ISO 3990:2023
(Main)Dentistry — Evaluation of antibacterial activity of dental restorative materials, luting materials, fissure sealants and orthodontic bonding or luting materials
Dentistry — Evaluation of antibacterial activity of dental restorative materials, luting materials, fissure sealants and orthodontic bonding or luting materials
This document specifies test methods for the evaluation of dental restorative materials, luting materials, fissure sealants and orthodontic bonding or luting materials that are claimed by their respective manufacturers to exert “antibacterial” effects. NOTE Materials for pulp capping (e.g. calcium hydroxide formulations), endodontic filling materials, dental implants or implant systems, nightguards and additive manufactured (e.g. 3D-printed) materials are not covered in this document. This document does not cover tests on the effectiveness of sterilization or disinfection procedures. This document cannot be used to demonstrate a lack of microbial contamination of medical devices used in dentistry.
Médecine bucco-dentaire — Évaluation de l'activité antibactérienne des matériaux de restauration dentaire, matériaux de scellement, produits de comblement des fissures et matériaux de collage ou de scellement orthodontiques
Le présent document spécifie les méthodes d’essai pour l'évaluation des matériaux de restauration dentaire, matériaux de scellement, produits de comblement des fissures et matériaux de collage ou de scellement orthodontiques qui sont revendiqués par leurs fabricants respectifs pour exercer des effets «antibactériens». NOTE Les matériaux de coiffage pulpaire (par exemple, formulations à base d'hydroxyde de calcium), les matériaux de remplissage endodontiques, les implants ou systèmes d’implants dentaires, les gouttières et les matériaux produits par fabrication additive (par exemple, par impression 3D) ne sont pas couverts par le présent document. Le présent document ne couvre pas les essais portant sur l’efficacité des modes opératoires de stérilisation ou de désinfection. Il ne peut pas être utilisé pour prouver l’absence de contamination microbienne des dispositifs médicaux utilisés en médecine bucco-dentaire.
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 3990
First edition
2023-07
Dentistry — Evaluation of
antibacterial activity of dental
restorative materials, luting materials,
fissure sealants and orthodontic
bonding or luting materials
Médecine bucco-dentaire — Évaluation de l'activité antibactérienne
des matériaux de restauration dentaire, matériaux de scellement,
produits de comblement des fissures et matériaux de collage ou de
scellement orthodontiques
Reference number
© ISO 2023
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on
the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below
or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: +41 22 749 01 11
Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Requirements . 2
4.1 General . 2
4.2 Extract . . . 2
4.3 Direct contact . 2
5 Sample preparation and control material preparation . 3
5.1 General . 3
5.2 General requirements and recommendations for sample preparation . 3
5.3 Specific requirements and recommendations for light-curing materials . 4
5.4 Specific requirements and recommendations for chemically setting materials . 4
5.5 Specific requirements and recommendations for CAD/CAM milled or subtractive
manufactured materials . 5
5.6 Sterility of samples . 5
5.7 Preparation of liquid extracts of material . 5
5.7.1 Principles of extraction . 5
5.7.2 Extraction vehicle . 6
5.7.3 Extraction conditions . . 6
5.7.4 Consecutive elution cycles . 6
5.8 Preparation of materials for direct contact tests . 7
5.8.1 Form of samples . 7
5.8.2 Principles of direct contact tests . 7
6 Bacterial strains, nutrient broths and preparation of bacterial cultures .8
7 Test procedures . 8
7.1 General . 8
7.2 Test on extracts . . 9
7.2.1 Tests on extracts toward planktonic cultures of bacteria . 9
7.2.2 Test on extracts toward bacterial biofilms. 10
7.3 Test by direct contact . 11
7.3.1 Test by direct contact toward planktonic cultures of bacteria . 11
7.3.2 Test by direct contact toward bacterial biofilms .12
7.4 Determination of antibacterial effects . 13
7.4.1 General .13
7.4.2 A ssessment of the reduction of the bacterial ability to replicate .13
7.4.3 A ssessment of bacterial membrane damage . 14
7.4.4 A ssessment of the reduction in bacterial metabolic activity . 16
8 A ssessment of results .17
9 Final test report .17
Annex A (informative) Bacterial strains and corresponding nutrient broths .19
Bibliography .21
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use
of (a) patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed
patent rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received
notice of (a) patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are
cautioned that this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent
database available at www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all
such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 106, Dentistry, in collaboration with
the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee CEN/TC 55, Dentistry, in
accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
Due to the general applicability of in vitro tests for antibacterial activity and their widespread use in
evaluating a large range of dental materials, it is the purpose of this document to define a scheme for
testing which requires decisions to be made in a series of steps rather than to specify a single test. This
should lead to the selection of the most appropriate test for a respective dental material to be evaluated.
Two categories of test are listed: extract test and direct contact test.
The choice of one or more of these categories depends upon the nature of the material to be evaluated,
the potential site of use and the nature of the use of the respective material. Extract tests are primarily
directed to substances leaching out from materials, whereas direct contact tests are directed to both,
effects from leachable substances and surface effects. The choice of test then determines the details of
the preparation of the samples to be tested, the preparation of the cultured bacteria or biofilms, and the
way in which the bacteria or biofilms are exposed to the samples or their extracts.
Both categories of tests are intended to be first conducted toward planktonic cultures of bacteria and
then, in case of positive results, toward bacterial biofilms.
This document proposes measurement of reduction of bacterial ability to replicate as the main method
to assess antibacterial effects. Additionally, bacterial membrane damage can be assessed in order to
further verify bacterial cell death and reductions in bacterial metabolic activity can be investigated as
another measure of bacterial viability.
There are several means of producing results in each of these test categories. The investigator should
be aware of the test categories and into which category a particular technique fits, in order to ensure
the comparability with other results on similar materials both at the intra- and interlaboratory level.
Examples of quantitative test protocols for assessing reduction of bacterial ability to replicate by colony
forming units (CFU) assay and for assessing bacterial membrane damage by flow cytometry and for
investigating reductions in bacterial metabolic activity by MTT assay are given in this document along
with guidance for the interpretation of the results.
v
INTERNATIONAL STANDARD ISO 3990:2023(E)
Dentistry — Evaluation of antibacterial activity of dental
restorative materials, luting materials, fissure sealants and
orthodontic bonding or luting materials
1 Scope
This document specifies test methods for the evaluation of dental restorative materials, luting
materials, fissure sealants and orthodontic bonding or luting materials that are claimed by their
respective manufacturers to exert “antibacterial” effects.
NOTE Materials for pulp capping (e.g. calcium hydroxide formulations), endodontic filling materials, dental
implants or implant systems, nightguards and additive manufactured (e.g. 3D-printed) materials are not covered
in this document.
This document does not cover tests on the effectiveness of sterilization or disinfection procedures. This
document cannot be used to demonstrate a lack of microbial contamination of medical devices used in
dentistry.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 1942, Dentistry — Vocabulary
ISO 4049, Dentistry — Polymer-based restorative materials
ISO 6344-3, Coated abrasives — Determination and designation of grain size distribution — Part 3:
Microgrit sizes P240 to P5000
ISO 7405, Dentistry — Evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry
ISO 9917-1, Dentistry — Water-based cements — Part 1: Powder/liquid acid-base cements
ISO 9917-2, Dentistry — Water-based cements — Part 2: Resin-modified cements
ISO 10993-1, Biological evaluation of medical devices — Part 1: Evaluation and testing within a risk
management process
ISO 10993-5, Biological evaluation of medical devices — Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
ISO 10993-12, Biological evaluation of medical devices — Part 12: Sample preparation and reference
materials
ISO 10993-18, Biological evaluation of medical devices — Part 18: Chemical characterization of medical
device materials within a risk management process
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 1942, ISO 7405, ISO 10993-1
and ISO 10993-5 apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
dental restorative material
material or combination of materials specially formulated and prepared for use in dentistry and/or
associated procedures for restoring lost integrity of teeth or for replacing teeth
3.2
positive control material
well characterized material and/or substance that, when evaluated by a specific test method,
demonstrates the suitability of the test system to yield a reproducible, appropriately positive or reactive
response in the test system
[SOURCE: ISO 7405:2018, 3.3]
3.3
negative control material
well characterized material and/or substance that, when evaluated by a specific test method,
demonstrates the suitability of the test system to yield a reproducible, appropriately negative,
nonreactive or minimal response in the test system
Note 1 to entry: In practice, negative control materials include materials lacking the active component that is
responsible for antibacterial activity or materials used in clinical practice with no antibacterial activity.
[SOURCE: ISO 7405:2018, 3.4, modified — Note 1 to entry has been replaced.]
3.4
antibacterial material
material exhibiting antibacterial activity as compared to the negative control material (3.3)
4 Requirements
4.1 General
The material claiming to be antibacterial shall meet one of the requirements in 4.2 and 4.3.
4.2 Extract
For tests on extract, an antibacterial material shall exhibit a median reduction of bacterial ability to
replicate of at least 99,9 % (3 log steps) as compared to the negative control material when tested in
accordance with 7.1.
[1],[2],[3]
NOTE This requirement is in line with the definitions of the American Society of Microbiology .
4.3 Direct contact
For tests by direct contact, an antibacterial material shall exhibit a median reduction of bacterial ability
to replicate at least 99 % (2 log steps) as compared to the negative control material when tested in
accordance with 7.2.
[4]
NOTE This requirement is in line with the definitions outlined in JIS Z 2801 .
5 Sample preparation and control material preparation
5.1 General
The tests described in this document shall be performed on
a) an extract of the sample, and/or
b) the sample itself.
Assessment of antibacterial properties shall be made on the material prepared in accordance with the
manufacturer’s instructions. Before testing antibacterial properties of dental materials in accordance
with this document, the physical and chemical properties of the material (and extracts) shall be
assessed in accordance with ISO 10993-1 and ISO 10993-18. Before testing antibacterial properties of
polymer-based restorative materials, the physical behaviour of the material should be characterized
according to ISO 4049. Before testing antibacterial properties of cements, the physical behaviour of the
material should be characterized according to ISO 9917-1 or ISO 9917-2, respectively.
Negative and positive control materials shall be included in each assay. If appropriate and possible,
control materials should be prepared by the same procedure as the sample (see 5.2 to 5.5). In all cases,
control materials shall resemble the dimensions and other material properties such as roughness of the
test materials. For direct contact tests, test materials and control materials shall have a circular shape
with a diameter of 10 mm and a thickness of 1 mm to be used in 48-well plates (see 7.3).
[5]
For tests on extracts, 0,2 % chlorhexidine digluconate shall be used as a positive control. Additionally,
to the extracts from the negative control material, nutrient broth used for bacterial culture in the
respective set of experiments (see Annex A for examples) shall be used as further negative control to
ensure experimental validity.
For tests by direct contact, copper plates (circular shape; diameter 10 mm; purity ≥99 %; absence of
[6]
visible surface impurities) shall be used as a positive control. These plates shall be ground with a
P2000 paper in accordance with ISO 6344-3 in order to provide similar roughness as compared to the
samples.
Negative control materials shall not exhibit any antibacterial activity. Therefore, PTFE samples shall be
used that have the same size and dimensions as the test samples.
All test or control samples shall be stored in sterile water at (37 ± 1) °C after mixing/curing/milling
as described by the manufacturer for 24 h prior to testing, e.g. for allowing leaching of monomers
in polymers. After these initial 24 h, all test or control samples shall be tested at once and after
10 consecutive elution cycles (see 5.7.4) to provide an indication on long-term antibacterial activity.
[7]
If antibacterial activity is still observed after 10 elution cycles, a further test after 20 elution cycles
should follow in order to demonstrate a plateau (i.e. a persisting effect) of the antibacterial activity.
Chemical analysis of the extracts should be additionally performed according to ISO 10993-18.
5.2 General requirements and recommendations for sample preparation
Sample preparation shall be in accordance with ISO 7405, ISO 10993-12, ISO 4049, ISO 9917-1 and
ISO 9917-2.
For the preparation of samples, consult the respective product standards and/or the manufacturer’s
instructions, and follow those descriptions as closely as possible. Justify any deviation from the
manufacturer's instructions. A detailed description of the sample preparation shall be included in the
test report. Sample preparation shall take into account the following factors:
a) temperature;
b) humidity;
c) light exposure: samples of photosensitive materials shall be produced under the condition that
ambient light does not activate them;
d) material of sample mould: ensure that the material of the sample mould and eventual lubricant
used do not interfere with the setting process of the material;
e) oxygen exposure: for materials that produce an oxygen inhibition layer during hardening, both
ends of the mould shall be covered with transparent oxygen barrier materials (e.g. polyester/mylar
strips) during hardening;
f) samples shall be produced under aseptic conditions; in cases, where this is not possible, the samples
can be sterilized by the method appropriate to the material, if necessary and possible (see 5.7.3).
5.3 Specific requirements and recommendations for light-curing materials
In accordance with ISO 7405, the following factors shall be taken into account, considering the final use
of the light-curing material:
a) Material of sample mould: If possible, the material of the sample mould should be according to
ISO 4049, i.e. stainless steel moulds with a white backing (white filter paper) at the bottom of the
sample. In case this is not possible, reflection coefficients of materials used for sample moulds
should be as close as possible to that of the oral surface to which the material is applied in order to
simulate the clinical situation.
NOTE Suitable sample mould materials with reflection coefficients close to dental hard tissues can be
semi-translucent or white plastic materials such as polyethylene (PE) or polytetrafluoroethylene (PTFE).
b) Light exposure: Light-curing shall be done to simulate clinical usage as closely as possible. This
often requires curing from one side only but sometimes entails a two-sided cure. The cure method
is material and/or process specific. In the case of one-component materials, there shall be no
voids, clefts or air-bubbles present when viewed without magnification. To provide the same level
of curing as would be the case in clinical usage, follow the instructions for use of the material
manufacturer including the recommended powered polymerization activator, which shall include
the emission wavelength region(s), the irradiance and the exposure time. This information shall
be documented in the test report. Care shall be taken to ensure that the light source and operating
condition conform to the instructions for use of the material manufacturer.
c) Oxygen exposure: For materials that produce an oxygen inhibition layer during light-curing, both
ends of the mould shall be covered with transparent oxygen barrier materials (e.g. polyester/mylar
strips) during light-curing.
d) Sample surface treatment: If the material is recommended by the manufacturer for surface
finishing after curing, the sample surfaces shall be ground and polished using the recommended
clinical procedures. If there are no such instructions and if required for testing, the samples shall
be ground on both ends, with a P2000 paper in accordance with ISO 6344-3, after first being set
against the transparent oxygen barrier material.
5.4 Specific requirements and recommendations for chemically setting materials
In accordance with ISO 7405, ISO 9917-1 and ISO 9917-2, the following factors shall be taken into
account, considering the final use of the chemically setting material:
a) Mixing: Mix sufficient material to ensure that the preparation of each sample is completed from
one batch. Prepare a fresh mix for each sample. The mixing shall be performed in accordance with
the respective product standards, if applicable.
b) Oxygen exposure: For materials that produce an oxygen inhibition layer during chemical curing,
both ends of the mould shall be covered with oxygen barrier materials (e.g. polyester/mylar strips)
during curing.
c) Sample surface treatment: If the material is recommended by the manufacturer for surface
finishing after curing, the sample surfaces shall be ground and polished using the recommended
clinical procedures. If there are no such instructions and if required for testing, the samples shall
be ground on both ends, with a P2000 paper in accordance with ISO 6344-3, after first being set
against the transparent oxygen barrier material.
5.5 Specific requirements and recommendations for CAD/CAM milled or subtractive
manufactured materials
The following factors shall be taken into account, considering the final use of the CAD/CAM milled or
subtractive manufactured material: sample surface treatment: if the material is recommended by the
manufacturer for surface finishing after CAD/CAM milling or subtractive manufacturing, the sample
surfaces shall be ground and polished using the recommended clinical procedures. If there are no such
instructions and if required for testing, the samples shall be ground on both ends, with a P2000 paper
in accordance with ISO 6344-3.
5.6 Sterility of samples
Sterility of the samples shall be taken into account.
Samples from dental materials that are supplied sterile shall be handled aseptically throughout the test
procedure.
Samples from dental materials that are normally supplied non-sterile but are sterilized before use shall
be sterilized by the method recommended by the manufacturer and handled aseptically throughout
the test procedure. The effect of sterilization methods or agents on the dental material should be
considered in defining the preparation of the sample prior to use in the test system.
Samples from dental materials not required to be sterile in use shall be used as supplied and handled
aseptically throughout the test procedure. It can be justifiable to decontaminate the test material in
order to avoid cross-contamination of the bacterial culture; however, the decontamination process shall
not alter the properties of the test material. An immersion in 70 % ethanol for 1 min is recommended
– unless specified otherwise – to reduce cross-contamination, followed by immersion in sterile water
for 1 min. Other methods for decontamination can be used if their efficacy has been proven and if it has
been verified that they do not change material properties.
If non-sterile samples are used, they should be checked for bacterial cross-contamination because the
contamination can lead to a false assessment of antibacterial properties.
5.7 Preparation of liquid extracts of material
5.7.1 Principles of extraction
Preparation of extracts shall be performed after a 24 h-storage in sterile water at (37 ± 1) °C following
mixing/curing as described by the manufacturer and after 10 consecutive elution cycles (see 5.7.4) to
[7]
provide an indication on long-term antibacterial activity .
If antibacterial activity is still observed for the extract after the 10th elution cycle, a further test on an
extract after 20 elution cycles should follow in order to demonstrate a plateau (i.e. a persisting effect) of
the antibacterial activity.
th th
Chemical analysis of the extracts should be additionally performed after the 10 and 20 elution cycle
according to ISO 10993-18.
Extracting conditions should attempt to simulate or exaggerate the clinical use conditions so as to
determine the potential antibacterial activity without causing significant changes in the sample, such
as fusion, melting or any alteration of the chemical structure, unless this is expected during clinical
application. Due to the nature of certain materials (e.g. biodegradable materials), alteration of the
chemical structure can occur during the extraction procedure.
NOTE The concentration of any endogenous or extraneous substances in the extract, and hence the amount
exposed to the test bacteria, depends on the interfacial area, the extraction volume, pH, chemical solubility,
diffusion rate, osmolarity, agitation, temperature, time and other factors.
5.7.2 Extraction vehicle
The choice of the extraction vehicle(s) taking into account the chemical characteristics of the sample
shall be justified and documented. One or more of the following vehicles shall be used:
a) nutrient broth used for bacterial culture in the respective set of experiments (see Annex A for
examples);
b) phosphate-buffered saline (PBS);
c) serum (for extraction of lipids).
The choice of vehicle should reflect the aim of the extraction. Nutrient broth is the preferred extraction
vehicle because of its ability to extract both polar and non-polar substances.
NOTE It is important to recognize that proteins from protein-rich or serum-containing nutrient broths are
known to bind, to some extent, extractables.
5.7.3 Extraction conditions
The extraction procedures shall be performed in accordance with ISO 10993-5.
The extraction shall be performed in sterile, chemically inert, closed containers by using aseptic
techniques with a volume of extraction vehicle based on the exposed surface area, in accordance with
ISO 10993-12.
With the exception of circumstances given below, the extraction shall be conducted under one of the
following conditions and shall be applied in accordance with the material characteristics and specific
conditions for use:
a) (24 ± 2) h at (37 ± 1) °C;
b) (72 ± 2) h at (37 ± 1) °C.
Other conditions which simulate the extraction that occurs during clinical use or provide an adequate
measure of the antibacterial properties of the material can be used but shall be justified and
documented.
Manipulation of the extract, such as by pH adjustment, filtering, centrifugation or other processing
methods prior to being applied to the bacteria should be avoided because it can influence the result. If
suchlike manipulation still is necessary, these details shall be recorded in the final report along with a
rationale for the additional steps.
5.7.4 Consecutive elution cycles
For providing an indication on long-term antibacterial activity, consecutive elution cycles are performed
[7]
by using the extraction vehicle (see 5.7.2) and extraction conditions (see 5.7.3) as described above .
The whole elution procedure shall be conducted by consecutively performing at least 10 single elution
steps. For each single elution step, the samples shall be stored in the dark at (37 ± 1) °C for either
(24 ± 2) h or (72 ± 2) h. After that period, the elution vehicle shall be renewed, and another elution
step shall be performed. This procedure shall be repeated 10 times. For this purpose, extract samples
for a period of two weeks. Change the extraction vehicle four times a week in 24 h intervals and one
time at 72 h. This results in 10 changes. The extracts used for testing shall be 24 h extracts and no 72 h
extracts.
In the case antibacterial activity is observed for the extract after the 10th elution cycle, conduct a
further 10 elution cycles and test on an extract after 20 elution cycles in order to demonstrate a plateau
(i.e. a persisting effect) of the antibacterial activity. For this purpose, extract samples for a period of
four weeks. Change the extraction vehicle four times a week in 24 h intervals and one time at 72 h. This
results in 20 changes. The extracts used for testing should be 24 h extracts and no 72 h extracts.
According to ISO 10993-12, extracts should, if possible, be used immediately after preparation to
prevent sorption on to the extraction container or other changes in composition. If an extract is stored
for longer than 24 h refrigerated at 2 °C to 8 °C, then the stability and homogeneity of the extract under
the storage conditions shall be verified.
5.8 Preparation of materials for direct contact tests
5.8.1 Form of samples
The preferred sample of a solid material shall have a circular shape with a diameter of 10 mm and
a thickness of 1 mm to be used in 48-well plates. There should be at least one flat surface. If not,
adjustments shall be made to achieve flat surfaces.
In the case of materials that have another physical state than solid (gels, etc.), they can be tested in their
respective various shapes or sizes without modification in the antibacterial assays. These shapes shall
be similar among all samples. In these cases, the respected volumes of nutrient broth used for bacterial
culture need to be adjusted accordingly.
5.8.2 Principles of direct contact tests
Tests for direct contact shall be performed after a 24 h-storage in sterile water at (37 ± 1) °C following
mixing/curing as described by the manufacturer and after 10 consecutive elution cycles (see 5.7.4) to
[7]
provide an indication on long-term antibacterial activity .
If antibacterial activity is still observed for the material after the 10th elution cycle, a further test on
the material after 20 elution cycles should follow in order to demonstrate a plateau (i.e. a persisting
effect) of the antibacterial activity.
It shall be ensured that all surfaces of the samples are exposed to extraction. Samples sticking together
can result in unextracted surfaces and false positive findings. Use an appropriate rack (see Figure 1) to
mount samples for extraction. The volume of extraction vehicle used to extract samples shall be large,
i.e. at least 10 ml/cm sample surface.
Figure 1 — Example of a rack for mounting of samples
Use one of the following extraction media:
a) nutrient broth used for bacterial culture in the respective set of experiments (see Annex A for
examples);
b) PBS.
For materials that are not pH-neutral, for example, cements, products containing alkaline glasses, or
that can be subject to corrosion, PBS should be used. In this instance, capacity to recharge shall be
considered as well (e.g. for glass ionomer-based materials).
6 Bacterial strains, nutrient broths and preparation of bacterial cultures
Established bacterial type or reference strains are preferred and, where used, shall be obtained
1)
from recognized repositories . Selection of bacterial strains shall be based on the relevance of these
organisms for the area of application of the respective material (e.g. Streptococcus spp. for materials
related to restorative dentistry or orthodontics). Due to restricted availability and potentially impaired
comparability of the obtained results, no clinical bacterial isolates should be used.
Annex A summarizes recommended bacterial type or reference strains with their corresponding
nutrient broths and solid growth media to be used for the set of experiments described in this document.
2)
All experiments shall be performed in accordance with appropriate microbiological practices .
If a stock culture of a bacterial strain is stored, storage shall be at −80 °C or below in the corresponding
nutrient broth but containing a cryoprotectant, e.g. glycerol. The nutrient broth shall meet the growth
requirements of the selected bacterial type strain.
Only bacterial strains free from any cross-contamination shall be used for the test. Before use, stock
cultures should be tested for the absence of cross-contamination (e.g. by MALDI-TOF analysis). Only
use pure cultures. The nutrient broth used for the experiment shall be sterile and free of any cross-
contamination.
Using the chosen bacterial type or reference strain and nutrient broth, prepare sufficient planktonic
bacterial cultures to complete the assay. Avoid sub-culturing bacterial cultures for more than five times
on agar plates or in liquid cultures because sub-culturing can change the properties of the chosen
bacterial type strain.
7 Test procedures
7.1 General
Assessment of antibacterial properties shall be made on the final finished product.
A minimum of three independent experiments with at least three replicates in each experiment shall be
used for samples and negative control materials and positive control materials.
1) For example, from the American Type Culture Collection (ATCC), the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen (DSMZ) or the National Collection of Type Cultures (NCTC).
2) For example, WHO Good Practices for Pharmaceutical Microbiology Laboratories (WHO Technical Report
[8]
Series, No. 961, 2011, Annex 2) .
7.2 Test on extracts
7.2.1 Tests on extracts toward planktonic cultures of bacteria
7.2.1.1 Principle
This test allows assessment of antibacterial properties by assessing reduction of bacterial ability to
replicate in planktonic cultures and by measuring bacterial membrane damage or reduction in bacterial
metabolic activity in planktonic cultures.
7.2.1.2 Apparatus, and materials and reagents
7.2.1.2.1 Apparatus
7.2.1.2.1.1 Cell culture laboratory equipment, i.e. pipettes, incubator.
7.2.1.2.1.2 96-well plates.
7.2.1.2.2 Materials and reagents
7.2.1.2.2.1 Extracts from test and control samples, see 5.6.
7.2.1.2.2.2 Nutrient broth, see Annex A.
7.2.1.2.2.3 Positive control material: 0,2 % chlorhexidine digluconate.
7.2.1.2.2.4 Negative control material, nutrient broth, see Annex A.
7.2.1.3 Procedure
Prepare overnight cultures at (37 ± 1) °C under aerobic or anaerobic conditions as appropriate for
the respective culture conditions of the chosen bacterial strain (see Annex A). Adjust to a bacterial
5 5
concentration that is between 2,5 × 10 CFU/ml and 10 × 10 CFU/ml with the same nutrient broth used
to grow the bacteria. Use an optical density (measured at 600 nm) corresponding to the above bacterial
concentration as a guide for the adjustment.
NOTE Although slightly varying per each bacterial strain, an optical density (measured at 600 nm) of 0,1
typically corresponds to a starting inoculum of about 10 CFU/ml.
Pipette a 100 µl aliquot of the adjusted overnight culture of the chosen bacterial strain into each of a
sufficient number of wells of a 96-well plate for exposure to the extracts.
Pipette to each of the bacterial cultures 100 µl of
a) the original extract, and/or
b) the original extract and a dilution series of the extracts using the extract vehicle as diluent.
Alternatively, where materials of limited solubility are known or suspected to be present, dilution
should be achieved by varying the original extraction ratio of sample to extraction medium.
Prepare replicate wells for both the negative control material and positive control material.
Incubate the well plates at (37 ± 1) °C under aerobic or anaerobic conditions as appropriate for the
respective culture conditions of the chosen bacterial strain (see Annex A) for an appropriate period
corresponding to the selected specific assay.
If biofilms form during the culture period of overnight culture with extracts, resuspend the biofilms in
the supernatant (by frequently pipetting up and down followed by visual examination of the wells for
confirming complete removal of the biofilms).
Determine antibacterial effects as outlined in 7.4.
7.2.2 Test on extracts toward bacterial biofilms
7.2.2.1 Principle
This test allows assessment of antibacterial properties by assessing reduction of bacterial ability to
replicate in biofilms and by measuring bacterial membrane damage or reduction in bacterial metabolic
activity in biofilms.
7.2.2.2 Apparatus, and materials and reagents
7.2.2.2.1 Apparatus
7.2.2.2.1.1 Cell culture laboratory equipment, i.e. pipettes, incubator.
7.2.2.2.1.2 96-well plates.
7.2.2.2.2 Materials and reagents
7.2.2.2.2.1 Extracts from test and control samples, see 5.6.
7.2.2.2.2.2 Nutrient broth, see Annex A.
7.2.2.2.2.3 Phosphate-buffered saline.
7.2.2.2.2.4 Positive control material: 0,2 % chlorhexidine digluconate.
7.2.2.2.2.5 Negative control material: Nutrient broth, see Annex A.
7.2.2.3 Procedure
Prepare overnight cultures at (37 ± 1) °C under aerobic or anaerobic conditions as appropriate for
the respective culture conditions of the chosen bacterial strain (see Annex A). Adjust to a bacterial
5 5
concentration that is between 2,5 × 10 CFU/ml and 10 × 10 CFU/ml with the same nutrient broth used
to grow the bacteria. Use an optical density (measured at 600 nm) corresponding to the above bacterial
concentration as a guide for the adjustment.
NOTE Although slightly varying per each bacterial strain, an optical density (measured at 600 nm) of 0,1
typically corresponds to a starting inoculum of about 10 CFU/ml.
Pipette a 200 µl aliquot of the adjusted overnight culture of the chosen bacterial strain into each of a
sufficient number of wells of a 96-well plate with flat bottom for biofilm formation.
Incubate the wells at (37 ± 1) °C under aerobic or anaerobic conditions as appropriate for the respective
culture conditions of the chosen bacterial strain for a total biofilm culture period of at least 48 h.
Refresh the nutrient broth every 24 h by carefully discarding the old nutrient broth while not affecting
the attached bacteria (mainly at the bottom of the well) and adding fresh nutrient broth.
After a total biofilm culture period of at least 48 h, carefully discard the nutrient broth and pipette to
each of the bacterial biofilms 100 µl of
a) the original extract, and/or
b) the original extract and a dilution series of the extracts using the extract vehicle as diluent.
Alternatively, where materials of limited solubility are known or suspected to be present, dilution
should be achieved by varying the original extraction ratio of sample to extraction medium.
Prepare replicate wells for both the negative control material and positive control material.
Incubate the well plates at (37 ± 1) °C under aerobic or anaerobic conditions as appropriate for the
respective culture conditions of the chosen bacterial strain (see Annex A) for an appropriate period
corresponding to the selected specific assay.
Carefully discard the nutri
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 3990
Première édition
2023-07
Médecine bucco-dentaire —
Évaluation de l'activité
antibactérienne des matériaux de
restauration dentaire, matériaux de
scellement, produits de comblement
des fissures et matériaux de collage ou
de scellement orthodontiques
Dentistry — Evaluation of antibacterial activity of dental restorative
materials, luting materials, fissure sealants and orthodontic bonding
or luting materials
Numéro de référence
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2023
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 2
4 Exigences . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Extrait . . 2
4.3 Contact direct . 3
5 Préparation de l’échantillon et du matériau de contrôle . 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Exigences générales et recommandations pour la préparation des échantillons . 4
5.3 Exigences spécifiques et recommandations pour les matériaux
photopolymérisables. 4
5.4 Exigences spécifiques et recommandations pour les matériaux à polymérisation
chimique . 5
5.5 Exigences spécifiques et recommandations pour les matériaux de CFAO fraisés ou
produits par fabrication soustractive . 5
5.6 Stérilité des échantillons . 5
5.7 Préparation des extraits liquides de matériau . 6
5.7.1 Principes d'extraction. 6
5.7.2 Milieu d’extraction . 6
5.7.3 Conditions d'extraction . 6
5.7.4 Cycles d’élution consécutifs . 7
5.8 Préparation des matériaux pour les essais en contact direct . 7
5.8.1 Forme des échantillons . 7
5.8.2 Principes des essais par contact direct . 8
6 Souches bactériennes, bouillons nutritifs et préparation des cultures bactériennes .8
7 Modes opératoires d’essai .9
7.1 Généralités . 9
7.2 Essais sur extraits . 9
7.2.1 Essais sur extraits vis-à-vis des cultures bactériennes planctoniques . 9
7.2.2 Essais sur extraits vis-à-vis des biofilms bactériens . 10
7.3 Essai par contact direct .12
7.3.1 Essai par contact direct vis-à-vis des cultures bactériennes planctoniques .12
7.3.2 Essai par contact direct vis-à-vis des biofilms bactériens .13
7.4 Détermination des effets antibactériens . 14
7.4.1 Généralités . 14
7.4.2 Évaluation de la réduction de la capacité bactérienne à répliquer . 14
7.4.3 Évaluation de l’endommagement de la membrane bactérienne .15
7.4.4 Évaluation de la réduction de l’activité métabolique bactérienne . 17
8 Interprétation des résultats .18
9 Rapport d’essai final .18
Annexe A (informative) Souches bactériennes et bouillons nutritifs correspondants .20
Bibliographie .21
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner
l’utilisation d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et
à l’applicabilité de tout droit de propriété revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent
document, l’ISO n'avait pas reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa
mise en application. Toutefois, il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent
document que des informations plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de
brevets, disponible à l'adresse www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié tout ou partie de tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir: www.iso.org/avant-propos.html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 106, Médecine bucco-dentaire, en
collaboration avec le comité technique CEN/TC 55, Médecine bucco-dentaire, du Comité européen de
normalisation (CEN), conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord
de Vienne).
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
En raison de l’applicabilité générale des essais in vitro pour l’activité antibactérienne et de leur
utilisation courante pour l’évaluation d’une vaste gamme de matériaux dentaires, l’objet du présent
document est de définir un schéma des essais qui nécessite la prise de décisions concernant une série
de phases plutôt que de spécifier un essai unique. Cette démarche devrait mener à la sélection de l'essai
le plus approprié pour un matériau dentaire à évaluer.
Deux catégories d’essai sont répertoriées: l’essai sur extrait et l’essai par contact direct.
Le choix d'une ou de plusieurs de ces catégories dépend de la nature du matériau à évaluer, du site
d'utilisation potentiel et de la nature de l'utilisation du matériau correspondant. Les essais sur extraits
concernent principalement les substances relarguées par les matériaux, tandis que les essais par
contact direct concernent aussi bien les effets dus aux substances relargables que les effets en surface.
Le choix de l’essai détermine alors les détails de la préparation des échantillons à soumettre à essai, de
la préparation des bactéries cultivées ou des biofilms, et la façon dont les bactéries ou les biofilms sont
exposés aux échantillons ou à leurs extraits.
Les deux catégories d’essai sont destinées à être réalisées d’abord sur des cultures planctoniques de
bactéries puis, en cas de résultats positifs, sur des biofilms bactériens.
Le présent document propose de mesurer la réduction de la capacité bactérienne à répliquer en tant que
méthode principale d’évaluation des effets antibactériens. De plus, l’endommagement de la membrane
bactérienne peut être évalué afin de vérifier que la cellule bactérienne est morte et les réductions de
l’activité métabolique bactérienne peuvent être étudiées en tant que mesure supplémentaire de la
viabilité bactérienne.
Il existe plusieurs moyens d'obtenir des résultats dans chacune de ces catégories d’essai. Afin de
s’assurer de la comparabilité avec d'autres résultats intra- et interlaboratoires sur des matériaux
similaires, il convient que l'investigateur connaisse les catégories d'essai auxquelles chaque technique
particulière appartient.
Le présent document donne des exemples de protocoles d'essai quantitatif pour évaluer la réduction
de la capacité bactérienne à répliquer par dosage des unités formant colonies (UFC), et pour évaluer
l’endommagement de la membrane bactérienne par cytométrie en flux et pour étudier les réductions
de l’activité métabolique bactérienne par test MTT. Il fournit également des recommandations pour
l’interprétation des résultats.
v
NORME INTERNATIONALE ISO 3990:2023(F)
Médecine bucco-dentaire — Évaluation de l'activité
antibactérienne des matériaux de restauration dentaire,
matériaux de scellement, produits de comblement
des fissures et matériaux de collage ou de scellement
orthodontiques
1 Domaine d'application
Le présent document spécifie les méthodes d’essai pour l'évaluation des matériaux de restauration
dentaire, matériaux de scellement, produits de comblement des fissures et matériaux de collage ou de
scellement orthodontiques qui sont revendiqués par leurs fabricants respectifs pour exercer des effets
«antibactériens».
NOTE Les matériaux de coiffage pulpaire (par exemple, formulations à base d'hydroxyde de calcium), les
matériaux de remplissage endodontiques, les implants ou systèmes d’implants dentaires, les gouttières et les
matériaux produits par fabrication additive (par exemple, par impression 3D) ne sont pas couverts par le présent
document.
Le présent document ne couvre pas les essais portant sur l’efficacité des modes opératoires de
stérilisation ou de désinfection. Il ne peut pas être utilisé pour prouver l’absence de contamination
microbienne des dispositifs médicaux utilisés en médecine bucco-dentaire.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 1942, Médecine bucco-dentaire — Vocabulaire
ISO 4049, Médecine bucco-dentaire — Produits de restauration à base de polymères
ISO 6344-3, Abrasifs appliqués — Détermination et désignation de la distribution granulométrique —
Partie 3: Micrograins P240 à P5000
ISO 7405, Médecine bucco-dentaire — Évaluation de la biocompatibilité des dispositifs médicaux utilisés en
médecine bucco-dentaire
ISO 9917-1, Art dentaire — Ciments à base d'eau — Partie 1: Ciments acido-basiques liquides/en poudre
ISO 9917-2, Médecine bucco-dentaire — Ciments à base d'eau — Partie 2: Ciments modifiés par addition de
résine
ISO 10993-1, Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 1: Évaluation et essais au sein d'un
processus de gestion du risque
ISO 10993-5, Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 5: Essais concernant la cytotoxicité
in vitro
ISO 10993-12, Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 12: Préparation des échantillons et
matériaux de référence
ISO 10993-18, Évaluation biologique des dispositifs médicaux — Partie 18: Caractérisation chimique des
matériaux des dispositifs médicaux au sein d'un processus de gestion du risque
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 1942, l’ISO 7405, l’ISO 10993-1
et l’ISO 10993-5 s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
matériau de restauration dentaire
matériau ou combinaison de matériaux spécialement formulé et préparé pour une utilisation en
médecine bucco-dentaire et/ou dans des modes opératoires associés pour restaurer la perte d’intégrité
des dents ou pour remplacer des dents
3.2
matériau de contrôle positif
matériau et/ou substance bien caractérisés, qui, soumis à essai conformément à une méthode
d’essai spécifique, démontrent l’aptitude du système d’essai à conduire à une réponse reproductible,
judicieusement positive ou réactive vis-à-vis du système d’essai particulier
[SOURCE: ISO 7405:2018, 3.3]
3.3
matériau de contrôle négatif
matériau et/ou substance bien caractérisés qui, soumis à essai conformément à une méthode
d’essai spécifique, démontrent l’aptitude du système d’essai à conduire à une réponse reproductible,
judicieusement négative, non réactive ou minimale vis-à-vis d’un système d’essai particulier
Note 1 à l'article: En pratique, les matériaux de contrôle négatif comprennent les matériaux qui ne contiennent
pas la substance active responsable de l’activité antibactérienne, ou les matériaux utilisés en milieu clinique et
qui n’ont pas d’activité antibactérienne.
[SOURCE: ISO 7405:2018, 3.4, modifiée — La Note 1 à l’article a été remplacée.]
3.4
matériau antibactérien
matériau présentant une activité antibactérienne par rapport au matériau de contrôle négatif (3.3)
4 Exigences
4.1 Généralités
Le matériau dit antibactérien doit satisfaire à l’une des exigences indiquées en 4.2 et 4.3.
4.2 Extrait
Pour les essais sur extraits, un matériau antibactérien doit présenter une réduction médiane de la
capacité bactérienne à répliquer d’au moins 99,9 % (trois niveaux de log ) par rapport au contrôle
négatif, lorsque l’essai est effectué conformément à 7.1.
[1],[2],[3]
NOTE Cette exigence est compatible avec les définitions de l’American Society of Microbiology .
4.3 Contact direct
Pour les essais par contact direct, un matériau antibactérien doit présenter une réduction médiane de
la capacité bactérienne à répliquer au moins 99 % (deux niveaux de log ) par rapport au matériau de
contrôle négatif, lorsque l’essai est effectué conformément à 7.2.
[4]
NOTE Cette exigence est compatible avec les définitions données dans la norme JIS Z 2801 .
5 Préparation de l’échantillon et du matériau de contrôle
5.1 Généralités
Les essais décrits dans le présent document doivent être effectués sur:
a) un extrait de l'échantillon; et/ou
b) l'échantillon lui-même.
L'évaluation des propriétés antibactériennes doit être réalisée sur le matériau préparé conformément
aux instructions du fabricant. Avant d’analyser les propriétés antibactériennes des matériaux dentaires
conformément au présent document, les propriétés physiques et chimiques du matériau (et des
extraits) doivent être évaluées conformément à l’ISO 10993-1 et à l’ISO 10993-18. Avant d’analyser
les propriétés antibactériennes des matériaux de restauration à base de polymères, il convient de
caractériser le comportement physique du matériau conformément à l’ISO 4049. Avant d’analyser les
propriétés antibactériennes des ciments, il est recommandé de caractériser le comportement physique
du matériau conformément à l’ISO 9917-1 ou l’ISO 9917-2, respectivement.
Des matériaux de contrôle positif et négatif doivent être incorporés à chaque essai. Si cela s’avère
approprié et possible, il convient de préparer les matériaux de contrôle en appliquant le même mode
opératoire que pour l’échantillon (voir 5.2 à 5.5). Dans tous les cas, les matériaux de contrôle doivent
avoir les mêmes dimensions et propriétés que les autres matériaux, notamment la même rugosité que les
matériaux d’essai. Pour les essais par contact direct, les matériaux d’essai et les matériaux de contrôle
doivent avoir une forme circulaire d'un diamètre de 10 mm et d’une épaisseur de 1 mm utilisable dans
des plaques à 48 puits (voir 7.3).
Pour les essais sur extraits, du digluconate de chlorhexidine à 0,2 % doit être utilisé comme contrôle
[5]
positif . En plus des extraits provenant du matériau de contrôle négatif, le bouillon nutritif utilisé pour
la culture bactérienne dans la série d’expériences correspondante (voir l’Annexe A pour des exemples)
doit être utilisé comme contrôle négatif supplémentaire afin d’assurer la validité expérimentale.
Pour les essais par contact direct, des plaques en cuivre (forme circulaire; diamètre de 10 mm;
pureté ≥99 %; absence d’impuretés superficielles visibles) doivent être utilisées comme contrôle
[6]
positif . Ces plaques doivent être poncées avec un papier P2000 conformément à l’ISO 6344-3 afin
d’obtenir une rugosité similaire à celle des échantillons.
Les matériaux de contrôle négatif ne doivent pas présenter d’activité antibactérienne. Par conséquent,
les échantillons de PTFE qui doivent être utilisés doivent avoir la même taille et les mêmes dimensions
que les échantillons pour essai.
Tous les échantillons pour essai ou échantillons de contrôle doivent être stockés dans de l’eau stérile
à (37 ± 1) °C après mélange/polymérisation/fraisage tel que décrit par le fabricant pendant 24 h
avant essai, par exemple pour permettre la lixiviation des monomères dans les polymères. Après ces
premières 24 h, tous les échantillons pour essai ou échantillons de contrôle doivent être soumis à
essai immédiatement, et après 10 cycles d'élution consécutifs (voir 5.7.4) pour fournir une indication
[7]
sur l’activité antibactérienne à long terme . Si l’activité antibactérienne est toujours observée après
10 cycles d'élution, il convient d’effectuer un essai supplémentaire après 20 cycles d'élution afin de
démontrer un plateau (c’est-à-dire un effet persistant) de l’activité antibactérienne.
Il est recommandé d’effectuer l’analyse chimique des extraits conformément à l’ISO 10993-18.
5.2 Exigences générales et recommandations pour la préparation des échantillons
La préparation des échantillons doit être conforme à l’ISO 7405, à l’ISO 10993-12, à l’ISO 4049, à
l’ISO 9917-1 et à l’ISO 9917-2.
Pour la préparation des échantillons, consulter les normes de produits respectives et/ou les instructions
du fabricant, et suivre ces descriptions aussi scrupuleusement que possible. Justifier tout écart par
rapport aux instructions du fabricant. Une description détaillée de la préparation des échantillons doit
figurer dans le rapport d’essai. La préparation des échantillons doit tenir compte des facteurs suivants:
a) température;
b) humidité;
c) exposition à la lumière: des échantillons de matériaux photosensibles doivent être fabriqués dans
des conditions telles que la lumière ambiante ne les active pas;
d) matériau du moule d’échantillon: s’assurer que le matériau du moule d’échantillon et que l’éventuel
lubrifiant utilisé n’affectent pas le processus de prise du matériau;
e) exposition à l’oxygène: pour les produits qui produisent une couche d’inhibition par l’oxygène
pendant le durcissement, les deux extrémités du moule doivent être recouvertes d’une matière
transparente imperméable à l’oxygène (par exemple, des bandes de polyester/mylar) pendant le
durcissement;
f) les échantillons doivent être produits en conditions d’asepsie; en cas d’impossibilité, les échantillons
peuvent être stérilisés par la méthode adaptée au matériau, si nécessaire et si possible (voir 5.7.3).
5.3 Exigences spécifiques et recommandations pour les matériaux
photopolymérisables
Conformément à l’ISO 7405, les facteurs suivants doivent être pris en compte, en considérant l’utilisation
finale du matériau photopolymérisable:
a) matériau du moule d’échantillon: si possible, il convient que le matériau du moule d'échantillon soit
conforme à l’ISO 4049, c’est-à-dire des moules en acier inoxydable avec un doublage blanc (papier-
filtre blanc) au fond de l’échantillon. En cas d’impossibilité, il est recommandé que les coefficients
de réflexion des matériaux utilisés pour les moules d’échantillons soient les plus proches possible
de ceux de la surface buccale sur laquelle le matériau est appliqué afin de simuler la situation
clinique;
NOTE Les matériaux du moule d’échantillon appropriés dont les coefficients de réflexion sont proches
de ceux des tissus durs dentaires peuvent être des matériaux semi-translucides ou en plastique blanc tels
que le polyéthylène (PE) ou le polytétrafluoroéthylène (PTFE).
b) exposition à la lumière: la photopolymérisation doit être effectuée pour simuler l’usage clinique
le plus précisément possible. Cela nécessite souvent une photopolymérisation d’un seul côté, mais
aussi quelquefois des deux côtés. La méthode de photopolymérisation est spécifique du matériau
et/ou du procédé. Pour les matériaux monocomposants, il ne doit y avoir aucun vide, aucune fissure
ni aucune bulle d’air lors d’une inspection à l’œil nu. Pour fournir le même niveau de polymérisation
qu’en milieu clinique, suivre les instructions d'utilisation du fabricant du matériau, y compris
l’activateur de polymérisation recommandé, qui doit comprendre la ou les régions de longueur
d’onde d'émission, l’éclairement énergétique et la durée d’exposition. Ces informations doivent être
documentées dans le rapport d’essai. Veiller à ce que la source de lumière et l’état de fonctionnement
soient conformes aux instructions d’utilisation du fabricant du matériau;
c) exposition à l’oxygène: pour les produits qui produisent une couche d’inhibition par l’oxygène
pendant la photopolymérisation, les deux extrémités du moule doivent être recouvertes d’une
matière transparente imperméable à l’oxygène (par exemple, des bandes de polyester/mylar)
pendant la photopolymérisation;
d) traitement de surface de l’échantillon: si le fabricant recommande une finition de surface du
matériau après la polymérisation, les surfaces de l’échantillon doivent être poncées et polies suivant
les modes opératoires cliniques recommandés. S’il n’existe pas de telles instructions, et si cela est
exigé pour les essais, les deux extrémités des échantillons doivent être poncées avec du papier
abrasif P2000 conformément à l’ISO 6344-3, après prise sous la matière transparente imperméable
à l’oxygène.
5.4 Exigences spécifiques et recommandations pour les matériaux à polymérisation
chimique
Conformément à l’ISO 7405, à l’ISO 9917-1 et à l’ISO 9917-2, les facteurs suivants doivent être pris en
compte, en considérant l’utilisation finale du matériau à polymérisation chimique:
a) mélange: mélanger suffisamment de matériau pour s’assurer que la préparation de chaque
échantillon s’effectue à partir d’un lot. Préparer un mélange frais pour chaque échantillon. Le
mélange doit être effectué en conformité avec les normes de produits respectives, le cas échéant;
b) exposition à l’oxygène: pour les produits qui produisent une couche d’inhibition par l’oxygène
pendant la polymérisation chimique, les deux extrémités du moule doivent être recouvertes
d’une matière imperméable à l’oxygène (par exemple, une bande de polyester/mylar) pendant la
polymérisation;
c) traitement de surface de l’échantillon: si le fabricant recommande une finition de surface du
matériau après la polymérisation, les surfaces de l’échantillon doivent être poncées et polies suivant
les modes opératoires cliniques recommandés. S’il n’existe pas de telles instructions, et si cela est
exigé pour les essais, les deux extrémités des échantillons doivent être poncées avec du papier
abrasif P2000 conformément à l’ISO 6344-3, après prise sous la matière transparente imperméable
à l’oxygène.
5.5 Exigences spécifiques et recommandations pour les matériaux de CFAO fraisés ou
produits par fabrication soustractive
Les facteurs suivants doivent être pris en compte, en considérant l’utilisation finale du matériau de
CFAO fraisé ou produits par fabrication soustractive: traitement de surface de l’échantillon: si le
fabricant recommande une finition de surface du matériau après fraisage ou fabrication soustractive
CFAO, les surfaces de l’échantillon doivent être poncées et polies suivant les modes opératoires
cliniques recommandés. S’il n’existe pas de telles instructions, et si cela est exigé pour les essais, les
deux extrémités des échantillons doivent être poncées avec du papier abrasif P2000 conformément à
l’ISO 6344-3.
5.6 Stérilité des échantillons
La stérilité des échantillons doit être prise en compte.
Les échantillons issus de matériaux dentaires qui sont fournis stériles doivent être manipulés en
asepsie tout au long du mode opératoire d'essai.
Les échantillons issus de matériaux dentaires qui sont normalement fournis non stériles, mais qui sont
stérilisés avant utilisation, doivent être stérilisés selon la méthode recommandée par le fabricant et
manipulés en asepsie tout au long du mode opératoire d’essai. Il convient que les effets des méthodes
ou des agents de stérilisation sur le matériau dentaire soient pris en compte lors de la définition de la
préparation de l'échantillon avant sa mise en œuvre dans le système d'essai choisi.
Les échantillons issus de matériaux dentaires n'ayant pas besoin d'être stériles pendant l’utilisation
doivent être employés tels qu'ils sont fournis et manipulés en asepsie tout au long du mode opératoire
d’essai. La décontamination du matériau d'essai afin d'éviter toute contamination croisée de la culture
bactérienne peut être justifiée; toutefois, le procédé de décontamination ne doit pas modifier les
propriétés du matériau d'essai. Il est recommandé d’effectuer une immersion dans 70 % d’éthanol
pendant 1 min, sauf indication contraire, pour réduire la contamination croisée, puis de réaliser une
immersion dans de l’eau stérile pendant 1 min. D’autres méthodes de décontamination peuvent être
utilisées si leur efficacité a été prouvée et s’il a été vérifié qu’elles ne modifient pas les propriétés du
matériau.
Si des échantillons non stériles sont utilisés, il convient que l'absence de contamination bactérienne
croisée sur ceux-ci soit vérifiée, car elle peut produire une fausse évaluation des propriétés
antibactériennes.
5.7 Préparation des extraits liquides de matériau
5.7.1 Principes d'extraction
La préparation des extraits doit être effectuée après un stockage de 24 h dans de l’eau stérile à (37 ± 1) °C
suivi d'un mélange/d’une polymérisation tel que décrit par le fabricant, et après 10 cycles d'élution
[7]
consécutifs (voir 5.7.4) pour fournir une indication sur l’activité antibactérienne à long terme .
Si l’activité antibactérienne est toujours observée pour l'extrait après le dixième cycle d'élution, il
convient d’effectuer un essai supplémentaire sur un extrait après 20 cycles d'élution afin de démontrer
un plateau (c’est-à-dire un effet persistant) de l’activité antibactérienne.
Il est recommandé d’effectuer l’analyse chimique des extraits après le dixième et le vingtième cycle
d’élution conformément à l’ISO 10993-18.
Il convient que les conditions d'extraction simulent ou exagèrent les conditions d'utilisation clinique
du matériau afin de définir l’activité antibactérienne potentielle sans induire de modifications
significatives de l'échantillon telles qu'une fusion, un ramollissement ou une altération de sa structure
chimique, en dehors de celles prévues lors de son utilisation clinique. En raison de la nature de certains
matériaux (par exemple les matériaux biodégradables), une altération de la structure chimique peut se
produire au cours du mode opératoire d'extraction.
NOTE La concentration de toute substance endogène ou exogène dans l'extrait, et donc la quantité de ces
substances mise au contact des bactéries utilisées dans l'essai, dépendent de la surface de contact, du volume
d'extraction, du pH, de la solubilité chimique, de la vitesse de diffusion, de l'osmolarité, de l'agitation, de la
température, de la durée et d'autres facteurs.
5.7.2 Milieu d’extraction
Le choix du ou des milieux d'extraction tenant compte des caractéristiques chimiques de l'échantillon
doit être justifié et documenté. Un ou plusieurs des milieux suivants doivent être utilisés:
a) bouillon nutritif utilisé pour la culture bactérienne dans la série d’expériences correspondante
(voir l’Annexe A pour des exemples);
b) tampon phosphate salin (PBS);
c) sérum (pour l’extraction des lipides).
Il convient que le choix du milieu reflète l'objectif de l'extraction. Le bouillon nutritif est le milieu
d’extraction privilégié en raison de sa capacité à extraire des substances polaires et non polaires.
NOTE Il est important de ne pas oublier que les protéines provenant de bouillons nutritifs riches en protéines
ou contenant du sérum sont connues pour se lier, dans une certaine mesure, aux substances extractibles.
5.7.3 Conditions d'extraction
Le mode opératoire d'extraction doit être conforme à l’ISO 10993-5.
L’extraction doit être effectuée dans des récipients stériles, chimiquement inertes et fermés, en
conditions d’asepsie, avec un volume de milieu d’extraction basé sur la surface exposée, conformément
à l’ISO 10993-12.
À l'exception des circonstances indiquées ci-dessous, l'extraction doit être menée dans l'une des
conditions suivantes et effectuée conformément aux caractéristiques du matériau et à ses conditions
d'utilisation spécifiques:
a) (24 ± 2) h à (37 ± 1) °C;
b) (72 ± 2) h à (37 ± 1) °C.
D'autres conditions, stimulant l'extraction se déroulant au cours de l'utilisation clinique ou fournissant
une mesure adéquate des propriétés antibactériennes du matériau, peuvent être utilisées, mais elles
doivent être justifiées et documentées.
Il convient d'éviter de manipuler l’extrait, notamment par ajustement du pH, filtration, centrifugation
ou d’autres méthodes de traitement, avant de l’appliquer sur les bactéries, car cela peut influencer le
résultat. Si des manipulations demeurent nécessaires, ces informations doivent être consignées dans le
rapport final avec une justification des étapes supplémentaires.
5.7.4 Cycles d’élution consécutifs
Pour fournir une indication sur l’activité antibactérienne à long terme, des cycles d'élution consécutifs
sont effectués en utilisant le milieu d’extraction (voir 5.7.2) et les conditions d’extraction (voir 5.7.3) tels
[7]
que décrits ci-dessus .
L’ensemble du mode opératoire d'élution doit être effectué en réalisant consécutivement au moins
10 étapes d'élution individuelles. Pour chaque étape d'élution individuelle, les échantillons doivent être
stockés à l’abri de la lumière à (37 ± 1) °C pendant (24 ± 2) h ou (72 ± 2) h. Après cette période, le
milieu d'élution doit être renouvelé, et une autre étape d'élution doit être effectuée. Cette opération doit
être répétée 10 fois. Pour cela, extraire des échantillons sur une période de deux semaines. Changer
le milieu d’extraction quatre fois par semaine à des intervalles de 24 h et une fois à 72 h. On obtient
ainsi 10 changements. Les extraits utilisés pour les essais doivent être des extraits de 24 h et non des
extraits de 72 h.
Dans le cas où une activité antibactérienne est observée pour l'extrait après le dixième cycle d'élution,
effectuer 10 cycles d'élution supplémentaires et réaliser l’essai sur un extrait après 20 cycles d'élution
afin de démontrer un plateau (c’est-à-dire un effet persistant) de l’activité antibactérienne. Pour cela,
extraire des échantillons sur une période de quatre semaines. Changer le milieu d’extraction quatre fois
par semaine à des intervalles de 24 h et une fois à 72 h. On obtient ainsi 20 changements. Il convient que
les extraits utilisés pour les essais soient des extraits de 24 h et non des extraits de 72 h.
Conformément à l’ISO 10993-12, il est recommandé, si possible, d’utiliser les extraits immédiatement
après la préparation pour empêcher l’absorption dans le récipient d’extraction ou toute autre
modification de la composition. Si un extrait est stocké pendant plus de 24 h dans un réfrigérateur
entre 2 °C et 8 °C, alors la stabilité et l’homogénéité de l’extrait dans les conditions de stockage doivent
être vérifiées.
5.8 Préparation des matériaux pour les essais en contact direct
5.8.1 Forme des échantillons
L'échantillon de prédilection de matériau solide doit avoir une forme circulaire d'un diamètre de 10 mm
et d'une épaisseur de 1 mm utilisable dans des plaques à 48 puits. Il convient qu’il ait au moins une
surface plane. Sinon, des ajustements doivent être faits pour obtenir des surfaces planes.
En cas de matériaux ayant un état physique différent de l’état solide (gels, etc.), ils peuvent être soumis à
essai dans leurs diverses formes ou tailles respectives, sans modification des essais antibactériens. Ces
formes doivent être similaires dans tous les échantillons. Dans ces cas, les volumes de bouillon nutritif
utilisés pour la culture bactérienne doivent être ajustés en conséquence.
5.8.2 Principes des essais par contact direct
Les essais par contact direct doivent être effectués après un stockage de 24 h dans de l’eau stérile à
(37 ± 1) °C suivi d'un mélange/d’une polymérisation tel que décrit par le fabricant, et après 10 cycles
d'élution consécutifs (voir 5.7.4) pour fournir une indication sur l’activité antibactérienne à long
[7]
terme .
Si l’activité antibactérienne est toujours observée pour le matériau après le dixième cycle d'élution, il
convient d’effectuer un essai supplémentaire sur le matériau après 20 cycles d'élution afin de démontrer
un plateau (c’est-à-dire un effet persistant) de l’activité antibactérienne.
Veiller à ce que toutes les surfaces des échantillons soient exposées à l’extraction. Les échantillons
collés les uns aux autres peuvent donner des surfaces non extraites et des faux positifs. Utiliser un
support approprié (voir Figure 1) pour monter les échantillons en vue de l’extraction. Le volume du
milieu d’extraction utilisé pour extraire les échantillons doit être élevé, c’est-à-dire au moins 10 ml/cm
de surface d'échantillon.
Figure 1 — Exemple de support pour le montage des échantillons
Utiliser l'un des milieux d’extraction suivants:
a) bouillon nutritif utilisé pour la culture bactérienne dans la série d’expériences correspondante
(voir l’Annexe A pour des exemples);
b) PBS.
Pour les matériaux dont le pH n’est pas neutre, par exemple les ciments, produits contenant des verres
alcalins, ou qui peuvent être sujets à la corrosion, il convient d’utiliser le PBS. Dans ce cas, la capacité
de se recharger doit être également prise en compte (par exemple pour les matériaux à base de verre
ionomère).
6 Souches bactériennes, bouillons nutritifs et préparation des cultures
bactériennes
Les souches bactériennes types ou de référence établies sont à privilégier et, lorsqu'elles sont utilisées,
1)
doivent être obtenues à partir de sources reconnues . La sélection de souches bactériennes doit
reposer sur la pertinence des organismes pour le domaine d'application du matériau respectif (par
exemple, Streptococcus spp. pour les matériaux en lien avec la médecine bucco-dentaire restauratrice
ou l’orthodontie). En raison de la disponibilité restreinte et de la comparabilité potentiellement affectée
des résultats obtenus, il convient de n’utiliser aucun isolat bactérien clinique.
L’Annexe A récapitule les souches bactériennes types ou de référence recommandées avec leurs
bouillons nutritifs correspondants et leurs milieux de croissance solides à utiliser pour la série
d’expériences décrites dans le présent document.
1) Par exemple, de l’American Type Culture Collection (ATCC), du Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen (DSMZ) ou du National Collection of Type Cultures (NCTC).
Toutes les expériences doivent être effectuées conformément aux pratiques de microbiologie
2)
appropriées .
Si une culture mère d'une souche bactérienne est conservée, le stockage doit se faire à –80 °C ou moins,
dans le bouillon nutritif correspondant, en présence d'un cryoprotecteur tel que du glycérol. Le bouillon
nutritif doit satisfaire aux exigences de croissance de la souche bactérienne type sélectionnée.
Seules les souches bactériennes exemptes de contamination croisée doivent être utilisées pour l’essai.
Avant utilisation, il convient de soumettre à essai les cultures mères pour démontrer l’absence de
contamination croisée (par exemple, par analyse MALDI-TOF). Utiliser uniquement des cultures pures.
Le bouillon nutritif utilisé pour l’expérience doit être stérile et exempt de contamination croisée.
À l’aide de la souche bactérienne type ou de référence choisie et du bouillon nutritif, préparer
suffisamment de cultures bactériennes planctoniques pour effectuer l’essai. Éviter de repiquer plus
de cinq fois des cultures bactériennes sur des boîtes de gélose ou dans des cultures liquides, car le
repiquage peut modifier les propriétés de la souche bactérienne type choisie.
7 Modes opératoires d’essai
7.1 Généralités
L'évaluation des propriétés antibactériennes doit être effectuée sur le produit fini.
Au moins trois expériences indépendantes avec au moins trois réplicats dans chaque expérience doivent
être utilisées pour les échantillons ainsi que pour les matériaux de contrôle négatifs et positifs.
7.2 Essais sur extraits
7.2.1 Essais sur extraits vis-à-vis des cultures bactériennes planctoniques
7.2.1.1 Principe
Cet essai permet d’évaluer les propriétés antibactériennes en évaluant la réduction de la capacité
bactérienne à répliquer dans les cultures planctoniques, et en mesurant l’endommagement de la
membrane bactérienne ou la réduction de l’activité métabolique bactérienne dans les cultures
planctoniques.
7.2.1.2 Appareillage, matériaux et réactifs
7.2.1.2.1 Appareillage
7.2.1.2.1.1 Équipement pour laboratoire de culture cellulaire, c’est-à-dire pipettes, incubateur.
7.2.1.2.1.2 Plaques à 96 puits.
7.2.1.2.2 Matériaux et réactifs
7.2.1.2.2.1 Extraits issus d'échantillons pour essai et
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
Loading comments...