérienne (3.1) commence sa transformation en cellule végétative
(3.36)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.9, modifié — «commence sa transformation en» remplace «germe pour
devenir une».]
3.10
cinétique d’inactivation
variation dans le temps de la concentration du microorganisme cible soumis à un procédé d’inactivation
3.11
paramètre d’inactivation
estimation mathématique qui décrit la résistance/sensibilité de l’organisme cible au traitement (3.35),
obtenue par l’ajustement de modèles primaires (3.18) et de modèles secondaires (3.24)
Note 1 à l'article: Des exemples de ces paramètres sont les valeurs D, δ et p pour les modèles primaires et z pour
les modèles secondaires.
3.12
potentiel d’inactivation
valeur Δ
destruction logarithmique
réduction logarithmique
différence dans la concentration logarithmique (log ufc/g, ou ml, ou cm ) du microorganisme cible
entre un point de temps antérieur et un point de temps postérieur, exprimée en log
Note 1 à l'article: Dans le présent document, le terme «potentiel d’inactivation» fait référence au type d’étude
d’inactivation et les termes «destruction logarithmique» et «réduction logarithmique» font référence au résultat
obtenu.
3.13
traitement d’inactivation
procédé utilisé pour détruire ou inactiver le microorganisme cible
3.14
inoculum
suspension microbienne à la concentration souhaitée utilisée pour contaminer les unités pour essai
(3.34)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.12]
3.15
valeur k
pente de la courbe d’inactivation
3.16
valeur p
paramètre décrivant la forme de la courbe d’inactivation
3.17
valeur de pH
mesure de la concentration d’acidité ou de basicité d’un matériau en solution aqueuse
[SOURCE: ISO 5127:2017, 3.12.2.29, modifié — Les notes à l’article ont été supprimées.]
3.18
modèle primaire
modèle mathématique décrivant les changements du dénombrement de la population microbienne en
fonction du temps
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.16]
3.19
laboratoire organisateur
laboratoire ayant la responsabilité de gérer les tests d’épreuve microbiologique (3.4)
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.17]
3.20
installation pilote
lieu de fabrication utilisé pour réaliser une expérience ou un essai avant de la ou le reproduire à plus
grande échelle
3.21
installation de production
lieu où les produits sont fabriqués à grande échelle
3.22
échantillonnage
sélection d’une ou plusieurs unités ou portions d’aliment, de telle sorte que les unités ou portions
sélectionnées sont représentatives de cet aliment
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.18]
3.23
point d’échantillonnage
moment auquel les unités pour essai (3.34) sont prélevées pour analyses
Note 1 à l'article: Lors de l’évaluation de la cinétique d’inactivation (3.10), ces points sont représentés comme des
points expérimentaux (3.8) sur le graphique d’inactivation.
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.19, modifié — «prélevées pour analyses» remplace «analysées et qui est
représenté en tant que point expérimental sur le graphique de cinétique» et la Note 1 à l’article a été
ajoutée.]
3.24
modèle secondaire
modèle mathématique décrivant les effets des facteurs du procédé d’inactivation (par exemple,
température, pH, a ) sur les paramètres du modèle primaire (3.18) (par exemple, la valeur D, δ)
w
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.20, modifié — «du procédé d’inactivation» remplace «environnementaux»
et «(par exemple, la valeur D, δ)» remplace «(par exemple, le taux de croissance)».]
3.25
sporulation
mécanisme par lequel une cellule végétative (3.36) forme une spore
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.21]
3.26
substitut (surrogate)
microorganisme non pathogène ayant une capacité de survie (3.27) similaire ou supérieure à celle du
microorganisme pathogène, à la fois dans la matrice et dans les conditions de transformation étudiées
3.27
survie
état qui consiste à continuer à vivre ou à exister sans augmentation ou diminution significative de la
viabilité
3.28
niveau cible de réduction
niveau cible d’inactivation exprimé en log
3.29
t
moment auquel le traitement commence
3.30
t
fin
moment auquel le traitement est terminé
3.31
t
inoc
moment auquel le microorganisme est inoculé dans l’aliment
3.32
t
xD
durée de traitement nécessaire pour une réduction de x log du microorganisme cible
3.33
prise d’essai
échantillon représentatif mesuré (volume ou masse) prélevé sur l’unité pour essai (3.34) pour servir à
l’analyse
[SOURCE: ISO 6887-1:2017, 3.5, modifié — «l’unité pour essai pour servir à l’analyse» remplace
«l’échantillon pour laboratoire pour servir à la préparation de la suspension mère» et la Note 1 à l’article
a été supprimée.]
3.34
unité pour essai
quantité (volume ou masse) mesurée de l’aliment utilisé pour l’inoculation, le traitement (3.35) ultérieur
et l’analyse
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.24, modifié — «le traitement ultérieur et l’analyse» a été ajouté.]
3.35
traitement
tout procédé, toute formulation ou toute caractéristique de produit, ou une combinaison de ceux-ci,
destinés à inactiver le microorganisme cible
3.36
cellule végétative
état d’une forme microbienne qui est capable de croître dans des conditions environnementales
favorables
[SOURCE: ISO 20976-1:2019, 3.25]
3.37
activité de l’eau
a
w
rapport de la pression de vapeur d’eau dans la denrée alimentaire sur la pression de vapeur de l’eau
pure à la même température
[SOURCE: ISO 18787:2017, 3.1, modifié — «pression de vapeur d’eau dans la denrée alimentaire sur
la pression de vapeur de l’eau pure» remplace «pression partielle de vapeur d’eau en équilibre avec le
produit analysé sur la pression saturante de vapeur d’eau en équilibre avec l’eau pure», et la formule et
les notes à l’article ont été supprimées.]
3.38
valeur z
modification du traitement (3.35) (par exemple, température, pH, a ) qui induit une variation de 10 fois
w
de la valeur D (3.6)
Note 1 à l'article: La température, le pH et a peuvent être indexés à la valeur z pour indiquer le traitement évalué.
w
4 Principe
Les études d’inactivation sont conçues pour déterminer les variations dans la concentration du
microorganisme cible pendant le test d’inactivation. Ces études peuvent être employées pour évaluer
si l’inactivation microbienne est importante ou non dans une denrée alimentaire et pour quantifier
la diminution du microorganisme cible dans des conditions de transformation et/ou une formulation
donnée(s) du produit alimentaire. Le champ et l’objectif de l’étude doivent être clairement spécifiés (par
exemple, évaluation/validation de l’efficacité du procédé alimentaire en tant que mesure de maîtrise,
évaluation de la stabilité et de la survie microbiennes), y compris le niveau cible de réduction et les
critères de décision. Le plan expérimental doit être en conformité avec cet objectif et doit tenir compte
des étapes du procédé et de la chaîne alimentaire pour lesquelles l’inactivation microbienne est évaluée.
La connaissance de l’exploitant du secteur alimentaire (par exemple, concernant les caractéristiques
et le procédé de production de ses produits) doit être combinée avec l’expertise en microbiologie
des aliments et sciences analytiques pour garantir la robustesse de l’étude (voir 14.3.2). Les études
d’inactivation utilisent de préférence le microorganisme cible. Dans les études de tests d’inactivation
réalisées dans les installations de production alimentaire, un substitut validé doit être utilisé à la place
[26]
du microorganisme pathogène cible .
Le laboratoire organisateur doit avoir des connaissances et des compétences en microbiologie des
aliments, sciences et technologies des aliments, ainsi qu’en statistique pour concevoir et réaliser les
études, interpréter les résultats et tirer les conclusions. Les analyses doivent être effectuées dans le
cadre d’un système d’assurance qualité (par exemple, ISO/IEC 17025).
Pour réaliser une étude de test d’inactivation, il convient de préparer l’inoculum de sorte que les
cellules ou spores microbiennes aient été adaptées aux conditions environnementales qui simulent
l’environnement de transformation des aliments, favorisant ainsi la réponse microbienne naturelle une
fois l’aliment inoculé.
La même souche microbienne peut présenter différentes formes en fonction du traitement (voir Figure 1)
[14]
. Les formes hétérogènes des courbes d’inactivation microbienne sont le résultat de la résistance
[16]
microbienne, de la réponse adaptative ou de l’hétérogénéité des cellules .
Légende
X traitement d’inactivation (temps ou dose)
Y log (N)
a
Log-linéaire.
b
Concave.
c
Convexe ou avec un épaulement.
d, e
Avec une queue ou biphasique.
f
Courbe sigmoïdale.
Figure 1 — Exemples de types de courbes d’inactivation microbienne
Il existe deux types d’étude d’inactivation: le potentiel d’inactivation et la cinétique d’inactivation d’un
microorganisme cible.
Les études du potentiel d’inactivation sont les plus appropriées pour la validation d’un procédé et/ou
la formulation d’un produit. Les résultats du potentiel d’inactivation sont propres aux conditions et à la
matrice étudiées. Pour extrapoler à d’autres conditions, il faut utiliser des paramètres de la cinétique
d’inactivation, ou réaliser une nouvelle étude du potentiel d’inactivation.
Les études de cinétique d’inactivation sont utilisées pour caractériser l’inactivation du microorganisme
par la détermination de paramètres d’inactivation tels que les valeurs D, δ et z. Ces études sont plus
complexes en termes d’élaboration du plan de l’étude, de réalisation, d’interprétation et d’exploitation
des résultats, en particulier dans le cas d’une non-linéarité (voir Figure 1), mais elles permettent
d’extrapoler les résultats à des conditions non soumises à essai dans le cadre de l’étude.
5 Appareillage
Un matériel courant de laboratoire de microbiologie spécifié dans l’ISO 7218 doit être utilisé. Un matériel
spécifique, y compris les éléments suivants, peut également être nécessaire pour préparer les prises
d’essai, les conserver dans des conditions adéquates, ou surveiller l’évolution de leurs caractéristiques
durant l’étude du test d’inactivation.
5.1 Appareillage pour le conditionnement des échantillons à l’air, sous vide ou sous une
atmosphère modifiée protectrice.
5.2 Enceinte climatique, capable d’atteindre et de maintenir la température de consigne à ± 1 °C et
d’ajuster l’humidité relative à ± 10 %.
5.3 pH-mètre, capable d’effectuer des mesurages avec une tolérance de ± 0,1 unité de pH. Les pH-
mètres doivent fournir des mesures avec une résolution de 0,01 unité de pH.
5.4 a mètre, satisfaisant aux exigences de l’ISO 18787.
w
5.5 Analyseur de gaz d’espace de tête, pour mesurer la composition en gaz (par exemple, O , CO ).
2 2
5.6 Enregistreur pour la mesure des conditions de température de l’unité pour essai.
5.7 Enregistreur pour la mesure des conditions d’humidité relative de l’unité pour essai.
5.8 Dispositif pour mesurer le traitement d’inactivation (par exemple, dosimètre pour un
traitement par irradiation, sonde pour un traitement thermique) de l’unité pour essai.
5.9 Appareillage (installation pilote ou équipement dans un laboratoire) pour effectuer le
traitement d’inactivation, qui simule les conditions prévisibles de production conduisant à l’inactivation
microbienne.
5.10 Équipement industriel pour réaliser l’étude d’inactivation au niveau de l’usine.
6 Milieux de culture et réactifs
Suivre les pratiques de laboratoire actuelles telles qu’elles sont spécifiées dans l’ISO 7218.
Pour la préparation et les essais de performance des milieux de culture et des réactifs, suivre les modes
opératoires spécifiés dans l’ISO 11133 et dans la Norme internationale spécifique du microorganisme
cible. Utiliser des méthodes pertinentes, reconnues au niveau international et largement acceptées,
pour la détection ou le dénombrement des microorganismes cibles stressés (par exemple, utiliser une
gélose sélective et une gélose non sélective avec une méthode en double couche).
7 Plan de l’étude et échantillonnage
7.1 Généralités
Le plan de l’étude et l’échantillonnage dépendent du niveau cible de réduction, du procédé, de la
formulation et des caractéristiques du produit. Les facteurs ayant un impact sur l’inactivation doivent
être clairement identifiés et leur portée doit être spécifiée.
Il existe deux types de tests d’inactivation pour étudier l’inactivation: le potentiel d’inactivation et la
cinétique d’inactivation. L’objectif de l’étude et les technologies utilisées en détermineront le type (voir
Annexe A).
S’agissant du potentiel d’inactivation, les unités pour essai doivent être prélevées au minimum au début
et à la fin du traitement.
Concernant la cinétique d’inactivation, les unités pour essai doivent être prélevées à chaque point
d’échantillonnage sur toute la durée du traitement. Lorsque l’accès pour l’échantillonnage pendant le
traitement n’est pas possible en raison de l’équipement et/ou de la technologie évalués, des traitements
indépendants de longueurs variables peuvent être requis.
La variabilité associée attendue déterminera le nombre de lots et d’unités pour essai à prendre en
compte (voir Annexe B).
Le plan de l’étude doit prendre en compte différentes sources de variabilité, en lien avec:
— les caractéristiques du procédé (par exemple, débit, temps de séjour, température, humidité,
conception de l’équipement);
— la formulation et les caractéristiques du produit (par exemple, graisse, sucre, sel, a , protéines, acides,
w
pH, taille des particules, composition chimique, flore annexe, concentrations des conservateurs,
atmosphère gazeuse);
— le cas échéant (par exemple, études sur les conservateurs), les conditions de transport et de stockage
(par exemple, humidité, conditionnement) pendant la durée de conservation.
Le plan de l’étude doit également tenir compte du niveau cible de réduction.
7.2 Définition du niveau cible de réduction pour l’étude d’inactivation
En fonction de l’objectif du test d’inactivation, le niveau cible de réduction doit être spécifié au début
de l’étude. Il peut être lié à des exigences réglementaires ou à des exigences internes. Il convient que
les laboratoires réalisant des études d’inactivation sur des produits soumis à des réglementations
aient connaissance des exigences les plus récentes. Le niveau cible de réduction influe sur le niveau
d’inoculum à utiliser. Il peut varier en fonction du type d’aliment (par exemple, pour l’inactivation de
[12]
Salmonella, une réduction de 4 log a été exigée pour le traitement des amandes et une réduction de
[13]
7 log pour les produits de volaille ). Pour pouvoir analyser le niveau cible de réduction, la limite de
quantification de la méthode d’analyse utilisée et le niveau de l’inoculum doivent être appropriés.
7.3 Nombre de lots
Le nombre de lots à inclure dans l’étude dépend de la variabilité du procédé de production et des
caractéristiques des aliments (voir Annexe B). Les caractéristiques des lots étudiés doivent être
représentatives de la variabilité rencontrée lors du procédé de production et basées sur l’historique des
données d’auto-contrôles.
Il convient d’utiliser un nombre minimal de trois lots pour les études de potentiel d’inactivation et de
cinétique d’inactivation. En général, il convient d’augmenter le nombre de lots dans les situations de
variabilité ou d’incertitude plus importante.
L’emploi d’un seul lot doit être clairement justifié, par exemple:
a) évaluation de l’impact d’une nouvelle formulation de l’aliment;
b) utilisation d’un lot représentant les conditions d’inactivation les plus défavorables (scénario le plus
défavorable);
c) lorsque plusieurs niveaux du traitement seront évalués dans des études de cinétique d’inactivation.
7.4 Préparation des unités pour essai
Les unités pour essai représentatives de la matrice (matières premières et ingrédients, produits
intermédiaires ou finis) avant le traitement d’inactivation peuvent être:
— soit des portions échantillonnées de manière aseptique des produits en vrac issus de la ligne de
production;
— soit des portions échantillonnées de manière aseptique ou le contenu complet de l’unité ou des
unités de conditionnement.
Les unités pour essai doivent être maintenues dans des conditions appropriées avant inoculation, et être
inoculées de préférence à un temps le plus proche possible du jour de production, sauf spécification
contraire par l’objectif de l’étude. Une fois inoculées, toutes les unités pour essai, y compris t (voir
Figure 2), doivent être maintenues dans les mêmes conditions appropriées, y compris le transport et le
stockage si nécessaire.
7.5 Nombre d’unités témoins et d’unités pour essai
Le nombre minimal d’unités à analyser dépend du type d’étude d’inactivation, de la nature de l’aliment
et des conditions de transformation (voir Annexe B).
Pour les études du potentiel d’inactivation, le nombre de points d’échantillonnage dépend de
l’accessibilité des échantillons. Dans certains cas, il est uniquement possible d’obtenir des échantillons
au début et à la fin du procédé. Dans d’autres cas, il est possible d’obtenir des échantillons intermédiaires.
Concernant les études de cinétique d’inactivation, il est important de disposer d’un nombre suffisant de
points expérimentaux pour obtenir une estimation exacte du type de courbe (voir Figure 1). Pour les
types de courbes linéaires, un minimum de six points d’échantillonnage est requis. Pour les types de
courbes non linéaires, un plus grand nombre de points d’échantillonnage est généralement nécessaire.
Il convient d’augmenter le nombre d’unités dans les situations de variabilité ou d’incertitude plus
importante en lien avec les caractéristiques des aliments et du procédé. Il est recommandé de préparer
des unités supplémentaires pour pallier les imprévus.
8 Choix des souches
Chaque souche utilisée doit avoir une caractérisation biochimique et/ou sérologique et/ou génétique
avec un niveau de détail suffisant pour que son identité soit connue. Les souches précédemment isolées
de la matrice alimentaire (matières premières, ingrédients, produits finis) ou de l’environnement
de production ou d’échantillons cliniques/alimentaires/environnementaux issus de toxi-infections
impliquant cet aliment sont privilégiées.
Il convient de connaître la source d’origine de tous les isolats et de conserver ces derniers dans une
collection de culture locale (par exemple, laboratoire réalisant le test d’inactivation), nationale
ou internationale, afin de permettre leur utilisation dans des essais futurs, si nécessaire. Utiliser
des souches pour lesquelles le ou les paramètres d’inactivation (par exemple, valeurs D, k ou δ) ont
été préalablement déterminés dans une matrice similaire (par exemple, résistance à la chaleur,
à la pression, aux acides) afin de s’assurer que la ou les souches sélectionnées sont adaptées à l’objectif.
[15]
Si la matrice n’est pas similaire, une étude préliminaire doit être réalisée pour mesurer la résistance .
Des cocktails de trois à cinq souches adaptées à l’objectif sont appropriés pour les études du potentiel
d’inactivation. Pour la cinétique d’inactivation, les souches doivent uniquement être soumises à essai
individuellement.
Idéalement, les études d’inactivation devraient utiliser le microorganisme cible. Dans le cas de
microorganismes pathogènes, cela est possible lorsque l’étude est réalisée en laboratoire ou dans une
installation pilote. Toutefois, cela n’est pas possible dans les usines ou les installations de production
alimentaire (voir Annexe A). Dans ce cas, un substitut doit être utilisé. L’adéquation du substitut
sélectionné doit être justifiée et documentée en lien avec le microorganisme pathogène, la matrice
alimentaire et le traitement évalué. Dans le cas contraire, une étude spécifique de validation du
[26]
substitut doit être effectuée et consignée par écrit .
9 Préparation de l’inoculum
9.1 Généralités
Afin de tenir compte de l’effet de dilution lors de l’inoculation des unités pour essai, la concentration de
l’inoculum doit être supérieure à la réduction logarithmique visée. Dans certains cas, il est nécessaire
de réaliser des études préliminaires pour atteindre le niveau cible d’inoculum, comme la concentration
par centrifugation ou la culture sur milieu solide pour réduire le plus possible le volume.
9.2 Préparation des cellules végétatives
Préparer les souches pour obtenir un inoculum standardisé dont les conditions physiologiques et la
concentration sont adaptées à l’objectif.
Il convient d’effectuer initialement la culture dans des milieux non sélectifs et dans des conditions
adaptées à une croissance optimale. Cette culture peut être utilisée dans des conditions optimales ou
être adaptée afin de simuler les conditions de contamination potentielle. Des exemples d’adaptation
sont le pH, le type d’acide, la température, l’a , la teneur en sel, la teneur en sucre, le milieu liquide ou
w
solide et l’atmosphère.
La concentration microbienne de l’inoculum doit être estimée en utilisant des méthodes reconnues
au niveau international et largement acceptées ou d’autres méthodes validées conformément à des
protocoles acceptés au niveau international. Cet inoculum peut être concentré par centrifugation pour
atteindre la concentration cible. En cas d’utilisation d’un cocktail, il convient de préparer les souches
individuellement et de les mélanger en concentration équivalente.
En outre, le nombre de microorganismes utilisé pour l’inoculum préparé doit être confirmé
à t (voir Figure 2) par dénombrement sur le même milieu que celui qui sera utilisé pour l’étude
inoc
d’inactivation.
Les cellules végétatives sont utilisées pour l’inoculation directe (inoculum humide) ou pour être
préparées pour des utilisations ultérieures dans des applications sèches.
Des techniques de préparation d’inoculum sec peuvent être requises pour les études sur les
aliments à basse teneur en humidité. L’inoculum peut être préparé sans support (par exemple par
lyophilisation, sous vide) ou séché sur un support (par exemple billes, sable, craie, talc, farine, forme
en poudre du produit, ou un produit similaire à l’aliment soumis à essai). Pour la préparation d’un
inoculum déshydraté, le microorganisme peut avoir besoin de plusieurs jours pour se stabiliser à une
concentration donnée. Des dénombrements des microorganismes viables de l’inoculum séché stabilisé
doivent être obtenus avant l’utilisation.
9.3 Préparation des spores
Pour préparer la suspension de spores, inoculer la ou les souches cibles dans un milieu de culture
approprié et incuber dans des conditions qui favoriseront un taux élevé de sporula
...
Questions, Comments and Discussion
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