SIST ISO 10706:2010

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10706
First edition
2000-04-01
Water quality — Determination of long term
toxicity of substances to Daphnia magna
Straus (Cladocera, Crustacea)
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité à long terme de substances
vis-à-vis de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
Reference number
©
ISO 2000
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Contents Page
Foreword.iv
Introduction.v
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Principle.1
4 Test environment.1
5 Reagents and materials .2
6 Apparatus .3
7 Treatment and preparation of samples .3
7.1 Special precautions for sampling and transportation of water or effluent samples.3
7.2 Preparation of solutions of substances to be tested.3
8 Procedure .4
8.1 Controls .4
8.2 Selection of exposure concentrations .4
8.3 Renewal of exposure solutions.5
8.4 Introduction of animals into the test system .5
8.5 Feeding of organisms .5
8.6 Observations and measurements.5
8.7 Validity of the test.6
9 Data analysis and expression of results .6
10 Test report .7
Annex A (informative) OECD M4 and M7 media — Preparation and acclimation of Elendt M4 and M7
media.9
Annex B (informative) ASTM reconstituted hard fresh water.12
Annex C (informative) Data collection sheet .13
Annex D (informative) Calculation of time-weighted mean concentration.15
Bibliography.17
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 10706 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,
Subcommittee SC 5, Biological methods.
Annexes A, B, C and D of this International Standard are for information only.
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Introduction
This International Standard defines a procedure for the determination of the long term sublethal toxicity of
chemicals, waters and waste waters to the water-flea Daphnia magna Straus. The methodology is adapted from a
guideline produced by the Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD Guideline 211, see
reference [1] in the Bibliography).
INTERNATIONAL STANDARD ISO 10706:2000(E)
Water quality — Determination of long term toxicity of substances
to Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
WARNING — Activated sludge and sewage contain potentially pathogenic organisms. Therefore,
appropriate precautions should be taken when handling them. Toxic test compounds and those whose
properties are unknown should be handled with care.
1 Scope
This International Standard describes a method for the determination of the long term sublethal toxicity to Daphnia
magna Straus (Cladocera, Crustacea)of:
a) chemical substances, which are soluble under the conditions of the test, or can be maintained as stable
suspensions or dispersions under the conditions of the test,
b) industrial or sewage effluents, treated or untreated, after decanting, filtration, or centrifugation,
c) surface or ground waters.
[1]
NOTE This International Standard is adapted from OECD Guideline 211 .
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 5667-2, Water quality — Sampling — Part 2: Guidance on sampling techniques.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples.
3Principle
Daphnia magna females, less than 24 h old, are exposed for a period of 21 days to a test substance, industrial or
sewage effluent or surface/ground water added to dilution water in a range of concentrations in a semi-static or
flow-through system. The survival of parents is recorded together with the number of live offspring produced per
live parent at the end of the test.
The survival is reported and the reproductive output of exposed parents living at the end of the test (expressed in a
number of terms) is compared to those of the control parents.
4 Test environment
The test atmosphere shall be free from vapours or dusts which may be toxic to Daphnia magna Straus.
The exposure solutions shall not be aerated.
The dissolved oxygen concentration in the exposure solutions shall be above 3 mg/l and the pH shall be within the
range of pH 6 to pH 9 and not change by more than 1,5 pH units for the duration of the test. Hardness shall be
above 140 mg/l (as CaCO ), which has been demonstrated to be necessary to promote reproductive performance
that shall meet the validity criteria (see 8.7).
The photoperiod of the test shall be 16 h of light and 8 h of darkness. The intensity shall be in the range 600 lux to
800 lux but not exceeding 1 200 lux.
The temperature of the test exposures shall be maintained within the range of 18 °C to 22 °C and the temperature
for the test shall not vary by more than 2 °C (for instance 18 °C to 20 °C, 19 °C to 21 °C or 20 °C to 22 °C)
throughout the test.
5 Reagents and materials
5.1 Test organism: Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea), hereafter referred to as D. magna, obtained
by acyclical parthenogenesis for at least three generations under specified culture conditions.
The age and the source (including clone, if possible) of the D. magna culture shall be indicated in the test report,
since the sensitivity of D. magna to toxicants can be affected by the source of the culture.
The animals used for the test shall be less than 24 h old and be from the second to fifth brood. The D. magna shall
be from a healthy stock showing no signs of stress such as mortality � 20 %, presence of males, ephippia, or
discoloured animals and there shall be no delay in the production of the first brood.
The stock animals shall be maintained in culture conditions (light, temperature, medium, feeding and animals per
unit volume) similar to those in the test. If the culture conditions differ from test conditions, it is recommended that
one generation be acclimated under the test conditions for about three weeks so as to avoid stressing the parent
animals.
5.2 Dilution water, synthetic as described in 5.3 or uncontaminated natural waters with comparable pH and
hardness characteristics to these dilution waters for culturing and testing.
5.3 Synthetic dilution water, prepared using one of the following methods:
a) OECD M4 and M7 media (see informative annex A);
b) ASTM reconstituted hard freshwater (see informative annex B).
The dilution water shall be aerated until the dissolved oxygen concentration has reached 95 % saturation and the
pH has stabilized. If necessary, adjust the pH to 8,0� 0,5 by adding sodium hydroxide (NaOH) solution or
hydrochloric acid (HCl) solution. The dilution water prepared in this way shall not be further aerated before use.
It is recommended that the TOC levels be� 5 mg/l before the addition of algae. The use of dilution water containing
EDTA (for instance M4 and M7) is not recommended when testing compounds containing metals because
chelation may reduce the toxicity of the compound.
If the test has to be performed for purposes necessitating the use of a dilution water with characteristics differing
from those described above, mention is necessary in the test report of the main characteristics (for instance pH,
hardness, TOC, COD) of the synthetic dilution water used.
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6 Apparatus
Ordinary laboratory apparatus and in particular the following.
6.1 Environmental controls, for controlling temperature, photoperiod and light intensity.
6.2 Measuring apparatus and/or instruments, for measuring dissolved oxygen, pH, hardness, total organic
carbon, chemical oxygen demand, light intensity and temperature.
6.3 Test containers, of chemically inert material and of sufficient capacity for the tests (for example 50 ml or
100 ml glass test tubes or beakers) and which are clean and uncontaminated.
7 Treatment and preparation of samples
7.1 Special precautions for sampling and transportation of water or effluent samples
Sampling of water or effluent shall be carried out in accordance with the general procedure specified in ISO 5667-2.
Bottles shall be completely filled to exclude air.
The preservation and storage of water or effluent samples shall be carried out in accordance with ISO 5667-16; the
following is only a summary. Carry out the toxicity test as soon as possible, ideally within 12 h of collection. If this
time interval cannot be observed, cool the sample (0 °C to 4 °C) and test the sample within 24 h. If testing cannot
be carried out within 48 h, the sample may be frozen (below�18 °C) for testing within 2 months of collection.
All portions (subsamples) shall be pretreated identically (i.e. if freezing of unstable water is necessary all portions,
including those needed for the first day, shall be frozen prior to testing; see ISO 5667-16).
Because of the duration of this test (21 days) and the periodic renewal of solutions, a sufficient number of portions
of the sample must be frozen to renew test solutions and to repeat the test, if needed (reserve samples). The
minimum volume of the frozen portions is dependent upon the toxicity of the sample to be tested. The volume of
sample needed for a semi-static test with ten daphnids exposed individually in 100 ml of undiluted sample is 9 l;
additional sample will be required for diluted exposures.
If the test is conducted on site or close to the sampling site, fresh samples may be used to replace the test
solutions. In this case the variations at the sampling site are incorporated into the test design.
7.2 Preparation of solutions of substances to be tested
7.2.1 Preparation of stock solutions
A stock solution of the substance(s) to be tested shall be prepared by dissolving a known quantity of the
substance(s) in a specified volume of dilution water, deionized water or distilled water in a glass container. The
stock solution shall be prepared immediately before preparing the exposure solutions unless the substance(s)
is/are known to be stable in defined storage conditions, in which case the stock solution may be prepared in
advance of testing and stored in these conditions.
Stock solutions or suspensions of substance(s) which are poorly soluble in water can be solubilized or dispersed
directly in the medium with ultrasonic dispersion, and/or stirring or with solvents or dispersants of low toxicity to
D. magna as discussed in ISO 5667-16. If a solvent is used, the concentration of the solvent in the stock solution
shall be such that the concentration in the highest exposure solution does not exceed 0,1 ml/l.
The use of organic solvents should be avoided. If they are required organic solvents such as acetone, ethanol,
methanol, dimethylformamide, triethylene glycol or dispersants such as Cremophor RH40, methylcellulose 0,1 %,
and HCO-40 may be used to produce a suitably concentrated stock solution. They are not toxic to D. magna at
0,1 ml/l concentrations. No single procedure for the preparation of stock solutions of poorly soluble substances can
be recommended due to the differing nature of chemicals.
7.2.2 Preparation of exposure solutions
The exposure solutions shall be prepared (8.2) by adding the stock solutions (7.2.1) or effluent samples (7.1) to the
dilution water (5.2) in specified quantities (see 8.2).
If the stock solutions are prepared in deionized or distilled water, no more than 100 ml of stock solution shall be
added to each litre of dilution water.
The chosen concentrations can also be prepared separately by the direct addition of the test substance to dilution
water where the amounts to be added can be accurately weighed out or pipetted for liquids.
If the sample pH is not between 6 and 9, the test shall be carried out after adjusting the pH to the value of the
nearest limit (6 or 9) using solutions of hydrochloric acid or sodium hydroxide.
NOTE Testing water samples at concentrations above 100 ml/l may reduce the reproduction and survival of D. magna
because of deficiency in the medium (for instance hardness). Identifying effects of such deficiencies may require the addition of
the same salts to the sample as in the dilution water.
8 Procedure
8.1 Controls
Every test shall include a control containing no test substance.
Two controls are required when a solvent or dispersant is used. One control shall contain no solvent or dispersant.
The second control shall contain a concentration of solvent or dispersant equal to that in the highest exposure
concentration.
8.2 Selection of exposure concentrations
There shall be at least five exposure concentrations arranged in a geometric series with a separation factor not
exceeding 3,2.
In setting the range of concentrations, the following shall be borne in mind:
a) if the objective is to obtain the NOEC (no observed effect concentration), the range of concentrations shall
include at least one concentration producing a significant effect compared to the control (LOEC: lowest
observed effect concentration), preceded by a NOEC.
If this is not the case, the test shall be repeated with a reduced lowest concentration. See footnote 1 to
clause 9.
b) If the objective is to obtain the EC (effect concentration producing a percentage response; typically this is
p
20 % and/or 50 %) for the effect on reproduction and survival, it is advisable that two exposure concentrations
be higher than this EC concentration (p is the percentage response selected). Otherwise, although it will still
p
be possible to estimate the EC , the confidence interval for the EC will be very wide and it may not be
p 50
possible to assess satisfactorily the adequacy of the fitted model.
NOTE Prior knowledge of the toxicity of the test substance from an acute test and/or from range-finding studies (ISO 6341)
is helpful in selecting appropriate exposure concentrations.
Where a solvent or dispersant is used to aid preparation of stock solutions, the concentration of solvent or
dispersant in the highest concentration shall not be greater than 0,1 ml/l. The concentration of solvent or dispersant
shall, as far as possible, be the same in all vessels.
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8.3 Renewal of exposure solutions
The exposure solutions shall be renewed at least three times per week. If preliminary stability tests indicate that the
test substance concentration falls below 80 % of the initial measured concentration before day three, consideration
shall be given to either increasing the frequency of exposure solution renewal or using a flow-through test.
Changes in the frequency of solution replacement or the rate of continuous flow shall be reported.
When semi-static tests are conducted, minimize the volume of medium transferred with the D. magna.
8.4 Introduction of animals into the test system
Transfer young animals (� 24 h old) from the culture system to the test system at the beginning of the test. Place
each individual in a single vessel containing 50 ml to 100 ml of exposure solution.
Larger volumes of exposure solution may be required for chemical analysis of exposure concentrations.
Alternatively, replicates can be pooled for chemical analysis.
Semi-static testing shall require at least ten animals exposed individually to each exposure concentration and
control. Furthermore, a second series of test vessels shall be prepared at the time of solution renewal and the
parent animals are transferred to them by means of a glass pipette of suitable bore diameter.
Organisms shall be exposed for a total of 21 days.
If a continuous flow test is being conducted, this International Standard should be used f
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 10706
Première édition
2000-04-01
Qualité de l'eau — Détermination de la
toxicité à long terme de substances
vis-à-vis de Daphnia magna Straus
(Cladocera, Crustacea)
Water quality — Determination of long term toxicity of substances to
Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
Numéro de référence
©
ISO 2000
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Sommaire Page
Avant-propos.iv
Introduction.v
1 Domaine d'application.1
2Références normatives .1
3 Principe.1
4 Environnement de l'essai.2
5Réactifs et produits .2
6 Appareillage .3
7 Traitement et préparation des échantillons .3
7.1 Précautions particulières concernant le prélèvement et le transport des échantillons d'eaux ou
d'effluents.3
7.2 Préparation des solutions des substances à expérimenter.3
8 Mode opératoire.4
8.1 Témoins .4
8.2 Sélection des concentrations d'essai.4
8.3 Renouvellement des concentrations d'essai.5
8.4 Introduction des animaux dans le système d'essai.5
8.5 Alimentation des organismes.5
8.6 Observations et mesures.6
8.7 Validité des résultats.6
9 Analyse des données et expression des résultats .7
10 Rapport d'essai .8
Annexe A (informative) Milieux M4 et M7 de l'OCDE — Préparation et acclimatation des milieux M4
Elendt et M7.10
Annexe B (informative) Eau dure reconstituée ASTM.13
Annexe C (informative) Fiche de collecte de données.14
Annexe D (informative) Calcul de la concentration moyenne pondérée dans le temps.16
Bibliographie .18
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiéeaux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude aledroit de fairepartie ducomité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments delaprésente Norme internationale peuvent faire
l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 10706 a étéélaboréepar le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau,
sous-comité SC 5, Méthodes biologiques.
Les annexes A, B, C et D de la présente Norme internationale sont données uniquement à titre d’information.
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Introduction
La présente Norme internationale définit une méthode pour la détermination de la toxicité sublétale à long terme
des substances chimiques, des eaux et des effluents vis-à-vis de la puce d’eau Daphnia magna Straus. La
méthodologie est adaptéed’une ligne directrice élaborée par l’Organisation de coopération et de développement
économiques (Ligne directrice 211 de l’OCDE, voir référence [1] de la Bibliographie).
NORME INTERNATIONALE ISO 10706:2000(F)
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicitéà long terme de
substances vis-à-vis de Daphnia magna Straus (Cladocera,
Crustacea)
AVERTISSEMENT — Les boues activées et les eaux usées peuvent contenir des organismes
potentiellement pathogènes. Il est par conséquent recommandé de prendre les précautions d'usage lors de
leur manipulation. Il convient de manipuler avec soin les composés d'essai toxiques et ceux dont les
propriétés sont inconnues.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale décrit une méthodepour ladétermination de la toxicité sublétale à long terme
vis-à-vis de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) des substances suivantes:
a) substances chimiques solubles dans les conditions de l'essai ou pouvant être maintenues en suspension ou
en dispersion stable dans les conditions de l'essai;
b) effluents industriels ou urbains, épurés ou non, s'il y a lieu aprèsdécantation, filtration ou centrifugation;
c) eaux de surface ou eaux souterraines.
NOTE La présente Norme internationale est adaptéedelaLigne directrice 211del'OCDE[1].
2Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s’applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 5667-2, Qualité de l’eau —Échantillonnage — Partie 2: Guide général sur les techniques d’échantillonnage.
ISO 5667-16, Qualité de l’eau —Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques des
échantillons.
3Principe
Exposition pendant 21 jours de Daphnia magna femelles âgées de moins de 24 heures à une substance d'essai, à
des effluents industriels ou urbains ou à des eaux de surface/souterraines ajoutés à de l'eau de dilution, dans une
gamme de concentrations d'un système semi-statique ou à renouvellement continu. Le nombre de parents
survivants ainsi que le nombre de descendants vivants issus de parents vivants à lafindel'essaisontconsignés.
La survie est notée et la capacité reproductrice des parents mis en expérimentation, vivants en fin d’essai
(exprimée en nombre d'individus) est comparée à celle des parents témoins.
4 Environnement de l'essai
L'enceinte d'essai doit être exempte de vapeurs ou de poussièrestoxiquesvis-à-vis de Daphnia magna Straus.
Les solutions d'essai ne doivent pas être aérées.
La concentration en oxygène dissous dans les solutions d'essai doit être supérieure à 3 mg/l et le pH doit se situer
dans la gamme comprise entre 6 et 9 et ne doit pas varier de plus de 1,5 unités au cours de l'essai. La dureté doit
avoir une valeur supérieure à 140 mg/l (expriméeenCaCO)ayant démontré qu'elle favorise la capacité
reproductrice pour êtreconformeaux critères de validité (voir 8.7).
Le cycle d'essai doit être de 16 h de lumière et de 8 h d’obscurité.L’intensité doit de préférence être comprise
entre 600 lux et 800 lux mais ne doit pas excéder 1 200 lux.
La température des solutions d'essai doit être maintenue dans une gamme comprise entre 18 °Cet 22 °Cet ne
pas varier de plus de 2 °C (par exemple 18 °C à 20 °C, 19 °C à 21 °Cou20 °C à 22 °C) pendant toute la duréede
l'essai.
5Réactifs et produits
5.1 Organismes pour essai: Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea), notée D. magna dans la suite du
texte, de troisième génération au moins, obtenue par parthénogenèse acyclique dans des conditions d'élevage
définies.
La sensibilité de D. magna aux toxiques étant fonction de l'origine de l'élevage, l'âge et la provenance (y compris
les clones, si possible) de l'élevage de D. magna doivent être mentionnés dans le rapport d'essai.
Les animaux utilisés pour l'essai doivent être âgés de moins de 24 h et provenir de la seconde à la cinquième
portée. Les D. magna doivent provenir d’un lot sain ne présentant aucun signe de stress tel que mortalité >20%,
présencedemâles, ephippia ou animaux décolorés, et doivent produire sans retard la première génération.
Le lot d’animaux doit être maintenu dans des conditions d'élevage (lumière, température, milieu, alimentation et
nombre par unité de volume) similaires à celles de l'essai. Si les conditions d'élevage diffèrent de celles de l'essai,
il est recommandé d'acclimater une génération aux conditions d'essai pendant environ trois semaines afin d'éviter
toute source de stress aux animaux parents.
5.2 Eau de dilution: eau synthétique comme décrit en 5.3 ou des eaux naturelles non contaminées ayant un pH
et des caractéristiques de dureté similaires aux eaux de dilution utilisées pour l'élevage et les essais.
5.3 Eau de dilution synthétique,préparée au moyen de l'une des méthodes suivantes:
a) milieux M4 et M7 de l’OCDE (voir annexe A);
b) eau de source dure reconstituée ASTM (voir annexe B).
L'eau de dilution doit être aérée jusqu'à ce que la concentration en oxygène dissous ait atteint la valeur de
saturation de 95 % et jusqu'à stabilisation du pH. Si nécessaire, ajuster le pH à 8,0� 0,5 par ajout d'une solution
d'hydroxyde de sodium (NaOH) ou d'acide chlorhydrique (HCI). L'eau de dilution ainsi préparéenedoit plus être
aérée avant emploi.
Il est recommandé que les niveaux de COT (carbone organique total) soient < 5 mg/l avant l'ajout d'algues. Il n'est
pas recommandé d'utiliser de l'eau de dilution contenant de l'EDTA (par exemple M7 et M4) pour analyser des
composés contenant des métaux dans la mesure où la chélation peut réduire la toxicité du composé.
Si l'essai doit être conduit en vue de besoins qui impliquent l'utilisation d'une eau de dilution dont les
caractéristiques diffèrent de celles décrites ci-dessus, il convient de mentionner dans le rapport d'essai les
principales caractéristiques (par exemple, pH, dureté, COT, DCO) de l'eau de dilution synthétique utilisée.
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6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Appareils de contrôle de l'environnement, pour le contrôle de la température, du cycle jour/nuit et de
l'intensité de la lumière.
6.2 Appareil et/ou instruments de mesurage, pour le mesurage de l'oxygène dissous, du pH, de la dureté,du
carbone organique total, de la demande chimique en oxygène, de l'intensité de la lumière et de la température.
6.3 Récipients d’essai,enmatériau chimiquement inerte et de capacité suffisante pour les essais (par exemple
tubes à essais ou béchers en verre de 50 ml ou 100 ml), propres et non contaminés.
7 Traitement et préparation des échantillons
7.1 Précautions particulières concernant le prélèvement et le transport des échantillons d'eaux
ou d'effluents
Les échantillons d'eaux ou d'effluents doivent être prélevés conformément à la procédure générale définie dans
l'ISO 5667-2. Les flacons doivent être complètement remplis pour ne plus contenir d'air.
Les échantillons d'eaux ou d'effluents doivent être conservés conformément à l'ISO 5667-16; ce qui suit n’en
constitue qu’un résumé.Réaliser l’essai de toxicité le plus rapidement possible, idéalement dans les 12 h qui
suivent le prélèvement. Si cette durée ne peut pas être respectée, refroidir l’échantillon (0 °C à 4 °C) et l’analyser
dans les 24 h. Si l’essai ne peut être réalisé dans les 48 h, l’échantillon peut être congelé (au-dessous de –18 °C)
pour être analysé dans les deux mois suivant le prélèvement.
Toutes les portions (sous-échantillons) doivent être prétraitées de la même manière (c'est-à-dire que lorsqu'il est
nécessaire de congeler de l'eau instable, toutes les portions, y compris celles utilisées le premier jour, doivent être
congelées avant les essais; voir l’ISO 5667-16).
En raison de la durée de cet essai (21 jours) et de la nécessité de renouveler périodiquement les solutions, un
nombre suffisant de portions d'échantillon doit être congelé afin de renouveler les solutions d'essai et de répéter
l'essai si nécessaire (échantillons de réserve). Le volume minimal de portions congelées dépend de la toxicité de
l'échantillon à analyser. Le volume d'échantillon nécessaire pour un essai semi-statique avec mise en
expérimentation individuelle de dix daphnies dans 100 ml d'échantillon non dilué est de 9 litres; des prélèvements
supplémentaires seront nécessaires pour des échantillons dilués.
Lorsque l'essai est réalisé sur le site ou à proximité du lieu de prélèvement, il est admis d'utiliser des échantillons
frais pour remplacer les solutions d'essai. Dans ce cas, les variations existantes sur le lieu de prélèvement sont
intégrées dans la méthode d'essai.
7.2 Préparation des solutions des substances à expérimenter
7.2.1 Préparation des solutions mères
La solution mère de la ou des substances à expérimenter doit être préparée par dissolution d'une quantité connue
de la ou des substances dans un volume défini d'eau de dilution, d'eau déionisée ou d'eau distilléedansun
récipient en verre. La solution mère doit être préparée juste avant la préparation des solutions d'essai à moins que
la (les) substance(s) soit (soient) réputée(s) stable(s) dans des conditions de conservation définies, auquel cas la
solution mère peut être préparée avant l'essai et conservée dans ces conditions.
Les solutions mères ou les suspensions de substance(s) de faible solubilité aqueuse peuvent être solubilisées ou
dispersées directement dans le milieu par des dispositifs à ultrasons, et/ou des agitateurs ou des solvants ou des
dispersants de faible toxicité vis-à-vis de D. magna comme traité dans l'ISO 5667-16. Si un solvant est utilisé,la
concentration du solvant dans la solution mère doit être telle que la concentration dans la plus forte solution d'essai
ne dépasse pas 0,1 ml/l.
Il convient d’éviter l’utilisation de solvants organiques. Si ceux-ci sont nécessaires, des solvants organiques tels
que acétone, éthanol, méthanol, diméthylformamide, triéthylèneglycol ou des dispersants tels que Cremophor
RH40, méthylcellulose 0,1 %, et HCO-40 peuvent être utilisés pour obtenir une solution mère convenablement
concentrée. Ils ne sont pas toxiques vis-à-vis de D. magna à des concentrations de 0,1 ml/l. En raison des
différences de nature des substances chimiques, aucune procédure unique ne peut être conseillée pour la
préparation des solutions mères de substances de faible solubilité aqueuse.
7.2.2 Préparation des solutions d'essai
Les solutions d'essai doivent être préparées (8.2) par ajout des solutions mères (7.2.1) ou des échantillons
d'effluents (7.1) à l'eau de dilution (5.2) en quantitésdéfinies (voir 8.2).
Lorsque les solutions mères sont préparées dans de l'eau déionisée ou distillée, il ne faut pas ajouter plus de
100 ml de solution mère par litre d'eau de dilution.
Les concentrations choisies peuvent également être préparées séparément par ajout direct de la substance d'essai
à l'eau de dilution lorsque les quantités à ajouter peuvent être pesées ou introduites à l’aide d’une pipette dans le
cas des liquides, de manière précise.
Si le pH de l’échantillon n’est pas compris entre 6 et 9, l’essai doit être effectué après ajustement du pH à la valeur
la plus proche (6 ou 9) à l’aide de solutions d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium.
NOTE L'analyse d'échantillons d'eau à des concentrations supérieures à 100 ml/l peut réduire la reproduction et la survie
des D. magna en raison d'insuffisances dans le milieu (par exemple, la dureté). Il peut s'avérer nécessaire pour déterminer les
effets de ces insuffisances d'ajouter à l'échantillon les mêmes sels que ceux de l'eau de dilution.
8 Mode opératoire
8.1 Témoins
Chaque essai doit comporter un témoin ne contenant aucune substance d'essai.
Lorsqu'un solvant ou un dispersant est utilisé, deux témoins sont nécessaires: l'un ne doit contenir aucun solvant
ou dispersant, l'autre doit contenir un solvant ou un dispersant à une concentration égale à celledela plusforte
concentration d'essai.
8.2 Sélection des concentrations d'essai
Utiliser au moins cinq concentrations d'essai disposées en une série géométrique avec un facteur de séparation ne
dépassant pas 3,2.
Lors de l'établissement de la gamme des concentrations, les points suivants doivent être pris en compte:
a) Si l’objectif est d’obtenir la NOEC (concentration sans effet observé), la gamme de concentration doit inclure
au moins une concentration produisant un effet significatif par rapport au témoin (LOEC: concentration la plus
faible avec effet observé), précédéed’une NOEC.
Si ce n’est pas le cas, l’essai doit être répété avec une concentration plus faible. Voir la note de bas de page 1
de l’article 9.
b) Si l’objectif est d’obtenir la CE (concentration produisant une réponse en pourcentage, généralement 20 %
p
et/ou 50 %) relative à l'effet sur la reproduction et la survie, il est souhaitable que deux concentrations d’essai
soient supérieures à cette concentration CE (p est le pourcentage de réponse choisi). Dans le cas contraire,
p
bien qu'il soit possible d'estimer la CE , l'intervalle de confiance pour CE sera très large et il peut s'avérer
p 50
impossible d'évaluer de manière satisfaisante l'adéquation du modèle établi.
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NOTE La connaissance préalable de la toxicité de la substance d’essai par un essai de toxicité aiguë et/ou préliminaire
(ISO 6341) est utile pour sélectionner les concentrations d'essai appropriées.
Lorsque les solutions mères sont préparées avec un solvant ou un dispersant, la concentration en solvant ou en
dispersant dans la plus forte concentration ne doit pas être supérieure à 0,1 ml/l et doit, dans toute la mesure du
possible, être identique dans tous les récipients.
8.3 Renouvellement des concentrations d'essai
Les concentrations d'essai doivent être renouvelées au moins trois fois par semaine. Lorsque les essais
préliminaires de stabilité indiquent une chute de la concentration de la substance d'essai à plus de 80 % de la
concentration initiale mesurée avant le troisième jour, il est nécessaire de procéder à une augmentation de la
fréquence de renouvellement de la solution d'essai ou d'utiliser un essai à renouvellement continu. La fréquence de
renouvellement de la solution ou la vitesse du débit de renouvellement continu doit être consignée.
Dans le cas d'essais semi-statiques, réduire le volume du milieu transféré avec les D. magna.
8.4 Introduction des animaux dans le système d'essai
Au début de l'essai, transférer les jeunes animaux (âgées de moins de 24 h) du système d'élevage dans le
système d'essai. Placer chacun d'entre eux dans un seul récipient contenant 50 ml à 100 ml de solution d'essai.
Pour l'analyse chimique des concentrations d'essai, il peut être nécessaire d'utiliser des volumes plus importants
de solution d'essai; des répliques peuvent également être regroupées.
Pour ce qui concerne les essais semi-statiques, au moins dix animaux doivent être expérimentés individuellement
pour chaque concentration considérée et chaque témoin. De plus, préparer une seconde sériederécipients d'essai
au moment du renouvellement des solutions, et transférer les animaux parents dans les solutions au moyen d'une
pipette en verre de diamètre approprié.
La duréed’exposition des organismes doit être de21jours.
Si un essai à renouvellement continu est effectué,il convientd’utiliser la présente Norme internationale en tant que
ligne directrice.
8.5 Alimentation des organismes
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